Ảnh hưởng của ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp enzim glucooxydaza từ chủng nấm mốc aspergillus niger 9.4

57 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tập 48, số 2, 2010 Tr. 57-66 ẢNH HƯỞNG CỦA ION KIM LOẠI ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZIM GLUCOOXYDAZA TỪ CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus niger 9.4 NGUYỄN THÚY HƯỜNG, NGÔ TIẾN HIỂN, NGUYỄN MINH THU, KHUẤT THỊ THỦY, ĐÀM LAM THANH, TRẦN THỊ CHÂU 1. MỞ ĐẦU Enzim glucooxydaza (GOD) (còn gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzim xúc tác cho phản ứng oxy hóa β-D-glucoza thành glucono-δ lactone và hydroperoxit khi có mặt oxy. Trong tự nhiên glucooxydaza được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường của nấm mốc, nhất là các loài Aspergillus niger, Penicillium notatum, P. glaucum, P. amagasakiense, P. chrysogenum, P. vitale và một số loài khác [6]. Glucooxydaza là một enzim thương phẩm quan trọng được sử dụng ngày càng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, để sản xuất axit gluconic, định lượng glucoza trong quá trình lên men và trong chuẩn đoán y học [5, 7, 8]. Glucooxydaza có thể được tổng hợp từ chủng nấm mốc Aspergillus bằng phương pháp lên men chìm từ nguồn cacbon là glucoza và một số chất dinh dưỡng với sự có mặt của oxy. Quá trình sinh tổng hợp enzim glucooxydaza chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong đó các ion kim loại đóng vai trò quan trọng quyết định năng suất của quá trình sinh tổng hợp. Trong bài báo này, ảnh hưởng của năm ion kim lọai là Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ và Co2+ đến sinh tổng hợp GOD của chủng Aspergillus niger kí hiệu 9,4 đã được nghiên cứu. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu - Chủng vi sinh vật: Chủng A. niger kí hiệu 9.4 trong bộ sưu tập giống Vi sinh vật công nghiệp thực phẩm của Viện Công nghiệp Thực phẩm có khả năng sinh tổng hợp GOD. - Môi trường giữ giống: Giống được giữ trên môi trường thạch khoai tây ở 4oC, cấy chuyền định kỳ 2 tháng 1 lần. - Môi trường nhân giống: Giống được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 20 ml môi trường, lắc 150 v/p/ 24 giờ, ở 30oC. Môi trường nhân giống (g/l): Glucoza 100; NaNO3 3; Cao nấm men 2; KH2PO4 1; KCl 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; Nước cất 1 lít; pH 6,2 (Liu et all, 2001) [4]. Thanh trùng 121oC trong 20 phút, làm nguội xuống 30oC trước khi tiếp 2 ml dịch huyền phù bào tử (7 × 105 bào tử/ ml). - Môi trường sinh tổng hợp glucooxydaza (Liu et all, 1999) [3] (môi trường MT1) có thành phần (g/l): Glucoza 100; KH2PO4 0,35; ure 0,55; MgSO4.7H2O 0,15; CaCO3 3; Nước cất 58 1lít; pH 6,2. Bình lên men dung tích 100 ml có chứa 20ml môi trường MT1, được tiếp 10% (v/v) giống đã nuôi cấy lắc 150 v/p ở 30oC trong 40 giờ. - Môi trường nghiên cứu ảnh hưởng của ion kim loại: Môi trường của Liu et all, 1999 [3] được xử lí loại bỏ các ion kim loại bằng cách bổ sung 1,2 g/l K4Fe(CN)6,4H2O + 20 ml H2SO4 1N để lạnh 10oC/2 ngày, li tâm 5000 v/p loại bỏ kết tủa. Thanh trùng 115oC/20 phút. 2.2. Phương pháp - Nghiên cứu ảnh hưởng của ion kim loại: Thử nghiệm khảo sát ảnh hưởng của từng ion kim loại ở 5 nồng độ. Chọn khoảng nồng độ thử nghiệm từ các kết quả nghiên cứu đã công bố. Với mỗi ion kim loại thử nghiệm được tiến hành 3 lần, mỗi lần 2 mẫu lặp cho mỗi nồng độ. - Bố trí thí nghiệm: Mẫu đối chứng (ĐC): Là môi trường MT1. Mẫu trắng (kí hiệu MT) là môi trường MT1 được xử lí 1,2 g/l K4Fe(CN)6,4H2O + 20 ml H2SO4 1N để lạnh 10oC/2 ngày để loại bỏ các ion kim loại có sẵn. Sau khi xử lí, hàm lượng các ion kim loại được phân tích nhằm hiệu chỉnh nồng độ của các ion kim loại đưa vào thử nghiệm. Bổ sung vào môi trường mẫu trắng hàm lượng các ion kim loại với các nồng độ theo bảng 1. Bảng 1. Nồng độ của ion kim loại và hợp chất dùng trong nghiên cứu Nồng độ ion kim loại (g/l) Nồng độ hợp chất chứa ion kim loại (g/l) Fe2+ Cu2+ Zn2+ Mn2+ Co2+ FeSO4 CuSO4 ZnSO4 MnSO4 CoCl2 0,004 0,004 0,005 0,010 0,005 0,011 0,010 0,012 0,027 0,011 0,008 0,008 0,007 0,020 0,010 0,022 0,020 0,017 0,055 0,022 0,012 0,012 0,009 0,030 0,015 0,033 0,030 0,022 0,082 0,033 0,016 0,016 0,011 0,040 0,020 0,044 0,040 0,027 0,110 0,044 0,020 0,020 0,013 0,050 0,025 0,054 0,050 0,032 0,137 0,055 - Thu hồi sinh khối: Sau lên men sinh khối sợi nấm được thu hồi bằng phương pháp lọc chân không. Rửa 3 lần bằng nước muối vô trùng. - Thu nhận dịch enzim thô: Sinh khối sợi nấm thu được sau lọc được phá vỡ bằng siêu âm (thiết bị sonopuls HD 2200, của hãng Bandelin - Đức) tần số 80 kHz trong 30 giây nhiệt độ 4oC kết hợp với bi thủy tinh [6]. Sau đó thu hồi dịch enzim bằng cách ly tâm ở chế độ 10,000 v/p ở 4oC trong 10 phút. Dịch trong, màu vàng phía trên là enzim thô và được dùng để xác định hoạt tính enzim GOD. - Phương pháp phân tích: Hoạt lực enzim glucooxydaza được xác định theo phương pháp sử dụng bộ KIT xác định hoạt tính GOD của hãng Megazyme (Ireland). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích hàm lượng các ion kim loại của mẫu đối chứng và mẫu trắng Mẫu đối chứng và mẫu trắng được phân tích hàm lượng các ion kim loại bằng phương pháp của JAS-SOP – 45 và AOAC 986.15. Kết quả được trình bày trong bảng 2. 59 Bảng 2. Thành phần ion kim loại trong mẫu đối chứng và mẫu trắng Ion kim loại (ppm) Mẫu đối chứng (không xử lí) Mẫu trắng xử lí K4Fe(CN)6.4H2O Fe2+ 0,0025 0,002 Cu2+ 0,0016 0,001 Zn2+ KPH KPH Mn2+ KPH KPH Co2+ KPH KPH Ghi chú: KPH là không phát hiện. 3.2. Ảnh hưởng của ion sắt đến sinh tổng hợp GOD Bảng 3. Ảnh hưởng của ion Fe2+đến sinh khối và hoạt tính GOD của A. niger 9.4 Hình 1. Ảnh hưởng của Fe2+ đến sự tạo thành sinh khối của A. niger 9.4 Hình 2. Ảnh hưởng của Fe2+ đến sinh tổng hợp GOD của A. niger 9.4 STT Kí hiệu Nồng độ thực (g/l) Sinh khối (g / 20 ml) GOD nội bào (U/gSK) 1 ĐC (môi trường không xử lí) 0,0025 1,68 ± 0,10 157,07 ± 18,13 2 MT (môi trường sau xử lí) 0,002 0,51 ± 0,04 60,34 ± 2,84 3 C1 0,006 0,51 ± 0,00 152,78 ± 0,25 4 C2 0,010 0,63 ± 0,00 288,05 ± 0,25 5 C3 0,014 0,52 ± 0,00 290,77 ± 0,25 6 C4 0,018 0,45 ± 0,00 118,70 ± 0,25 7 C5 0,022 0,52 ± 0,00 18,56 ± 0,25 Ảnh hưởng sinh khối theo nồng độ ion Fe 2+ 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 M T 0.006 0.010 0.014 0.018 0.022 Nồng độ (g/l) SK Ảnh hưởng GOD theo nồng độ ion Fe 2+ 0 50 100 150 200 250 300 M T 0.006 0.010 0.014 0.018 0.022 Nồng độ (g/ l) GOD 60 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion Fe2+ với các nồng độ khác nhau cho thấy: Nồng độ ion Fe2+ ảnh hưởng không đáng kể đến sự sinh trưởng của chủng nấm 9.4 và sinh khối thu được thấp hơn so với mẫu đối chứng (hình 1, phần nền là mẫu ĐC, các cột là mẫu trắng và mẫu thí nghiệm). Tuy nhiên, nồng độ ion Fe2+ ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính enzim GOD của chủng nấm 9.4. Kết quả thử nghiệm cho thấy, khi tăng nồng độ ion Fe2+ cao hơn nồng độ có sẵn trong môi trường nghiên cứu (MT không xử lí) hoạt tính enzim GOD của chủng nấm 9.4 tăng, và hoạt tính enzim GOD bắt đầu giảm từ nồng độ thử nghiệm 0,018 g/l. Tiến hành khảo sát mức độ ảnh hưởng ở khoảng nồng độ từ 0,006 - 0,018 g/l để tìm ngưỡng nồng độ ion Fe2+ cho kết quả GOD tối ưu cho thấy: ở nồng độ ion Fe2+ là 0,015 g/l chủng nấm 9.4 cho hoạt tính GOD cao nhất (kết quả này không trình bày ở đây) 3.3. Ảnh hưởng của ion đồng đến sinh tổng hợp GOD Bảng 4. Ảnh hưởng của ion Cu2+ đến sinh khối và hoạt tính GOD của A. niger 9.4 Hình 3. Ảnh hưởng của ion Cu2+ đến sự tạo thành sinh khối chủng A. niger 9.4 Hình 4. Ảnh hưởng của ion Cu2+ đến sinh tổng hợp GOD chủng A. niger 9.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion Cu2+ với các nồng độ khác nhau cho thấy: Nồng độ ion Cu2+ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim GOD của chủng 9.4 (hình 3, 4). Sinh khối thu được và hoạt tính enzim thấp hơn so với mẫu đối chứng (môi trường MT1 không xử lí). Vì vậy, cần phải loại đồng khỏi môi trường sinh tổng hợp GOD. STT Kí hiệu Nồng độ thực (g/l) Sinh khối (g / 20 ml) GOD nội bào (U/g SK) 1 ĐC (môi trường không xử lí) 0,0016 1,68 ± 0,10 157,07 ± 0,00 2 MT (môi trường sau xử lí) 0,001 0,51 ± 0,04 60,34 ± 2,84 3 C1 0,005 0,54 ± 0,03 8,66 ± 0,09 4 C2 0,009 0,63 ± 0,03 105,92 ± 0,09 5 C3 0,013 0,52 ± 0,03 96,34 ± 0,09 6 C4 0,017 0,48 ± 0,03 96,34 ± 0,09 7 C5 0,021 0,67 ± 0,03 58,94 ± 0,09 Ảnh hưởng sinh khối theo nồng độ ion Cu 2+ 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 MT 0.005 0.009 0.013 0.017 0.021 Nồng độ (g/l) SK Ảnh hưởng GOD theo nồng độ ion Cu 2+ 0 50 100 150 200 250 300 MT 0.005 0.009 0.013 0.017 0.021 Nồng độ (g/l) GOD 61 3.4. Ảnh hưởng của ion kẽm đến sinh tổng hợp GOD Ảnh hưởng của ion Zn2+ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp GOD của chủng 9.4 được khảo sát. Nồng độ ion Zn2+ gần như không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng 9.4 và sinh khối thu được thấp hơn so với mẫu đối chứng (MT1- không xử lí) (hình 5). Nồng độ ion Zn2+ có ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính enzim GOD của chủng 9.4. Kết quả thử nghiệm ở các nồng độ đều cho hoạt tính GOD thấp hơn rất nhiều so với mẫu đối chứng (MT1- không xử lí) (hình 6). Vì vậy, cần loại ion Zn2+ khỏi môi trường tổng hợp GOD. Hình 5. Ảnh hưởng của Zn2+ đến sinh khối của chủng 9.4 Hình 6. Ảnh hưởng của Zn2+ đến hoạt tính GOD của chủng 9.4 3.5. Ảnh hưởng của ion mangan đến sinh tổng hợp GOD Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ với các nồng độ khác nhau cho thấy: Nồng độ ion Mn2+ ảnh hưởng không đáng kể đến sự sinh trưởng của chủng 9.4. Trong khoảng nồng độ từ 0,01 - 0,04 g/l sinh khối tăng và tại nồng độ 0,05 g/l sinh khối giảm mạnh. Mẫu xử lí ion kim loại cho kết quả sinh khối thu được thấp hơn so với mẫu đối chứng (MT1- không xử lí) (hình 7). Kết quả thử nghiệm ở các nồng độ đều cho hoạt tính GOD thấp hơn so với mẫu đối chứng (MT1 - không xử lí) (hình 8). Vì vậy, không bổ sung ion Mn2+ vào môi trường tổng hợp GOD. Hình 7. Ảnh hưởng của Mn2+ đến sinh khối của chủng 9.4 Hình 8. Ảnh hưởng của Mn2+ đến hoạt tính GOD của chủng 9.4 3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của ion coban đến sinh tổng hợp GOD Ảnh hưởng sinh khối theo nồng độ ion Zn2+ 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 MT 0.005 0.007 0.009 0.011 0.013 Nồng độ (g/l) SK Ảnh hưởng GOD theo nồng độ ion Zn2+ 0 50 100 150 200 MT 0.005 0.007 0.009 0.011 0.013 Nồng độ (g/l) GOD Ảnh hưởng sinh khối theo nồng độ ion Mn 2+ 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 MT 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 Nồng độ (g/l) SK Ảnh hưởng GOD theo nồng độ ion Mn 2+ 0 50 100 150 200 MT 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 Nồng độ (g/l) GOD 62 Nghiên cứu ảnh hưởng của ion Co2+ tới sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim GOD của chủng 9.4 được khảo sát trên khỏang nồng độ từ 0.005 - 0.025 g/l. Kết quả cho thấy: Nồng độ ion Co2+ ảnh hưởng không đáng kể đến sự sinh trưởng của chủng 9.4 và sinh khối thu được thấp hơn so với mẫu đối chứng (MT1 - không xử lí). Sự có mặt của ion Co2+ làm tăng khả năng sinh enzim GOD của chủng 9.4 và kết quả thử nghiệm ở khỏang nồng độ từ 0,005 - 0,025 g/l đều cho hoạt tính GOD cao hơn so với mẫu đối chứng (MT1 - không xử lí) và cao gấp 3 lần so với mẫu trắng. Hình 9. Ảnh hưởng của Co2+ đến sinh khối của chủng 9.4 Hình 10. Ảnh hưởng của Co2+ đến hoạt tính GOD của chủng 9.4 3.7. Tối ưu hóa thành phần các ion kim loại Từ những kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng các ion kim lọai đến quá trình sinh trượng và sinh enzyme GOD của chủng 9.4, ion Fe2+ và ion Co2+ được bổ sung vào MT1 như là những thành phần vi lượng, làm gia tăng hoạt tính GOD. Theo kết quả tính toán, hoạt tính GOD được cho là tối ưu ở nồng độ ion Fe2+ = 0,015 g/l và Co2+ = 0,013 g/l. Nghiên cứu này nhằm xác định nồng độ tổ hợp ion Fe2+ và Co2+ trong môi trường lên men MT1 để có GOD cao nhất. Thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp: "Đường leo dốc" (Box Wilson) là phương pháp bố trí thí nghiệm nhiều yếu tố trong đó cho phép phân tích hồi quy bằng biến số mã hóa và thực hiện các loạt thí nghiệm theo phương pháp “tìm kiếm leo dốc” để tìm cực trị của hàm mục tiêu. Bước 1. Chọn các mức của biến số mã hóa, dựa vào kết quả phân tích ảnh hưởng của Fe2+ và Co2+ Bảng 5. Các mức quy hoạch 22 và kết quả GOD MT Biến số thực Biến số mã hóa Y (GOD) Fe2+ Co2+ X0 X1 X2 Lần 1 Lần 2 Lần 3 YTB 1 0,012 0,008 1 -1 -1 313,24 314,50 319,72 315,82 2 0,022 0,008 1 1 -1 364,11 378,10 397,36 379,86 3 0,012 0,018 1 -1 1 452,04 453,33 451,08 452,15 4 0,022 0,018 1 1 1 285,35 326,04 312,58 307,99 5 0,015 0,013 1 0 0 436,78 452,28 431,3 440,12 6 0,015 0,013 1 0 0 437,89 423,29 422,37 427,85 7 0,015 0,013 1 0 0 434,82 450,32 419,34 434,83 Ảnh hưởng sinh khối theo nồng độ ion Co 2+ 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 MT 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Nồng độ (g/l) SK Ảnh hưởng GOD theo nồng độ ion Co 2+ 0 50 100 150 200 250 300 MT 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Nồng độ (g/l) GOD 63 Hiện tại hoạt tính GOD được cho là tối ưu ở nồng độ ion: Fe2+ = X1 = 0,015; Delta = 0,005 g/l Co2+ = X2 = 0,013; Delta = 0,005 g/l. Tại mỗi mức thử nghiệm, tiến hành thí nghiệm 3 lần. Bước 2. Tính phương trình hồi quy tuyến tính, lập bảng ma trận X0 X1 X2 Ma trận đảo Y1 Y2 Y3 YTB X0 7 0 0 1/7 0 0 2724,23 2797,86 2753,75 2758,61 X1 0 4 0 0 1/4 0 -115,82 -63,69 -60,86 -80,12 X2 0 0 4 0 0 1/4 60,04 86,77 46,58 64,46 Ta có phương trình hồi quy: Y = bo + b1*X1 + b2*X2 có các hệ số và độ lệch chuẩn như sau Hệ số Độ lệch chuẩn bo = 394,088 Sbo = 4,856 b1 = - 20,031 Sb1 = 6,424 b2 = 16,116 Sb2 = 6,424 Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) một yếu tố để xem xét bo; b1; b2 có ý nghĩa không. Kết quả cho thấy phương trình bậc nhất đã phù hợp. Bước 3: Xác định hướng leo dốc Đường leo dốc là đường thẳng góc với đường đồng mức của phương trình: Y = 394,088 - 20,031*X1 + 16,116*X2. Phương trình có nghĩa: Thay đổi -20,03 đơn vị nồng độ ion Fe2+ (g/l) đồng thời với thay đổi +16,12 đơn vị nồng độ ion Co2+ (g/l). Hoặc thay đổi giảm 1,24 đơn vị nồng độ ion Fe2+ (g/l) đồng thời với thay đổi tăng 1,00 đơn vị nồng độ ion Co2+ (g/l). Thí nghiệm leo dốc Tiếp tục thực hiện các mức thí nghiệm mới. Kết quả thí nghiệm lần 8 cho kết quả GOD cao hơn điểm giữa. Đến lần 9, kết quả GOD giảm. Như vậy, thí nghiệm 8 cho kết quả cao nhất, Y(GOD) nằm đâu đó xung quanh điểm này. Lần Biến mã hóa Biến thực Kết quả X1 X2 Fe2+ Co2+ Y(GOD) 5, 6, 7 Điểm giữa 0 0 0,015 0,013 434,27 8 Các điểm trên đường leo dốc -1,24 1,00 0,011 0,018 567,83 9 -2,49 2,00 0,005 0,023 181,14 64 Thí nghiệm tiếp Quy hoạch thử nghiệm mới, với điểm giữa là điểm 8 ở thí nghiệm trên. Biến số mã hóa: Fe2+ = X1 = 0,011 Delta = 0,001 g/l Co2+ = X2 = 0,018 Delta = 0,001 g/l Các mức quy hoạch 22 và kết quả GOD. Phân tích hồi quy cho các lần thí nghiệm này: Lập bảng ma trận X 0 X 1 X 2 Ma trận đảo Y X 0 7 0 0 1 /7 0 0 3635 ,34 X 1 0 4 0 0 1 /4 0 - 176,58 X 2 0 0 4 0 0 1/ 4 186, 52 Ta có phương trình hồi quy: Y = bo + b1*X1 + b2*X2 có các hệ số và độ lệch chuẩn như sau : Hệ số Độ lệch chuẩn bo = 519,334 Sbo = 8,938 b1 = - 44,145 Sb1 = 11,824 b2 = 46,630 Sb2 = 11,824 Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) một yếu tố để xem xét bo; b1; b2 có ý nghĩa không. Kết quả cho thấy phương trình bậc nhất đã phù hợp. Đường leo dốc là đường thẳng góc với đường đồng mức của phương trình: Y = 519,334 – 44,145*X1 + 46,630*X2. MT Biến số thực Biến số mã hóa Y (GOD) Fe2+ Co2+ X0 X1 X2 10 0,010 0,017 1 -1 -1 492,47 11 0,012 0,017 1 1 -1 427,86 12 0,010 0,019 1 -1 1 609,41 13 0,012 0,019 1 1 1 497,44 14 0,011 0,018 1 0 0 546,83 15 0,011 0,018 1 0 0 526,52 16 0,011 0,018 1 0 0 534,81 65 Từ phương trình trên, có nghĩa thay đổi - 44,15 đơn vị nồng độ ion Fe2+ (g/l) đồng thời với thay đổi + 46,63 đơn vị nồng độ ion Co2+ (g/l). Hoặc thay đổi giảm 0,95 đơn vị nồng độ ion Fe2+ (g/l) đồng thời với thay đổi tăng 1,00 đơn vị nồng độ ion Co2+ (g/l). Như vậy, trong hàng loạt thí nghiệm trên, tại mức nồng độ Fe2+ = 0,010 g/l và Co2+ = 0,019 g/l có khả năng cho hoạt tính GOD cao nhất. Dừng leo dốc, thí nghiệm kiểm chứng Bảng 6. Kết quả kiểm chứng với nồng độ ion Fe và Co tối ưu Thử nghiệm kiểm chứng cho kết quả GOD cao và ổn định. MT1 bổ sung ion Fe2+ và Co2+ với hàm lượng ion Fe2+ 0,010 g/l và Co2+ 0,019 g/l, tương ứng FeSO4.7H2O = 0,027 g/l và CoCl2.6H2O = 0,042 g/l, có môi trường sinh tổng hợp GOD mới (môi trường MT2) như sau (g/l): Glucoza 100; KH2PO4 0,35; Ure 0,55; MgSO4.7H2O 0,15; FeSO4.7H2O 0,027; CoCl2 0,042; CaCO3 3,0; Nước cất 1lít; pH 6,2. 4. KẾT LUẬN Các ion kim loại có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng hợp enzim GOD của chủng A. niger 9.4. Ion Zn2+ mặc dù cho sinh khối cao nhất nhưng hoạt độ GOD lại rất thấp. Các ion Fe2+ và Co2+ ảnh hưởng tích cực đến sinh tổng hợp GOD. Việc bổ sung đồng thời hai ion Fe2+ và Co2+ với hàm lượng: FeSO4 (0,027 g/l), CoCl2 (0,042 g/l) vào môi trường lên men cho hoạt tính GOD cao hơn hẳn so với các mẫu bổ sung đơn lẻ từng ion (hoạt độ GOD chỉ đạt cao nhất là 290,77 U/g đối với Fe2+ và 278,4 U/g đối với Co2+). Bằng phương pháp quy hoạch toán học thực nghiệm Box Wilson đã tìm được thành phần ion kim loại tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp GOD của chủng A. niger 9.4 là FeSO4 0.027 g/l và CoCl2 0.042 g/l, hoạt tính enzim GOD đạt 612.42 U/g sinh khối. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hatzinikolaou D. G. and Macris B. J. - Factors regulating production of glucose oxidase by Aspergillus niger, Enzyme and Microbiology Technology (1995) 530-534 2. Lu T., Peng X., Yang H, and Ji L. - The production of glucose oxidase using the waste myceliums of A. niger and the effect of metal ion on the activity of glucose oxidase, Enzyme Microb. Technology 19 (1996) 339-342. 3. Liu J. Z., Yang H. Y.. Weng L. P, and Ji L. N. - Synthesis of glucose oxidase and catalase by Aspergillus. niger in resting cell culture system, Letter in Applied Microbiology 29 (5) (1999) 337-341. TT Nồng độ Fe2+ Nồng độ Co2+ Hoạt tính GOD (U/g SK) 1 0,010 0,019 597,68 2 0,010 0,019 612,42 3 0,010 0,019 600,73 66 4. Liu J. Z., Huang Y. Y., Liu J., Wenng L. P., and Ji L. N. - Effects of metal ions on simultaneous production of glucose oxidase and catalase by Aspergillus niger, Letters in Applied Microbiology 32 (2001) 16-19, 5. Pickering G. J. - The production of reduced alcohol wine using glucose oxidase. PhD. Thesis, Lincoln University, New Zealand, 1997. 6. Kristensen S. R. - Mechanisms of cell damage and enzyme release, Department of Clinical Chemistry, Odense University Hospital. 41 (4) (1994) 423-33. 7. Pickering G. J. - The use of enzymes to stabilise colour and flavour in wine, Australian Grapegrower & Winemaker, 1998, 417 p. 8. Pickering G. J. - The use of glucose oxidase in winemaking. Proceeding of the 1st EILOenology and Viticulture Seminar Series, Eastern. Eastern Institute of technology. New Zealand G. J. Pickering (ed). Campus Press, New Zealand, 2000, pp. 11-21. SUMMARY EFFECT OF SOME CATIONS ON THE GLUCOSE OXYDASE BIOSYNTHESIS OF Aspergillus niger 9.4 The glucose oxydase enzyme (GOx) (EC 1.1.3.4) binds to beta-D-glucopyranose (a hemiacetal form of the six-cacbon sugar glucose) and aids in breaking the sugar down into its metabolites. GOx is a dimeric protein that catalyzes the oxidation of beta-D-glucose into D- glucono – 1,5- lactone (which then hydrolyzes to gluconic acid) using molecular oxygen and releasing hydrogen peroxide. GOx can be used in the removal of either glucose or oxygen from foodstuffs in order to improve their storage capability. GOx can be biosynthesed by fungi Aspergillus niger and Penicillium. The effect of various cations, such as Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ and Co2+ on the simultaneous production of glucose oxidase and catalase by Aspergillus niger 9.4 were investigated. Among the five cations, Zn2+ caused negative effect on GOx biosynthesis, two ions Fe2+ and Co2+ had positive influences on GOx biosynthetic process. The mutual influences between Fe2+ and Co2+ on GOx synthesis were also studied according to applied mathematic plan of Box –Wilson. In the medium, which was added FeSO4 (0.027 g/l) and CoCl2 (0.042 g/l) GOD enzyme activity (612.42 U/gr of biomass) was much higher than the sample with individual ion Fe2+ or Co2+ (maximum of GOD enzyme activity reached 290.77U/gr and 278.4 U/g). Địa chỉ: Nhận bài ngày 12 tháng 6 năm 2009 Viện Công nghệ Thực phẩm, 301 Thanh Xuân, Hà Nội.