Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa bụp giấm (Hibiscus Sabdariffa L. Malvaceae) trên chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan bằng Acetaminophen

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 80 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA BỘT SẤY PHUN TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM (HIBISCUS SABDARIFFA L. MALVACEAE) TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY TỔN THƯƠNG TẾ BÀO GAN BẰNG ACETAMINOPHEN Lê Thị Lan Phương*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mở đầu: Sử dụng các thuốc tân dược như acetaminophen (Paracetamol) hay thuốc điều hòa rối loạn lipid máu (statin, fibrat) trong thời gian dài có thể dẫn đến tình trạng suy giảm chức năng gan, viêm gan. Do đó, việc nghiên cứu các thuốc mới có nguồn gốc từ thiên nhiên với ít tác dụng phụ hơn và có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ gan đang trở thành vấn đề cấp thiết. Trong khi đó, một số công trình trên thế giới đã chứng minh Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) có tác dụng bảo vệ gan trên thực nghiệm. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về tác dụng này của Bụp giấm. Mục tiêu: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (BSP) trên chuột nhắt trắng tổn thương tế bào gan bằng acetaminophen. Phương pháp: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của BSP với liều 450 mg/kg (1/20 Dmax) và 900 mg/kg (1/10 Dmax) trên mô hình gây tổn thương gan bằng acetaminophen 200 mg, đường uống, trong 14 ngày. Thuốc đối chiếu là silymarin, liều 50 mg/kg. Định lượng AST, ALT trong máu và sinh thiết gan chuột cuối thử nghiệm. Kết quả: Liều 450 mg BSP/kg làm giảm men gan ALT 30 % (p < 0,001) và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan. Liều 900 BSP mg/kg làm giảm men gan AST 40 % (p < 0,001), ALT 52% (p < 0,001) và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan. Kết luận: BSP thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan bằng acetaminophen. Tác dụng này phụ thuộc liều sử dụng. Từ khóa: Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, acetaminophen, silymarin. ABSTRACT EVALUATING THE PROTECTIVE EFFECT OF HIBISCUS (HIBISCUS SABDARIFA L. MALVACEAE) CALYCES DRY POWDER ON ACETAMINOPHEN-INDUCED HEPATOTOXICITY IN MICE Le Thi Lan Phuong, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 80 - 84 Background and aimed: Using these drugs for a long time such as acetaminophen or hypolipidemic drugs (statins, fibrats) can reduce the function of liver. So, it is very necessary to find new drugs from herbal medicines which can protect liver and less adverse effects than the others. There are some researchs proving that Hibiscus (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) can protect the function of liver in vivo, however, none research carries about its effect in Viet Nam. The present study was designed to evaluate the protective effect of dry powder from Hibiscus’s calyce on acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Method: Study the hepatoprotective effect of BSP 450 mg/kg (1/20 Dmax) and 900 mg/kg (1/10 Dmax) in ∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.DS. Lê Thị Lan Phương ĐT: 0907748591 Email: lanphuongd04@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 81 hepatotoxicity mice induced by acetaminophen (p.o., 14 days). The control group used silymarin 50 mg/kg. Quantify level of AST, ALT and examine liver histopathology of mice. Results: The dose of 450 mg BSP/kg (1/20 Dmax) showed significant reduction in ALT level by 30% (p < 0.001) and also reduced levels of inflammation and hepatocellular necrosis. The dose of 900 mg BSP/kg (1/10 Dmax) reduced in AST level by 40% (p < 0.001), ALT level by 52% (p < 0.001) and also reduced levels of inflammation and hepatocellular necrosis. Conclusion: The results indicate that BSP exhibit the protective effect in liver of acetaminophen-induced hepatotoxicity mice at doses investigated. Key words: Hyperlipidemic, Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, acetaminophen, silymarin. MỞ ĐẦU Bụp giấm, tên khoa học là Hibiscus sabdarifa L. Malvaceae, là một loài cây nhiệt đới có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau và đã được trồng thành công ở Bình Thuận, Việt Nam với quy mô rộng và đạt tiêu chuẩn VietGAP. Đây không chỉ là nguồn nguyên liệu quý giá cho việc sản xuất chế phẩm mà còn là một phương cách xóa đói giảm nghèo cho nông dân vùng đất khô hạn này. Bụp giấm chứa anthocyanin có tác dụng chống oxy hóa rất tốt, ngoài ra còn có alkaloid, chất đường, chất khoáng, acid hữu cơ,... Bộ phận thường sử dụng là đài hoa, lá và đôi khi là quả (4). Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến Bụp giấm như: Tác dụng giảm lipid máu của các polyphenol thông qua sự ức chế quá trình tạo mỡ và thúc đẩy sự thanh thải lipid ở gan, giảm độc tính của acetaminophen trên gan (giảm số tế bào chết và sự oxy hóa tế bào), hạ huyết áp,... (1,3,8). Tuy nhiên, ở Việt Nam công trình nghiên cứu về tác dụng của Bụp giấm còn rất ít, chủ yếu là một số nghiên cứu về công dụng của Bụp giấm trong thực phẩm như dùng làm chất màu hoặc lên men làm nước giải khát, rượu vang... Từ nguồn nguyên liệu đài hoa Bụp giấm, Trung tâm nghiên cứu và phát triển dược liệu miền Trung đã nghiên cứu xây dựng quy trình và sản xuất dạng bột sấy phun với hàm lượng anthocyanin toàn phần chiếm 0,215%. Dạng chế phẩm này đã được chứng minh về tác dụng hạ lipid máu trên chuột nhắt trắng ở liều 0,45 g/kg và 0,9 g/kg(2)cho thấy khả năng điều trị hoặc kết hợp với các thuốc hóa dược khác để điều trị bệnh lý rối loạn lipid máu. Bên cạnh đó, một số các thuốc hóa dược hiện nay như niacin hay nhóm fibrat ngoài những tác dụng phụ trên đường tiêu hóa còn có thể gây nguy cơ viêm gan, suy chức năng gan. Với mong muốn góp phần nghiên cứu một chế phẩm điều hòa lipid máu đồng thời có tác dụng bảo vệ gan để có thể sử dụng phối hợp điều trị hoặc làm giảm các tác dụng không mong muốn trên gan khi sử dụng dài ngày các thuốc tân dược điều trị rối loạn lipid máu (6), chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt gây tổn thương gan bằng aetaminophen (paracetamol). PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu Bột sấy phun (BSP) từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) do Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu Miền trung cung cấp, chứa 0,215% anthocyanin toàn phần, độ ẩm < 5%, có màu đỏ nâu, đạt yêu cầu về độ mịn, độ nhiễm khuẩn, kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật. Quy trình sản xuất bột sấy phun: Đài hoa Bụp giấm 50 kg ngâm trong 200 lít nước (đạt tiêu chuẩn nước uống) ở 80oC trong 60 phút, rút dịch chiết 1. Thêm 100 lít nước ở 80oC trong 60 phút, rút dịch chiết 2. Trộn đều dịch chiết 1 và 2, lọc qua vải thu được 215 lít dịch chiết 3, trộn dịch chiết 3 với maltoz-dextrin từ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 82 10-13%, sấy phun, thu được bột sấy phun (BSP) với độ ẩm < 5%. Phương tiện Hóa chất: Acetaminophen (efferalgan 500 mg), Silymarin 10g - Sigma. Thuốc thử định lượng AST, ALT máu: Maxmat (Pháp), Mindray (Trung Quốc). Thiết bị dụng cụ: Máy sinh hóa tự động Biolis 24i. Súc vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng phái đực, trưởng thành (5 – 6 tuần tuổi), chủng Swiss abino, nặng 18 – 22 g được cung cấp bởi viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh. Chuột được nuôi ở nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối, mỗi lồng 6 – 8 chuột, sử dụng thức ăn là cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp, carbohydrat và vitamin trong suốt thử nghiệm. Phương pháp nghiên cứu (5) Chuột được nuôi ổn định 01 tuần và xét nghiệm AST, ALT ban đầu trước khi tiến hành thử nghiệm. Chuột được chia làm 5 lô (n = 10). Lô 1 (chứng): Uống nước cất Lô 2 (bệnh): Uống acetaminophen 200 mg/kg + nước cất Lô 3 (chứng dương): Uống acetaminophen 200 mg/kg + silymarin 50 mg/kg Lô 4 (thử 1): Uống acetaminophen 200 mg/kg + BSP 450 mg/kg Lô 5 (thử 2): Uống acetaminophen 200 mg/kg + BSP 900 mg/kg Chuột thử nghiệm được cho uống acetaminophen vào 8 – 9 giờ sáng, silymarin, BSP và nước cất vào 3 – 4 giờ chiều với thể tích 0,1 ml/10g trong vòng 14 ngày. Ngày thứ 15, gây mê, mổ chuột lấy máu tim thực hiện các xét nghiệm định lượng AST, ALT và phẫu thuật lấy gan bảo quản trong dung dịch formalin 10%. Sau khi xử lý bằng các phương pháp thường quy, đúc tiêu bản bằng paraffin, cắt những lát gan dày 4µm và nhuộm trong hematoxylin eosin. Quan sát trên kính hiển vi.(8) Phương pháp thống kê – xử lý dữ liệu Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Phân tích số liệu bằng phép kiểm t-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Minitab 15.0. KẾT QUẢ Tác dụng của BSP trên chuột nhắt gây tổn thương gan cấp tính bằng acetaminophen Trước thử nghiệm: Giá trị AST, ALT của các chuột khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm. Sau thử nghiệm: Ở lô gây độc bằng acetaminophen, các chỉ số AST và ALT tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) so với lô chứng uống nước cất, đồng thời kết quả sinh thiết gan cho thấy có sự tổn thương gan, hoại tử ở mức độ nhẹ và có biểu hiện của phản ứng viêm trong tế bào. Nhóm uống silymarin có giá trị AST giảm (p < 0,001), ALT (p < 0,01). Nhóm uống BSP với liều 450 mg/kg có giá trị ALT giảm (p < 0,001) so với nhóm gây độc. Nhóm uống BSP liều 900 mg/kg có giá trị AST giảm (p < 0,001) và ALT giảm (p < 0,001) so với nhóm gây độc. Sinh thiết gan cho thấy mức độ giảm tổn thương gan ở cả nhóm uống silymarin, nhóm uống BSP 450 mg/kg và nhóm uống BSP 900 mg/kg. Bảng 1. Kết quả định lượng AST, ALT của các nhóm thử nghiệm (n = 10) Lô chuột AST (U/L) ALT (U/L) Chứng (nước cất) 111,6 ± 25,91 52,6 ± 18,57 Bệnh (aceta) 210,4 ± 42,89*** 99,5 ± 15,52*** Silymarin 50 mg/kg (Sily + aceta) 113,9 ± 24,96### 67,4 ± 21,81## BSP 450 mg/kg (BG1 + aceta) 182,1 ± 25,15*** 69,2 ± 13,62*### BSP 900 mg/kg (BG2 + aceta) 126,9 ± 43,67### 48 ± 11,06### Ghi chú: P * < 0,05, *** < 0,001 so với nhóm chứng; P ## < 0,01, ### < 0,001 so với nhóm gây độc. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 83 Bảng 2. Kết quả vi phẫu gan của các nhóm thử nghiệm (mức độ tăng của các nhóm so với nhóm chứng uống nước cất). Tế bào gan thoái hóa mỡ TB gan hoại tử Xâm nhập TB viêm đơn nhân Xâm nhập TB viêm đa nhân Viêm khoảng cửa Tăng sinh tái tạo TB gan Độc Tăng 5% loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy, 5% loại không bào lớn trong tiểu thùy và quanh TMTT tiểu thùy + 0 + + 0 Silymarin Tăng 0,2 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy 0 0 0 0 0 BG1 Tăng 2 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy 0 0 0 0 0 BG2 Tăng 5 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy 0 0 0 0 0 Kết quả được đọc bởi Khoa Giải Phẫu Bệnh – Bệnh viện Chợ Rẫy TP. Hồ Chí Minh TMTT: Tĩnh mạch trung tâm; TB: Tế bào; BG1: Lô điều trị bằng bột sấy phun liều 450 mg/kg; BG2: Lô điều trị bằng bột sấy phun liều 900 mg/kg. Hình 1. Giá trị men gan AST của các nhóm thử nghiệm. P *** < 0,001: so với nhóm chứng; ### < 0,001 so với nhóm gây độc. Hình 2. Giá trị men gan ALT của các nhóm thử nghiệm. P * < 0,05, *** < 0,001: so với nhóm chứng; ## < 0,01, ### < 0,001: so với nhóm gây độc. KẾT LUẬN Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan bằng acetaminophen 200 mg/kg trong 14 ngày. Liều 450 mg/kg bột sấy phun làm giảm men gan ALT 30% (p < 0,001) và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan. Liều 900 mg/kg bột sấy phun làm giảm men gan AST 40 % (p < 0,001), ALT 52% (p < 0,001) và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan. Nghiên cứu được công bố năm 2009 của tác giả Liang-Chih Liu và cộng sự cho thấy tác dụng làm giảm số tế bào chết ở gan của dịch chiết nước đài hoa Bụp giấm liều 200 mg/kg, 400 mg/kg và 600 mg/kg trên chuột nhắt đực BALB/c gây độc cấp tính bằng acetaminophen 1000 mg/kg(3). Như vậy, kết quả nghiên cứu đã thể hiện sự tương đồng về tác dụng bảo vệ gan của đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan bằng acetaminophen, tuy nhiên, có sự khác biệt giữa hai nghiên cứu về phương pháp chiết xuất, liều lượng, mô hình gây độc cũng như giống chuột thử nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hainida E et al. (2008). Effects of defatted dried roselle (Hibiscus sabdariffa L.) seed powder on lipid profiles of hypercholesterolemia rats. Journal of the Science of Food and Agriculture, 88, pp. 1043-1050. 2. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2013). Đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 84 (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) trên chuột nhắt. Tạp chí Y Học TP. HCM, 17 (1), tr. 369 – 374. 3. Liu LC et al. (2009). Aqueous extract of Hibiscus sabdariffa L. decelerates acetaminophen-induced acute damage by reducing cell death and oxidave stress in mouse experimental models. JSci Food Agric, 90, pp. 329-337. 4. Mady C et al. (2009). Le bissap (Hibiscus sabdariffa L.): composition et principales utilisations. Fruits, vol.64, pp. 179-193. 5. Nguyễn Lê Việt Hùng, Nguyễn Phương Dung, Trần Công Luận (2013). Đánh giá tác dụng hạ men gan của cao chiết nước Tiểu sài hồ thang trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol. Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh, 17(1), tr. 374-379. 6. Trần Thị Thu Hằng (2009). Dược lực học. Nhà xuất bản Phương Đông, tr. 569-583. 7. Tuñón MJ, Alvarez M, Culebras JM, et al (2009). "An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure". World J Gastroenterol, 15(25), pp. 3086-3098. 8. Wahabi HA et al. (2010). The effectiveness of Hibiscus sabdariffa in the treatment of hypertension: Asystematic review. Phytomedicine, 17, pp. 83-86. Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 08/10/2013, 14/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014