Đề tài Chế tạo máy PCR

yên tử tạp chất này chiếm chỗ một trong những nút của mạng tinh thể thì cơ chế dẫn điện sẽ thay đổi. Nguyên tử tạp chất (chẳng hạn như Phosphore), vỏ ngoài cùng có 5 điện tử; trong đó 4 điện tử tham gia liên kết hóa trị với các nguyên tử lân cận, điện tử thứ năm liên kết yếu hơn với hạt nhân và các nguyên tử xung quanh. cho nên, chỉ cần cung cấp một năng lượng nhỏ (nhờ nhiệt độ, ánh sáng …), điện tử này sẽ thoát khỏi trạng thái ràng buộc, trở thành hạt dẫn tự do. Nguyên tử tạp chất khi đó bị ion hóa và trở thành một ion dương. Nếu có điện trường đặt vào, các hạt dẫn tự do trên sẽ chuyển động có hướng, tạo nên dòng điện. Như vậy tạp chất nhóm 5 cung cấp điện tử cho bán dẫn ban đầu nên được gọi là tạp chất cho. Chất bán dẫn có pha tạp chất cho gọi là bán dẫn loại N. Trường hợp tạp chất pha vào thuộc nhóm 3 của bảng tuần hoàn các nguyên tố, do lớp vỏ ngoài cùng của nguyên tử tạp chất chỉ có 3 điện tử khi tham gia vào mạng tinh thể của chất cơ bản chỉ tạo nên 3 mối liên kết hoàn chỉnh, còn mối liên kết thứ tư bị bỏ hở. Khi có kích thích nhỏ là một trong những điện tử của các mối liên kết hoàn chỉnh bên cạnh sẽ đến thế vào liên kết bỏ hở nói trên. Nguyên tử tạp chất lúc đó sẽ trở thành một ion âm. Tại mối liên kết mà điện tử vừa đi khỏi sẽ dư ra một điện tích dương, nghĩa là xuất hiện một lỗ trống. Nếu có điện trường đặt vào, các lỗ trống này sẽ tham gia dẫn điện. Như vậy, tạp chất nhóm 3 tiếp nhận điện tử từ chất cơ bản để làm sản sinh các lỗ trống nên được gọi là tạp chất nhận. Chất bán dẫn có pha tạp chất nhóm 3 như trên gọi là bán dẫn loại P. Như vậy, tùy theo tạp chất pha vào thuộc nhóm 3 hay nhóm 5 (xét với Si hoặc Ge) mà chất bán dẫn thuần trở thành bán dẫn P hay N. Hạt dẫn đa số tương ứng là lỗ trống hoặc điện tử. Ở trạng thái cân bằng, mỗi chất bán dẫn đều trung hòa điện, nghĩa là tổng 9 điện tích dương bằng tổng điện tích âm trong thể tích (Dương Vũ Văn, 2002, trang 43). p-type n-type Si 100%, 0 0 K Hình 2.5 Điện tích và lỗ trống của bán dẫn 2.7. Sensor nhiệt Để đo nhiệt độ ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau, dùng sensor nhiệt là thích hợp nhất trong điều khiển, chúng có nhiều loại khác nhau. Để đo được nhiệt độ chính xác cao và gia tốc biến thiên nhiệt nhanh, hai loại sensor nhiệt là „cặp nhiệt điện‟ và „điện trở palatin‟ đáp ứng tốt. 2.7.1. Nhiệt điện trở Platin Platin là vật liệu cho nhiệt điện trở được dùng rộng rãi với dải đo nhiệt từ -200 đến 850 oC. Nhiệt điện trở platin có nhiều loại: Pt – 100 là trị số điện trở ở định mức 0oC là 100Ω, Pt – 500, Pt – 1000. Các loại Pt – 500, Pt – 1000 có hệ số nhiệt độ lớn hơn. Do đó, độ nhạy lớn hơn (điện trở thay đổi mạnh theo nhiệt độ). Với Pt – 1000, sự thay đổi nhiệt khoảng chừng 4 Ω/0K. Các tính chất của nhiệt điện trở này được qui định theo tiêu chuẩn quốc tế DIN IEC 751. Theo tiêu chuẩn này, dải đo nhiệt độ của điện trở platin từ -200 đến 850 oC. Cho dải đo đầu tiên từ -200 đến 0 oC ta có đa thức cấp ba: R(t) = R0 (1 + At + Bt 2 + C[t-100 o C ].t 3 ) (2.2) Cho dải đo từ 0 đến 850oC ta có đa thức cấp hai: R(t) = R0 (1 + At + Bt 2 ) (2.3) Các hệ số có giá trị như sau: A = 3,90802 . 10 -3 0 C -1 B = -5,802 . 10 -7 0 C -2 C = -4,2735 . 10 -12 0 C -3 10 Pt 100 R0 là trị số điện trở định mức ở 0 o C. Ngoài ra, theo tiêu chuẩn IEC 751 còn xác định một trị số đặc trưng nữa, đó là hệ số nhiệt độ trung bình giữa 0 và 100oC. Đó là tỉ lệ giữa sự thay đổi điện trở ở 0 và 100 oC với điện trở định mức R0. α = (R100 – R0)/R0dt = 3,850.10 -3 0 C -1 (2.4) Trị số α của nhiệt điện trở platin theo DIN có sự khác biệt với trị số này. Theo tiêu chuẩn DIN, vật liệu platin dùng làm nhiệt điện trở có pha tạp. Do đó khi bị các tạp chất khác thẩm thấu trong quá trình sử dụng sự thay đổi trị số điện của nó ít hơn so với platin ròng nhờ thế nó tự ổn định lâu dài theo thời gian. Hình 2.6 Đặc tuyến điện trở Pt100 2.7.1.1. Cách tính nhiệt độ theo điện trở Trong khoảng nhiệt độ trên 0oC nhiệt độ được tính theo sự thay đổi điện trở platin theo DIN IEC 751 như sau: t = -R0.A + [(R0.A) 2 – 4R0.B(R0 - R)] 1/2 (2.5) R = điện trở đo được theo Ohm t = nhiệt độ được tính theo oC R0, A, B = thông số theo DIN IEC 751 400 350 300 250 200 150 100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Nhiệt độ (0C) Đ iệ n t rở ( Ω ) 11 2.7.1.2. Sai số cho phép Khi tính đến sai số, tiêu chuẩn DIN IEC 751 phân biệt hai đẳng cấp: A và B. Đẳng cấp A có giá trị cho nhiệt độ từ -200 đến 650oC cho các máy đo nhiệt độ dùng 3 hay 4 dây đo. Đẳng cấp B có giá trị cho toàn thang từ -200 đến 850oC. Đẳng cấp A: t = ± (0.15 + 0.002 . t) Đẳng cấp B: t = ± (0.30 + 0.005 . t) t = nhiệt độ với oC (không có dấu ±) Ngoài ra, còn nhiều đẳng cấp khác cho đo đạc chính xác hơn hay không chính xác lắm, rẻ tiền ta còn có các đẳng cấp: B 1/3 DIN, B ½ DIN, B2 DIN, B5 DIN. 2.7.1.3. Cấu trúc của cảm biến nhiệt platin  Nhiệt điện trở với vỏ gốm: Sợi platine được giữ chặt bên trong ống gốm sứ với bột nhôm oxit. Dải đo từ 200 oC đến 800oC  Nhiệt điện trở với vỏ thuỷ tinh: Loại này có độ bền cơ học và độ nhạy cao. Dải đo từ -200oC đến 400oC. Được dùng trong môi trường hóa chất có độ ăn mòn cao.  Nhiệt điện trở với vỏ nhựa: Giữa hai lớp polyamid dây platine có đường kính khoảng 30 μm được dán kín. Với cấu trúc mảng, cảm biến loại này được dùng để đo nhiệt độ bề mặt. Dải đo nhiệt độ từ -80oC đến 230oC.  Nhiệt điện trở với kỹ thuật màng mỏng: Trên một nền oxit nhôm, một lớp platin dày khoảng 1 μm được phủ lên bằng phương pháp phun ion hay bốc hơi chân không. Sau đó, với phương pháp quang khắc hay tia laser, lớp platin có hình một đường gấp khúc và được chuẩn hoá cũng bằng tia laser. Sau đó, lớp platin được phủ bởi một lớp thủy tinh. Dải đo nhiệt độ từ -50 đến 400oC. Các nhiệt điện trở với kỹ thuật màng mỏng đều có thời gian hồi áp rất bé (khoảng 1 giây) và quán tính nhiệt bé. Với kỹ thuật màng mỏng, nhiệt điện trở có sự ổn định lâu dài. 12 2.7.1.4. Kỹ thuật nối dây Nhiệt điện trở thay đổi điện trở theo nhiệt độ với một dòng điện không đổi đi qua điện trở ta có điện thế đo được U = I.R. Để cảm biến không bị nóng lên qua phép đo, dòng điện cần phải nhỏ khoảng 1mA (đối với Pt100) điện thế này cần được đưa đến máy đo qua dây đo, với sai số thấp nhất. Ta có 3 kỹ thuật nối dây đo: - Kỹ thuật 2 dây: Hình 2.7 Kỹ thuật nối 2 dây Với kỹ thuật nối 2 dây phép đo có sai số lớn do điện trở của dây dẫn và sự thay đổi của chúng theo nhiệt độ. - Kỹ thuật 3 dây: Hình 2.8 Kỹ thuật nối 3 dây Với cách nối này hai mạch đo được hình thành, một trong hai được dùng để làm mạch chuẩn. Với kỹ thuật 3 dây, sai số phép đo do nhiệt độ và điện trở dây dẫn không còn. Tuy nhiên 3 dây đo phải có cùng trị số kỹ thuật và cùng một nhiệt độ. - Kỹ thuật 4 dây: Hình2.9 Kỹ thuật nối 4 dây 13 Với kỹ thuật 4 dây, người ta đạt kết quả đo tốt nhất. Hai dây được dùng để cho một dòng điện không đổi đi qua, hai dây khác được dùng làm dây đo điện thế trên nhiệt điện trở (Dương Minh Trí,2001, trang 14 - 23). 2.7.2. Cặp nhiệt điện Những nguyên tắc hay lý thuyết về hiệu ứng nhiệt điện được xây dựng bởi nhiều nhà khoa học như Thomas Johann Seebeck (1821), Jean Charles Althanase Peltier (1843), William Thomson, Lord Kelvin … và trải qua một thời gian dài. Hiệu ứng Seebeck mô tả sự chuyển đổi năng lượng nhiệt sang năng lượng điện với sự xuất hiện một dòng điện. Do đó, việc đo nhiệt độ được chuyển thành đo điện. Trong thực tế, một cặp nhiệt điện là hai dây kim loại khác nhau được nối chung với nhau ở hai đầu. Do sự khác nhau giữa năng lượng liên kết của electron và các nguyên tử kim loại khác nhau, ta có một điện áp nhiệt. Điện áp nhiệt này có thể tạo nên một dòng điện khi hai đầu còn lại của kim loại được nối với nhau. Trong mạch điện khép kín này, ta có một dòng điện gây nên bởi hiệu ứng Seebeck. Do đầu nối thứ hai của cặp nhiệt điện một điện áp nhiệt cũng phát sinh. Nếu hai đầu có nhiệt độ giống nhau, dòng điện bằng 0. Như thế, một cặp nhiệt điện chỉ có thể cho ta một điện thế khi có sự chênh lệch về nhiệt độ. (Dương Minh trí, trang 61) 2.8. Cấu trúc và đặc tính của chip AT90S8535 Chip AT90S8535 của hãng ATMEL có những đặc điểm sau:  Điện áp nguồn nuôi: 4V- 6V.  Có 118 lệnh mạnh hầu hết được thực hiện trong 1 chu kỳ xung nhịp.  RAM flash 8 kbyte lập trình được trong hệ thống. Chịu được 100000 lần ghi/xóa.  Bộ nhớ EEPROM 512 byte. Chịu được 100000 lần ghi/xóa.  Bộ nhớ SRAM bên trong 512 byte.  Bộ biến đổi ADC 8 kênh, 10 bit.  32 đường vào/ra lập trình được.  32 thanh ghi đa năng.  Bộ định thời gian watchdog lập trình được với bộ dao động bên trong. 14 Hình 2.10 Sơ đồ chân của AT90S8535. Chức năng các chân:  VCC: điện áp nguồn nuôi  GND: đất  Cổng A (PA0 đến PA7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng A cung cấp các đường địa chỉ dữ liệu vào ra theo kiểu hợp kênh khi dùng bộ nhớ ở bên ngoài.  Ngoài ra cổng A còn thêm chức năng chuyển đổi từ dạng tỷ biến sang dạng số.  Cổng B (PB0 đến PB7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng B cung cấp các chức năng ứng với các tính năng đặc biệt của AT90S8535.  Cổng C (PC0 đến PC7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng C cung cấp các địa chỉ lối ra khi dùng bộ nhớ ở bên ngoài.  Cổng D (PD0 đến PD7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng D cung cấp các chức năng ứng với các tính năng đặc biệt của AT90S8535.  RESET: lối vào được đặt lại  XTAL1: lối vào bộ khuếch đại đảo và lối vào mạch tạo xung nhịp bên trong  XTAL2: lối vào bộ khuếch đại đảo  ICP: là chân vào cho chức năng bắt tính hiệu vào bộ định thời/đếm 1.  OC1B: là chân ra cho chức năng so sánh lối ra bộ định thời/đếm 1. 15  ALE: là chân tín hiệu cho phép chốt địa chỉ được dùng khi truy nhập bộ nhớ ngoài. (www.atmel.com) 2.9. Ngôn ngữ Bascom Ngôn ngữ Bascom được viết trên ngôn ngữ C++ của hãng Microsoft, có những ưu điểm vượt trội so với Assem, nó gần với ngôn ngữ người vì vậy dễ lập trình và kiểm soát lỗi, giúp cho chương trình viết đơn giản và dễ hiểu. Bascom còn có trợ giúp thêm chạy chương trình mô phỏng, trình biên dịch… 2.10. Mạch điện Mạch điện được thiết kế trên máy tính bởi phần mềm Orcad, mạch được thiết kế theo dạng board chức năng, mỗi board đảm nhận một chức năng riêng nên dễ kiểm tra, sửa chữa và nâng cấp. 2.11. Ứng dụng của PCR 2.11.1. PCR định lượng Việc áp dụng PCR số lượng luôn luôn đòi hỏi phải kèm theo một hồ sơ (protocol PCR) để giảm đến mức thấp nhất những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và kích hoạt. PCR phải duy trì trong 20 vòng để tạo kích hoạt mạch thẳng ( www.ykhoa.net). 2.11.2. PCR sản xuất đột biến (PCR mutagenesis) Có thể dùng kỹ thuật PCR để xóa đi hoặc cấy ghép một đột biến vào phân tử DNA mục tiêu. Kỹ thuật này giúp nghiên cứu cấu trúc chức năng tương lai trong các protein cuối cùng. Sự xóa đi có thể dùng primer nối với vòng cần phải xóa đi và tiến hành vị trí giới hạn trong quá trình tái tổ hợp với primer thứ hai. 2.11.3. PCR ứng dụng trong cloning tái tổ hợp (cloning of recombinant) Nếu trước đây, muốn đưa một đoạn gene vào plasmid để chuyển thể plasmid này vào một vi khuẩn thì công việc này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức. Trước hết là phải có một số lượng tế bào đích để từ đó người ta ly trích toàn bộ bộ gene 16 (genomic DNA). Sau đó, dùng nhiều loại enzyme cắt giới hạn để cắt bộ gene thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, điện di trên gel, dùng kỹ thuật Southern blotting và phát hiện đoạn gen muốn tìm bằng kỹ thuật lai với đoạn dò đặc hiệu. Từ kết quả đó, có thể định vị và trích được đoạn gen muốn tìm từ bản gel đã điện di để gắn vào plasmid rồi đưa vào vi khuẩn mang. Tuy nhiên, công việc như vậy cũng chưa đã hoàn tất, vì chưa chắc chúng ta đã gắn đúng đoạn gen mong muốn vào plasmid vì trên bản thạch chúng ta không thể chỉ lấy đúng đoạn gen đã định vị mà không lẫn các đoạn gene khác. Do vậy, phải chọn đúng vi khuẩn mang plasmid có gene mong muốn. Chúng ta gọi toàn bộ kỹ thuật này là clone tái tổ hợp, có khi phải thực hiện trong nhiều tháng, thậm chí nhiều năm, mà nhiều khi chưa chắc đã thành công. Ngày nay, các nhà nghiên cứu có thể dùng kỹ thuật PCR trong thí nghiệm này. Trước hết là từ một vài tế bào đích ban đầu (không cần phải có nhiều tế bào đích như kỹ thuật cũ), có thể sử dụng cặp mồi đặc hiệu để tổng hợp và khuếch đại đoạn gen muốn tìm thành hàng tỷ bản sao giống hệt nhau rồi đưa vào plasmid (không cần phải dùng một lượng lớn tế bào đích để ly trích được bộ gene và phân tích bằng restriction enzyme, rồi làm Southern blotting...). Lúc này plasmid mang đúng đoạn gen đích, không thể có lẫn lộn các đoạn gene khác. Vì vậy sau khi chuyển thể plasmid vào vi khuẩn mang, không cần phải làm kỹ thuật chọn dòng nữa. Như vậy, chúng ta thấy cũng cùng một mục đích, nhưng với PCR, công việc đã gọn lại rất nhiều ( www.ykhoa.net). 2.11.4. PCR nhân bản đoạn DNA mong muốn Với các kỹ thuật sinh học phân tử cổ điển, để có được một đoạn DNA mong muốn nào đó, nhà nghiên cứu phải có trong tay một số lượng lớn tế bào đích, để ly trích được bộ gene của tế bào. Sau đó từ bộ gene phức tạp này, ly trích đoạn DNA muốn tìm bằng hàng loạt các kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, tốn thời gian và công sức. Với kỹ thuật PCR, công việc được giải quyết một cách gọn gàng hơn nhiều. Chỉ cần một số lượng nhỏ bộ gene có trong mẫu thử, với một cặp mồi đặc hiệu, có thể tổng hợp và khuếch đại đoạn DNA đích trong bộ gen phức tạp thành hàng tỷ bản sao các đoạn DNA giống hệt nhau mà không cần phải làm động tác ly trích trở lại. Một trường hợp khác là nếu đoạn gen mong muốn đã nghiên cứu trước đó và đã được gắn vào một plasmid, chuyển thể vào một loại vi khuẩn mang. Nếu muốn có 17 đoạn gene để nghiên cứu thì phải xin tác giả của nó gởi cho mình vi khuẩn mang với plasmid có gắn đoạn gen trên. Tuy đơn giản hơn là phải ly trích ngay từ đầu đoạn gen trên, nhưng cũng tốn khá nhiều thời giờ chờ đợi. Với PCR thì công việc lại đơn giản hơn gấp nhiều lần. Chỉ cần có đoạn mồi cho gen mong muốn, rồi dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen này thành hàng tỷ bản copy giống hệt nhau. Có rất nhiều đoạn gen mong muốn, rất thuần khiết, để làm nghiên cứu mà không cần phải chờ đợi, phải xin phép tác giả,... Từ cấu trúc của protein với thứ tự các amino acid, có thể suy ra được cấu trúc của đoạn mồi cần tổng hợp để khuyếch đại được đoạn gene chịu trách nhiệm trong tổng hợp protein trên. Ngoài ra, nhờ kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transciptase PCR), có thể dễ dàng khuếch đại mRNA, nhờ vậy có thể nghiên cứu được sự biểu hiện gene mà không cần phải sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trước đây như ly trích mRNA từ một số lượng tế bào đích khá lớn rồi phát hiện nó bằng kỹ thuật Northern blotting. Phát hiện mRNA còn có một ứng dụng khác nữa là phát hiện xem vi sinh vật gây bệnh có kháng được với hóa trị liệu hay không, vì chỉ có vi khuẩn còn hoạt động mới tổng hợp được mRNA, nếu vi khuẩn đã chết thì khó phát hiện được mRNA vì cấu trúc này không bền dễ bị huỷ bởi các men RNase vốn dĩ rất bền và hiện diện sẵn trong môi trường ( www.ykhoa.net). 2.11.5. PCR dùng trong phát hiện các vi sinh vật gây bệnh Bằng cách khuếch đại đoạn nucleic acid đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm, thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cực cao mà không có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được. Sở dĩ được như vậy vì chỉ cần dưới 1 vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có hiện diện acid nucleic đích và được PCR khuếch đại. Trong các thử nghiệm huyết thanh hay miễn dịch học, chìa khoá chính của thử nghiệm là có được trong tay các kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu. Nếu không muốn mua sản phẩm thương mại, phải tự chế, đây là một công việc rất công phu và tốn thời gian. Trong khi đó với PCR, chìa khóa chính của thử nghiệm là vấn đề tìm cho được các đoạn mồi đặc hiệu. Nhờ có máy vi tính trợ giúp mà công việc này trở nên đơn giản: với một đĩa CD có đầy đủ các dữ liệu về thư viện DNA của các vi sinh vật 18 mà các nhà nghiên cứu trước đã nghiên cứu được và với một phần mềm chuyên dùng, có thể tự chọn những cặp mồi theo đúng trình tự đã chọn. Sau đó chỉ cần đặt hàng cho một hãng tổng hợp đoạn mồi theo đúng trình tự đã chọn. Sau khi tổng hợp, hãng sản xuất có thể gởi đến người sử dụng theo đường bưu điện mà không cần phải có điều kiện bảo quản chặt chẽ, vì các đoạn mồi sau khi tổng hợp xong, làm đông khô có thể giữ rất bền trong điều kiện bình thường. Công việc lúc này là thử nghiệm xem các đoạn mồi được chọn đặc hiệu như mong muốn hay không, nếu không thì lại chọn một cặp mồi khác. Do phản ứng PCR quá nhạy, nên khi áp dụng trong chẩn đoán, một vấn đề rất quan trọng cần phải lưu tâm, đó là hiện tượng dương tính giả, chủ yếu là do mẫu thử bị nhiễm bởi các sản phẩm PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm PCR thì các mảnh này sẽ được khuếch đại và mẫu cho kết quả dương tính nhưng là dương tính giả. Ðể có thể tránh được kết quả dương tính giả, PCR chẩn đoán phải được thực hiện trong một phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ, các giai đoạn thí nghiệm phải được thực hiện tại những khu vực riêng, với các đồ dùng thí nghiệm riêng, sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một lần (đầu pipette, ống nghiệm phản ứng, ống nghiệm chuẩn bị bệnh phẩm). Ngoài ra còn phải áp dụng nhiều biện pháp để loại trừ ngoại nhiễm. Hiện nay, có lẽ hiệu quả nhất là sử dụng phương pháp nội tại loại trừ ngoại nhiễm: đó là trộn sẵn trong ống nghiệm làm phản ứng PCR men Uracil N Glycosylase (UNG) là men có khả năng phá hủy các sản phẩm PCR ngoại nhiễm trước khi phản ứng PCR xảy ra. Chính nhờ việc sử dụng UNG mà các thử nghiệm PCR chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh có thể thực hiện được tại bất cứ phòng thí nghiệm nào, không cần phải tại một thí nghiệm được thiết kế đặc biệt cho PCR chẩn đoán. Ngoài ra, PCR còn có một biến thể là kỹ thuật Nested - PCR có thể làm tăng thêm độ nhạy cảm của thử nghiệm một khi nucleic acid đích hiện diện khá ít trong mẫu thử. Với kỹ thuật RT-PCR, có thể khuếch đại nucleic đích là RNA, nhờ vậy có thể phát hiện tác nhân gây bệnh mà acid nucleic đích là RNA chứ không chỉ hạn chế với acid nucleic là DNA. Tuy nhiên, cần phải lưu ý rằng kỹ thuật RT-PCR cũng như Nested - PCR là những kỹ thuật không thể dùng UNG là yếu tố nội tại chống ngoại nhiễm, vì vậy chỉ có thể thực hiện được trong những phòng thí nghiệm có kiểm soát chặt chẽ. 19 Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR không những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại kiểu di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn. Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng. Ngoài ra, PCR còn có thể phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, ví dụ phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicin, một chìa khóa chủ yếu để bác sĩ điều trị có thể sử dụng phát đồ điều trị đúng cho bệnh nhân ( www.ykhoa.net). 2.11.6. PCR với tiến hóa và khảo cổ học Từ năm 1963, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu nghiên cứu về tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của protein (cytochrome c, hemoglobin, ribonuclease). Sau đó, bắt đầu nghiên cứu tập trung vào trình tự chuỗi 16S RNA của ribosome trên vi khuẩn hay bộ gene của ty thể và lục lạp của thực vật. Ngày nay, PCR đã góp phần làm công việc nghiên cứu về tiến hóa phân tử học trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Người ta có thể so sánh các loài với nhau bằng cách dùng các mồi đặc hiệu cho những vùng có tính ổn định cao trong bộ gen, nhờ đó khuếch đại các vùng biến đổi, rồi so sánh với nhau. Ưu điểm vượt trội nhất của PCR trong lĩnh vực này là chỉ cần một số lượng rất nhỏ mẫu vật là đủ để có thể tiến hành phân tích. Trong lĩnh vực khảo cổ học, nhờ DNA là một loại phân tử khá bền vững, có những mảnh DNA có thể tồn tại nguyên vẹn trong thời gian khá dài. Có rất nhiều trường hợp những mảnh DNA cổ đại đã được PCR khuếch đại thành công: người ta có thể khuếch đại DNA ty thể từ một người Châu Mỹ sống cách đây 7000 năm hay từ các mảnh xương của cọp răng chồn sống cách đây 14.000 năm ( www.ykhoa.net). 2.11.7. PCR với phát hiện các khiếm khuyết gene Khiếm khuyết gene gây các bệnh di truyền hay ung thư là do bị đột biến đoạn hay đột biến điểm. Phát hiện các đột biến bằng phương pháp PCR, khi đoạn DNA đặc hiệu đuợc khuếch đại lên có kích thước khác bình thường (do thêm hay mất đoạn). Với các trường hợp đột biến điểm, PCR hiện nay đã chiếm độc quyền trong lãnh vực này vì khả năng thực hiện các thí nghiệm tương đối đơn giản và ít tốn thời gian so với các thử 20 nghiệm sinh học phân tử không dùng PCR. Dùng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn DNA có chứa đột biến điểm rồi phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử khác; hay dùng cặp primer chỉ khuếch đại đuợc đoạn DNA có đột biến điểm mà không khuếch đại đoạn gene bình thường ( www.ykhoa.net). 2.11.8. PCR và việc định loại các mô Các mô được định loại (type) khác nhau dựa vào sự khác nhau về các kháng nguyên của phức hợp phù hợp tổ chức chính (MHC), ở người gọi là kháng nguyên HLA. Ðịnh type các mô là một việc hết sức cần thiết trong ngân hàng dữ liệu mô ghép và trước khi thực hiện phẫu thuật ghép mô hay cơ quan. Hiện nay, định type các mô được dựa vào các phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, PCR cũng là một triển vọng đầy hứa hẹn trong lĩnh vực này, vì định type các mô dựa vào PCR cho được nhiều thông tin hơn là các phương pháp miễn dịch học ( www.ykhoa.net). 2.11.9. PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền Dấu ấn di truyền được nói ở đây là những dấu ấn giúp phân biệt các cá thể trong cùng loài, xem có liên hệ với nhau hay không. Các dấu ấn này hoàn toàn không có ý nghĩa gì trong việc biểu hiện kiểu hình thông qua tổng hợp protein. Trước đây, để phát hiện các dấu ấn di truyền phải ly trích được bộ gene từ một khối lượng khá nhiều tế bào của cá thể cần khảo sát (mô, máu,..) sau đó cắt đoạn bộ gene này bằng các restriction enzyme, điện di trên thạch, làm Southern blotting, rồi dùng các đoạn dò đặc hiệu được đánh dấu để phát hiện. Kết quả là mỗi cá thể sẽ có một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dò khi lai ghép trên Southern blotting. Người ta gọi kỹ thuật này là kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mảnh DNA bị cắt đoạn, RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism). Với PCR, công việc trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Có hai kiểu PCR phát hiện dấu ấn di truyền hiện đang được dùng. Kiểu thứ nhất là dùng PCR với các đoạn mồi nằm trước và sau các microsatellite, là các cấu trúc CACACA lặp đi lặp lại khoảng 100000 lần trong bộ gene của động vật có vú và khuếch đại các microsatellite này. Vì các cá thể khác nhau có sự khác nhau về số lượng các cấu trúc CA tạo thành các 21 microsatellite nên sau khi khuếch đại bằng PCR và phân tích các vạch trên thạch điện di, sẽ thấy các kiểu mẫu vạch khác nhau tùy từng cá thể được phân tích. Kiểu thứ hai gọi là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các DNA đa hình (Random Amplified polymorphic DNA - RAPD) là dùng các đoạn mồi ngẫu nhiên, thường ngắn khoảng 10 nucleotide, cho bắt cặp với nucleic acid đích trong điều kiện bắt cặp không chặt chẽ, ở nhiệt độ khoảng 30 – 40oC chẳng hạn. Nhờ vậy khi thực hiện PCR, sẽ có sản phẩm PCR là những đoạn DNA dài ngắn khác nhau do các đoạn mồi bắt cặp ngẫu nhiên trên DNA đích (ngẫu nhiên nhưng là tất nhiên, vì đoạn mồi sẽ bắt cặp trên chuỗi đích nào tương đối bổ sung nhất với nó) và các kích thước của những đoạn này sẽ được phát hiện trên thạch điện di. Sự giống và khác nhau về hình ảnh trên thạch điện di sẽ cho biết các cá thể đuợc phân tích có giống hay khác nhau, hay có liên hệ với nhau như thế nào. Kỹ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa học hình sự. Chỉ cần tội phạm để lại trên hiện trường rất ít mẫu vật: một vài giọt máu khô, vết tinh dịch, vài sợi lông hay tóc, hay thậm chí mẫu tàn thuốc có dính lại vài tế bào niêm mạc miệng, là có thể truy tìm được dấu ấn di truyền và phát hiện được ngay đúng tội phạm mà không thể nào chối cãi được. (www.ykhoa.net) 2.11.10. PCR và kỹ thuật phát hiện trình tự chuỗi của một đoạn DNA (DNA sequencing) Trước đây, để làm DNA sequencing, người ta phải dùng kỹ thuật Maxam và Gilbert, kỹ thuật này tương đối phức tạp. Hiện nay làm DNA sequencing bằng kỹ thuật PCR đơn giản hơn nhiều, kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật Sanger. Được rất được nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện nay sử dụng. Giá trị sử dụng Phương pháp PCR có ý nghĩa lớn vì nhiều lí do : Thời gian thực hiện cực nhanh : Chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần hoặc lâu hơn. Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời. Trong khi đó, phương pháp tạo dòng 22 điển hình cần các vật liệu đắt tiền như màng, nucleotide triphosphate mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần thao tác khéo léo đặc biệt. Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleotide thô. Ví dụ mẫu máu hay dấu vết trong phân tích pháp y. Điều này ngược với kĩ thuật tái tổ hợp DNA, đoạn gen hoặc vector đều cần tương đối tinh khiết. Nhờ ưu thế trên, PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời trong việc khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu và chẩn đoán phân tử. Giới hạn duy nhất đối với phương pháp này là phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất một phần) của đoạn DNA cần khuếch đại. Nó không thay thế kĩ thuật tái tổ hợp DNA mà góp phần đáng kể bổ sung kĩ thuật này. Như vậy, từ khi ra đời đến nay, PCR đã có vai trò cách mạng hóa trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng gene. Nó được hoàn thiện không ngừng và có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như xác định trình tự nucleotide của gene, gây đột biến điểm định hướng,…Có thể thực hiện PCR in situ (ngay trong tế bào) với cả DNA, RNA. Nó được sử dụng trong pháp y để phân tích di truyền vệt máu khô, chẩn đoán các bệnh di truyền và lây nhiễm, dự báo các sai hỏng di truyền. PCR có thể dùng để nghiên cứu DNA cổ xưa từ mẫu khảo cổ. PCR kết hợp với các kĩ thuật khác của tạo dòng phân tử giúp sinh học xâm nhập vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới (www.ykhoa.net). 2.12. Thành phần hóa học của DNA Deoxyribonucleic acid là một hợp chất polymer cấu tạo bởi các đơn phân nucleotide. Nó được tạo nên do sự nối liền nhiều đơn phân cùng kiểu là các nucleotide. Kết quả phân tích hóa học DNA của những sinh vật khác nhau cho thấy sự giống nhau đặc biệt giữa các đơn chất hợp thành DNA. Thành phần hóa học của DNA gồm có gốc acid phosphoric, đường 5-desoxyribose và các base nitrogenous. base nitrogenuos ở DNA gồm có hai purine là adenine (A) và guanine (G) và hai pyrimidine là cytosine (C) và thymine (T); ở RNA còn có uracil (U) thay cho thymine (T). Đường pentose (5C) desoxyribose gắn với nitrogenous base ở vị trí C1 sẽ tạo nên nucleoside. Nucleoside được gắn thêm nhóm phosphate vào C5 của đường pentose thành 23 nucleotide. Tính đặc hiệu của nucleotide do base, nên khi nói đến acid nucleic, base thường được sử dụng thay cho nucleotide. Cách gọi thường dùng là cặp base, kí hiệu bp hay kb (Phạm Thành Hổ, 2000, trang 140 - 141). Hình 2.11 Cấu tạo hóa học của acid nucleic 24 Phần 3. Vật liệu và cách thức tiến hành 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành  Quá trình chế tạo bắt đầu từ 3 / 2005 đến 8 / 2005.  Tiến hành chế tạo tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM.  Quá trình chế tạo tại Bộ môn Điều Khiển Tự Động trực thuộc khoa Cơ Khí.  Chạy mẫu kiểm tra và so sánh kết quả tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Linh kiện cho bộ khuếch đại tín hiệu từ cảm biến  Nhiệt điện trở Platine Pt100 (sản xuất tại Đức)  Sensor cảm ứng nhiệt Lm35 (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 1000 µF , 100 µF ,10 µF, 1 µF, 104 pF (sản xuất tại Đài Loan)  Điện trở sai số 1% không thay đổi theo nhiệt độ (sản xuất tại Singapore)  Biến trở vi chỉnh (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A (sản xuất tại Trung Quốc)  Op07 (sản xuất tại Đài Loan)  Ổn áp 7805, 7905 (sản xuất tại Đài Loan) 3.2.2. Linh kiện cho mạch vi xử lý  Tụ 1000 µF,100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 33 pF,1000 µF, 100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A  Vi xử lý AT90S8535 (sản xuất tại Đài Loan)  Thạch anh 4M  LM358 (sản xuất tại Đài Loan)  LCD 20 x 4 (Sản xuất tại Trung Quốc)  Ổn áp 7805  Phím 4x4  Optodiac P521 (sản xuất tại Đài Loan) 25 3.2.3. Linh kiện cho mạch khuyếch đại công suất  Điôt 10A, N4007 (sản xuất tại Nga và Trung Quốc)  Tụ : 2200 µF, 10000 µF  IRF 2807 (sản xuất tại Đài Loan)  Điện trở 1 MΩ 3.2.4. Linh kiện và thiết bị cho bộ nguồn  Biến áp các nguồn ra 9V(3A), 9-0-9(3A), 24V(15A) (sản xuất tại Việt Nam)  Điôt cầu 50A (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 10000µF,4700 µF  Ổn áp 7805, 7809, 7812, 7818, 7824  Transitor C3998 (sản xuất tại Đài Loan) 3.2.5. Linh kiện cho bộ luân nhiệt và nắp chống ngưng  TE 7000/127/085BS (sản xuất tại Singapore)  Dây điện trở cung cấp nhiệt  Nhôm tản nhiệt 10 x 21 x 3 mm  Quạt 10 cm x10 cm, DC 12V, 0,6A (sản xuất tại Nhật)  Mỡ Silicon  Keo chịu nhiệt (sản xuất tại Mỹ)  Fip 5 mm  Cao su silicon  Dây dẫn chịu nhiệt (sản xuất tại Nhật)  Giấy cách điện dẫn nhiệt 3.2.6. Vật liệu làm khung và vỏ máy  Inox 5 dem  Sắt V 2  Giấy cách điện  Thép chống từ  Máy bào kim loại 26  Máy khoan kim loại  Máy hàn  Máy cắt  Que hàn 5 mm  Máy đánh bóng 3.2.7. Hoá chất chạy PCR và dụng cụ điện di  DNA khuôn mẫu  dNTP  Taq polymerase  Primer  Dung dịch đệm thích hợp và MgCl2 3.3. Cách thức tiến hành 3.3.1. Thiết kế 3.3.1.1. Thiết kế khung và vỏ máy a. Bộ phận bên ngoài của máy Nắp chống ngưng tụ hơi nước được bố trí bên trên tiện sử dụng, phía trên nắp được thiết kế thêm nút điều khiển dễ sử dụng và chế tạo. Nút điều khiển điều khiển vị trí chống ngưng tụ hơi nước có hai chế độ: điều chỉnh theo ý muốn và điều chỉnh tự động nhờ lực đàn hồi của lò xo. Khóa cố định giữ nắp chống ngưng áp sát vào ống eppendorff trong suốt quá trình chạy mẫu. Khoá được thiết kế đơn giản và dễ chế tạo. Bàn phím nhập số liệu và LCD thiết kế nghiêng góc 480 so với đáy, thuận tiện cho thao tác và quan sát hiển thị trên LCD. b. Bộ phận bên trong Gồm biến áp, bộ khuếch đại, nhôm tản nhiệt, mạch vi xử lý, bộ chỉnh lưu điện xoay chiều thành điện một chiều. Biến áp và bộ khuếch đại được bố trí xa với mạch điều khiển nhằm hạn chế nhiễu. 27 Hình 3.1 Vỏ máy 28 3.3.1.2. Thiết kế bộ phận truyền tải nhiệt cho ống plastic (eppendorff) Dựa vào kích thước của ống eppendorff và tính năng của giếng, giếng thiết kế với chất liệu nhôm kích thước: 41 x 41 x 12 mm, mặt trên khoang 25 giếng, đường kính mỗi giếng 6 mm, sâu 11 mm và khoang thêm 16 lỗ phụ có vai trò làm giảm khối lượng. Tai ở đáy dày 1 mm, rộng 2 mm có vai trò cố định vào khối luân nhiệt. 3.3.1.3. Thiết kế tấm cố định Tấm cố định có vai trò giữ giếng đặt ống nghiệm (eppendorff), thermoelectric và tản nhiệt khít với nhau. Tấm cao su silicon có vai trò chống ẩm cho thermoelectric trong quá trình hoạt động. 93 9 3 53 5 3 Hình 3.3 Tấm cố định Hình 3.2 Giếng đặt ống eppendorff 1 1 2 1 1 2 41 3,5 61 29 93 9 3 53 5 3 Hình 3.4 Cao su silicon 3.3.1.4. Thiết kế nắp chống ngưng Nắp chống ngưng thiết kế gồm 2 lớp: lớp ngoài inox, lớp trong là fip cách nhiệt Thông số của nắp chống ngưng : Điện áp:16V Dòng điện: 3A Kích thước: 90 x 90 x 60 mm Tốc độ làm nóng :1,5oC/s ± 0,3 3.3.2. Chế tạo 3.3.2.1. Gia công bộ phận truyền tải nhiệt cho ống plastic (eppendorff) Nhôm được gia công có bề dày 12 mm. Giếng khoan trên chất liệu nhôm, dễ khoan và dẫn nhiệt tốt, thay đổi nhiệt độ nhanh. Khoan trên máy khoan vi sai của Mỹ. Yếu tố quan trọng là lỗ khoan và ống eppendorff phải khít với nhau, lỗ khoan phải nhẵn. Ngoài ra tiến hành khoan thêm một số lỗ phụ mục đích giảm khối lượng, giúp biến thiên nhiệt độ nhanh. 30 Hình 3.5 Giếng khoan Ta cố định giếng lên tấm fip cách nhiệt bằng keo chống thấm chịu nhiệt không cho không khí lọt vào bộ phận chuyển tải nhiệt nằm bên dưới bảo đảm độ bền cho TE. Muốn nhiệt độ luân chuyển nhanh đòi hỏi tấm tản nhiệt đủ lớn, diện tích tiếp xúc nhiều và đủ độ dày cho TE. Vì vậy, lót lớp dẫn nhiệt mỏng giữa hai mặt tiếp xúc làm tăng diện tích tiếp xúc giúp cho quá trình biến thiên nhiệt nhanh. Nếu nhiệt độ tấm tản nhiệt tăng cao làm cho quá trình chuyển tải nhiệt từ TE sang tấm tản nhiệt bị chậm lại (trong quá trình làm lạnh) làm cho quá trình làm hạ nhiệt chậm lại. Để khắc phục điều này ta có hai phương pháp là: dùng tản nhiệt đủ lớn hoặc dùng quạt làm mát cho tản nhiệt. Để TE có độ bền cao một yếu tố quan trọng khác là áp lực lên TE trong quá trình hoạt động, áp lực này phải nhỏ hơn áp lực tối đa mà nhà sản xuất yêu cầu và áp lực phải đều trên TE, nếu áp lực bị lệch về 1 cạnh, sau một thời gian sử dụng TE sẽ hoạt động không ổn định, đôi khi có thể gây nứt, biến dạng TE. Dùng ốc vít cố định phải giống nhau và thêm một số vòng đệm, quá trình cố định phải vặn từ từ từng cặp đối diện nhau. Tốt nhất nên dùng tua vít có đo momen xoắn Khi TE chuyển tải nhiệt kích thước của TE, tấm tản nhiệt và khối nhôm sẽ thay đổi theo bề dày và bề ngang làm tăng hoặc giảm áp lực lên TE tùy theo làm nóng hay làm lạnh. Dùng nhiều vòng lót giúp khắc phục điều này. 31 3.3.2.2. Khảo sát và chế tạo nắp chống ngưng Khảo sát và chế tạo nắp chống ngưng có kích thước và công suất nhiệt phù hợp. Nắp được thiết kế chung cho 2 loại ống eppendorff loại 200 μl đầu tròn và đầu bằng với bộ phận chống ngưng di động được giúp áp sát vào đầu của ống eppendorff làm cho nhiệt truyền đồng bộ, chống ngưng tụ tốt. Những máy PCR đời cũ không có nắp chống ngưng vì vậy làm cho một số chất trong ống eppendorff bay hơi dẫn đến phản ứng PCR không xảy ra người ta thường dùng thêm dầu propanol cho vào ống eppendorff để hạn chế điều này. Nắp có lớp ngoài làm bằng inox dày 1 mm kích thước 90 x 90 x 60 mm, lớp trong làm bằng fip dày 5mm kích thước 50 x 50 x 40 mm Hình 3.6 Nắp chống ngưng 3.3.2.3. Làm khung và gò máy Sau khi đã có những thông số chi tiết, tiến hành gia công với mục tiêu là: kích thước nhỏ, phù hợp với phòng thí nghiệm, bền và đẹp. Khung được gia công bằng sắt V2 được phủ sơn, Vỏ được gò bằng Inox, đáy được làm bằng gỗ. 3.3.2.4. Làm nguồn cung cấp cho bộ khuếch đại và vi xử lý Muốn máy hoạt động ổn định cần phải có nguồn nuôi phù hợp, công suất đủ lớn, chống được sụt áp và chống nhiễu. Từ điện áp xoay chiều(AC) 220V được hạ áp xuống các điện áp: 9-0-9V, 9V AC, 24V AC. Chỉnh lưu sang dòng điện một chiều nhờ diot cầu và tụ thành điện một chiều 32 (DC) ±12V, 12V, 34V. Điện áp một chiều này đưa qua bộ phận ổn áp cho ra điện áp cần thiết và công suất phù hợp. 3.3.2.5. Làm mạch khuếch đại cho TE Mạch khuếch đại dùng IRF2807 được thiết kế cho đảo cực và cung cấp những điện áp khác nhau cho thermoelectric. Bộ phận khuếch đại được cố định trên tấm mikal cách li các mass với nhau nhằm hạn chế nhiễu. 3.3.2.6. Thiết kế và lắp mạch vi xử lý Mạch vi xử lý được thiết kế trên phần mềm Orcad cho vi xử lý AT90S8535 các cổng I/O như sau:  PortA (A0 đến A7) dùng cho chuyển đổi AD.  PortB (B0 đến B7) dùng cho hiển thị LCD.  PortC (C0 đến C7) dùng cho bàn phím ma trận.  PortD (D0 đến D7) dùng cho điều khiển bộ khuếch đại, quạt và điện trở cung cấp nhiệt. Hình 3.7 Board mạch vi xử lý 3.3.2.7. Làm mạch khuếch đại cho Pt100 Mạch khuếch đại dùng OP07, có độ phân giải cao, độ sai số 0,2%. Tín hiệu điện lấy từ mạch cầu đưa vào mạch khuếch đại, từ biến thiên điện trở theo nhiệt độ được chuyển sang dạng biến thiên điện áp theo nhiệt độ. 33 Hình 3.8 Nguồn cho khuếch đại và mạch cầu 3.3.3. Viết chương trình và nạp cho vi xử lý Chương trình điều khiển được viết bằng ngôn ngữ Bascom, nạp cho chip AT90S8535 thông qua mạch nạp nối với máy tính. 3.3.4. Chạy phản ứng PCR 34 Phần 4. Kết quả thảo luận 4.1. Về phần cứng 4.1.1. Về bộ phận điều khiển và nhiệt độ  Điện áp nguồn ổn định, khi điện áp AC 220 V giảm xuống 190 V máy còn hoạt động bình thường vì nguồn một chiều dùng ổn áp.  Mạch vi xử lí hoạt động ổn định được thiết kế chống nhiễu trong điều khiển với optodiac P521.  Tốc độ thay đổi nhiệt độ của giếng: 10C/s ± 0,3.  Tốc độ thay đổi nhiệt độ của nắp: 1,5 oC/s ± 0,4.  Hệ số tuyến tính nhiệt độ R2 = 0.9959 4.1.2. Về toàn phần máy  Vỏ máy khích thước 450 x 255 x 240 mm, khối lượng 14 kg.  Máy chịu lực nén lớn hơn 57000 N/m2.  Dùng điện áp vào xoay chiều 220 V.  Công suất tối đa 300 W. Tính trên công suất toàn phần. 4.2. Về phần mềm  Dễ điều khiển; được thiết kế giao diện rõ ràng bằng ngôn ngữ tiếng Việt.  Nhập nhiệt độ: 100 giá trị.  Nhập thời gian: 100 giá trị mỗi giá trị tối đa 64000 giây (17,5 giờ).  Số vòng lặp: 255.  Số bước chạy mẫu: 255 bước.  Độ ổn định cao; phần mềm chưa tìm thấy sự cố trong hoạt động. 35 4.3. Về Nhiệt độ Kiểm tra trong điều kiện nhiệt độ tấm tản nhiệt khoảng 45oC, nhiệt độ môi trường 30,5 0 C Bảng 4.1 Nhiệt độ tăng từ 30oC đến 85oC STT Thời gian (s) Nhiệt độ máy (oC) 1 0 30 2 5 35,7 3 10 41,1 4 15 45,9 5 20 50,8 6 25 55,3 7 30 59,7 8 35 64,1 9 40 67,3 10 45 70,5 11 50 73,5 12 55 76,5 13 60 79 14 65 81,1 15 70 82,9 16 75 84,7 17 80 86,3 36 Nhiệt độ máy 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Thời gian Nh iệt đ ộ Nhiệt độ máy Đồ thị 4.1 Nhiệt độ tăng 30oC đến 85oC Nhân xét: Với nhiệt độ cánh tản nhiệt như vậy, khi nhiệt độ máy tăng cao thì tốc độ tăng nhiệt chậm lại do ΔT tăng. Cần hạ thấp ΔT bằng cách tăng nhiệt độ cánh tản nhiệt 37 Bảng 4.2 Nhiệt độ giảm từ 90oC về 10oC STT Thời gian (s) Nhiệt độ máy (oC) 0 0 90 1 5 83,1 2 10 76,2 3 15 69,4 4 20 62,9 5 25 56,7 6 30 51,2 7 35 46,3 8 40 41,7 9 45 36,8 10 50 32,7 11 55 28,9 12 60 25,3 13 65 23 14 70 20,8 15 75 18,7 16 80 17,2 17 85 15,8 18 90 14,5 19 95 13,2 20 100 12,1 21 105 11,2 22 110 10,3 38 Nhiệt độ máy 0 20 40 60 80 100 0 15 30 45 60 75 90 10 5 Thời gian Nh iệt đ ộ Nhiệt độ máy Đồ thị 4.2 Nhiệt độ giảm từ 90oC về 10oC Nhận xét: Khi nhiệt độ hạ xuống thấp, tốc độ giảm nhiệt chậm lại do ΔT tăng. Cần hạ thấp ΔT bằng cách bố trí quạt tạo tốc độ gió đủ lớn thổi vào tấm tản nhiệt và nhiệt độ tấm tản nhiệt thích hợp. 39 Bảng 4.3 Nhiệt độ duy trì STT Thời gian (s) Nhiệt độ máy (oC) 0 0 65 1 5 65 2 10 65,2 3 15 65,1 4 20 64,8 5 25 65 6 30 65,1 7 35 65 8 40 64,5 9 45 65,2 10 50 65 11 55 64,9 12 60 65,1 13 65 65,2 14 70 64,7 15 75 65 16 80 65,1 17 85 65,1 18 90 65 19 96 65,2 20 100 64,9 40 Nhiệt độ máy 64 64,5 65 65,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 Thời gian Nh iệt đ ộ Nhiệt độ máy Đồ thị 4.3 Nhiệt độ duy trì ở 65oC Nhận xét: Nhiệt độ duy trì còn biến thiên lớn, khắc phục điều điều này có 2 cách: Cách 1: Khảo sát tìm điện áp nguồn điện nuôi thích hợp cho nhiệt độ cần duy trì. Cách này không hay, vì mỗi khoảng nhiệt độ khác nhau cần có điện áp nuôi khác nhau. Nếu làm theo cách này, phải dùng thêm một số thiết bị tải và điện áp kích tốn kinh phí chế tạo và làm máy cồng kềnh. Cách 2: Dùng phương pháp băm xung, tức là từ điện xoay chiều được chuyển thành điện một chiều, sau đó được đưa qua thiết bị băm xung được điều khiển bởi vi xử lý. Dòng điện dạng xung được đưa qua bộ phận chỉnh lưu thành dòng một chiều có điện thế phụ thuộc vào băm xung. Dùng điện áp này để kích tải. Chương trình trên vi xử lý được viết dạng băm xung tự động, khi nhiệt độ máy bằng nhiệt độ cần thiết, vi xử lý sẽ tự động xuất dòng điện "nuôi" có công suất tỏa nhiệt đúng bằng nhiệt lượng tiêu hao. Vì vậy nhiệt độ sẽ rất ổn định. 41 Bảng 4.4 So sánh nhiệt độ máy và nhiệt độ nhiệt kế DT150 (Korea) Nhiệt độ máy Nhiệt độ kế 29 19,5 32,6 24,4 34,4 26,1 36,5 28,5 38,5 31,2 40,4 33,5 44,2 37,5 46 40,6 48 44,7 50 47,7 51,8 51,1 56 57,5 57,9 59,9 59,7 62,9 62 65,7 64,1 67,7 66,2 70 68,2 72,2 70,1 74,4 72,2 77 74 78,9 76,1 81 78 83,2 42 Kết quả xử lý số liệu nhiệt độ máy và nhiệt độ nhiệt kế SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,997964 R Square 0,995931 Adjusted R Square 0,995738 Standard Error 0,987181 Observations 23 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 5009,645 5009,645 5140,592 1,37E-26 Residual 21 20,46506 0,974527 Total 22 5030,11 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 0.95% Upper 0.95% Intercept 14,98439 0,589689 25,41069 2,98E-17 13,75807 16,21072 13,75807 16,21072 X Variable 1 0,737742 0,01029 71,69792 1,37E-26 0,716344 0,75914 0,716344 0,75914 0 20 40 60 80 100 19 ,5 28 ,5 37 ,5 47 ,7 59 ,9 67 ,7 74 ,4 81 Nhiệt độ nhiệt kế Nh iệt đ ộ m áy Nhiệt độ máy Nhiệt kế Đồ thị 4.4 Nhiệt độ máy và nhiệt độ thực trên nhiệt kế 43 Phương trình đường chuẩn nhiệt độ của nhiệt kế: y = x (4.1) Phương trình đường thẳng nhiệt độ máy y = 0,75x + 14,98 (4.2) Toạ độ điểm cắt A (59,92; 59,92) Tại điểm này nhiệt độ máy bằng nhiệt độ nhiệt kế Qui nhiệt độ máy về nhiệt độ nhiệt kế Khi nhiệt độ lớn hơn 59,92 y = yo + (y' - yo)/0,75 (4.3) Khi nhiệt độ nhỏ hơn 59,92 y = yo - (yo - y')/0,75 (4.4) y : Nhiệt độ thực tế yo : Nhiệt độ tại điểm cắt y' : Nhiệt độ vi xử lý đưa ra Từ kết quả khảo sát thấy, hệ số tuyến tính còn thấp (0.9957), nhiệt độ biến thiên còn lệch so với nhiệt độ chuẩn sau khi chuẩn lại chương trình đường nhiệt độ. Có hai lý do dẫn đến sai số này: - Nhiệt kế sai số và hệ số tuyến tính không cao. Đã đo thử nhiệt độ trên máy PCR của hãng eppendorf thấy nhiệt độ trên máy là 94oC trong khi nhiệt độ trên nhiệt kế là 86 o C. - Nguyên nhân thứ hai là board mạch khuếch đại cho Pt có hệ số tuyến tính không cao. Khắc phục, thay OP07 bởi MAX4236_37A. 44 Đồ thị 4.5 Hệ số tuyến tính board mạch khuyếch đại dùng MAX4236_37A 4.4. Về kết quả chạy mẫu 4.4.1. Hoạt động của máy 45 Khi khởi động máy, LCD hiện chu "Help??". Nếu nhấn nút Help trên bàn phím, màn hình sẽ hiện cách sử dụng máy. Để kêt thúc ấn phím Cancel muốn tiêp tục ấn phím Help. Sau khi ấn phím Cancel máy sẽ "khởi động", chờ đến khi màn hình hiện chữ "an STAR". Lúc này máy khởi động xong. Sau khi ấn Star màn hình hiển thị nhập số liệu. Đồng ý với số liệu nhập ấn phím OK, không đồng ý ấn Cancel. Khi nhập, nếu nhập sai máy yêu cầu nhập lại số. Nhập xong máy sẽ chạy theo chương trình cài đặc. Sau khi chạy xong phản ứng PCR máy sẽ thông báo lên màn hình. Lúc này muốn chạy tiếp tục thì ấn phím Reset nhập lại số liệu mới. 4.4.2. Chạy phản ứng PCR Mẫu chạy trên hai máy đồng thời. Một trên máy của hãng eppendorf và một trên máy chế tạo. Chạy RAPD trên đối tượng cây điều. Trình tự của primer 11 (OPN 06): 5’GAGACGCACA 3’ và Tm = 35,3 0 C Bảng 4.5 Hoá chất chạy PCR Hoá chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer MgCl2 dNTP Primer (OPN 06) Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 25 mM 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 5 U 20 ng/ul 2,5 ul 2 ul 3 ul 0,65 ul 0,1 ul 1 ul 19 ul 250 uM 200 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) 0,5 U 20 ng 46 Bảng 4.6 Chu kỳ nhiệt chạy PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 4 37 94 1 33 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C Kết quả điện di sau khi đã chạy PCR Nhận xét: Băng điện di của DNA chạy trên máy chế tạo cho kết quả rõ hơn band điện di chạy trên máy eppendorf. Máy chế tạo sau khi điện di cho ra 3 băng DNA, còn máy đối chứng cho ra 2 băng. Giải thích kết quả: Băng của máy chế tạo cho kết quả rõ hơn, vì trong quá trình hạ nhiệt độ để primer bắt cặp với DNA khuôn, thì tốc độ hạ nhiệt của máy chế tạo chậm hơn máy eppendorf vì vậy số lượng primer bắt cặp với DNA khuôn cao hơn. Chạy đối chứng trên máy Eppendorf Chạy trên máy PCR Thùy Dương 47 Hơn nữa, ở giai đoạn duy trì nhiệt độ, nhiệt độ của máy eppendof rất ổn định xem như không đổi. Trong khi máy chế tạo, sự biến thiên so với nhiệt độ duy trì:  Thấp hơn nhiệt độ duy trì lớn nhất: 0,80C  Cao hơn nhiệt độ duy trì lớn nhất: 1,10C Do sự biến thiên nhiệt này làm cho hóa chất trong ống eppendorf có sự đối lưu tốt hơn, hay nói cách khác sự chuyển động hỗn độn của các phần tử nhanh hơn. Do vậy hóa chất được phân bố đều trong toàn thể tích làm cho phản ứng xảy ra tốt hơn. 48 Phần 5. Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận Bước đầu máy hoạt động cơ bản theo ý muốn, chạy đúng theo chương trình cài từ bàn phím, tốc độ biến thiên nhiệt chấp nhận được (1oC/s ± 0,3), các bộ phận bên trong máy hoạt động bình thường, nhiệt độ duy trì sai số ± 0,5oC. Đây là máy lần đầu chế tạo và cũng là máy chế tạo đầu tiên trong nước, khó tránh khỏi những hạn chế này. Bước đầu chạy PCR đã cho kết quả tốt. 5.2. Đề nghị 5.2.1. Về chạy mẫu Cần chạy thêm nhiều mẫu với nhiều kỹ thuật khác nhau để xác định tốc độ tăng giảm nhiệt tối ưu và nhiệt độ biến thiên (trong giai đoạn duy trì) tối ưu nhằm rút ngắn thời gian chạy mẫu và nâng cao độ tin cậy. 5.2.2. Bộ phận khuyếch đại Thay IRF2807 bằng IRF khác công suất lớn hơn và điện trở nhỏ hơn vì IRF2807 (3Ω) còn sinh nhiệt lớn. 5.2.3. Bộ phận vi xử lý Mở rộng thêm bộ nhớ ngoài giúp người sử dụng tiện dùng hơn, khi máy đang chạy bị cúp điện chỉ cần gọi chương trình lưu ra không cần phải nhập lại chu trình chạy mẫu. 5.2.4. Mạch khuếch đại Pt Tìm mạch tối ưu hơn, có hệ số tuyến tính cao, giảm sai số, ổn định cao. 5.2.5. Nguồn điện Trọng lượng của máy sẽ giảm xuống 7 kg nếu ta thay đổi biến áp chuyển sang dùng nguồn xung tương tự như nguồn máy tính. 49 5.2.6. Bàn phím Thiết kế phím cao su chìm làm tăng tính thẩm mỹ độ bền và thao tác dễ dàng. 5.2.7. Vỏ và khung Chuyển sang đúc bằng nhựa chịu nhiệt giúp giảm trọng lượng và chống nhiễu, tăng thẩm mỹ. 5.2.8. Chương trình Viết thêm phần trợ giúp, phần hạn chế nhiệt độ quá cao và phần báo lỗi khi hoạt động gặp sự cố. Linh hoạt nhiệt độ tấm tản nhiệt hơn trong quá trình chạy máy, sẽ rút ngắn thời gian chạy mẫu và tốc độ thay đổi nhiệt độ ổn định hơn. Chương trình viết đã điều khiển 2 yếu tố nhiệt độ và thời gian, yếu tố thứ 3 cũng khá quan trọng là tốc độ thay đổi nhiệt độ. Cần khảo sát kỹ tốc độ biến thiên nhiệt, tốc độ thay đổi nhiệt ảnh hưởng đển phản ứng PCR như thế nào nhằm rút ngắn thời gian chạy mẫu và nâng cao độ tin cậy. Khi cả 3 yếu tố là nhiệt độ, thời gian và tốc độ thay đổi nhiệt độ được kiểm soát tốt máy sẽ có độ tin cậy như máy nhập ngoại hiện đại. 5.2.9. Thermoelectric module Cần thay thế loại công suất lớn hơn, quan tâm nhất ở đây là dòng điện qua tối đa (IMax), nên chọn loại IMax nhỏ nhất nhằm hạ giá thành chế tạo và tăng độ bền. Đối với máy PCR loại 25 giếng nên chọn loại Thermoelectric 25 V - 35V, 5 A 5.2.10 Tản nhiệt Tản nhiệt chỉ dùng nhôm đen vì nhôm này độ đặc gần 100%. Điều quan tâm ở đây là bề dày của tản nhiệt và độ dài của cánh tản nhiệt. Bề dày tối thiểu là 5 mm, cánh tản nhiệt khoảng 5 - 8 cm. Ta quan tâm đến tản nhiệt vì liên quan đến tốc độ thay đổi nhiệt độ. Tản nhiệt ngoài vai trò khuyếch tán nhiệt ra, còn có vai trò quan trọng là đóng vai trò như “kho” giữ nhiệt, khi làm nóng nhiệt lấy ra và khi làm lạnh nhiệt lượng được “cất” vào, giúp 50 duy trì giá trị ΔT tối ưu cho Thermoelectric tăng giảm nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang. 1999. Di truyền phân tử những nguyên tắc cở bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp. 278 trang 2. Nguyễn Tăng Cường, Phan Quốc Thắng. 2004. Cấu Trúc Và Lập Trình Họ Vi Điều Khiển 8051. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 298 trang 3. Phạm Thành Hổ. 1998. Di truyền học. NXB Giáo Dục. 621 trang 4. Hoàng Oanh, Phương Lan. 2002. Làm lạnh bằng bán dẫn và ứng dụng. Tạp Chí Electronics số 8/2002. 65 trang 5. Tống Văn On, Hoàng Đức Hải. Họ vi điều khiển 8051.NXB Lao Động - Xã Hội. 412 trang 6. Đặng Thành Phu. 2003. Các Bài Tập Lập Trình Bằng Ngôn Ngữ Assembler. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 302 trang 7. Đỗ Xuân Tiến. 2003. Kỹ thuật vi xử lý & lập trình Assembly cho hệ vi xử lý. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 349 trang 8. Hoàng văn Tiến, Lê Khắc Thận, Lê Doãn Diên. 1997. Sinh hóa học với cơ sở khoa học của công nghệ gen. NXB Nông Nghiệp. 326 trang 9. Khuất Hữu Thanh. 2003. Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 226 trang 10. Dương Minh Trí. 2001. Cảm Biến Và Ứng Dụng. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 512 trang 11. Dương Vũ Văn. 2002. Vật liệu điện - điện tử. NXB Đại Học Quốc Gia Tp HCM. 324 trang 12. Phạm Hùng Vân. 1996. Y Học Tp. Hồ Chí Minh. N0, special:27 - 35 13. Lê Phi Yến, Lưu Phú, Nguyễn Như Anh. 1998. Kỹ Thuật Điện Tử. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 321 trang 14. First News. Cẩm nang tra cứu - thay thế linh kiện điện tử - bán dẫn và IC. NXB Trẻ. 552 trang Tiếng Nước Ngoài 1. 2. 52 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.