Đề tài Kiểm tra chất lượng vi sinh tại Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam

Nếu mật đọ vi sinh vật qua cao thì phải pha loãng theo MNP. 3.3.1.2.4 Thiết bị, bao bì, công nhân: Sử dụng que stick vô trùng trên đầu có quấn bong gòn quét đều trong long ống dẫn của các thiết bị sau đó đem đi pha loãng theo MPN. Sử dụng làm que cấy để cấy rải trên đĩa petri. Làm tương tự với tay và quần áo công nhân Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 19 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Bao bị cho chạy qua máy đóng gói nhưng không cho sản phẩm vào (chứa không khí) đã qua hệ thống tiệt trùng UHT. Sử dụng nước muối để tráng đều bao bì, sau đó đem đi làm mẫu phân tích. 3.3.1.2.5 Nước thải: Dùng chai thủy tinh có nắm để lấy mẫu nước trước và sau khi qua hệ thống xử lý nước thải. Đem pha loãng mẫu để kiểm tra vi sinh. 3.2.3 Các bước chuẩn bị môi trường - dung dịch pha loãng: - Pha môi trường theo hướng dẫn trên nhãn của mỗi loại môi trường. - Tính số lượng mẫu để cân đối môi trường cần pha - Cân và pha môi trường với nước cất vào các lọ 250mL để pha lõang mẫu. - Các đầu pipetman rửa sạch, sấy khô cho vào ca Inox và đậy kín nắp. Chỉ sử dụng các đầu pipetman có đầu còn nguyên vẹn. - Bông gòn để kiểm tra tay công nhân, thiết bị, thùng tole được cắt nhỏ, vửa dùng, thấm nước, vắt khô rồi cho vào đĩa petri, gói giấy. - Tất cả được tiệt trùng bằng Autoclave ở 1210C – 1 atm trong 20 phút. - Sau khi tiệt trùng cho môi trường vào bể điều nhiệt ở 450C – 500C đối với môi trường dùng liền. Nếu môi trường chưa dùng liền để nguội cho vào tủ lạnh, khi dùng đem đun cách thủy cho đến khi thạch tan hòan tòan, làm nguội đến 450C - 500C trước khi sử dụng. - Đối với nước cất pha lõang mẫu sau khi tiệt trùng phải cho nhiệt độ hạ xuống bằng nhiệt độ của mẫu thử để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đội nhiệt độ đột ngột. 3.2.4 Chuẩn bị mẫu cấy: - Sắp xếp mẫu theo thứ tự thời gian, độ sạch đến dơ; bán thành phẩm theo thứ tự số thùng, từ mẫu sạch đến dơ; nguyên liệu theo thứ tự ngày nhập và độ sạch đến dơ. - Sắp xếp các lon mẫu, lọ mẫu theo thứ tự, ghi tên mẫu trên lọ mẫu - Sắp xếp các đĩa petri và ghi ký hiệu mẫu trên đĩa petri theo thứ tự - Vệ sinh phòng, bật đèn cực tím để thanh trùng phòng trong 30 phút Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 20 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Cân mẫu, trộn mẫu thật kỹ sao cho các vi sinh vật phân bố đều trong lọ chứa mẫu. Tránh tạo bọt và để bọt tan hết. Khỏang thời gian từ khi trộn đến khi lấy phần mẫu để thử không vượt quá 3 phút. - Tiến hành cấy mẫu theo các hướng dẫn công việc tương ứng. 3.2.5 Cấy mẫu phân tích các chỉ tiêu: Tùy thuộc vào mỗi mẫu cần phân tích, các chỉ tiêu khác nhau mà sử dụng các phương pháp cấy mẫu khác nhau. Chi tiết sẽ được trình bày ở phần kế tiếp. 3.2.6 Tính và xử lý kết quả - Tùy thuộc vào phương pháp sử dụng mà ta có cách đọc kết quả riêng sau ( số lượng khuẩn lạc, độ đục, bọt khí, đổi màu chất chỉ thị...) - Xử lý kết quả:  Thường thì các mẫu phân tích tại nhà máy la đếm số lượng khuẩn lạc và lấy đó làm kết quả để kết luận rằng các mẫu nguyên liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm có đạt yêu cầu chất lượng không.  Nếu sản phẩm đạt thì cho xuất xưởng, nếu chưa đạt thì kiểm tra lại lần 2, lần 3(đồng thời kiểm tra lại mẫu nguyên liệu cũng nhue bán thành phẩm xem đã bị nhiểm vi sinh ở khâu nào, nếu vẫn chưa đạt thi đem đi tái chết hoặc tiêu hủy nguyên lô. Đối với nguyên liệu nếu không đạt thì trả lại cho nhà cung cấp.  Vì một số yêu cầu tính bảo mật của công ty nên em không trình bày kết quả cụ thể của các mẫu đã tham gia đánh giá chất lượng cũng như chỉ tiêu riêng của nhà máy đặt ra để đánh giá chất lượng. Em xin dẫn nguồn số liệu từ tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6213:2004 để tạm đánh giá chất lượng của các sản phẩm phân tích xem có đạt kết quả không (các chỉ tiêu riêng được áp dụng tại nhà máy luôn nhỏ hơn so với số liệu cho phép của TCVN 6213:2004). Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 21 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4 Các phương pháp phân tích Tùy thuộc vào mỗi loại vi sinh vật mà ta có phương pháp phân tích riêng. Tuy nhiên tất cả đều tuân theo quy trình chung như sau: Ñoàng nhaát maãu 10g maãu + 90ml dd pha loãng Pha loaõng 10-2, 10-3, 10-4… Caáy maãu UÛ maãu Ñoïc keát quaû Keát luaän Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 22 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.1 Tổng VSV hiếu khí 3.4.1.1 Phương pháp Phương pháp kiểm nghiệm tổng số vi khuẩn hiếu khí theo Iso 5511-1992 3.4.1.2 Phạm vi áp dụng Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sữa và sản phẩm sữa. 3.4.1.3 Thiết bị và dụng cụ - Máy đếm khuẩn lạc - Autoclave - Tủ sấy dụng cụ duy trì ở 1700C – 1750C - Tủ ấm cài đặt 300C±10C - Cân phân tích - Bể điều nhiệt 450C – 500C - Đĩa petri 90 – 100mm - Các thiết bị thông thường của phòng vi sinh đã tiệt trùng. 3.4.1.4 Môi trường và thuốc thử - Plate count agar 3.4.1.5 Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu vào bình chứa 225mL nước cất vô trùng, lắc cho mẫu tan hòan toàn. - Lấy 2 đĩa petri, dùng pipetman vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 mL mẫu thử. - Nếu cần, thực hiện tương tự với các nồng độ pha lõang tiếp theo, mỗi độ pha loãng dùng 1 pipette riêng biệt. - Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 12 – 15ml môi trường Plate count agar (đã giữ ở 450C – 500C trong bể điều nhiệt), xoay nhẹ đĩa theo kim đồng hồ và ngược lại để hòa tan mẫu vào môi trường. Để môi trường đông đặc tự nhiên. - Thời gian hoàn tất 1 mẫu không quá 15 phút. - Lật úp và ủ các đĩa vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C±10C trong 72 giờ ± 3 giờ. Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm. - Đếm số khuẩn lạc ở các đĩa petri. Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu, tránh lẫn lộn các hạt nhỏ không tan hoặc các chất kết tủa trong đĩa với khuẩn lạc nhỏ. Kiểm tra thật kỹ các đốm còn nghi ngờ để phân biệt khuẩn lạc với các chất lạ. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 23 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Những khuẩn lạc mọc lan rộng được tính là những khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu các khuẩn lạc mọc lan rộng nhưng ít hơn ¼ bề mặt đĩa thì đếm những khuẩn lạc trên phần còn lại của đĩa và tính số lượng tương ứng cho toàn đĩa. Nếu lan rộng hơn ¼ bề mặt thì loại bỏ đĩa đó. - Chỉ các đĩa có ít nhất 10 khuẩn lạc, nhiều nhất 300 khuẩn lạc. - Thực hiện đĩa đối chứng để kiểm tra độ vô trùng. 3.4.1.6 Tính kết quả Trong đó: Σ c : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha lõang thứ nhất n2: số đĩa của độ pha lõang thứ hai d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. 3.4.2 Nấm men nấm mốc 3.4.2.1 Phương pháp Xác định đơn vị khuẩn lạc nấm men hoặc mốc bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ủ ở nhiệt độ 250C theo 6611 – 2004 3.4.2.2 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ nấm men và/hoặc nấm mốc trong sữa và sản phẩm sữa bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 250C. 3.4.2.3 Thiết bị và dụng cụ - Nồi hấp tiệt trùng - Tủ nuôi ủ ở nhiệt độ 250C ± 10C - Bếp cách thủy điều chỉnh được nhiệt độ 450C ±10C . - Máy đo pH (hiệu Meter 310) - Các dụng cụ thông thường của PTN vi sinh. 3.4.2.4 Môi trường và thuốc thử - Chất pha loãng canh thang pepton - Môi trường DBRC Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 24 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.2.5 Quy trình phân tích - Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha lõang ban đầu, và các dung dịch pha loãng thập Phân. - Dùng 1 pipet vô trùng cấy vào dĩa petri vô trùng, mỗi dĩa 1mL mẫu thử nếu là dạng lỏng hoặc 1mL chất huyền phù ban đầu nếu là sản phẩm dạng khác. - Nếu cần, dùng 1 pipette vô trùng khác cấy vào 2 dĩa petri vô trùng khác mỗi dĩa 1mL dung dịch pha lõang 10-1 (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 1mL dung dịch pha loãng 10-2(sản phẩm dạng khác). - Nếu cần, lặp lại thao tác này cho các nồng độ pha loãng tiếp theo. - Rót vào mỗi dĩa petri khoảng 15mL môi trường thạch dextroza chứa oxitetraxicline hoặc môi trường chứa chloramphenicol (đã chuẩn bị trước và giữ ở 450C trong nồi hấp cách thủy). - Khuấy trộn kỹ mẫu với môi trường bằng cách xoay dĩa petri và để cho hỗn hợp đông đặc trên mặt phẳng ngang, mát. - Thời gian từ khi chuẩn bị dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất nuôi cấy với môi trường không vượt quá 15 phút. - Thực hiện mẫu đối chứng để kiểm tra độ vô trùng. - Ủ các đĩa vào tủ ấm 4 ngày ở nhiệt độ 250C. • Để tránh hiện tượng mọc lan, cần phủ thêm một lớp môi trường nuôi cấy lên trên mặt các dĩa đã cấy sau khi đã đông đặc . - Không chồng quá 6 dĩa lên nhau, để các dĩa xa thành và nóc tủ. 3.4.2.6 Tính kết quả Chỉ giữ lại các dĩa có 10 – 150 khuẩn lạc: Tổng số CFU của nấm mốc và/hoặc nấm men, N, trong 1gram hoặc 1ml sản phẩmđược tính theo công thức: ∑C : là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các dĩa được giữ lại. n1: là số dĩa của độ pha lõang thứ I có chứa 10 – 150 khuẩn lạc n2: là số dĩa của độ pha lõang thứ II có chứa 10 – 150 khuẩn lạc d: hệ số pha lõang tương ứng với độ pha lõang thứ I Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 25 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.3 Coliform 3.4.3.1 Phương pháp Phương pháp kiểm tra tổng số coliform theo Iso 5541-1986. 3.4.3.2 Phạm vi áp dụng Xác định tổng số coliform trong sữa và sản phẩm sữa. 3.4.3.3 Thiết bị và dụng cụ - Nồi hấp tiệt trùng điều chỉnh được áp lực 14°C ± 1°C trong 20 phút - Tủ sấy dụng cụ duy trì được nhiệt độ 1700C – 1750C - Tủ ấm cài đặt được nhiệt độ ở 300C ± 10C - Cân kỹ thuật - Kính hiển vi - Bể điều nhiệt duy trì nhiệt độ ở 450C – 500C - Đĩa petri 90 – 100mm - Các thiết bị thông thường của phòng vi sinh đã tiệt trùng. 3.4.3.4 Môi trường và thuốc thử 3.4.3.4.1 Chất pha loãng: dùng 1 trong 4 lọai dung dịch pha loãng - Dung dịch pepton / muối: Thành phần: Pepton : 1.0g NaCl : 8.5g Nước : 1000 ml Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7.0 ± 0.1 ở 250C. - Dung dịch Ringer nồng độ ¼ - Dung dịch Pepton - Dung dịch đệm Photphat 3.4.3.4.2 Môi trường nuôi cấy: - Môi trường VRBL (Violet red bile lactose) – Môi trường đặt chọn lọc. - Môi trường BGB (Brillan green Bile Lactose) 2% - môi trường khẳng định. 3.4.3.5 Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu vào bình chứa 225mL nước cất vô trùng hoặc chất pha loãng, lắc cho tan mẫu hoàn toàn. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 26 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Lấy 2 đĩa petri, dùng pipetman vô trùng cho vào mỗi đĩa 1mL mẫu thử. Nồng độ pha lõang 10-1. - Lấy 2 đĩa petri khác, dùng pipetman vô trùng cho vào mỗi đĩa 1mL mẫu thử. Nồng độ pha lõang 10-2. - Thực hiện tương tự cho độ pha loãng tiếp theo nếu cần. - Rót vào mỗi đĩa petri khỏang 15mL môi trường VRBL (đã giữ ở 450C – 500C trong bể điều nhiệt), xoay nhẹ đĩa theo kim đồng hồ và ngược lại để hòa tan mẫu vào môi trường. Để môi trường đông đặc tự nhiên. - Thực hiện song song mẫu đối chứng với 15mL môi trường VRBL. - Đổ thêm 4mL môi trường VRBL tráng phủ kín bề mặt mỗi đĩa và để đông đặc như trên. - Thời gian hoàn tất 1 mẫu không quá 15 phút. - Lật úp và ủ các đĩa vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C ±10C trong 24 giờ ±2giờ. - Sau 24 giờ, đếm các khuẩn lạc Coliform có màu đỏ tía, đường kính ≥0.5mm, đôi khi có vòng đỏ nhạt bao quanh. - Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất 15 khuẩn lạc, nhiều nhất 150 khuẩn lạc để đếm và khẳng định. 3.4.3.6 Thử khẳng định Cấy 5 khuẩn lạc từ mỗi lọai vào các ống nghiệm chứa môi trường BGB 2% và nuôi ở nhiệt độ 300C ± 10C trong 24 giờ ± 2giờ , các khuẩn lạc cho thấy sự sinhkhí trong ống Durham được coi là Coliform. 3.4.3.7 Tính kết quả Số Coliform có trong 1mL hoặc 1g (sản phẩm khác) được tính theo công thức: Tổng số Coliform/1g mẫu = Σc/(n1+0.1n2)d Trong đó: Σc : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai 3.4.4 E.coli 3.4.4.1 Phương pháp Kiểm tra Escherichia coli giả định theo Iso 11866 - 1997 Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 27 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.4.2 Phạm vi áp dụng Xác định Escherichia coli giả định trong sữa và sản phẩm sữa. 3.4.4.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị & dụng cụ vi sinh thông thường. 3.4.4.4 Môi trường và thuốc thử • Lauryl sulfate tryptose broth • EC broth. • Tryptone water. • Thuốc thử Kovacs 3.4.4.5 Quy trình phân tích (phương pháp MPN) - Chuẩn bị dịch đồng nhất mẫu hoặc pha lõang mẫu để được dịch mẫu có độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng ở những nồng độ kế tiếp (10-2 - 10-3 ,...) sao cho dãy ống nghiệm ở nồng độ pha loãng cuối cùng có 01 ống cho kết quả âm tính. - Thực hiện trên 9 ống nghiệm (mỗi một nồng độ sử dụng 3 ống nghiệm). - Ở mỗi nồng độ sử dụng 01 pippet vô trùng, tuần tự cấy 10ml dịch mẫu đã pha l loãng ở nồng độ 10-1 vào 3 ống nghiệm chứa môi trường Lauryl sulfate tryptose broth có nồng độ kép. Tiếp tục hút 1ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-2 vào 3 ống nghiệm chứa môi trường Lauryl sulfate tryptose broth có nồng độ đơn và thực hiện tương tự đối với dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-3. - Nếu nghi ngờ số lượng E.Coli trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. - Ủ các ống nghiệm ở 370C ± 20C trong 24h ± 2h. Sau 24h nếu không có hiện tượng sinh khí ủ tiếp đến 48h ± 2h. - Ghi nhận số ống sinh khí. Dùng que cấy vòng, cấy chuyền các ống sinh khí sang các ống nghiệm chứa môi trường EC broth, ủ ở 440C± 20C trong 24h ± 2h, sau 24h nếu không có hiện tượng sinh khí, tiếp tục ủ đến 48h ± 2h. - Ghi nhận số ống sinh khí ứng với mỗi độ pha loãng. - Dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống EC broth (+) sang ống nghiệm chứa 5 – 10ml tryptone water. Ủ 440C± 20C trong 48h ± 2h. Sau thời gian ủ, nhỏ 0.5ml thuốc thử Kovacs vào các ống nghiệm, lắc đều, sau 1 phút nếu trong ống nghiệm xuất hiện vòng màu đỏ là dương tính. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 28 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả dương tính trên môi trường tryptone ứng với mỗi độ pha loãng. 3.4.4.6 Tính kết quả - Từ số lượng các ống nghiệm có E.Coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 9 ống – phụ lục 1) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN / g mẫu hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. - Ghi chú: Nếu giá trị MPN < 0,3 E.Coli / g hay ml mẫu thì kết quả ghi như sau: không có sự hiện diện E.coli trong 01 ml hay 1g mẫu. Bảng chỉ số MPN & giới hạn độ tin cậy (mức độ tin cậy) Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 29 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.5 Staphilococcus aureus 3.4.5.1 Phương pháp Kiểm tra Staphilococcus aureus theo ISO (6888-1) - 1999 3.4.5.2 Phạm vi áp dụng Định lượng Staphylococcus Aureus trong thực phẩm. 3.4.5.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ vi sinh thơng thường đã tiệt trùng 3.4.5.4 Môi trường và thuốc thử - Baird parker agar medium - Brain heart infusion broth - Rabbit plasma 3.4.5.5 Quy trình phân tích - Dùng pipet tiệt trùng hút 1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha loãng thích hợp vào 3 đĩa môi trường thạch Baird parker (mỗi đĩa khoảng 0.3ml). Hoặc hút 0.1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha loãng bằng pipet tiệt trùng cho vào 1 dĩa thạch Baird parker (thực hiện 2 đĩa song song). Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt môi trường càng nhanh càng tốt. Lật úp đĩa, ủ ở 35°C - 37°C trong 24h ± 2h. - Sau 24h ± 2h đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc đặc trưng. Tiếp tục ủ thêm 24h ± 2h và đánh dấu các khuẩn lạc đặc trưng mới hình thành, cần đếm cả các khuẩn lạc không đặc trưng. Giữ lại các đĩa cĩ số khuẩn lạc trong khoảng 15 – 150. - Chọn: + 5 khuẩn lạc đặc trưng trong trường hợp những đĩa chỉ chứa các khuẩn lạc đặc trưng. + 5 khuẩn lạc khơng đặc trưng trong trường hợp những đĩa chỉ chứa các khuẩn lạc khơng đặc trưng. + 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc khơng đặc trưng trong trường hợp những đĩa chứa cả 2 dạng khuẩn lạc trên. Khuẩn lạc Staphylococcus Aureus đặc trưng cĩ màu đen hoặc xám, bĩng, lồi vàcĩ vàng sáng bao quanh. - Nhuộm gram: gram (+) - Khẳng định: Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 30 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Dùng que cấy vịng cấy mỗi một khuẩn lạc đã được chọn lọc từ mơi trường Braid – Parker sang ống nghiệm chứa 10ml Brain heart infusion broth, ủ ở 35°C hoặc 37°C trong 24h ± 2h. Sau 24h ± 2h dùng pipette vơ trùng cấy 0.1ml canh trùng vào ống nghiệm chứa 0.3ml huyết tương thỏ Rabbit Plasma và ủ ở 35°C - 37°C. Theo dõi phản ứng đơng huyết tương sau 4h, 6h, 24h. Kết quả thử nghiệm là dương tính khi thể tích khối đơng huyết tương lớn hơn ½ thể tích dịch lỏng ban đầu. 3.4.5.6 Tính kết quả 3.4.5.6.1 Tính số khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính trên mỗi đĩa : Trong đó: Ac: số khuẩn lạc đặc trưng được chọn để thử phản ứng Coagulase bc: số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng Coagulase dương tính Cc: tổng số khuẩn lạc đặc trưng đánh dấu trên đĩa Anc: số khuẩn lạc khơng đặc trưng được chọn để thử phản ứng Coagulase bnc: số khuẩn lạc khơng đặc trưng cho phản ứng Coagulase dương tính Cnc: tổng số khuẩn lạc khơng đặc trưng đánh dấu trên đĩa. 3.4.5.6.2 Tính số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên một đơn vị mẫu thử: Trong đó: Σa: tổng số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus cho phản ứng Coagulase dương tính trên tất cả các đĩa đã được chọn V : thể tích mẫu trên mỗi đĩa (ml) n1: số đĩa được đếm ở nồng độ pha lỗng thứ nhất. n2: số đĩa được đếm ở nồng độ pha lỗng thứ hai Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 31 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến d : hệ số pha lỗng tương ứng với nồng độ pha lỗng thứ nhất Kết quả được làm trịn đến 2 chữ số cĩ nghĩa. 3.4.5.6.3 Tính trên lượng nhỏ: a) Nếu 2 đĩa, mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc, kết quả được ghi nhận như sau: - Đối với sản phẩm lỏng, số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus cho phản ứng Coagulase dương tính trên 1ml mẫu dựa vào cơng thức: Trong đó: Σa: tổng số khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính được xác định dựa vào công thức (1) trên 2 đĩa đã được chọn. V : thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml) - Đối với sản phẩm khác (được pha loãng), số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus cho phản ứng Coagulase dương tính trên 1g mẫu dựa vào cơng thức: Trong đó: Σa: tổng số khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính được xác định dựa vào cơng thức (1) trên 2 đĩa đã được chọn. V : thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml) d : hệ số pha lõang b) Nếu 2 đĩa khơng chứa bất kỳ khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính và nếu thể tích mẫu cấy là 0.1ml thì kết quả được ghi nhận như sau: < 10 khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên 1ml (sản phẩm lỏng) < 10/d khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên 1g (sản phẩm khác); trong đĩ d là hệ số pha lõang. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 32 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.6 Clostridium perfringens 3.4.6.1 Phương pháp Định lượng Clostridium Perfringens theo ISO 7937 – 1997 – 04 -15trong thực phẩm và thức ăn gia súc. 3.4.6.2 Phạm vi áp dụng Định lượng Clostridium Perfringens trong thực phẩm và thức ăn gia súc. 3.4.6.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ vi sinh thơng thường đã tiệt trùng. 3.4.6.4 Môi trường và thuốc thử - Egg yolk free tryptose sulfite cycloserine agar (SC) – Mơi trường này đã từng được gọi là EY – free TSC - Fluid thioglycollate medium - Lactose sulfite medium (LS) 3.4.6.5 Quy trình phân tích - Cấy 1ml dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha lỗng thích hợp vào một đĩa petri vơ trùng. Đổ 10ml – 15ml mơi trường SC agar đã được ủ 470C vào đĩa, lắc đều. Sau khi mơi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 15ml SC agar. Đĩa đã cấy mẫu được ủ ở 350C hoặc 370C trong 20h ± 2h trong bình kỵ khí. - Thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi độ pha lỗng. - Sau khi ủ, khuẩn lạc Clostridium Perfringens trên mơi trường SC agar cĩ màu đen. Giữ lại các đĩa cĩ số khuẩn lạc nhỏ hơn 150, chọn 5 khuẩn lạc điển hình. Nếu số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa nhỏ hơn 5 thì chọn tất cả để tiến hành thử nghiệm sinh hĩa. - Cấy từng khuẩn lạc chọn lọc vào trong ống nghiệm chứa 10ml mơi trường fluid thioglycollate. Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 350C hoặc 370C trong 18h đến 24h. Sau khi ủ, dùng pippet vơ trùng cấy 5 giọt dịch canh trùng từ mơi trường fluid thioglycollate sang ống nghiệm chứa 8ml mơi trường LS cĩ ống Durham lật úp. - Ủ ở 460C trong 18h đến 24h. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 33 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Kết quả được xem là dương tính nếu mơi trường chuyển thành màu đen và khí - Sinh ra phải lớn hơn ¼ chiều cao ống Durham. 3.4.6.6 Tính kết quả 3.4.6.6.1 Tính số khuẩn lạc C. perfringens trên mỗi đĩa theo cơng thức sau: Trong đó: b: số khuẩn lạc C.perfringens cho thử nghiệm dương tính A: số khuẩn lạc C.perfringens được chọn để tiến hành thử nghiệm C: số khuẩn lạc đặc trưng được đánh dấu trên đĩa. 3.4.6.6.2 Phương pháp tính: 3.4.6.6.2.1 Những đĩa chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc C. perfringens Trong đó: ∑a: tổng số khuẩn lạc C.perfringens trên tất cả các đĩa ở hai nồng độ pha lỗng liên tiếp. n1: số đĩa được đếm ở độ pha lỗng thứ nhất. n2: số đĩa được đếm ở độ pha lỗng thứ hai d: hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thứ nhất N: số khuẩn lạc C.perfringens trong 1g hoặc 1ml mẫu Kết quả được làm tròn đến 2 chữ số có nghĩa. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 34 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.6.6.2.2 Tính trên số lượng nhỏ - Nếu 2 đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc C.perfringens dựa vào cơng thức (1) tính số khuẩn lạc C.perfringens cho mỗi đĩa. Đặt m là số khuẩn lạc trung bình đếm được trên 2 đĩa. - Nếu sản phẩm lỏng: (không pha loãng): N E : số khuẩn lạc C.perfringens trên 1ml mẫu. - Nếu sản phẩm khác: N E = m / d N E : số khuẩn lạc C.perfringens trên 1g mẫu. d : hệ số pha loãng 3.4.6.6.2.3 Không có khuẩn lạc Nếu 2 đĩa không chứa bất kỳ khuẩn lạc C.perfringens nào, kết quả được ghi nhận như sau: < 1 C.perfringens trên 1ml (sản phẩm lỏng) < 1/d C.perfringens trên 1g mẫu (sản phẩm khác) d: hệ số pha loãng 3.4.7 Streptococci faecal 3.4.7.1 Phương pháp: Phân tích Streptococci trong nước uống đóng chai theo TCVN 6189 -2 1996 3.4.7.2 Phạm vi áp dụng: Phát hiện Streptococci feacal trong thực phẩm. 3.4.7.3 Thiết bị và dụng cụ: Dụng cụ chuyên dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. 3.4.7.4 Môi trường và thuốc thử: Môi trường pha sẵn SB (thạch Slanetz – Bartley) 3.4.7.5 Quy trình phân tích: - Dùng pipet tiệt trùng hút 1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha loãng thích hợp vào 3 đĩa mơi trường thạch SB (mỗi đĩa khoảng 10ml). Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 35 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Hoặc hút 0.1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha lỗng bằng pipet tiệt trùng cho vào 1 dĩa thạch Baird parker (thực hiện 2 đĩa song song). Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt mơi trường càng nhanh càng tốt. Lật úp đĩa, ủ ở 35°C - 37°C trong 24h ± 2h. - Sau 24h ± 2h đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc đặc trưng. Tiếp tục ủ thêm 24h ± 2h và đánh dấu các khuẩn lạc đặc trưng mới hình thành, cần đếm cả các khuẩn lạc khơng đặc trưng. - Giữ lại các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 15 – 150. 3.4.7.6 Tính kết quả: Số Streptococci feacal có trong 1mL hoặc 1g (sản phẩm khác) được tính theo công thức: Tổng số Strep/1g mẫu = Σc/(n1+0.1n2)d Trong đó: Σc : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai 3.4.8 Speudomonas aeruginosa 3.4.8.1 Phương pháp: Dựa trên phương pháp định lượng Pseumonas aeruginosa theo TCVN 7138: 2002 3.4.8.2 Phạm vi áp dụng: Định lượng Pseumonas aeruginosa trong thực phẩm. 3.4.8.3 Thiết bị và dụng cụ: Dụng cụ chuyên dụng nuôi cấy vi sinh vậ trong phòng thí nghiệm. 3.4.8.4 Môi trường và thuốc thử: Môi trường chuyên dụng pha sẵn nuôi cấy Pseumonas aeruginosa. Thành phần môi trường Pseu (Phụ lục) 3.4.8.5 Quy trình phân tích: Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 36 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Chuyển 0.1 ml dung dịch nước giải khát hoặc mẫu nguyên liệu khô đã đồng hóa vào đĩa petri chứa khoảng 10 – 15ml dung dịch môi trường Pseu. - Dùng que trang vô trugnf dàn đều mẫu trên đĩa. - Lật úp đĩa và đem đi nuôi ở nhiệ độ 370C trong 24h. 3.4.8.6 Tính kết quả: Đếm và chọn các đĩa có từ 15 đến 150 khuẩn lạc. Tính số lượng khuẩn lạc trong 1ml dung dịch hoặ trong 1g mẫu (nguyên liệu rắn) theo công thức: Coliform/1g mẫu = Σc/(n1+0.1n2)d Trong đó: Σc : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai 3.4.9 Salmonella 3.4.9.1 Phương pháp Phát hiện Salmonella trong nước uống đóng chai theo TCVN 6785 : 2001 3.4.9.2 Phạm vi áp dụng Xác định Samonella trong sữa thực phẩm. 3.4.9.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị & dụng cụ vi sinh thông thường. 3.4.9.4 Môi trường và thuốc thử • Nước Peptone đệm (BPW) • Môi trường Rappaport – Vassiliadis bổ sung Malachite Green Magnesium Chloride (RVS broth) • Môi trường Selenite Cystine broth • Môi trường Brilliant Green Phenol Red Agar (Edel and Kampelmacher) • Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate Agar • Môi trường TSI Agar • Môi trường Urea agar • Môi trường L.Lysine decarboxylation Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 37 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến • Nước muối sinh lý • Thuốc thử dùng cho phản ứng β - galactosidase • Thuốc thử dùng cho phản ứng Voges – Proskauer • Thuốc thử dùng cho phản ứng Indole 3.4.9.5 Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu vào lọ chứa 225ml môi trường BPW, để yên 60 phút ± 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút nếu mẫu vẫn chưa tan, lắc đến khi mẫu tan hòan tòan, sau đó ủ ở 37°C trong 16h – 20h. - Tăng sinh chọn lọc: Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, chuyển 0.1ml dịch tăng sinh sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS broth, ủ ở 41.5°C trong 18h – 24h. Thực hiện song song, chuyển 10ml dịch tăng sinh sang lọ chứa 100ml môi trường Selenite Cystine broth, ủ ở 37°C trong 18h – 24h. - Phân lập và nhận diện: + Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn từ dịch tăng sinh chọn lọc RVS lên đĩa môi trường Brilliant green phenol red agar và đĩa môi trường XLD agar, ủ ở 37°C trong 18h – 24h. + Thực hiện tương tự đối với mẫu từ dịch tăng sinh chọn lọc Selenite Cystine broth lên đĩa môi trường Brilliant green phenol red agar và đĩa môi trường XLD Agar ủ ở 37°C trong 20h – 24h. + Sau 20h -24h các biểu hiện của Samonella trên từng môi trường khác nhau như sau: o Trên môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm đen. Một số đông Samonella có thể có tâm đen, bóng, rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. o Trên môi trường Brilliant green phenol red agar: khuẩn lạc có màu hồng, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển thành màu đỏ. 3.4.9.6 Khẳng định - Từ môi trường chọn lọc phân biệt chọn 5 khuẩn lạc, nếu ít hơn 5 khuẩn lạc thì chọn tất cả để khẳng định. - Cấy các khuẩn lạc đã chọn lên môi trường Nutrient agar ủ ở 37°C trong 18h đến 24h. Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc thuần để sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 38 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến a) Trên môi trường TSI: Dùng que cấy vòng cấy lên phần nghiêng và cấy đâm sâu vào môi trường chứa trong ống nghiệm, ủ ở 37°C trong 24h. Giải thích sự thay đổi của môi trường như sau: * Phần đáy ống nghiệm: Màu vàng: có sự lên men glucose Màu đỏ : không có sự lên men glucose Màu đen: có sự hình thành hydrogen sulfide Nứt thạch: có hiện tượng sinh khí * Phần nghiêng môi trường: Màu vàng: có sử dụng lactose và sucrose hoặc sử dụng một trong hai lọai đường trên. Màu đỏ: không sử dụng lactose cũng như sucrose b) Trên môi trường Ure agar: Dùng que cấy vòng cấy một ít sinh khối lên phần nghiêng môi trường. Ủ ở 37°C trong 24h. Thử nghiệm dương tính khi có sự phân giải urea phóng thích khí NH3 làm thay đổi màu môi trường từ đỏ sang hồng, để lâu hơn chuyển sang màu đỏ tím (deep cerise). Ngòai ra còn phân biệt: dương tính nhanh khi màu đổi trong vòng 2h – 4h. c) Trên môi trường L.Lysine decarboxylation: Cấy một ít sinh khối vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường. Ủ ở 37°C trong 24h. - Thử nghiệm dương tính khi màu môi trường chuyển sang màu tím. - Thử nghiệm âm tính: màu môi trường là màu vàng. d) Phản ứng β - Galactosidase: Dùng que cấy vòng cấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần vào ống nghiệm chứa 0.25ml dung dịch nước muối. Nhỏ vào ống nghiệm 1 giọt Toluen và lắc. Đặt ống nghiệm vào bể điều nhiệt 37°C trong 24h. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 39 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Thử nghiệm dương tính khi dịch trong ống nghiệm có màu vàng. Phản ứng thường thấy rõ sau 20 phút. e) Phản ứng Voges – Proshauer: Dùng que cấy vòng cấy một ít sinh khối vào 2 ống nghiệm, mỗi ống chứa 0.2ml môi trường VP, một ống ủ ở nhiệt độ phòng và một ống ủ ở 37°C trong 24h. Sau khi ủ, theo thứ tự nhỏ vào mỗi ống 2 giọt Creatine, 3 giọt 1-naphthol ethanolic và 2 giọt potassium hydroxide, lắc đều sau khi cho mỗi chất phản ứng vào ống nghiệm. Thử nghiệm dương tính khi có sự chuyển màu: từ màu hồng sang đỏ nhạt trong vòng 15 phút. f) Phản ứng Indole: Cấy 1 ít sinh khối vào ống nghiệm chứa 5ml Tryptone / Tryptophan ủ ở 37°C trong 24h. Sau khi ủ, nhỏ vào 1 giọt thuốc thử Kovac. Thử nghiệm dương tính: khi vòng màu đỏ xuất hiện. Giải thích kết quả sinh hóa: 3.4.9.7 Tính Kết quả - Kết quả định tính Samonella được báo cáo là (+) hoặc (-) / 25g mẫu. 3.4.10 Bacillus cereus 3.4.10.1 Phương pháp Kiểm tra bacillus cereus theo iso 7932 - 1987 Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 40 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.10.2 Phạm vi áp dụng Phương pháp này áp dụng cho việc xác định số khuẩn lạc Bacillus Cereus trong thực phẩm cho người và động vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30°C. 3.4.10.3 Thiết bị và dụng cụ - Tủ sấy điều chỉnh được ở 170 - 175°C trong thời gian không ít hơn 1h. - Nồi hấp tiệt trùng ở 121 ± 1°C trong thời gian không ít hơn 20’ - Tủ ấm điều chỉnh được nhiệt độ 50 ± 1°C - Tủ ấm điều chỉnh được nhiệt độ 30 ± 1°C - Bếp cách thủy duy trì được ở nhiệt độ 45 ± 5°C và 50 ± 1°C - Que cấy làm bằng platinum – iridium hoặc nickel-chromium, đường kính xấp xỉ 3mm và que cấy tròn cùng chất liệu. - Máy đo pH: hiệu chuẩn được ở độ chính xác ± 0.1pH ở 25°C. - Oáng nghiệm: 18 x 180mm - Dĩa petri đường kính 90 -100mm; nếu cần có thể 140mm - Pipette chia độ: 10ml và 1ml, vạch chia tương ứng 0.5ml và 0.1ml với đầu pippet đường kính 2 – 3mm - Que trang thủy tinh hình tam giác đều cách 3cm, đầu que dài 20cm, cấu trúc dễ đốc tiệt trùng. - Bóp cao su 3.4.10.4 Môi trường và thuốc thử 3.4.10.4.1 Lòng đỏ trứng(egg yolk emusion): đã pha sẵn chuyên dùng, lưu giữ ở nhiệt độ 0-50C 3.4.10.4.2 Môi trường thạch cơ bản a) Môi trường thạch pha sẵn dạng khan Bacillus Cereus selective agar (MYB agar). Hòa tan 45g môi trường khan trong 01 lít nước cất, lắc đều. Đun nhẹ, khuấy đều đến khi sôi và tan hoàn toàn. Nếu cần, điều chỉnh về pH=7.2 rồi phân phối 90ml hoặc 180ml vào chai thủy tinh có nắp, hấp tiệt trùng ở 120°C trong 15 phút. Trước khi sử dụng làm nguội đến 50°C, thêm 10ml egg yorlk Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 41 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 20% vào 90ml môi trường. Lắc đều, rót môi trường vào các dĩa petri đã khô sạch, tiệt trùng; để đông đặc rồi sấy đĩa trong tủ ấm ở 30°C ± 1°C trong 30’. b) Môi trường thạch dùng để phân lập: Chuẩn bị giống môi trường MYB nhưng không thêm egg yorlk. Sau khi hấp tiệt trùng, làm nguội trong bếp cách thủy 45 ± 5°C, rót vào các dĩa petri và để đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, sấy khô dĩa (lật úp ngược dĩa và sấy khô) trong tủ ấm ở 50 ± 1°C trong 30’. Nếu chuẩn bị dĩa trước, các dĩa chưa qua sấy chỉ nên được giữ không quá 4h ở nhiệt độ phòng và không quá 1 ngày ở nhiệt độ 0 - 5°C. 3.4.10.4.3 Môi trường glucose agar: Thành phần theo bảng sau: Tryptone 10.0g Yeast extract 1.5g Glucose (C6H12O6) 10.0g Sodium Chloride (NaCL) 5.0g Bromocrerol purple (C12H15Br2NaO2S) 0.015g Agar 12-18g Nước 1000ml Hòa tan các thành phần vào nước bằng cách đun sôi. Điều chỉnh pH để sau khi hấppH = 7.0. Chuyển 15ml môi trường vào ống nghiệm. Tiệt trùng 15 phút ở 121°C, 1atmNgay trước khi sử dụng làm chảy môi trường trong bếp cách thủy hoặc vòi nước trong 10 phút rồi tiếp tục làm nguội nhanh đến khoảng 30°C. 3.4.10.4.4 Môi trường Voges – Proskauer (VP): Thành phần theo bảng sau: Peptone 7.0g Glucose (C6H12O6) 5.0g K2HPO4 (Dipotassium hydrogen orthophosphate) 5.0g Sodium Chloride (NaCL) 5.0g Nước 1000mL Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 42 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Hòa tan các thành phần hoặc môi trường khan pha sẵn trong nước. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng có pH = 7.0. Rót 5ml môi trường vào ống nghiệm (18 x 180mm), tiệt trùng 15 phút ở 121°C. 3.4.10.4.5 Thuốc thử Voges – Proskeuer (V.P): - Dung dịch α - napthol (C10H8O) 5% trong cồn 96%. Giữ trong chai nâu có nútchặt ở 0-5°C° - Dung dịch Potassium hydroxide (KOH) 40% trong nước cất. - Tinh thể creatine (C4H10N3O) 3.4.10.4.6 Nitrate medium: Hòa tan 22g môi trường khan trong 01 lít nước cất. Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng có pH = 7.0. Chuyển 5ml môi trường vào ống nghiệm (18x180mm), tiệt trùng 15 phút ở 121°C. 3.4.10.4.7 Thuốc thử Nitrate: - α - napthol (C4H10O): dung dịch 0.5% (W/V) trong acid acetic 5 mol/l. Hòa tan 0.5g α - napthol trong acid acetic và lọc qua giấy lọc vi sinh. Giữ trong chai nâu nút chặt (có bóp nhỏ giọt) ở 0 - 5°C. - Sulfanilic acid, dung dịch 0.8% (W/V) trong acid acetic 5 mol/l: hòa tan acid sulfanilic trong acid acetic, lọc qua giấy lọc vi sinh. - Thuốc thử hòan chỉnh: ngay trước khi sử dụng trộn đồng thể tích 2 dung dịch trên. - Bột kẽm 3.4.10.5 Quy trình phân tích 3.4.10.5.1 Cân mẫu, pha loãng nồng độ ban đầu 3.4.10.5.2 Cấy và ủ mẫu: - Dùng pipet tiệt trùng hút 1ml dung dịch mẫu nguyên (dạng lỏng) hoặc pha loãng (dạng khác) cho vào 3 đĩa thạch MYB (mỗi đĩa khoảng 0.3ml) - Hoặc hút 0.1mL dung dịch mẫu nguyên (dạng lỏng) hoặc pha loãng (dạng khác) trên bằng pipet tiệt trùng cho vào 1 đĩa thạch MYB (thực hiện 2 đĩa song song). Tùy theo nồng độ vi sinh vật có trong mẫu mà thực hiện các nồng độ pha loãng tiếp theo. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 43 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Cẩn thận dùng que trang tiệt trùng trải đều mẫu lên bề mặt thạch không chạm que vào thành dĩa. Mỗi que trang dùng cho 1 dĩa. Để yên 15 phút ở nhiệt độ phòng. - Ủ dĩa/ (úp ngược) trong tủ ấm 300C±10C trong 18 – 24h. Nếu khuẩn lạc chưa rõ ràng, ủ thêm 24h trước khi đếm. 3.4.10.6 Khẳng định: Bước 1: Chọn lọc và thuần hóa các khuẩn lạc lấy để khẳng định: - Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi dĩa được chọn ở mục VI, nếu có ít hơn 5 khuẩn lạc trên mỗi dĩa, chọn tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ để khẳng định. - Nếu các dĩa mọc quá dày khó có thể chọn khuẩn lạc phân lập tốt, cấy via 5khuẩn lạc nghi ngờ trên dĩa thạch MYP, ủ trong tủ ấm 300C±10C trong 18 – 24h. Chọn ít nhất 1 khuẩn lạc rõ ràng, có màu hồng từ đĩa này để tiến hành khẳng định. Bước 2: Trên môi trường glucose – agar: Dùng que cấy tròn lấy các khuẩn lạc được chọn vào ống nghiệm chứa môi trường glucose –agar đã được làm tan chảy. Ủ các ống nghiệm ở 300C±10C trong 24h. Nếu cả ống nghiệm có màu vàng, thường kèm theo có sinh khí thì chứng tỏ khuẩn lạc cho phản ứng glucose dương tính. Bước 3: Phản ứng trên môi trường V.P: - Cấy chuyền các khuẩn lạc chọn lọc vào ống nghiệm chứa môi trường V.P.Ư trong tủ ấm 300C±10C trong 24h. - Chuyển 1mL canh trùng vào ống nghiệm sạch để thử acetylmethylcarbinol thêm 0.2mL KOH 40%; 0.6mL alpha-naphthol và 1 vài tinh thể creatine, lắc mạnh và để yên 1h. Phản ứng dương tính sẽ cho màu hồng eosin trong ống nghiệm. Bước 4: Trên môi trường nitrat: - Cấy chuyền các khuẩn lạc chọn lọc vào ống nghiệm chứa môi trường nitrat. Ủ trong tủ ấm ở 300C±10C trong 24h. - Kiểm tra phản ứng khử nitrat bằng cách thêm (0.2 – 0.5)mL thuốc thử nitrit vào mỗi ống nghiệm. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 44 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Nếu có màu đỏ xuất hiện thì đã có phản ứng nitrat thành nitrit. Nếu không có màu đỏ xuất hiện trong 15s, thêm 1 ít bột kẽm và để yên 10 phút vẫn không có màu đỏ xuất hiện thì phản ứng nitrat âm tính. 3.4.10.7 Tính kết quả 3.4.10.7.1 Tính toán kết quả: Nếu 80% số khuẩn lạc nghi ngờ được chọn để khẳng định thì lấy tất cả các khuẩn lạc đếm được để tính kết quả. Còn trong các trường hợp khác, tính tóan số lượng Bacillius cereus từ phần trăm của cereus đếm được ở trên. Trường hợp tổng trung bình của các khuẩn lạc khẳng định ở nhỏ hơn 15, báo cáo kết quả như sau: X = (Y x ne) bacillus cereus/mL (g). Trong đó: ne = 1/V; V: thể tích mẫu hút để cấy; Y: số khuẩn lạc nhỏ hơn 15. - Trường hợp có pha loãng ne = 1/V x 1/d Trong đó, d: độ pha loãng của mẫu. - Trường hợp không có khuẩn lạc nào được khẳng định là Bacillus cereus trên mẫu ban đầu (dạng lỏng) hoặc với dung dịch huyền phù ban đầu (đối với sản phẩm dạng khác) thì biểu diễn kết quả như sau: X = Y x ne bacillus cereus /g (mL) Y: số khuẩn lạc nhỏ hơn 1 3.5 Kết quả thu thập và biện luận Kết quả sau khi phân tích sẽ được lưu lại để xử lý. Vì một số yêu cầu bảo mật của công ty nên em sẽ trình bày kết quả cách xử lý kết quả chung về yêu cầu vi sinh vật trong nước giải khát theo yêu cầu vi sinh vật đối với nước khoáng thiên nhiên đóng chai TCVN 6213:2004: - Phải đảm bảo chất lượng không gây rủi ro cho sức khoẻ người tiêu dùng (không được có các vi sinh vật gây bệnh); - ngoài ra phải tuân thủ các yêu cầu về vi sinh vật sau đây: Kiểm tra lần đầu Quyết định E.Coli 1 x 250ml Không phát hiện trong bất Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 45 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến kỳ mẫu nào Coliform tổng số 1 x 250ml Nếu > 1 hoặc < 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ 2 Streptococci feacal 1 x 250ml Pseudomonas aeruginosa 1 x 250ml Nếu > 2 thì loại bỏ Kiểm tra lần thứ hai E. coli n c* m M Coliform tổng số 4 1 0 2 Streptococci feacal 4 1 0 2 Pseudomonas aeruginosa 4 1 0 2 ----- * Các kết quả của lần kiểm tra thứ nhất và thứ hai: Kiểm tra lần thứ hai được thực hiện sử dụng cùng thể tích như đã dùng để kiểm tra lần đầu. Trong đó: - n: số đơn vị mẫu lấy từ lô hàng để kiểm tra. c: số lượng mẫu tối đã có thể chấp nhận hoặc số lượng đơn vị mẫutối đa cho phép vượt quá chuẩn m về vi sinh vật. Nếu vượt quá số này thì lô hàng được coi là không đạt. m: là số lượng tối đa hoặc mức tối đa vi khuẩn tương ứng/g; các giá trị trên mức này có thể được chấp nhận hoặc không được chấp nhận. M: là lượng thực phẩm được chấp nhận trong số thực phẩm không được chấp nhận. Giá trị bằng M hoặc lớn hơn M trong bất kỳ mẫu nàod dều không được hcấp nhậnvì ảnh hưởng tới sức khoẻ con người. Dựa trên kết quả sau khi phân tích các mẫu ta đem so sánh với yêu cầu số lượng vi sinh vật cho phép trong các mẫu ma ta có cách xử lý. Quan trọng nhất chính là thành phẩm, vi đây la sản phẩm sẽ tung ra thị trường cho người tiêu dùng. Nếu như mẫu thành phẩm đạt tất cả các chỉ tiêu cho phép thi cho Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 46 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến xuất xưởng. Còn nếu chỉ cần không đạt 1 trong các chỉ tiêu nêu trên thì phải đem đi kiểm tra lại lần thứ 2. Song song với đó phải kiểm tra cũng như đối chiếu các mẫu bán thành phẩm và nguyên liệu nhằm xác định nguyên nhân bị nhiễu là từ đâu, ở khâu nào trong dây chuyền sản xuất để có cách xử lý. Đối với thành phẩm sau khi kiểm tra lại lần 2 hoặc có thể lần thứ 3 mà thấy đạt yêu cầu nghĩa là do sai sót của nhân viên kiểm tra vi sinh. Còn nếu mẫu vẫn bị nhiễm nghĩa là do 1 trong các khâu sản xuất. Khi đó dựa trên kết quả đó mà có cách xử lý khác nhau. Nếu nhiễm các loại vi sinh mà không thể xử lý nhiệt thì phải tiên hành tiêu hủy. Tại Nhà Máy Sản Xuất Nước Giải Khát, thường thì mẫu thành nhiễm các các chỉ tiêu đã nêu ở trên (khó nhất là dạng bào tử) thì đem đi xử lý nhiệt khoảng 800C rồi đi cấy lấy kết quả. Nếu nhiễm ở mức độ vẫn còn cho phép thì có thể đem đi tái chế bằng cách pha loãng với các tỉ lệ thích hợp với các mẻ đã phối trộn mới. Sau đó tiếp tục đem qua xử lý UHT và đóng gói cũng như kiểm tra chất lượng. Nếu đạt sẽ cho xuất xưởng. 3.6 Kết luận và kiến nghị Sau thời gian thực tập tại phòng phân tích vi sinh em xin có một số nhận xét sau đây: - Các chỉ tiêu phân tích là tương đối đầy đủ và đạt tiêu chuẩn ISO. - Các phương pháp phân tích đúng theo các tiêu chuẩn ISO và có độ chính xác cao. - Trang thiết bị tương đối đầy đủ và đáp ứng được yêu cầu công việc. - Cán bộ và nhân viên phân tích có chuyên môn và tinh thần trách nhiệm cao cũng như rất tận tình hướng dẫn cho sinh viên thực tập. Qua đó em cũng có một số ý kiến đề xuất như sau: - Các phương pháp phân tích tương đôi cổ điển, có thể thay thế bằng các phương pháp mới để tiết kiệm thời gian cũng như để đảm bảo độ chính xác cao hơn như: sử dụng đĩa petri film để nuôi cấy hoặc sử dụng rapid test và cũng có thể dùng các biosensor... Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 47 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Quy mô sản xuất của nhà máy tương đối lớn vì vậy các mẫu cần phân tích khá nhiều. Tuy nhiên số lượng nhân viên phân tích vi sinh hiện nay chỉ một người hoàn toàn rất khó đảm đương một lượng công việc rất lớn. Vi vậy nhà máy cần phải tuyển thêm nhân lực cho phòng vi sinh. - Mặc dù trang thiết bị tương đối đầy đủ và hiện đại tuy nhiên vẫn chưa hoàn toàn đáp ứng hết yêu cầu công việc. Ví dụ như thiếu máy dập mẫu, tủ ấm để ủ các mẫu chưa hoàn toàn đầy đủ các nhiệt độ tối ưu để nuôi cấy vi sinh vật, diện tích phòng vi sinh chưa đạt... Nhà máy cần nâng cấp cũng như trang bị thêm các thiết bị cần thiết. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 48 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 4. CÁC BIỆN PHÁP AN TOÀN TRONG NHÀ MÁY 4.1 Biện pháp an toàn phòng thí nghiệm vi sinh: 4.1.1 Nhân viên phòng thí nghiệm (PTN) phải tuân thủ các nguyên tắc sau: - Không được ăn trong PTN, ngoại trừ việc dùng bánh thanh vị sau khi cảm quan. - Đầu tóc, ăn mặc bảo hộ lao động phải gọn gàng, tóc dài phải buộc ra phía sau, phải luôn luôn mặc quần áo bảo hộ khi vào PTN - Không được hút thuốc trong PTN - Không phận sự miễn vào PTN - Tiếp khách trong PTN phải được sự đồng ý của người phụ trách - Khi xong việc nhớ rửa tay, cởi tháo các trang bị an toàn - Không được thực hiện các thí nghiệm không được phép. 4.1.2 Quy định an tòan khi sử dụng hóa chất: - Hóa chất được sắp xếp trong kho hay tủ chuyên dụng theo từng loại (hữu cơ, vô cơ, lỏng, rắn,…) hoặc theo thứ tự a,b,c để khi cần dễ tìm. - Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi và trước khi dùng phải đọc kỹ nhãn hiệu, hướng dẫn sử dụng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. - Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp và cổ chai. - Các loại hóa chất nhạy cảm với ánh sáng phải được giữ trong chai lọ màu tối. - Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. - Các hóa chất sử dụng xong phải được cất giữ, đặt ở nơi khô ráo, cách xa khu vực có khả năng gây lửa (nguồn nhiệt, khu vực có điện, có gas…). - Sử dụng hóa chất đúng mục đích, tiết kiệm, không sử dụng bừa bãi gây lãng phí. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 49 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Khi tiếp xúc với hóa chất phải sử dụng các thiết bị bảo hộ lao động (mắt kiếng, găng tay cao su,…), không để hóa chất tiếp xúc trực tiếp với da. Các hóa chất dễ bay hơi phải được thao tác trong tủ hotte. - Khi làm việc với các acid hay base mạnh: o Luôn luôn đổ acid hay base vào nước khi pha loãng, tuyệt đối không đổ nước vào acid hay base. o Tuyệt đối không dùng miệng hút acid hay base mà phải dùng ống bóp cao su. - Các chất thải, vật liệu, phế liệu của hóa chất phải để đúng nơi qui định - Khi có sự cố xảy ra không được dùng vòi phun nước chữa cháy mà phải dùng CO2, cát để dập tắt - Không sử dụng bếp trần để đun dung môi - Không được ôm trong người các chai acid đậm đặc - Luôn làm sạch tất cả hóa chất bị đổ ngay tức khắc - Mang chai với cả hai tay, không dùng quai xách hoặc cổ chai để xách hóa chất. 4.1.3 Biện pháp xử lý khi bị hóa chất tiếp xúc: - Khi bị bỏng acid hay base: rửa ngay với nước lạnh nhiều lần rồi bôi lên chỗ bỏng NaHCO3 1% (nếu bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). - Khi bị hóa chất bắn vào mắt: dội mạnh nhiều lần với nước lạnh sạch hoặc NaCl 1% cho đến khi sự kích thích ở mắt giảm đi. Nếu đã xử lý mà không thấy giảm phải đưa ngay đến bác sĩ - Khi bị hóa chất bắn vào quần áo: phải rửa sạch vùng dính hóa chất, nếu bị hóa chất bắn nhiều phải cởi bỏ quần áo bị tiếp xúc hóa chất, rửa sạch bằng nước lạnh và thay đồng phục khác. Nếu ở vùng da xảy ra các triệu chứng nhiễm độc như: ngứa nổi đỏ ở vùng da phải chuyển đến bệnh viện để được điều trị - Khi bị hít phải hóa chất và gây ngạt thở: Sử dụng thiết bị bảo vệ hô hấp thích hợp và chuyển ngay bệnh nhân ra khỏi nơi có hóa chất. làm hô hấp nhân tạo nếu bị ngưng thở, sau đó cho nghỉ ngơi và đưa đến bác sĩ - Khi bị nuốt phải hóa chất: chuyển ngay đến bệnh viện gần nhất. 4.2 An toàn vệ sinh thực phẩm: Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 50 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Theo các chuyên gia, sản phẩm chất lượng tốt là yếu tố bắt buộc để thành công. Đối với công ty thực phẩm, dinh dưỡng thì vệ sinh an toàn thực phẩm còn quan trọng hơn nữa. Và vì vậy tại nhà máy nước giải khát chính sách quản lý chất lượng luôn được đặt lên hàng đầu. - Để bảo đảm chất lượng nhất quán cũng như những sản phẩm có mặt trên thị trường an toàn tuyệt đối cho người sử dụng, những công ty như Vinamilk đã tuân thủ tuyệt đối các tiêu chuẩn, hệ thống quốc tế như chứng chỉ chất lượng ISO chứng chỉ vệ sinh an toàn thực phẩm HACCP. Các hệ thống này kiểm soát từ khâu nguyên liệu đầu vào (kể cả bao bì), vận hành máy móc, công nghệ cho đến thành phẩm và cuối cùng là đưa sản phẩm ra ngoài thị trường. - Một số công ty có kế hoạch đưa sản phẩm đến các siêu thị ở nước ngoài còn phải được yêu cầu đạt những chứng nhận bán lẻ chuyên biệt như BRC (British Retail Contortium). Để đạt được chứng nhận BRC, Vinamilk phải đảm bảo tuyệt đối từng yêu cầu về nguyên liệu, về nhà cung ứng nguyên liệu, về từng khâu sản xuất... 4.3 Công tác ATLĐ, xử lý môi trường, PCCC… - Thực hiện các biện pháp bảo vệ an toàn lao động đối với cán bộ và công nhân viên trực tiếp tham gia sản xuất. Trang bị quần, áo, nón bảo hộ, khẩu trang, găng tay và dép (dép đi bên ngoài màu xanh và dép đi trong khu vực sản xuất màu trắng). Các máy móc thiết bị xử dụng luôn luôn tuân thủ các tiêu chuẩn an toàn. - Môi trường xung quanh khu vực sản xuất luôn đảm bảo tiêu chuẩn HACCP. Phòng chống các loại côn trùng, ruồi, chuột... Hệ thống xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn ISO. - Trang bị đầy đủ các thiết bị phòng cháy chữa cháy khắp nhà máy, đặc biệt là những nơi dễ xảy ra cháy nổ. - Thường xuyên mở lớp tập huấn về công tác An toàn lao động, vệ sinh an toàn thực phẩm và phòng cháy chữa cháy cho cán bộ, công nhân viên trong nhà máy. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 51 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 5. NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN VỀ QUÁ TRÌNH THỰC TẬP Mặc dù thời gian thực tập tại nhà máy là không dài nhưng nhờ có kế hoạch cụ thể cũng như sự tận tình hướng dẫn của quý nhà máy, các anh chị trong ban QA và thầy hướng dẫn thực tập đã giúp em học hỏi được rất nhiều. Qua thời gian thực tập em nhận thấy và thu nhận được nhiều những kiến thức sản xuất bên ngoài thực tế. Nhờ đó mà có sự so sánh giữa những kiến thức đã được học và thực tiễn bên ngoài. Không chỉ được đi tham quan toàn bộ nhà máy, tìm hiểu về quy trình sản xuất các sản phẩm nước giải khát tại nhà máy mà còn được các anh chị hướng dẫn cho phép trực tiếp tham gia kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh. Nhờ đó mà em đã thu nhận được rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình sản xuất. Quy trình sản xuất tại nhà máy rất hiện đại, chất lượng sản phẩm đạt tiêu chuẩn cao. Mặc dù lượng nhân công tại nhà máy là không nhiều nhưng sản lượng lại rất cao và đồng nhất. Thơi gian làm việc có khoa học và đảm bảo sức khỏe cho nhân viên trong nhà máy. Sự giúp đỡ rất tận tình của quý anh chị trong công ty cung như thầy hướng dẫn đã giúp em hoàn thành quá trình thực tập và bài báo cáo thực tập. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 52 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO - Trần, L. T. (2009). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. NXB Giáo Dục. - TCVN 4830-89:Vi sinh vật học-Hướng dẫn chung về phương pháp đếm vi khuẩn Staphylococus aureus-Kỹ thuật đếm khuẩn lạc. NXB Trung tâm Thông tin Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, 2010 x Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 53 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 7. PHỤ LỤC -