Đề tài Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn

vµ s­ng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i trong nghiªn cøu nµy ngoµi viÖc chÕ t¹o kh¸ng thÓ chèng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn th©n cña vi khuÈn, cßn ph¶i chÕ t¹o ®­îc c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu ®Ó trung hßa ®éc tè cña vi khuÈn. §Ó cã thÓ chÕ t¹o ®­îc kh¸ng thÓ kh¸ng ®éc tè, b­íc ®Çu tiªn lµ chÕ t¹o ®­îc kh¸ng nguyªn ®éc tè an toµn ®Ó miÔn dÞch cho ®éng vËt thÝ nghiÖm. 3.2.1. Nghiªn cøu ®éng th¸i sinh tr­ëng cña E. coli Tõ bé gièng gåm 10 chñng E. coli ph©n lËp ®­îc, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®éng th¸i sinh tr­ëng cña vi khuÈn trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh©n t¹o. Chóng t«i nu«i cÊy 10 chñng E. coli ë ®iÒu kiÖn 370C, sau ®ã theo dâi sù biÕn ®éng vÒ sè l­îng vi khuÈn vµ pH sau 24, 48 vµ 72 giê nu«i cÊy. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 11. B¶ng 11: §éng th¸i sinh tr­ëng cña c¸c chñng E. coli trong bé gièng ®· chän Chñng E. coli Thêi gian nu«i cÊy (®iÓm kh¶o s¸t)T 0h (1) 24h (2) 48h (3) 72h (4) Hanco 1 CFU(107/ml) 0 142.0 85.5 52.25 pH 7.2 5.62 7.01 7.31 Hanco 2 CFU(107/ml) 0 115 83.5 52 pH 5.76 6.46 7.73 Hanco 3 CFU(107/ml) 0 129.5 75.5 22.6 pH 7.2 5.72 6.01 7.81 Hanco 4 CFU(107/ml) 0 103.5 73.9 32.5 pH 7,2 5.61 6.03 6.21 Hanco 5 CFU(107/ml) 0 107 74.9 40 pH 7,2 5.66 5.98 6.39 Hanco 6 CFU(107/ml) 0 108 74.6 39 pH 7,2 5.73 6.95 7.48 Hanco 7 CFU(107/ml) 0 26.5 18.7 16 pH 7,2 5.88 6.52 7.17 Hanco 8 CFU(107/ml) 0 141 98.5 64 pH 7,2 5.96 6.58 7.77 Hanco 9 CFU(107/ml) 0 129.5 62.1 35.7 pH 7,2 5.65 6.25 7.12 Hanco 10 CFU(107/ml) 0 132 68.5 24 pH 7,2 5.74 6.72 7.30 3.2.2. Nghiªn cøu m«i tr­êng vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy thÝch hîp ®Ó s¶n sinh ®éc tè E. coli. Song song víi nghiªn cøu ®éng th¸i sinh tr­ëng cña vi khuÈn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö ®éc lùc cña dÞch nu«i cÊy theo tõng c«ng thøc vµ m«i tr­êng kh¸c nhau b»ng c¸ch tiªm cho chuét b¹ch. Chóng t«i ®· chÕ t¹o 9 lo¹i m«i tr­êng víi c¸c chØ tiªu dinh d­ìng kh¸c nhau (phï hîp víi yªu cÇu dinh d­ìng cña E. coli trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh©n t¹o) nh»m t×m kiÕm mét m«i tr­êng thÝch hîp cho sù sinh tr­ëng vµ s¶n sinh ®éc tè cña E. coli. ChØ tiªu dinh d­ìng cña c¸c lo¹i m«i tr­êng ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 12. B¶ng 12: ChØ tiªu dinh d­ìng cña c¸c m«i tr­êng nu«i cÊy M«i tr­êng §¹m amin (mg/ml) Tryptophan (mg%) Pepton (gr%) NaCl (%) pH MT1 1.297 17.5 2.1 0.351 7.15 MT2 2.330 50.0 2.8 1.390 7.00 MT3 1.760 25.0 2.2 0.769 7.13 MT4 0.440 11.0 2.4 0.910 7.26 MT5 1.205 34.0 2.6 0.806 7.40 MT6 2.160 20.0 3.0 0.720 7.22 MT7 2.820 15.0 3.0 0.860 6.97 MT8 1.650 24.0 3.0 0.430 7.04 MT9 1.360 20.9 2.07 0.183 7.27 Víi 9 lo¹i m«i tr­êng ë trªn, chóng t«i nu«i cÊy chñng Hanco 3 víi c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau ®Ó theo dâi sù liªn quan gi÷a ®éng th¸i sinh tr­ëng víi ®éc lùc cña n­íc läc canh trïng (®éc tè) trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm Sau khi nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng cã c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau, dÞch nu«i cÊy sèng ®­îc ly t©m ë 7000g/15 phót, thu phÇn n­íc trong, läc qua mµng läc cã kÝch th­íc lç läc 0,2 μm, dung dÞch thu ®­îc sau khi läc gäi lµ dÞch chøa ®éc tè, ký hiÖu lµ T2, chóng t«i tiÕn hµnh tiªm dÞch qua läc T2 cho chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®éc lùc giÕt chuét ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 13. B¶ng 13: §éc lùc cña dÞch nu«i cÊy ®­îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch tiªm dÞch qua läc T2 M«i tr­êng Tû lÖ chÕt/ tiªm §­êng tiªm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 MT1 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT2 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 1/4 1/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 0/4 1/4 0/4 MT3 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 MT4 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 0/4 1/4 0/4 MT5 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 1/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 MT6 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT7 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 MT8 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT9 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 1/4 1/4 1/4 1/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 2/4 2/4 1/4 2/4 Qua b¶ng 13 chóng t«i thÊy ®éc tè nµy yÕu, tiªm d­íi da kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc (chuét kh«ng chÕt) mµ chØ ph¸t hiÖn ®­îc b»ng tiªm phóc xoang hoÆc tÜnh m¹ch. Còng tõ kÕt qu¶ trªn, chóng t«i thÊy m«i tr­êng 9 lµ m«i tr­êng mµ E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. C¸c c«ng thøc nu«i cÊy 5, 6, 7, 8, 9 lµ nh÷ng c«ng thøc nu«i cÊy mµ E. coli cã thÓ s¶n sinh ®éc tè. Chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm lÆp l¹i nh÷ng c«ng thøc nµy trªn m«i tr­êng 9. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 14. B¶ng 14: §éc lùc ®­îc x¸c ®Þnh víi liÒu tiªm vµ ®­êng tiªm kh¸c nhau Tû lÖ chuét chÕt C«ng thøc Tiªm phóc xoang Tiªm tÜnh m¹ch ∑sè chuét chÕt /chuét tiªm 0,2ml 0,4ml 0,2ml 0,4ml CT5 1/4 2/4 1/4 3/4 7/12 CT6 0/4 1/4 0/4 2/4 3/12 CT7 0/4 1/4 1/4 2/4 4/12 CT8 0/4 1/4 0/4 1/4 2/12 CT9 0/4 1/4 0/4 2/4 3/12 §C 0/4 0/4 0/4 0/4 0/16 Ghi chó: §C - §èi chøng lµ m«i tr­êng v« trïng Qua b¶ng 14 chóng t«i thÊy víi c«ng thøc 5 E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. LÆp l¹i vµ më réng, chóng t«i chÕ t¹o dÞch nu«i cÊy ®éc tè víi tõng chñng E. coli b»ng m«i tr­êng 9 vµ nu«i cÊy theo c«ng thøc 5, sau ®ã kiÓm tra ®éc lùc dÞch nu«i cÊy víi tõng chñng vµ ®a chñng (trén 10 chñng) b»ng c¸ch: tiªm 0,4 ml/con dÞch qua läc T2 vµo tÜnh m¹ch chuét b¹ch, theo dâi tû lÖ chuét chÕt/tiªm. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 15. B¶ng 15: §éc lùc cña ®éc tè T2 do c¸c chñng E. coli riªng rÏ vµ kÕt hîp t¹o ra Gièng Hanco §­êng tiªm/ liÒu tiªm (ml) Sè chuét TN (con) Sè chuét èm/tiªm Tû lÖ èm (%) Sè chuét chÕt/tiªm Tû lÖ chÕt (%) Hanco 1 TM/0.4 5 4/5 80 0/5 0 Hanco 2 TM/0.4 5 5/5 100 0/5 0 Hanco 3 TM/0.4 5 5/5 100 1/5 20 Hanco 4 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 5 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 6 TM/0.4 5 5/5 100 5/5 100 Hanco 7 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 8 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 9 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 10 TM/0.4 5 4/5 80 0/5 0 Poly (§a gi¸) TM/0.4 5 5/5 100 4/5 80 §èi chøng TM/0.4 5 0/5 0 0/5 0 Ghi chó: §C - §èi chøng lµ m«i tr­êng v« trïng “chuét èm” lµ chuét sau khi tiªm rÊt mÖt, thë m¹nh, thë dèc, l«ng dùng lªn, n»m gôc, kh«ng muèn ho¹t ®éng, tô thµnh tõng ®¸m, bá ¨n. Cã con thØnh tho¶ng bÞ co dËt, cã con ®iªn cuång, ch¹y lung tung, cã con liÖt ch©n sau, ®i kÐo lª trªn sµn. Tr­íc khi chuét chÕt cã thÓ co dËt hoÆc kh«ng; còng cã tr­êng hîp chuét chÕt nhanh, co dËt mÊy lÇn råi chÕt, sau 48 giê con nµo kh«ng chÕt th× håi phôc dÇn. KÕt qu¶ cho thÊy tõng chñng cã ®éc lùc cña ®éc tè kh¸c nhau, tõng chñng cã thÓ lµm chuét chÕt hoÆc èm kh¸c nhau (chuét ®èi chøng kh«ng cã hiÖn t­îng nµy). Nh­ng ë ®éc tè poly (trén nhiÒu chñng) th× ®éc lùc thÓ hiÖn râ rÖt. §ã lµ sù céng h­ëng cña c¸c ®éc tè. V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i lµ chÕ t¹o kh¸ng nguyªn cã chøa hçn hîp ®éc tè cña nhiÒu chñng E. coli, ®Ó kh¸ng thÓ thu ®­îc cã thÓ ®èi phã víi tÝnh phøc t¹p cña E. coli vµ tÝnh ®a d¹ng bÖnh cña nã g©y ra còng nh­ dÞch tÔ häc cña c¸c bÖnh nµy trong thùc tÕ ch¨n nu«i. 3.3. Nghiªn cøu ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn 3.3.1. Nghiªn cøu ph­¬ng ph¸p lµm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc KÕ thõa nh÷ng nghiªn cøu tr­íc ®©y vÒ E. coli vµ ®éc tè E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p sau: + BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ë nhiÖt ®é 700C trong 30 phót. + BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 3 0/00. + BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng phenol 5 0/00. + BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng thiomersal 0,40/00. M«i tr­êng sau khi nu«i cÊy ®¹t tiªu chuÈn ®­îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè, ®­îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p trªn. DÞch nu«i sau khi xö lý, ®­îc ®Æt trong tñ Êm 370C trong 24h. Sau ®ã chóng t«i tiÕn hµnh kiÓm tra v« trïng theo th­êng quy trªn c¸c m«i tr­êng kh¸c nhau ®Ó xem ë ®iÒu kiÖn ®ã cã bÊt ho¹t ®­îc vi khuÈn hay kh«ng. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 16. B¶ng 16: KÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t Canh trïng xö lý KÕt qu¶ kiÓm tra trªn m«i tr­êng KÕt qu¶ NA NB BA SA Thio 700C/30 phót - - - - - §¹t Formol 3 0/00 - - - - - §¹t Phenol 5 0/00 - - - - - §¹t Thiomersal 0.4 0/00 - - - - - §¹t (-): kh«ng cã vi khuÈn mäc (+): cã vi khuÈn mäc B»ng kÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng chóng t«i nhËn thÊy c¶ 4 ph­¬ng ph¸p v« ho¹t vµ gi¶i ®éc trªn ®Òu cã kh¶ n¨ng bÊt ho¹t E. coli. TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra hiÖu qu¶ gi¶i ®éc cña c¸c ph­¬ng ph¸p trªn b»ng c¸ch ly t©m dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t, lÊy n­íc trong läc qua mµng 0,2 mm thu ®­îc dÞch läc gäi lµ “gi¶i ®éc tè”, sau ®ã tiªm gi¶i ®éc tè ®ã cho chuét b¹ch 18 - 20 gam víi liÒu tiªm 0,4 ml vµo tÜnh m¹ch vµ so s¸nh víi tiªu chuÈn ®éc tè ë trªn (tiªu chuÈn ®Ó ®¸nh gi¸ ®éc tè E. coli ®ã lµ cø 0,4ml ®éc tè khi tiªm tÜnh m¹ch cho chuét 18 – 20g, ph¶i g©y chÕt Ýt nhÊt lµ 40% tæng sè chuét ®­îc tiªm). NÕu gi¶i ®éc tè g©y chÕt tíi 40% sè chuét thÝ nghiÖm th× ®éc tè ®ã ch­a ®­îc gi¶i ®éc, tøc lµ ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc ®ã kh«ng ®¹t vµ ng­îc l¹i. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 17. B¶ng 17: TÝnh an toµn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc Ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t LiÒu tiªm (ml) §­êng tiªm Tû lÖ chuét chÕt/chuét tiªm % chuét chÕt HiÖu qu¶ gi¶i ®éc 700C/30 phót 0,4 TM 2/10 20% §¹t Formol 3 0/00 0,4 TM 1/10 10% §¹t Phenol 5 0/00 0,4 TM 6/10 60% Kh«ng ®¹t Thiomersal 0,40/00 0,4 TM 10/10 100% Kh«ng ®¹t KÕt qu¶ trªn cho thÊy: Ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng phenol vµ thiomersal kh«ng nh÷ng kh«ng mang l¹i hiÖu qu¶ gi¶i ®éc mµ cßn lµm t¨ng tÝnh ®éc cña ®éc tè, do ®ã kh«ng thÓ dïng hai hãa chÊt nµy ®Ó gi¶i ®éc ®­îc. Ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 vµ 700C/30 phót cã hiÖu qu¶ gi¶i ®éc t­¬ng ®èi tèt. 3.3.2. KiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 vµ 700C/30 phót. Chóng t«i dïng dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®ù¬c bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ®Ó tiªm miÔn dÞch cho chuét b¹ch 18 - 20 gam liÒu 0,4 ml/con vµo d­íi da. Sau tiªm 21 ngµy lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh kiÓm tra hiÖu gi¸ ng­ng kÕt. KÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 18. B¶ng 18: TÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i ch­a ®éc tè sau khi ®· bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc Ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t §­êng tiªm LiÒu tiªm (ml) Sè l­îng (con) HiÖu gi¸ ng­ng kÕt HGKT trung b×nh Formol 30/00 DD 0.4 5 1/128 1/64 1/64 1/256 1/128 1/128 700C/30 phót DD 0.4 5 1/128 1/32 1/64 1/64 1/32 1/64 * “DD”: d­íi da Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy chuét tiªm dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®­îc xö lý b»ng formol nång ®é 30/00 cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n (trung b×nh 1/128). Nh­ vËy ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 ë 37oC trong 24h cã hiÖu qu¶ tèt nhÊt. DÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc, ®éc lùc gi¶m ®i nh­ng vÉn cã tÝnh kh¸ng nguyªn. 3.3.3. X¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè §éc tè cña E. coli lµ mét yÕu tè quan träng tham gia vµo qu¸ tr×nh g©y bÖnh tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, sau khi ®· chÕ t¹o ®­îc dÞch nu«i chøa gi¶i ®éc tè nh­ trªn, cÇn x¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè trong dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· gi¶i ®éc. 3.3.3.1. Nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè Chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè trªn ®èi t­îng lµ chuét b¹ch víi ph­¬ng ph¸p nh­ sau: ChÕ t¹o gi¶i ®éc tè E. coli (Kh¸ng nguyªn ®éc tè T2): dÞch nu«i cÊy chøa ®éc tè (hçn hîp 10 chñng E. coli) ®­îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè E. coli ®a gi¸ ®­îc gi¶i ®éc b»ng focmol 30/00 ë 37oC/24h, ly t©m víi tèc ®é 7000g/15phót, lÊy n­íc trong läc qua mµng läc cã kÝch th­íc lç läc 0,2 μm, thu dÞch läc, dÞch läc ®ã gäi lµ gi¶i ®éc tè  E. coli ®a gi¸ (hçn hîp gi¶i ®éc tè 10 chñng E. coli). NÕu chÕ t¹o víi mét chñng E. coli th× gäi lµ gi¶i ®éc tè T2 chñng E. coli ®ã. ChÕ t¹o kh¸ng huyÕt thanh: Chuét b¹ch ®­îc tèi miÔn dÞch b»ng gi¶i ®éc tè ®a gi¸ theo quy tr×nh sau: LÇn tiªm 1 2 3 4 5 6 §­êng tiªm DD DD FX DD FX DD LiÒu tiªm (ml) 0.5 0.8 0.4 1.0 0.8 1.2 Mçi mòi ®­îc tiªm c¸ch nhau 1 tuÇn. 21 ngµy sau khi tiªm mòi cuèi cïng th× tiÕn hµnh lÊy m¸u, ch¾t huyÕt thanh. KiÓm tra sù ®¸p øng miÔn dÞch b»ng ph­¬ng ph¸p kiÓm tra kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh chuét miÔn dÞch b»ng c¸c ph¶n øng huyÕt thanh häc sau: 3.3.3.2. Ph¶n øng kÕt tña trong èng nghiÖm gi÷a gi¶i ®éc tè víi huyÕt thanh cña chuét miÔn dÞch gi¶i ®éc tè HuyÕt thanh ®­îc ly t©m (tèi thiÓu 4500g/phót) lo¹i hÕt cÆn (nÕu cã). HuyÕt thanh ®­îc pha lo·ng theo cÊp sè 2 nh­ th­êng quy, bæ sung kh¸ng nguyªn ®éc tè vµo huyÕt thanh ®· pha lo·ng theo tû lÖ thÓ tÝch 1:1. HiÖu gi¸ ®­îc x¸c ®Þnh lµ ®é pha lo·ng huyÕt thanh cao nhÊt mµ vÉn thÊy kÕt tña. KÕt tña xuÊt hiÖn râ sau 36 – 48 giê vµ kÕt luËn ë 72 giê sau ph¶n øng. KÕt qu¶ cña ph¶n øng ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 18. H×nh 3: Ph¶n øng kÕt tña trªn èng nghiÖm gi÷a ®éc tè T2 víi kh¸ng huyÕt thanh B¶ng 18: Ph¶n øng kÕt tña trong èng nghiÖm gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét tiªm gi¶i ®éc tè E. coli ®a gi¸ (hiÖu gi¸ huyÕt thanh ®a gi¸ kh¸ng ®éc tè E. coli) Kh¸ng nguyªn §Þnh tÝnh §Þnh l­îng §èi chøng 1 §èi chøng 2 T2Hanco 1 + 1/16 - - T2Hanco 2 + 1/8 - - T2Hanco 3 + 1/4 - - T2Hanco 4 + 1/4 - - T2Hanco 5 + 1/8 - - T2Hanco 6 + 1/2 - - T2Hanco 7 + 1/4 - - T2Hanco 8 + 1/8 - - T2Hanco 9 + 1/4 - - T2Hanco 10 + 1/16 - - T2 Poli + 1/16 - - §èi chøng 1: HuyÕt thanh kh¸ng E. coli + M«i tr­êng §èi chøng 2: HuyÕt thanh ©m tÝnh + §éc tè Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy, ph¶n øng gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét ®Òu cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh, ngoµi ra cßn x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè, tøc lµ ®· cã sù kÕt hîp gi÷a ®éc tè vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu t­¬ng øng. §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®· g©y ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch. 3.3.3.3. Ph¶n øng kÕt tña khuÕch t¸n kÐp trong th¹ch (ADP) gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè víi huyÕt thanh chuét ®­îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè. §Ó ph©n tÝch thªm vÒ ®éc tè E. coli trong hçn hîp ®éc tè, chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng ADP theo kü thuËt Owchterlony. Thµnh phÇn tham gia ph¶n øng gåm cã, kh¸ng nguyªn ®éc tè ®­îc bè trÝ ë giÕng trung t©m, cßn c¸c giÕng xung quanh lµ huyÕt thanh chuét miÔn dÞch ®­îc pha lo·ng theo cÊp sè 2. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 19. B¶ng 19: Ph¶n øng ADP gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ víi huyÕt thanh chuét miÔn dÞch gi¶i ®éc tè E. coli (hiÖu gi¸ huyÕt thanh ®a gi¸ kh¸ng ®éc tè E. coli) Kh¸ng nguyªn §Þnh tÝnh HiÖu gi¸ kÕt tña §èi chøng 1 §èi chøng 2 T2Hanco 1 + 1/4 - - T2Hanco 2 + 1/8 - - T2Hanco 3 + 1/4 - - T2Hanco 4 + 1/8 - - T2Hanco 5 + 1/4 - - T2Hanco 6 + 1/8 - - T2Hanco 7 + 1/4 - - T2Hanco 8 + 1/8 - - T2Hanco 9 + 1/4 - - T2Hanco 10 + 1/8 - - T2 Poli + 1/16 - - * §èi chøng 1: HuyÕt thanh kh¸ng E. coli + M«i tr­êng §èi chøng 2: HuyÕt thanh ©m tÝnh + §éc tè H×nh 4. Ph¶n øng ADP gi÷a ®éc tè T2 víi kh¸ng huyÕt thanh Ph¶n øng ADP d­¬ng tÝnh mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n vÒ tÝnh kh¸ng nguyªn cña ®éc tè, ngoµi ra ta cßn x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ kÕt tña, nghÜa lµ kh¸ng nguyªn ®éc tè g©y miÔn dÞch m¹nh. KÕt qu¶ cña c¸c ph¶n øng huyÕt thanh trªn cho thÊy: Gi¶i ®éc tè E. coli cã tÝnh kh¸ng nguyªn tèt, ®· kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch. Kh¸ng ®éc tè trong huyÕt thanh chuét ®­îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè cã thÓ ®­îc ph¸t hiÖn qua ph¶n øng kÕt tña víi kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli trong èng nghiÖm, qua ph¶n øng ADP trong gel th¹ch. Qua hai ph¶n øng ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè. Mçi chñng E. coli cã kh¶ n¨ng s¶n sinh ®éc tè víi hµm l­îng kh¸c nhau. §éc tè ®a gi¸ m¹nh h¬n vµ g©y miÔn dÞch tèt h¬n ®éc tè ®¬n gi¸. 3.4. Nghiªn cøu c¸c chÊt bæ trî lµm t¨ng miÔn dÞch Chóng t«i sö dông c¸c chÊt bæ trî: ISA vµ IMS cña h·ng Septic, Al(OH)3 vµ alum cña SPI Pharma. Mçi chÊt bæ trî ®­îc bæ sung vµo dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®­îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc (gäi lµ t¾t lµ kh¸ng nguyªn) víi tû lÖ thÝch hîp. Tr­íc tiªn chóng t«i tiÕn hµnh thö an toµn trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ thu ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 20. B¶ng 20: TÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn cã chøa c¸c chÊt bæ trî kh¸c nhau Kh¸ng nguyªn cã chÊt bæ trî Tû lÖ chuét chÕt/tiªm theo ®­êng tiªm KÕt luËn D­íi da (1 ml) Phóc xoang (0,5) Nhò hãa ISA 6/10 7/10 Kh«ng ®¹t Nhò hãa IMS 4/10 4/10 Kh«ng ®¹t AL(OH)3 0/10 0/10 §¹t Alum 0/10 0/10 §¹t Tõ kÕt qu¶ thö an toµn, chóng t«i nhËn thÊy 2 s¶n phÈm cã bæ trî Al(OH)3 vµ alum khi bæ sung vµo kh¸ng nguyªn E. coli an toµn h¬n so víi s¶n phÈm cã bæ trî dÇu kho¸ng ISA, IMS. Tõ ®©y chóng t«i sö dông 2 s¶n phÈm nµy ®Ó tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch. Chóng t«i tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc cña hai s¶n phÈm trªn b»ng c¸ch miÔn dÞch liÒu 0,4ml/con theo ®­êng tiªm d­íi da trªn chuét b¹ch vµ so s¸nh víi ®èi chøng (®èi chøng lµ chuét miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). Sau khi tiªm 21 ngµy, tiÕn hµnh lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh, kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh. KÕt qu¶ cô thÓ nh­ sau: B¶ng 21: KiÓm tra tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn cã bæ sung c¸c chÊt bæ trî ChÊt bæ trî Nång ®é HiÖu gi¸ tõng con HiÖu gi¸ trung b×nh Al(OH)3 10/00 1/128 1/64 1/128 1/128 1/128 1/115,2 20/00 1/256 1/128 1/256 1/256 1/128 1/204,8 30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/128 1/179,2 40/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 Alum 0.50/00 1/128 1/64 1/128 1/128 1/64 1/102,4 10/00 1/256 1/128 1/128 1/256 1/128 1/179,2 20/00 1/128 1/512 1/128 1/256 1/128 1/230,4 30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 §èi chøng (kh«ng cã chÊt bæ trî) 1/128 1/64 1/64 1/128 1/128 1/102,4 Nh×n chung chuét ®­îc miÔn dÞch b»ng kh¸ng nguyªn cã chÊt bæ trî cã hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n so chuét ®èi chøng, cô thÓ: §èi víi chÊt bæ trî lµ Al(OH)3 ë mçi nång ®é kh¸c nhau th× g©y ra ®¸p øng miÔn dÞch kh¸c nhau trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm. Trong ®ã nång ®é 20/00 cho kÕt qu¶ tèt nhÊt thÓ hiÖn qua hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cña huyÕt thanh chuét lµ cao nhÊt (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/204,8). Nång ®é tèi ­u cña chÊt bæ trî alum còng lµ 20/00 (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/230,4). Tõ nh÷ng kÕt qu¶ trªn, chóng t«i quyÕt ®Þnh chän alum bæ sung víi nång ®é 2 0/00 lµm chÊt bæ trî cho kh¸ng nguyªn vµ sö dông cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo. 3.5. Nghiªn cøu tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn Sau khi ®· chän ®­îc chÊt bæ trî thÝch hîp lµ alum 20/00 chóng t«i s¶n xuÊt 3 l« liªn tôc ®Ó kh¶o s¸t tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn nµy trªn nhiÒu lo¹i ®éng vËt kh¸c nhau: chuét lang 250 - 300 gam , thá 1800 - 2000 gam vµ b¶n ®éng vËt lµ gµ hËu bÞ. Mçi loµi ®éng vËt cã mét liÒu l­îng kh¸ng nguyªn kh¸c nhau, ®­êng ®­a thuèc vµo lµ tiªm d­íi da, riªng ®èi víi gµ ®­êng ®­a thuèc vµo lµ tiªm b¾p. Sau khi tiªm, chóng t«i tiÕn hµnh theo dâi c¸c ph¶n øng cña ®éng vËt thÝ nghiÖm vµ sè l­îng ®éng vËt bÞ chÕt trªn tæng sè ®éng vËt ®­îc tiªm. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®­îc thèng kª ë b¶ng 22. Qua b¶ng kÕt qu¶, chóng t«i thÊy r»ng víi c«ng thøc chÕ t¹o lµ kh¸ng nguyªn + alum 2 0/00, khi tiÕn hµnh thö an toµn víi ba l« s¶n xuÊt kh¸c nhau, ®Òu cho kÕt qu¶ an toµn trªn c¸c ®éng vËt thÝ nghiÖm. Cô thÓ lµ kh«ng cã tr­êng hîp nµo ®éng vËt thÝ nghiÖm bÞ chÕt hoÆc hoÆc ph¶n øng víi chÕ phÈm. B¶ng 22: KÕt qu¶ thö tÝnh an toµn cña c¸c l« kh¸ng nguyªn trªn ®éng vËt L« thÝ nghiÖm Sè chuét lang ph¶n øng /sè tiªm Sè thá ph¶n øng/sè tiªm Sè gµ ph¶n øng/sè tiªm LiÒu dd (ml) LiÒu dd (ml) LiÒu dd (ml) LiÒu tiªm b¾p (ml) 1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3,0 2,0 3,0 4,0 2,0 3,0 4,0 L« 1 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/7 0/8 0/8 0/8 0/8 0/7 §C l« 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/5 0/4 L« 2 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/6 0/6 0/7 0/7 0/7 0/7 §C l« 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/3 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 L« 3 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/9 §C l« 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Tæng TN 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/21 0/22 0/23 0/23 0/23 0/23 Tæng §C 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/11 0/12 0/12 0/12 0/13 0/12 Ghi chó: §éng vËt kh«ng cã ph¶n øng khi ®­îc tiªm chÕ phÈm. §èi chøng:M«i tr­êng + formol 30/00 + alum 20/00 3.6. Nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn vµ nghiªn cøu thêi gian s¶n sinh miÔn dÞch sau khi tiªm §Ó nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm trªn chuét b¹ch 18-20 gam, víi sè l­îng lµ 40 con cho mét lÇn thÝ nghiÖm. Cø mét tuÇn sau khi miÔn dÞch, tiÕn hµnh lÊy m¸u 10 con ®Ó kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u cña c¸c chuét thÝ nghiÖm. ThÝ nghiÖm ®­îc lÆp l¹i 3 lÇn. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cô thÓ nh­ sau: B¶ng 23: TÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch Tiªm d­íi da 0,4ml/con HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh chuét sau tiªm 1 tuÇn 2 tuÇn 3 tuÇn 4 tuÇn HGKT thÝ nghiÖm lÇn 1 - 1/32 1/218 1/230 HGKT thÝ nghiÖm lÇn 2 - 1/34 1/230 1/230 HGKT thÝ nghiÖm lÇn 3 - 1/28 1/205 1/218 HGKT chuét ®èi chøng (chuét tiªm kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî) - 1/28 1/128 1/115 B¶ng 23 vµ h×nh 5 cho thÊy sau khi miÔn dÞch mét tuÇn c¸c chuét thÝ nghiÖm ch­a cã sù ®¸p øng miÔn dÞch, sang tuÇn thø hai trong huyÕt thanh chuét ®· b¾t ®Çu cã kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i kh¸ng nguyªn E. coli nh­ng hiÖu gi¸ vÉn cßn thÊp (kho¶ng 1/32). ë tuÇn thø ba thø t­ hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ lµ cao nhÊt (kho¶ng 1/128 – 1/256). KÕt qu¶ trªn cho thÊy, kh¸ng huyÕt thanh cña nh÷ng ®éng vËt thÝ nghiÖm ®­îc miÔn dÞch kh¸ng nguyªn cã thªm chÊt bæ trî alum 2 0/00 cã hiÖu gi¸ cao h¬n so víi huyÕt thanh cña nh÷ng con ®èi chøng (®­îc miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn cã bæ sung thªm chÊt bæ trî alum 2 0/00 cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch tèt. 3.7. chÕ t¹o kh¸ng nguyªn thÝch hîp g©y miÔn dÞch cho gµ Víi bé gièng chuÈn ®· ®­îc chän läc vµ æn ®Þnh, chóng t«i tiÕn hµnh chÕ t¹o kh¸ng nguyªn ®Ó miÔn dÞch cho gµ. Chóng t«i tiÕn hµnh nu«i cÊy E. coli theo c«ng thøc m«i tr­êng vµ c«ng thøc nu«i cÊy ®· ®­îc nghiªn cøu ë trªn, ®Ó chÕ t¹o kh¸ng nguyªn, phôc vô cho qu¸ tr×nh miÔn dÞch gµ. Cã 15 l« kh¸ng nguyªn ®· ®­îc chÕ t¹o vµ ®­îc kiÓm tra c¸c tÝnh chÊt vÒ: ®Ëm ®é vi khuÈn, ®é thuÇn khiÕt, v« trïng vµ an toµn. KÕt qu¶ ë b¶ng 24. B¶ng 24: KiÓm tra chÊt l­îng c¸c l« kh¸ng nguyªn thö nghiÖm L« kh¸ng nguyªn §Ëm ®é vi khuÈn (CFU/ml) KiÓm tra thuÇn khiÕt KiÓm tra v« trïng §é an toµn §¸nh gi¸ chung L« 1 8 x108 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 2 8.5 x108 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 3 1.5 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 4 2 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 5 1x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 6 3 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 7 1.5 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 8 2,5 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 9 1.5 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 10 2 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 11 3,5 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 12 1 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 13 8,5 x108 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 14 3 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t L« 15 2 x109 §¹t §¹t §¹t §¹t Theo kÕt qu¶ b¶ng 24: 15 l« kh¸ng nguyªn ®· s¶n xuÊt ®Òu ®¹t tiªu chuÈn vµ ®­îc ®­a vµo sö dông, g©y miÔn dÞch cho gµ. 3.8. nghiªn cøu quy tr×nh miÔn dÞch cho gµ Chóng t«i chän ra 3 l« kh¸ng nguyªn ®· chÕ t¹o lµ: l« 6, l« 11 vµ l« 14 ®Ó tiÕn hµnh thö nghiÖm víi 3 qui tr×nh miÔn dÞch trªn 3 ®µn gµ m¸i ®Î, mçi ®µn 10 con. LÊy m¸u gµ kiÓm tra HGKT trong huyÕt thanh gµ theo ®Þnh kú. KÕt qu¶ thö nghiÖm miÔn dÞch ®­îc tr×nh bµy trong b¶ng 25. B¶ng 25: KÕt qu¶ thö nghiÖm c¸c qui tr×nh miÔn dÞch trªn gµ Qui tr×nh miÔn dÞch Qui tr×nh 1 Qui tr×nh 2 Qui tr×nh 3 HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh gµ (sau khi miÔn dÞch) TuÇn 1 1/3,2 1/4,3 1/2 TuÇn 2 1/21,6 1/28,8 1/26,4 TuÇn 3 1/32 1/67,2 1/58,6 TuÇn 4 1/57,6 1/208 1/121,2 TuÇn 5 1/121,6 1/236,8 1/224 TuÇn 10 1/120,4 1/244,2 1/211,2 TuÇn 12 1/116,2 1/251,4 1/121 TuÇn 15 1/56,8 1/121 1/62,4 Sau tiªm nh¾c l¹i 1/57,2 1/265,6 1/112,2 Møc ®é ph¶n øng ®èi víi gµ 4-5 giê sau mçi lÇn tiªm miÔn dÞch c¬ së Gµ b¾t ®Çu mÖt, gi¶m ¨n trong vßng 05 ngµy Gµ b¾t ®Çu mÖt, gi¶m ¨n trong vßng 02 ngµy Gµ b¾t ®Çu mÖt, gi¶m ¨n trong vßng 04 ngµy Sau khi tiªm miÔn dÞch cao ®é 3% gµ bÞ chÕt, c¶ ®µn mÖt mái, gi¶m ¨n Gµ mÖt mái, gi¶m ¨n, sau 3 ngµy khoÎ l¹i b×nh th­êng Gµ mÖt mái, gi¶m ¨n, sau 3 ngµy khoÎ l¹i b×nh th­êng Sau tiªm nh¾c l¹i Gµ mÖt mái, gi¶m ®Î ®Õn 90% trong 02 ngµy, gi¶m ¨n Gµ mÖt mái, gi¶m ®Î ®Õn 30% trong 01 ngµy. Gµ mÖt mái, gi¶m ®Î ®Õn 50% trong 02 ngµy. Qua kÕt qu¶ thö 3 qui tr×nh ë trªn chóng t«i thÊy qui tr×nh 2 cho kÕt qu¶ miÔn dÞch cao nhÊt vµ æn ®Þnh nhÊt nªn qui tr×nh nµy ®­îc chän lµm qui tr×nh miÔn dÞch chÝnh thøc. Qui tr×nh miÔn dÞch kÌm theo phô lôc (phô lôc 01) 3.9. x¸c ®Þnh hµm l­îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ Sau khi chän ®­îc qui tr×nh miÔn dÞch thÝch hîp, tiÕn hµnh tiªm miÔn dÞch cho ®µn gµ ®Î trøng dïng lµm nguyªn liÖu s¶n xuÊt chÕ phÈm kh¸ng thÓ lßng ®á trøng. Chóng t«i chän ra 5 l« kh¸ng nguyªn ®· chÕ t¹o lµ: l« 4, l« 6, l« 8, l« 11 vµ l« 14 ®Ó miÔn dÞch cho 5 ®µn gµ m¸i ®Î. Theo dâi hµm l­îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ. Sö dông hai ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh vµ ADP ®Ó x¸c ®Þnh hµm l­îng kh¸ng thÓ (ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh x¸c ®Þnh hµm l­îng kh¸ng thÓ kh¸ng víi kh¸ng nguyªn th©n E. coli, ph¶n øng ADP x¸c ®Þnh hµm l­îng kh¸ng thÓ kh¸ng ®éc tè E. coli). KÕt qu¶ ®Þnh l­îng hµm l­îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ trong lßng ®á trøng gµ t­¬ng øng víi c¸c l« kh¸ng nguyªn miÔn dÞch ®­îc tr×nh bµy trong b¶ng 26. Nh­ vËy, víi c¸c l« kh¸ng nguyªn kh¸c nhau, sau khi miÔn dÞch cho gµ trong giai ®o¹n thu ho¹ch trøng lµm nguyªn liÖu, hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ng­ng kÕt trong huyÕt thanh gµ cã hµm l­îng lu«n æn ®Þnh ë 1/128 ®Õn 1/281,6; hiÖu gi¸ ADP dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16. Hµm l­îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ kh«ng chªnh lÖch nhiÒu (hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ng­ng kÕt trung b×nh trong lßng ®á trøng dao ®éng tõ 1/118,2 ®Õn 1/243,2; hiÖu gi¸ ADP dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16 ).. §iÒu ®ã chøng tá kh¸ng thÓ cña gµ sau khi ®¸p øng miÔn dÞch ®­îc truyÒn nhiÒu vµo trong lßng ®á trøng. §ã chÝnh lµ ®iÒu kú diÖu vµ ­u viÖt cña lßng ®á trøng gµ. B¶ng 26: Hµm l­îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ L« kh¸ng nguyªn HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh HGKT trung b×nh trong lßng ®á trøng Ng­ng kÕt nhanh ADP Ng­ng kÕt nhanh ADP L« 4 1/ 281,6 1/16 1/243,2 1/8 L« 6 1/128 1/8 1/118,4 1/8 L« 8 1/230,4 1/16 1/192 1/16 L« 11 1/256 1/8 1/217,6 1/16 L« 14 1/268,8 1/8 1/243,2 1/8 3.10. nghiªn cøu qui tr×nh s¶n xuÊt Trøng thu ho¹ch tõ gµ miÔn dÞch ®­îc chóng t«i chÕ thö s¶n phÈm theo 5 quy tr×nh s¶n xuÊt kh¸c nhau, chän ®­îc QTSX4 lµ tèi ­u, ®¹t yªu cÇu vÒ c¸c tiªu chuÈn: vËt lý, v« trïng, HGKT x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt ®¹t tõ 1/80-1/100, HGKT x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ADP ®¹t tõ 1/8 - 1/16. Quy tr×nh s¶n xuÊt kÌm theo phô lôc (phô lôc 02) 3.11. Nghiªn cøu qui tr×nh kiÓm nghiÖm vµ b¶o qu¶n chÕ phÈm 3.11.1. Kh¶o s¸t chØ tiªu c¶m quan cña s¶n phÈm Theo dâi c¸c chØ tiªu c¶m quan 03 l« s¶n phÈm; mçi l« 20 mÉu trong vßng 06 th¸ng, chóng t«i thÊy cã sù kh¸c biÖt râ rÖt gi÷a c¸c mÉu s¶n phÈm ë ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n kh¸c nhau. ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é phßng kho¶ng 25oC, tÊt c¶ c¸c mÉu s¶n phÈm sau 01th¸ng ®· chuyÓn mµu tõ vµng sang tr¾ng ngµ, cã hiÖn t­îng ph©n líp, sau 02 th¸ng cã l¾ng cÆn. ë nhiÖt ®é b¶o qu¶n 2-8oC trong 06 th¸ng tÊt c¶ c¸c mÉu s¶n phÈm ®Òu ®¹t yªu cÇu c¶m quan, kh«ng thay ®æi vÒ mµu s¾c s¶n phÈm, ®é ®ång nhÊt, kh«ng v¸ng, kh«ng cÆn. VËy, s¶n phÈm b¶o qu¶n ë 2-8oC lµ ®¹t yªu cÇu. 3.11.2. Kh¶o s¸t ®é v« trïng cña s¶n phÈm Dïng 3 l« s¶n phÈm, mçi l« 20 mÉu ®Ó kiÓm tra v« trïng theo tiªu chuÈn ViÖt Nam (TCN) (D­îc ®iÓn ViÖt Nam II, TËp 3, NXB Y häc, trang 498) S¶n phÈm ®­îc kiÓm tra trªn c¸c m«i tr­êng sau: NA (nutrient agar), NB (nutrient broth), BA (blood agar), SA (sabouraud agar), Thioglycolat C¸c m«i tr­êng kiÓm tra s¶n phÈm ®­îc ®Ó trong tñ Êm 370C, theo dâi Ýt nhÊt 4 ngµy, riªng th¹ch nÊm SA ®Ó ë nhiÖt ®é phßng víi thêi gian theo dâi Ýt nhÊt 7 ngµy. S¶n phÈm ®­îc b¶o qu¶n ë 2-80C vµ cø sau 1 th¸ng th× kiÓm tra v« trïng 01 lÇn, kh¶o s¸t trong 06 th¸ng. KÕt qu¶ tr×nh bµy trong b¶ng 27. 3.11.3. Kh¶o s¸t hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm X¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh vµ ph¶n øng ADP gi÷a s¶n phÈm ®­îc b¶o qu¶n ë 2-80C víi kh¸ng nguyªn vµ ®éc tè E. coli t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau, kh¶o s¸t trong 6 th¸ng. KÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é v« trïng vµ hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trªn b¶ng 27. Tõ b¶ng 27 ta thÊy trong ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n 2-80C, ®é v« trïng cña s¶n phÈm ®­îc b¶o ®¶m trong 05 th¸ng. Sau 05 th¸ng cã 04 mÉu trong tæng sè 60 mÉu cña c¶ hai l« cã t¹p trïng nh­ng kh«ng ph¸t hiÖn cã nÊm trong s¶n phÈm. HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm kh«ng thay ®æi trong suèt thêi gian b¶o qu¶n. B¶ng 27: KÕt qu¶ kh¶o s¸t chØ tiªu v« trïng vµ hgkt trong thêi gian b¶o qu¶n L« SX Thêi gian theo dâi HGKT KÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng Ng­ng kÕt ADP NA NB BA SA Thio - + - + - + - + - + L« 02/09/08 (n = 20) T0 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T1 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T2 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T3 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T4 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T5 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T6 1/100 1/16 20 0 18 2 20 0 20 0 20 0 L« 15/11/08 (n = 20) T0 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T1 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T2 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T3 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T4 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T5 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T6 1/80 1/8 20 0 19 1 20 0 20 0 20 0 L« 28/01/09 (n = 20) T0 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T1 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T2 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T3 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T4 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T5 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T6 1/100 1/16 20 0 19 1 20 0 20 0 20 0 3.11.4. Kh¶o s¸t ®é an toµn cña s¶n phÈm B¶ng 28: §é an toµn cña s¶n phÈm trªn chuét b¹ch vµ thá §éng vËt thÝ nghiÖm §­êng tiªm Ngµy 1 Ngµy 2 Ngµy 3 Ngµy 4 Ngµy 5 Ngµy 6 Ngµy 7 KÕt qu¶ Chuét b¹ch 5 con Tiªm d­íi da LiÒu 0,4 ml/con LiÒu 0,4 ml/con LiÒu 0,4 ml/con B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% chuét sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng 5 con Tiªm phóc xoang LiÒu 0,4 ml/con LiÒu0,4 ml/con LiÒu 0,4 ml/con B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% chuét sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng Thá 3 con Tiªm d­íi da LiÒu 3 ml/con LiÒu 3 ml/con LiÒu3 ml/con B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% thá sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng 3 con Tiªm phóc xoang LiÒu 5 ml/con LiÒu 5 ml/con LiÒu 5 ml/con B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% thá sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng B¶ng 29: §é an toµn cña s¶n phÈm trªn lîn §éng vËt thÝ nghiÖm §­êng tiªm Ngµy 1 Ngµy 2 Ngµy 3 Ngµy 4 Ngµy 5 Ngµy 6 Ngµy 7 KÕt qu¶ Lîn <5 kg ( 20- 30 ngµy tuæi) 10con Tiªm b¾p thÞt LiÒu 2 ml/kgTT LiÒu2 ml/kgTT LiÒu2 ml/kgTT B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng 10 con Tiªm phóc xoang LiÒu 4 ml/kgTT LiÒu 4 ml/kgTT LiÒu4 ml/kgTT B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng Lîn >5 kg (>30 ngµy tuæi) 10 con Tiªm b¾p thÞt LiÒu 1,5ml/kgTT LiÒu 1,5ml/kgTT LiÒu 1,5ml/kgTT B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng 10 con Tiªm phóc xoang LiÒu 3 ml/kgTT LiÒu 3 ml/kgTT LiÒu 3 ml/kgTT B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng B×nh th­êng 100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh th­êng KÕt qu¶ kiÓm tra chØ tiªu hiÖu lùc cña s¶n phÈm + Ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt trùc tiÕp gi÷a s¶n phÈm víi kh¸ng nguyªn E. coli vµ b»ng ph¶n øng ADP gi÷a s¶n phÈm vµ ®éc tè E. coli. Pha lo·ng kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng n­íc muèi sinh lý theo ®é pha lo·ng kh¸c nhau. Víi ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh, lÊy mét l­îng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét l­îng kh¸ng nguyªn E. coli b»ng nhau, trén ®Òu, ®Ó ë nhiÖt ®é kho¶ng 250C. §äc kÕt qu¶ sau 3 - 5 phót b»ng m¾t th­êng. Víi ph¶n øng ADP còng lÊy mét l­îng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét l­îng ®éc tè E. coli nhá vµo c¸c giÕng, trong ®ã ®éc tè E. coli nhá vµo giÕng trung t©m, kh¸ng thÓ nhá vµo c¸c giÕng xung quanh. KÕt qu¶ ®äc sau 72 giê. §èi chøng ©m lµm t­¬ng tù b­íc trªn nh­ng thay thÕ kh¸ng thÓ cña s¶n phÈm b»ng n­íc sinh lý. §èi chøng d­¬ng lµm t­¬ng tù b­íc trªn nh­ng thay thÕ kh¸ng thÓ cña s¶n phÈm b»ng kh¸ng thÓ E. coli ®· biÕt. KÕt qu¶: chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®¹t hiÖu gi¸ ng­ng kÕt ë ®é pha lo·ng ≥1/50, hiÖu gi¸ ADP ë ®é pha lo·ng ³ 1/4. + KÕt qu¶ kiÓm tra chØ tiªu hiÖu lùc cña s¶n phÈm trªn chuét: Dïng 20 con chuét b¹ch träng l­îng trung b×nh mçi con 18 - 20g, khoÎ m¹nh, chia lµm 2 nhãm: Nhãm 1: 10 con, mçi con tiªm 0,4 ml kh¸ng thÓ vµo phóc xoang. Sau 24 giê tiªm lÇn hai cïng liÒu. Nhãm 2: 10 con kh«ng tiªm lµm ®èi chøng. Sau 48 giê kÓ tõ khi tiªm kh¸ng thÓ lÇn hai, c«ng c­êng ®éc cho c¶ hai nhãm chuét víi liÒu tiªm d­íi da mçi chuét 0,2 ml dÞch nu«i cÊy E. coli ®a gi¸ nu«i cÊy 24 giê (10 chñng E. coli gièng sau khi nu«i cÊy 24h, ®em trén ®Òu víi tû lÖ b»ng nhau). Theo dâi chuét trong 7 ngµy, ®¸nh gi¸ kÕt qu¶. TÝnh hiÖu sè cña sè l­îng chuét sèng sãt cña nhãm 1 (nhãm ®­îc tiªm miÔn dÞch b»ng kh¸ng thÓ lßng ®á trøng) vµ sè l­îng chuét sèng sãt cña nhãm 2 (nhãm ®èi chøng). KÕt qu¶ ë b¶ng 30. B¶ng 30: HiÖu lùc cña s¶n phÈm trªn chuét Nhãm thÝ nghiÖm Sè l­îng chuét chÕt/sè chuét tiªm Kh¶ n¨ng b¶o hé (% sè chuét sèng) Nhãm 1 0/10 100% Nhãm 2 8/10 20% Qua kÕt qu¶ trªn ta thÊy, s¶n phÈm cã kh¶ n¨ng b¶o hé tèt ®èi víi chuét thÝ nghiÖm (100%), trong khi nhãm ®èi chøng tû lÖ chuét sèng sãt sau khi c«ng c­êng ®éc chØ ®¹t 20%. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ KÕt luËn §· thu thËp ®­îc 340 mÉu bÖnh phÈm lîn èm do tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu ë 5 tØnh ®¹i diÖn cho 3 miÒn B¾c - Trung - Nam. Tõ 340 mÉu bÖnh phÈm nµy ®· sµng läc vµ tuyÓn chän ®­îc 10 chñng E. coli ®iÓn h×nh cã ®éc lùc m¹nh, tÝnh kh¸ng nguyªn tèt ®Ó lµm gièng. §· x¸c ®Þnh ®­îc ®éng th¸i sinh tr­ëng cña 10 chñng E. coli ph©n lËp ®­îc. C¸c chñng E. coli nµy t¨ng tr­ëng cùc ®¹i sau 24 giê nu«i cÊy sau ®ã gi¶m dÇn, trong khi pH cña m«i tr­êng nu«i cÊy gi¶m cùc tiÓu sau 24 giê nu«i cÊy sau ®ã t¨ng dÇn. ViÖc lµm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn b»ng formol 30/00 ë 37oC trong 24h cho hiÖu qu¶ tèt. Sau khi bÞ bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc, ®éc lùc bÞgi¶m ®i nh­ng vÉn gi÷ ®­îc tÝnh kh¸ng nguyªn. Alum 20/00 lµ chÊt bæ trî kh¸ng nguyªn an toµn vµ lµm t¨ng miÔn dÞch. §· nghiªn cøu ®­îc qui tr×nh miÔn dÞch tèi ­u cho gµ ®Ó thu ®­îc hµm l­îng kh¸ng thÓ cao nhÊt trong lßng ®á trøng. Hµm l­îng kh¸ng thÓ trong lßng ®á trøng kh¸ng víi kh¸ng nguyªn th©n E. coli lu«n æn ®Þnh ë 1/118,2 ®Õn 1/243,2 vµ hµm l­îng kh¸ng thÓ kh¸ng víi ®éc tè E. coli dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16. §· nghiªn cøu ®­îc qui tr×nh s¶n xuÊt kh¸ng thÓ, qui tr×nh kiÓm nghiÖm vµ b¶o qu¶n chÕ phÈm. ChÕ phÈm kh¸ng thÓ s¶n xuÊt ra cã hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ng­ng kÕt ®¹t tõ 1/80 ®Õn 1/100, hiÖu gi¸ ADP ®¹t ³ 1/4. S¶n phÈm ®¹t c¸c tiªu chuÈn vÒ vËt lý, v« trïng, an toµn vµ hiÖu lùc. NhiÖt ®é b¶o qu¶n chÕ phÈm tèt nhÊt lµ tõ 20C - 80C, thêi gian b¶o qu¶n lµ 5 th¸ng. KiÕn nghÞ TiÕp tôc kh¶o s¸t chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®­îc t¹o ra trªn lîn ®Ó x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng b¶o vÖ cña chÕ phÈm ®èi víi lîn m¾c bÖnh vµ ®­a ra liÒu phßng vµ ®iÒu trÞ bÖnh. CÇn s¶n xuÊt thö nghiÖm mét sè l« chÕ phÈm ®Ó ®­a ra kh¶o nghiÖm trªn thùc ®Þa tr­íc khi s¶n xuÊt ®¹i trµ vµ ®­a chÕ phÈm kh¸ng thÓ nµy vµo phßng vµ trÞ bÖnh bÖnh tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu do E. coli g©y ra. Tµi liªu tham kh¶o TiÕng viÖt §Æng Xu©n B×nh, TrÇn ThÞ H¹nh (2003), "Kh¶o s¸t sù biÕn ®éng hµm l­îng Globulin miÔn dÞch trong s÷a ®Çu cña lîn n¸i khi sö dông chÕ phÈm sinh häc phßng bÖnh tiªu ch¶y lîn con", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp X, (1), tr.42-49. §Æng Xu©n B×nh (2004), Vai trß cña vi khuÈn Escherichia coli vµ Clostridium Perfringens trong bÖnh tiªu ch¶y ë lîn con theo mÑ, c¸c biÖn ph¸p phßng trÞ, LuËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp, ViÖn Khoa häc Kü thuËt N«ng nghiÖp ViÖt Nam, Hµ Néi. T« Minh Ch©u, NguyÔn Ngäc H¶i (1999), "B­íc ®Çu ph©n lËp vµ ®Þnh danh E.coli g©y bÖnh phï ®Çu ë lîn con sau cai s÷a", Khoa häc kü thuËt n«ng l©m nghiÖp, (3), tr.60-63. §ç Trung Cø, TrÇn ThÞ H¹nh, NguyÔn Quang Tuyªn (2000), "Sö dông chÕ phÈm sinh häc Biosubtyl ®Ó phßng trÞ bÖnh tiªu ch¶y ë lîn con tr­íc vµ sau cai s÷a", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp VII, (2), tr.58-62. §oµn ThÞ Kim Dung (2003), Sù biÕn ®æi mét sè vi khuÈn hiÕu khÝ ®­êng ruét, vai trß cña E.coli trong héi chøng tiªu ch¶y cña lîn con theo mÑ, c¸c ph¸c ®å ®iÒu trÞ, LuËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp, ViÖn Thó y, Hµ Néi. §µo Träng §¹t, Phan Thanh Ph­îng, Lª Ngäc Mü (1995), BÖnh ®­êng tiªu hãa ë lîn, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.43-86. NguyÔn Ngäc H¶i, T« Minh Ch©u, M.Carles, A.Tripodi vµ G.Bodin (2000), "T×m hiÓu nguyªn nh©n cña héi chøng thÇn kinh - phï m¾t ë heo cai s÷a", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp VII, (2), tr.27-35. Ph¹m Kh¾c HiÕu, Bïi ThÞ Tho (1996), "KÕt qu¶ kiÓm tra tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cña E.coli ph©n lËp tõ lîn con bÞ bÖnh ph©n tr¾ng t¹i c¸c tØnh phÝa B¾c trong 20 n¨m qua (1975 - 1995)", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp III, (4), tr.63-66. Lý Liªn Khai (2001), "Ph©n lËp x¸c ®Þnh ®éc tè ruét cña c¸c chñng E.coli g©y bÖnh tiªu ch¶y cho heo con", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp VIII, (2), tr.13-18. NguyÔn ThÞ Néi, Vò Ngäc L©m, Ph¹m Kh¾c V­îng (1978), "Nghiªn cøu Escherichia coli trong phßng thÝ nghiÖm. Vi trïng Escherichia coli ®éc trong bÖnh lîn con Øa ph©n tr¾ng vµ ®é nhiÔm khuÈn cña bÖnh. HiÖu lùc cña vacxin E.coli ®èi víi lîn con Øa ph©n tr¾ng trong s¶n xuÊt", KÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc kü thuËt Thó y 1968-1978, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.207-225. Sö An Ninh (1995), C¸c chØ tiªu sinh lý, sinh hãa m¸u, n­íc tiÓu vµ h×nh th¸i ®¹i thÓ mét sè tuyÕn néi tiÕt ë lîn con m¾c bÖnh ph©n tr¾ng, LuËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp, Tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp I Hµ Néi. NguyÔn Kh¶ Ngù, Lª V¨n T¹o, §ç Ngäc Thóy, NguyÔn Ngäc Nhiªn (1999), "X¸c ®Þnh ®éc lùc vµ chän chñng vi khuÈn E.coli ph©n lËp tõ lîn con m¾c bÖnh phï ®Çu, chÕ t¹o thö nghiÖm vacxin phßng bÖnh", B¸o c¸o khoa häc Ch¨n nu«i Thó y 1998 - 1999, HuÕ, tr.440-453. Cï H÷u Phó, NguyÔn Ngäc Nhiªn, Vò B×nh Minh, §ç Ngäc Thóy (1999), KÕt qu¶ ph©n lËp vi khuÈn E.coli vµ Salmonella spp ë lîn m¾c tiªu ch¶y, x¸c ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc cña chñng vi khuÈn ph©n lËp ®­îc vµ biÖn ph¸p phßng trÞ, B¸o c¸o khoa häc ch¨n nu«i thó y 1998-1999, tr.189-196. NguyÔn Ngäc Phôc (2005), C«ng t¸c thó y trong ch¨n nu«i lîn, Nxb Lao ®éng - x· héi, tr.60-67. Lª V¨n T¹o vµ cs (1995), "HiÖu qu¶ sö dông vacxin E.coli cho uèng phßng bÖnh ph©n tr¾ng lîn con", N«ng nghiÖp C«ng nghiÖp Thùc phÈm, (11), tr.432-433. Lª V¨n T¹o, NguyÔn Kh¶ Ngù (1996a), "X¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt vµ kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn E.coli ph©n lËp tõ lîn con tr­íc vµ sau cai s÷a bÞ bÖnh Colibacillosis ë ®ång b»ng s«ng Cöu Long", N«ng nghiÖp, C«ng nghiÖp, Thùc phÈm, (2), tr.493-494. Lª V¨n T¹o (1996b), "CÊu tróc Fimbriae, serotype b¸m dÝnh K88 cña vi khuÈn E.coli vµ vai trß cña nã trong qu¸ tr×nh g©y bÖnh ph©n tr¾ng lîn con", N«ng nghiÖp, C«ng nghiÖp, Thùc phÈm, (2), tr.62-63. NguyÔn Nh­ Thanh, NguyÔn B¸ Hiªn, TrÇn ThÞ Lan H­¬ng (2001), Vi sinh vËt thó y, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.72-101. §ç Ngäc Thóy, Darren Trott, Alan Frost, Kirsty Town Send, Cï H÷u Phó, NguyÔn Ngäc Nhiªn, ¢u Xu©n TuÊn, NguyÔn Xu©n Huyªn, V¨n ThÞ H­êng, Vò Ngäc Quý (2002), "TÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cña c¸c chñng Escherichia coli ph©n lËp tõ lîn con tiªu ch¶y ë mét sè tØnh miÒn B¾c ViÖt Nam", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp IX, (2), tr.21-31. Tæng côc Thèng kª (2008), Niªn gi¸m thèng kª n¨m 2008, Nxb Thèng kª, Hµ Néi, tr.107-110. §oµn Xu©n Tróc (2003), Sæ tay kü thuËt ch¨n nu«i lîn trang tr¹i, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.3-4. T¹ ThÞ VÞnh, §Æng ThÞ Hße (2002), "Mét sè kÕt qu¶ sö dông c¸c chÕ phÈm sinh häc ®Ó phßng trÞ bÖnh tiªu ch¶y ë lîn con", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp IX, (4), tr.54-56. TiÕng anh Aarestrup, M.F., Jorsal, S.E., Ahrens, P., Jensen, N.E., and Meyling, A. (1997), "Molecular characterization of Escherichia coli strains isolated from pigs with edema diseas", J. Clin. Microbiol., (35), pp.20-24. Akita, E.M., and S.Nakai, S. (1993), "Comparison of four purification methols for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain", Journal of Immunological methols, (160), pp.207-214. Bakker, D., Willemsen, P.T.J., Simons, L.H., van Zijderveld, F.G., de Graaf, F.K. (1992), "Characterization of the antigenic and adhesive properties of FaeG, the major subunit of K88 fimbriae", Mol. Microbiol, (6), pp.247-255. Bertschinger, H.U., and Pohlenz, J., (1983), "Bacterial colonization and morphology of the intestine in porcine Escherichia coli enterotoxemia (edema disease)", Vet. Pathol., ( 20), pp.99-110. Biehl, L.G., and Hoefling, D.C. (1986), "Diagnosis and treatment of diarrhea in 7-to 14 day old pigs", J. Am. Vet. Assoc., (188), pp.1144-1146. Blanco, J., Gonzalez, E.A., Bernardez, I., Rigueiro, B. (1983), "Differential biological activity of Vero cytotoxins (VT) released by human and porcine Escherichia coli strains". FEMS. Microbiol. Lett., ( 20), pp.167-170. Bosworth, B.T., Samuel, J.E., Moon, H.W., O’ Brien, V.M., and Whipp, S.C. (1996), "Vaccination with Genetically Modified Shiga - Like toxin IIe prevents Edema Disease in Swine", Infection and Immunity, pp.55-60. Butler, J.E. (1973), "Synthesis and distribution of immunoglobulins", J.Am.Vet. Med. Assoc., (163), pp.795-800. Cavalieri, S.J, Snynder, I.S. (1982), "Cytotoxin activity of a partially purifield Escherichia coli alpha - haemolysin", J. Med. Microbiology, (15), pp.11-21. Choi, B.K., and Schifferli, D.M. (2001), "Characterization of FasG segments required for 987P fimbria-mediated binding to piglets glycoprotein receptors", Infect. Immun., (69), pp. 6625-6632. Cox, E., Houvenagel, A. (1993), "Comparison of the invitro adhesion of K88, K99, F41 and 987P positive Escherichia coli to intestinal villi of 4 to 5 week old pigs", Vet. Microbiol., (34), pp.7-18. Dean, E.A. (1990), "Comparison of receptors for 987P pili of enterotoxigenic Escherichia coli in the small intestines of neonatal and older pigs", Infect. Immun., (58), pp.4030-4035. Dean, E.A., Samuel, J.E. (1994), "Age-related resistance to 987P fimbria-mediated colonization correlates with specific glucolipid receptors in intestinal mucus in swine" Infect. Immun., (62), pp.4789-4794. Deprez, P., De Cupere, F., Muylle, E., and Zobisch, H. (1992), "The use of egg powder antibodies in the prevention of post weaning colibacillosis", Proc. Int. Congr. Pig. Vet.Soc., (12), pp.251. Fairbrother, J.M., Bestchinger, H.U., Nielsen, O.N., Pohlenz, J.F. (1992), Escherichia coli infections, diseases of swine. Seventh Edition. Wolfe publishing Ltd - Australian 1992, pp.489-497. Fekete, P.Z., Gerardin, J., Jaccquemin, E., Mainil, J.G., Nagy, B. (2002), "Replicon typing of F18 fimbriae encoding plasmids of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli strains from porcine post-weaning diarrhoea and oedema disease", Vet. Microbiol., (85), pp.275-284. Francke, S., Harmsen, D., Caprioli, A., Pierrard, D., L.H., Karch, H. (1995), "Clonal relatedness off Shiga-like toxin producing Escherichia coli O101 strains of human and porcine origin". J. Clin. Microbiol., (33), pp.3174–3178. Frydendahl, F., (2002), "Prevalence of serogroups and virulence genes in E. coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches", Vet. Microbiol., (85), pp.169-182. Gannon, V.P.J., Gyless, C.L., (1990), "Characteristics of the Shiga-like toxin produced by Escherichia coli associated with porcine oedema disease". Vet. Microbiol., (24), pp.97-100. H. Imberechts, P. Deprez, E. Van Driessche and P. Pohl. (1997), "Chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae of Escherichia coli inhibit shedding of F18 positive E. coli by experimentally infected pigs", Veterinary Microbiology., (54), pp.329-341. Holm, A., and Poulsen, H.D. (1996), "Swine nutrition management update: ZinC oxide in treating E.coli diarrhea in pigs after weaning", Compend. Cont. Educ. Pract. Vet., (18), pp.8. Hung, Vu Khac (2004), Escherichia coli - Prevalence and comparison of virulece factors in strains isolated from pigs with diarrhoea in Slovak Republic, Ph.D. Thesis, University of Veterinary medicine, Kosice Slovak Republic. H Yokoyama, R C Peralta, R Diaz, S Sendo, Y Ikemori, Y. (1992), "Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets", Infect Immun., (3), pp.998-1007. Isaacson, R.E., and Start, G.L. (1992), "Analysis of K99 plasmids from enterotoxigenic Escherichia coli", FEMS. Microbiol, Lett., (90), pp.141-146. Jacobs, A.A.C. and de Graaf, F.K. (1985), "Production of K88, K99 and F41 fimbriae in relation to growth phage and rapid procedure for adhesion purification", FEMS. Micribiol, Lett., (26), pp.15-19. Johansen, M., Andresen, L.O., Jorsal, S.E., Thomsen, L.K., Waddell, T., and Gyles, C.L. (1996), "Vaccination against oedema diseas", Proc. Int. Congr. Pig. Vet. Soc., (14), pp.378. Khan, A.S., Johnston, N.H., Goldfine, H. and Schifferli. (1996), "Porcine 987P glucolipid receptors on intestinal brush borders and their cognate bacterial ligands", Infect. Immun., (64), pp.3688-3693. Konowalchuk, J., Speirs, J.I., Stavric, S. (1977), "Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli". Infect. Immun., (18), pp.775-779. Kwon, D., Choi, C., Jung, T., Chung, H.K., Kim, J.P., Bae, S.S. (2002), "Genotypic prevalence of the fimbrial adhesins (F4, F5, F6, F41 and F18) and toxin (LT, STa, STb, and Stx 2e) in Escherichia coli isolated from postweaning pigs with diarrhoea or oedema disease in Korea", Vet. Red., (12), pp.35-37. Mainil, J. (1999), "Shiga/Verocytotoxin and Shiga/Verotoxigenic Escherichia coli in animal". Vet. Res., (30), pp.235-257. Marquers, L.R.M., Peiris, J.S.M., Cryz, S.J., O’Bien, A.D. (1987), "Escherichia coli strains isolated from pigs with oedema disease produce a variant of Shiga-like toxin II". FEMS. Microbiol. Lett., (44), pp.33-38. Mooi, F.R., Wouters, C., Wijfjes, A., de Graaf, F.K. (1982), "Construction and characterization of mutants impaired in the biosynthesis of the K88ab antigen", J. Bacteriol., (150), pp.512-521. Nagy, B. (1986), Vaccines against toxigenic Escherichia coli disease in animals, In Development of Drugs and Vaccines against Diarrhea,11th Nobel Conf Stockholm, 1985. Lund: Stdentlitteratur, pp.53. Nagy, B., Fekete, P.Z. (1999), "Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals", Vet. Res., (30), pp. 259 - 284. Pohl, P., Mainil, J. (1995), "F17 positive Escherichia coli", Vet. Rec., (137), pp.623-624. Ronald R Marquardta, L.Z Jina , Jung-Woo Kima , Lin Fanga, Andrew A Frohlicha, Samuel K. (1998)," Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli K88+ infection in neonatal and early-weaned piglets", FEMS Immunology & Medical Microbiology., pp.11-13. Sandefur, P.D., Peterson, J.W. (1976), "Isolation of skin permeability factors culture filtrates of Salmonella typhimurium". Infection and Immunity, (14), pp.671-679. Sarmiento, J.I. (1983), Environmental temperature: A predisposing factor in the enterotoxigenic Escherichia coli induced diarrhea of the newborn pig, M.S. Thesis, Univ. Guel.Ph, Ont. Sarrazin, E., and Bertschinger, H.U. (1997), "Role of fimbriae F18 for actively acquired immunity against porcine enterotoxigenic Escherichia coli. Escherichia coli", Vet. Microbiol., (54), pp.133-144. Simons, B.L., Mol, O., van Breemen, J.F.L., Oudega, B. (1994), "Morphological appearance of K88ab fimbriae and optical diffraction analysis of K88 paracrystalline structures", FEMS. Microbiol. Lett., (118), pp.83-88. Smith, H.W. (1963), "The haemolysisns of Escherichia coli", J. Pathol. Bacterial., pp.197-212. Soderlind, O., Thafvelin, B., and Mollby, R. (1998), "Virulence factors in Escherichia coli strains isolated from Swedish pigs with diarrhea", J. Clin. Microbiol., (26), pp.879-884. Sydler, T., Buergi, E., Bertschinger, H. U., and Pospischil, A. (1996), "Edema disease in adult swine", Proc. Int. Congr. Pig.Vet. Soc., (14), pp.272. Thomlinson, J.R., and Lawrence, T.J.L. (1981), "Dietary manipulation of gastric pH in the prophylaxis of enteric disease in weaned pigs: Some field observations", Vet. Rec., (109), pp.120-122. Wittig, W., Klie, H., Gallien, P., Lehmann, S., Timm, M., and Tschape, H. (1995), "Prevalence of the fimbrial antigens F18 and K88 and of enterotoxins and verotoxins among Escherichia coli isolated from weaned pigs", Zbl. Bakt., (283), pp. 95-104.