Đề tài Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN . 5 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên .5 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin .6 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin. .6 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin. .8 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan .8 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan 9 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan 10 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan 11 1.3.4. Độc tính của chitosan . 11 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên thế giới. 12 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin 15 1.6. Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin. 17 1.6.1. Glucosamin hydroclorua 17 1.6.2. Glucosamin sulfat. . 17 1.6.3. Acetyl glucosamin . 18 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó 18 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam .21 1.8.1. Trên thế giới .21 1.8.2. Ở Việt Nam 23 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl). .25 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến 25 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của ĐỗĐình Rãng 26 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu .27 CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua .29 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm. 30 3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin. 31 3.4. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl). 32 3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin. .32 3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan 33 3.4.3. Tinh chế glu.HCl. 34 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin .39 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độđến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin .39 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin .40 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm. 41 4.1.1.Quá trình khử khoáng 41 4.1.2. Quá trình loại bỏ protein .41 4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ Astaxanthin) .42 4.2. Điều chế chitosan .43 4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 43 4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin. .44 4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan. .45 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

pdf51 trang | Chia sẻ: banmai | Ngày: 08/05/2013 | Lượt xem: 859 | Lượt tải: 5download
Tóm tắt tài liệu Đề tài Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
CHOH CHOH CH2OH CHO CHN CHOH CHOH CHOH CH2OH + CHO HC H2SO4d 500C + H2O 1.6. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc. 1.6.1. Glucosamin hydroclorua. Công thức cấu tạo: OHC OH NH2 OH OH OH HCl 4 Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride. Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63 Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi. Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C Tan được trong nước 0,1g/ml 1.6.2. Glucosamin sulfat Công thức cấu tạo: OHC OH NH2 OH OH OH H2SO4 5 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 18 Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate. Công thức phân tử: C6H13O5N.H2SO4 Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24 1.6.3. Acetyl glucosamin Công thức cấu tạo: OHC OH NHAc OH OH OH 6 Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D- (+)-glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine. Công thức phân tử: C8H15O6N Phân tử lượng: Macetylglucosamin = 221,21 Điểm nóng chảy: 201 - 2100C Tan được trong nước, 0,1g/ml 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9] Glucosamine là một aminomonosacharit được thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan. Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường. Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp. Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen và proteoplycan. Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào sụn. Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản Hình 5 : Đau xương cột sống Hình 6 : Khớp nối Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 19 mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [ 9]. Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển. Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển [9]. Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp. Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80). Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]. Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp. Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là: • Glucosamin hydroclorua. • Glucosamin sulfat. • Acetyl glucosamin. Trong thực nghiệm trên thỏ con, người ta thấy glucosamin chỉ làm tăng thành phần các proteoglycan trong các vị trí mô sụn hư cần phải sửa chữa mà không có tác dụng tương tự trên phần sụn khớp bình thường. Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp. Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald Hình 7 :Các vị trí khớp nối Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 20 Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau. Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều. Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID. Nhược điểm của thuốc NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ. Một vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc. Trước đây glucosamin được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin, chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp. Hiện nay cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp. Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yếu cầu trên lâm sàng. Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như : Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9]. Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài. Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [8]: 1. Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài. Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt Nam Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 21 2. Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID. 3. Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn. Sau đó ngưng sử dụng NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục được duy trì theo kiểu tuyến tính. 4. Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc. Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó. 5. Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy. Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn có trong dạ dày. Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫn với một lượng lớn ion Cl- và ion H+. Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muối glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có mặt trong dạ dày. 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và tại Việt Nam 1.8.1. Trên thế giới 1.8.1.1. Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3] Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%). Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô. Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 1500C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70%. Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 22 Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất. 1.8.1.2. Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3] Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C; tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C, và đem xay nhỏ. Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần bã. Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã. Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete. Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem. Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin. 1.8.1.3. Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3] Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ. Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C, sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp. Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính, thu được chitosan. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 23 Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố. Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác aceton có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao. Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay. 1.8.1.4. Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17] Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40C trong thời gian 48 giờ. Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7. Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5%. Sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm. Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7. Sản phẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng ở 90 - 1000C trong 2,5 giờ. Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7, sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether. Sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm. Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g. Hiệu suất 44,3%. 1.8.2. Tại Việt Nam 1.8.2.1. Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3] Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính. Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1 giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin. Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan. Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp. Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 24 1.8.2.2. Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam [3] Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau. Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửa trung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính. Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan. Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn. 1.8.2.3. Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3] Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửa trung tính. Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên. Sản phẩm đem làm khô thu được chitin. Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu. Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hóa chất xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm. 1.8.2.4. Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học [3] Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực hiện theo các bước : khử khoáng, khử protein và deacetyl. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 25 Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hóa học. Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng proteaza và deacetyl bằng enzym deacetylaza. Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5giờ. Rửa sạch đến pH= 7. Sau đó khử protein bằng papain 13%, tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 - 5,5, ở nhiệt độ 70 - 800C trong thời gian 4 giờ. Rửa sạch, tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng. Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ. Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan sạch. Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp, trong và mềm mại. Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Tuy nhiên điều kiện khó khăn do việc tìm mua hoặc sản xuất enzym deacetylaza nên công đoạn deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc. 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3] Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7. Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ. Tẩy màu rửa sạch, sấy khô. Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ. Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện. Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh. Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C. 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14] Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô. Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô. Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%, đun sôi. Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô. Chitin thu được có màu trắng Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 26 phớt hồng. Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 1000C, tẩy màu băng than hoạt tính, để kết tinh và lọc. Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng. Hiệu suất quá trình 51,4%. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 27 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu *Vật liệu: Vỏ tôm *Hóa chất: Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết như axit hydroclorua (HCl), natri hydroxit (NaOH), kali permanganat (KMnO4), axit oxalic (C2H2O4), oxi già (H2O2), axit acetic CH3COOH, ngoài ra còn có các dung môi khác như nước cất, methanol, ethanol… *Dụng cụ thí nghiệm: Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế, thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinh hàn hồi lưu, dụng cụ lọc… 2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thu được chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thu được chitosan. 2. Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan. 3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng. 4. Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR, 1H-NMR, 13C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam. So sánh với các số liệu phổ đã công bố để xác định cấu trúc sản phẩm. - Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãng Nicolet. - Đo phổ 1H – NMR và 13C – NMR trên máy Bruker AC- 500MHz trong dung môi D2O. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 28 5. Kiểm tra, đo một số thông số như nhiệt độ nóng chảy trên máy Boetius – MK (Đức). 6. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. 7. Phưong pháp xác định hàm lượng chất không tan. a) Nguyên lý: Chitosan tan được trong axit acetic loãng, còn chitin và các tạp chất khác thi không tan. b) Tiến hành : Cân chính xác a gam chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1%, khuấy đảo 60 phút cho chitosan tan hết rồi lọc, rửa cặn bằng axit acetic loãng, sau đó rửa lại bằng nước cất và đem sấy khô đến khối lượng không đổi. Hàm lượng chất không tan được tính theo công thức: (%)100*(%) a BAX −= Trong đó: A : khối lượng phễu lọc + giấy + tạp chất sau khi sấy (g). B : khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g). a : khối lượng chitosan sử dụng (g). X : Hàm lượng chất không tan (%). 8. Phương pháp xác định hiệu suất quá trình bằng phương pháp trọng lượng. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 29 Chương III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua (glu.HCl) Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế chitin, chitosan và glu.HCl từ vỏ tôm Vỏ tôm sạch Ngâm trong HCl 10%, Ts = 12 giờ, T0 = t0 phòng Rửa trung tính Đun trong NaOH 3%, Ts = 3,5 - 4 giờ, T0 = 90 - 950C Rửa trung tính 1.Ngâm trong hỗn hợp KMnO4 + C2H2O4. Hoặc 2.Ngâm trong H2O2 1%. Chitin trắng sạch Loại Khoáng Loại Protein Rửa sạch, sấy khô ở T0 = 600C Đun trong NaOH 50%, Ts = 4 giờ, T0=110 - 1200C Chitosan Đun trong HCl 36%, Ts= 4 giờ, T0 = 90-95% Glucosamin hydroclorua Rửa trung tính, sấy khô Tẩy màu, lọc, sấy khô Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 30 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm Cân 40g vỏ tôm khô cho vào cốc 1lít, sau đó cho từ từ 200ml HCl 10% vào và để ngập toàn bộ vỏ tôm, nhận thấy có hiện tượng sủi bọt mạnh chứng tỏ có phản ứng xẩy ra, kiểm tra pH=1 - 2 là được, ngâm trong khoảng 12 giờ (để qua đêm) và để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lại khuấy để cho phản ứng xảy ra nhanh hơn (đến khi không thấy bọt, khí thoát ra, thử pH vẫn còn axit). Sau 12 giờ, vớt vỏ tôm ra và rửa lại bằng nước thường đến pH=7, sau đó rửa bằng nước cất. Lúc này vỏ tôm có màu hồng nhạt và mềm do đã được loại hết các tạp chất vô cơ. Vỏ tôm thu được để ráo bớt nước sau đó cho vào bình cầu 500ml, đồng thời cho NaOH 3% vào cho đến khi ngập hoàn toàn vỏ tôm và kiểm tra pH= 11- 12 là đạt yêu cầu. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ, lúc đun có lắp sinh hàn để tránh hiện tượng trào bọt ra ngoài và mùi khó chịu. Sau khi phản ứng kết thúc đem sản phẩm đi rửa bằng nước thường đến pH=7, sau đó tráng lại bằng nước cất. Sản phẩm thu được có màu trắng phớt hồng. Chất màu (astaxanthin) có trong chitin được loại bỏ theo 2 phương pháp: 1. Cho 10ml dung dịch KMnO4 1% vào trong bình đựng chitin ở trên, sau đó trộn đều với nhau, để trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, rửa sạch sản phẩm, nhận thấy sản phẩm có màu tím đen chứng tỏ vẫn còn nhiều KMnO4 chưa được rửa sạch. Để loại hết KMnO4 ta dùng 50ml axit Oxalic HOOC-COOH 1%, nhận thấy nếu để ở nhiệt độ phòng thì khó loại hết màu tím, ta đem đun nóng ở nhiệt độ 50 - 600C thì màu mất hoàn toàn, rửa sạch thu được sản phẩm có màu trắng đẹp. 2. Ngâm ngập chitin bằng 60ml H2O2 1%, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm sau khi ngâm tuy màu đã bớt nhiều nhưng vẫn còn thấy hơi phớt hồng, rửa sạch bằng nước, tráng lại bằng nước cất. Sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 600C, thu được chitin trắng sạch. Hiệu suất quá trình điều chế chitin được tính theo công thức sau: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 31 2 1 1 (%) *100%mH m = Trong đó : m1: số gam của vỏ tôm ban đầu (g). m2: số gam chitin thu được (g). H1(%) : hiệu suất của quá trình (%). Kết quả thu được như bảng 3.1: Bảng 3.1. Hàm lượng chitin trong vỏ tôm STT Vỏ tôm (g) Chitin (g) Hiệu suất (%) 1 40 10,87 27,18 2 40 13,67 32,73 3 40 12,27 30,68 4 40 14,33 35,83 5 40 13,09 34,65 3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin Từ chitin điều chế trên, cân lượng chính xác 10g chitin cho vào bình cầu 500ml, sau đó cho 350ml dung dịch NaOH 50% cho đến ngập hoàn toàn chitin. Đun ở nhiệt độ 110 - 1200C, có hồi lưu tránh bay hơi dung môi, bay mùi khó chịu, thỉnh thoảng có khuấy cho phản ứng xảy ra nhanh, thời gian đun là 4 giờ. Sản phẩm sau phản ứng được rửa sạch đến pH=7, rửa lại bằng nước cất, sấy khô. Sản phẩm thu được là chitosan có màu trắng. Hiệu suất quá trình điều chế chitosan được tính theo công thức: 4 2 3 (%) *100%mH m = Trong đó: m3: khối lượng chitin tham gia phản ứng (g). m4 : khối lượng sản phẩm chitosan thu được(g). H2(%) : hiệu suất của quá trình (%). Kết quả thu được ở bảng 3.2: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 32 Bảng 3.2. Hiệu suất điều chế chitosan từ chitin STT Chitin (g) Chitosan (g) Hiệu suất (%) 1 10 6,33 63,3 2 10 6,56 65,6 3 10 7,23 72,3 4 10 7,0 70,0 5 10 7,47 74,7 Tinh chế chitosan Cân 5g chitosan cho vào cốc thủy tinh 1lít, sau đó cho 300ml axit acetic CH3COOH 1%, khuấy ở nhiệt độ thường trong thời gian 30 phút thu được dung dịch trong suốt. Dung dịch được đem đi lọc bỏ cặn bẩn. Sau đó cho 30 ml NaOH 10% vào, khuấy đều trong 10 phút thu được dung dịch keo. Lọc lấy kết tủa keo và rửa 3 lần bằng methanol (5ml/lần). Cho kết tủa keo bào bình cầu 250ml, thêm 140ml CH3OH và đun ở nhiệt độ 60 - 650C trong thời gian 5 giờ. Lọc và rửa bằng aceton 2 lần, sau đó sấy khô ở 400C. Thu được 4,2g chitosan tinh khiết. Hiệu suất 84%. 3.4.Điều chế glu.HCl 3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin Cân 5g chitin khô (đã cắt nhỏ) cho vào bình cầu 250ml, sau đó thêm 40ml HCl 36%. Đun cách thủy có lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều và duy trì ở nhiệt độ khoảng 90 - 950C. Khi nhiệt độ hỗn hợp trong bình phản ứng đạt 65 - 700C thì chitin bắt đầu tan rất nhanh tạo thành dung dịch màu nâu đen. Đun trong thời gian 4giờ. Kết thúc thời gian phản ứng, sản phẩm được lọc nóng để loại bỏ cặn bẩn, sau đó dịch lọc được tẩy màu bằng 1g than hoạt tính, giai đoạn này được hỗn hợp được đun nóng đến 900C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 50 - 600C trong thời gian 30 phút. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 33 Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch có màu xanh nhạt trong suốt, để nguội thu được dung dịch có màu vàng rơm. Dung dịch để nguội lạnh ở nhiệt độ 0 - 40C, thời gian để kết tinh là 12 giờ (để qua đêm). Tinh thể glu.HCl được tách ra bằng phương pháp lọc, sau đó rửa lại sản phẩm thu được bằng cồn 960. Sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 600C thì thu được tinh thể glu.HCl khô trắng đẹp. Dịch lọc còn lại sau khi lọc kết tinh được cô bớt dung môi bằng cất chân không ở nhiệt độ 60 - 650C, đến khi thể tích bằng 1/3 thể tích đem cô ban đầu, để kết tinh và lọc lấy kết tinh, rửa bằng cồn 960, sấy khô. Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công thức sau: 6 7 3 5 (%) *100%m mH m += Trong đó : m5: khối lượng chitin ban đầu (g). m6 : khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ nhất (g). m7: khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ hai (g). H3(%): hiệu suất của quá trình (%). Kết quả thu được ở bảng 3.3: Bảng 3.3. Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin STT Chitin (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%) 1 5 3,12 62,4 2 5 3,14 62,8 3 5 3,10 62,0 3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan Cân 5 gam chitosan cho vào bình cầu 250ml, thêm từ từ 40ml axit HCl 36% vào bình, sau đó thực hiện các thao tác tương tự như phần 3.4.1 trên. Tính thời gian phản ứng khi chitosan bắt đầu tan vào dung dịch. Đun được 1 giờ thì nhận thấy dung dịch có độ nhớt cao, đun tiếp đến 3 giờ thì thu được dung dịch đặc quánh. Kết thúc thời gian phản ứng, cho thêm 20ml nước cất vào Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 34 để pha loãng dung dịch rồi đem lọc lấy dung dịch nước cái. Dung dịch có màu nâu đen được tẩy màu bằng than hoạt tính. Do có pha loãng dung dịch, lượng nước đưa vào tương đối nhiều nên để có kết tinh cần phải cô bớt dung môi đến thể tích 1/5 thể tích dung dịch ban đầu. Sau khi cô, dung dịch được để nguội lạnh ở nhiệt độ 0 - 40C qua đêm. Nhận thấy có rất ít tinh thể glu.HCl được tạo thành, hầu như là không đáng kể. Lọc lấy kết tinh, rửa lại bằng cồn, sấy khô. Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công thức sau: %100*(%) 8 9 4 m mH = Trong đó : m8 : khối lượng chitosan ban đầu (g). m9 : khối lượng glucosamin thu được (g). H4(%) : Hiệu suất quá trình (%). Kết quả thu được ở bảng 3.4: Bảng 3.4. Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitosan STT Chitosan (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%) 1 5 0,5 10,0 2 5 0.35 7,0 3 5 0.6 12,0 3.4.3. Tinh chế glu.HCl Cân 2g glu.HCl cho vào bình cầu 100ml, thêm dần 25ml cồn 960, đun sôi, có khuấy ở nhiệt độ 75 - 800C. Sau khi hỗn hợp sôi, cho từ từ nước cất tối thiểu vào, cho đến khi glu.HCl tan hết (vẫn duy trì ở nhiệt độ sôi), lượng nước cất tối thiểu là 5,5 - 6ml cho 2g glu.HCl. Đun tiếp 60 phút, lọc nóng. Để kết tinh lại ở nhiệt độ 0 - 40C trong thời gian 4 giờ. Tinh thể được lọc và rửa bằng cồn 960 (2 lần x 3ml), sấy khô ở nhiệt độ 600C thu được glu.HCl tinh khiết. Dung dịch nước cái đem cô bớt dung môi và Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 35 kết tinh lại để thu thêm glu.HCl. Sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy 192 - 1940C. Cấu trúc của glu.HCl điều chế ra đã được đo các loại phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR. Phổ IR có các vạch đặc trưng sau: ν(OH…O) 3354,44(cm-1); ν(N-H) 3289.88(cm-1); ν(C-H) 2852,33-2945,58(cm-1); δ(OH phẳng) 1422,37(cm-1); δ(OH không phẳng) 1248,95(cm-1); ν(C-O) 1185,36(cm-1); ν(C-N) 1029,28(cm-1). • α-D-glucosamin hydroclorua O HO HO NH2.HCl OH OH 1 2 3 4 5 6 Phổ 1H-NMR (500MHz, D2O, δ : ppm) 5,42 (d, J = 3,5Hz, 1H, H1); 3,3 (dd, J = 3,5Hz; 10,5Hz, 1H, H2); 3,5 – 3,9 (m, 4H, H3, H4, H5, H6). Phổ 13C-NMR (125MHz, D2O, δ : ppm) 89,6 (C1); 54,7 (C2); 70,0 (C3); 70,2 (C4); 72,0 (C5); 60,8 (C6). • β-D-glucosamin hydroclorua O HO HO NH2.HCl OH OH 1 2 3 4 5 6 Phổ 1H-NMR (500MHz, D2O, δ : ppm) 4,93 (d, J = 8,5Hz, 1H, H1); 2,98 (dd, J = 8,5Hz; 10,5Hz,1H, H2); 3,2 – 3,9 (m, 4H, H3, H4, H5, H6). Phổ 13C-NMR (125MHz, D2O, δ : ppm) 93,1 (C1); 57,2 (C2); 72,5 (C3); 76,6 (C4); 70,2 (C5); 60,9 (C6). Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 36 Hình 9: Phổ IR – glucosamin hydroclorua Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 37 Hình 10 : Phổ 1H-NMR – glucosamin hydroclorua Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 38 Hình 11 : Phổ 13C-NMR – glucosamin hydroclorua Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 39 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (5 lần) với mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, nhiệt độ phản ứng 90 - 950C nhưng thực hiện với điều kiện thời gian khác nhau: • Lần 1: thời gian phản ứng 1giờ. • Lần 2: thời gian phản ứng 2 giờ. • Lần 3: thời gian phản ứng 3 giờ. • Lần 4: thời gian phản ứng 4 giờ. • Lần 5: thời gian phản ứng 5 giờ. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.5: Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng: Ts (h) 1 2 3 4 5 Chitin(g) 5 5 5 5 5 Glu.HCl(g) 2,93 2,97 3,05 3,14 3,11 H(%) 58,6 59,4 61,0 62,8 62,2 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (3 lần) với mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, thời gian phản ứng 4 giờ nhưng thực hiện với điều kiện ở những khoảng nhiệt độ khác nhau. • Lần 1: khoảng nhiệt độ 25 - 300C (nhiệt độ phòng). • Lần 2: khoảng nhiệt độ 55 - 600C. • Lần 3: khoảng nhiệt độ 90 - 950C. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.6: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 40 Bảng 3.6 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng: T0 (0C) 25 - 30 55 - 60 90 - 95 Chitin(g) 5 5 5 Glu.HCl(g) - 1,83 3,14 Hiệu suất (%) - 36,6 62,8 - : không xác định. 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (3 lần) với lần 5g chitin, thời gian phản ứng 4giờ, nhiệt độ phản ứng 90 - 950C nhưng thực hiện trong điều kiện nồng độ axit hydrocloric khác nhau: • Lần 1: Nồng độ axit HCl 10%. • Lần 2: Nồng độ axit HCl 20%. • Lần 3: Nồng độ axit HCl 36%. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.7: Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất phản ứng. HCl (%) 10 20 36 Chitin (g) 5 5 5 Glu.HCl (g) - - 3,14 Hiệu suất (%) - - 62,8 - : không xác định. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 41 Chương IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm 4.1.1. Quá trình khử khoáng Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2. Nên người ta thường dùng các loại axit như HCl, H2SO4… để khử khoáng. Khi khử khoáng, nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn. Nếu dùng H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít sử dụng. Phản ứng của HCl để khử khoáng như sau: MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O. CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O. Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4. Trong quá trình rửa thì muối Cl- tạo thành được rửa trôi, nồng độ axit HCl có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của chitosan thành phẩm, đồng thời nó ảnh hưởng lớn tới thời gian và hiệu quả khử khoáng. Nếu nồng độ HCl cao sẽ rút ngắn được thời gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt mạch do có hiện tượng thủy phân các liên kết β-(1-4) glucozit để tạo ra các polyme có trọng lượng phân tử trung bình thấp, có khi bị thủy phân triệt để đến glucosamin. Ngược lại nếu nồng độ HCl quá thấp thì quá trình khử khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm. Tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch axit HCl cũng ảnh hưởng tới hiệu quả khử khoáng. Vì vậy, ở đây chúng tôi chọn dung dịch HCl 10% với tỷ lệ chitin/HCl là w/v = 1/5 và thời gian khử khoáng là 12 giờ (qua đêm) để đảm bảo quá trình khử khoáng xảy ra hoàn toàn. Sau khi khử khoáng chúng tôi tiến hành rửa trung tính, công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết các muối, axit dư tan trong nước. Quá trình rửa kết thúc khi dịch rửa cho pH=7. 4.1.2. Quá trình loại bỏ protein Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng, chúng tôi tiến hành loại bỏ hoàn toàn protein bằng dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm thủy phân thành các amin tự Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 42 do tan và được loại ra theo quy trình rửa trôi. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 - 12 là được để đảm bảo việc loại bỏ protein được hoàn toàn. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ (trong quá trình đun lưu ý vấn đề trào dung môi do tạo bọt nhiều và mùi bay ra khó chịu). Sản phẩm sau khi đun được rửa sạch bằng nước thường và nước cất đến pH = 7. Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trôi hết các muối natri, các amin tự do và NaOH dư. Sấy khô ở 600C, thu được chitin thô. 4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin) Chitin thô thu được có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin. Do chitin ổn định với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl+NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3,…lợi dụng tính chất này chúng tôi đã sử dụng KMnO4, H2O2 để khử màu cho chitin. • Cách 1: Dùng hỗn hợp KMnO4 1% + C2H2O4 1% để tẩy màu. Trước tiên chúng tôi cho chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) vào cốc thuỷ tinh, sau đó cho dung dịch KMnO4 1% (10ml) vào, khuấy đảo sao cho toàn bộ chitin đều ngấm dung dịch KMnO4 1%, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ. Hỗn hợp được rửa sạch, sản phẩm chitin lúc này có màu tím của KMnO4. Để loại màu tím chúng tôi sử dụng 50ml axit oxalic 1% ((COOH)2), để tăng nhanh khả năng tẩy màu chúng tôi đun nóng hỗn hợp dung dịch ở nhiệt độ 50 - 600C đến khi chitin có màu trắng hoàn toàn. Theo cách này một số tác giả rằng sản phẩm của phản ứng có tạo ra Mn2+, mà trong chitin - chitosan có nhóm –NHCOCH3 và nhóm –NH2, do đó các nhóm này có thể tạo phức với Mn2+ gây ra hiện tượng khâu mạch làm ảnh hưởng đến phản ứng chuyển hoá tiếp theo. • Cách 2: Dùng H2O2 1% để tẩy màu. Chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) cho vào cốc thuỷ tinh, sau đó cho 60ml dung dịch H2O2 1% vào ngập toàn bộ chitin, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Chitin thu được có màu trắng phớt hồng. Chúng tôi dùng H2O2 với nồng độ <1,5% để tránh hiện tượng oxy hoá phá mạch phân tử Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 43 chitin - chitosan. Với phương pháp này chitin thu được vẫn còn màu phớt hồng, nếu đem đun nóng nhẹ lên khoảng 50 - 600C thì thu được chitin trắng hơn. Chitin sau quá trình tẩy màu được rửa sạch bằng nước thường và được rửa lại với nước cất. Sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được chitin khô sạch có màu trắng. Lượng chitin thu được dao động từ 10,87g – 14,33g (27 – 36%). 4.2. Điều chế chitosan Phương trình phản ứng điều chế chitosan từ chitin : O NHCOCH3 OH CH2OH * O * n nNaOH 50% 110-1200C O NH2 OH CH2OH * O * n + nCH3COONa Quá trình điều chế chitosan từ chitin thực chất là quá trình deacetyl hoá (deacetylation) chitin, chuyển hoá nhóm –NHCOCH3 thành nhóm –NH2 và loại bỏ nhóm acetyl -CH3CO, chuyển hoá thành muối natri (CH3COONa). Để thực hiện được quá trình deacetyl hoá hoàn toàn, chúng tôi sử dụng NaOH đậm đặc 50%, thời gian là 4 giờ với nhiệt độ ở 110 - 1200C. Ở đây dựa vào tính chất chitosan tan được trong dung dịch axit loãng tạo thành dung dịch keo trong suốt, trong khi đó chitin không tan do đó chúng tôi sơ bộ kiểm tra mức độ chuyển hóa chitin thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào CH3COOH 1%, nếu sản phẩm tan tạo thành dung dịch keo trong suốt là được. Sau đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu trắng sáng. Quá trình điều chế chitosan từ chitin cho hiệu suất tương đối cao (63,3 – 74,7%). 4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl) Glucosamin là đơn vị cấu thành lên chitosan, các phân tử glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết glucozit tạo nên phân tử chitosan, mặt khác chitosan lại là sản phẩm của quá trình deacetyl chitin, do đó để điều chế glu.HCl ta có thể đi theo hai con đường : Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 44 1. Từ chitin dùng axit HCl đặc 36%, ở nhiệt độ cao thực hiện thủy phân cắt mạch thu được glucosamin. 2. Thủy phân cắt mạch chitosan bằng axit HCl đặc (36%) ở nhiệt độ cao để thu được glucosamin. 4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin Phương trình thuỷ phân chitin bằng axit HCl: Chitin acetyl glucosamin glu.HCl + CH3COOH HCl 36% H2O, T0cao HCl 36% H2O, T0cao O NHCOCH3 OH CH2OH O O O NHCOCH3 OH CH2OH O HCl 36% O OH OH NHCOCH3 OH CH2OH HCl 36% H2O, T0cao O OH OH NH3Cl OH CH2OH + CH3COOH H2O, T0cao Phản ứng thủy phân cắt mạch chitin để thu glucosamin phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Qua tham khảo tài liệu chúng tôi đã khảo sát thời gian tối ưu cho phản ứng và kết quả cho thấy thời gian phản ứng 4 giờ là tốt nhất (hiệu suất 62,8%). Nếu kéo dài thêm thì hiệu suất phản ứng cũng không tăng lên. Điều này phù hợp với các kết quả đã công bố. Do đó chúng tôi chọn thời gian để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tiếp theo là 4 giờ. Qua thực nghiệm chúng tôi thấy rằng khi cho HCl đặc vào trong bình cầu với chitin nếu khuấy ở nhiệt độ phòng thì chitin có tan nhưng thời gian tan kéo dài rất lâu (2 giờ) và tạo hỗn hợp có độ nhớt cao. Nếu tăng dần nhiệt độ lên thì đến 70oC chitin tan rất nhanh. Do đó chúng tôi đã khảo sát phản ứng này ở các nhiệt độ khác nhau và kết quả cho thấy: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 45 - Ở nhiệt độ phòng sau khi chitin tan hết chúng tôi tiếp tục khuấy trong khoảng thời gian 4giờ. Lúc này thu đươc dịch keo không màu, rất khó khăn trong vấn đề lọc, chúng tôi tiến hành pha loãng với methanol rồi lọc, dịch lọc được tẩy màu bằng than hoạt tính ở nhiệt độ 55 - 60oC, cô dịch lọc để đuổi methanol và loại bớt nước, để kết tinh qua đêm nhưng không thấy glucosamin kết tinh ra. - Ở nhiệt độ 55 - 60oC kết quả cho thấy là thời gian để chitin tan nhanh hơn nhiều (40 - 50 phút), dịch thu được có màu vàng rồi chuyển sang nâu đen, dịch thu được vẫn có độ nhớt lớn, vẫn phải pha loãng với methanol để thuận lợi cho quá trình lọc, tẩy màu, cô dịch lọc như trên, để kết tinh qua đêm và hiệu suất glu.HCl thu được tương đối thấp (36,6%). - Nếu tăng nhiệt độ lên đến 70oC chitin tan rất nhanh (2 – 3 phút) , dịch thu được có độ nhớt vừa phải, có thể lọc được luôn mà không cần pha loãng với methanol. Tẩy màu bằng than hoạt tính, cô dịch lọc, để kết tinh qua đêm. Hiệu suất glu.HCl thu được tương đối cao (62,8%). Trong tất cả các trường hợp chúng tôi đều cô đuổi bớt dung môi là methanol và nước vì glu.HCl tan rất tốt trong nước (độ tan 01g/ml). Sau khi chọn được thời gian và nhiệt độ tối ưu, chúng tôi cũng đã tiến hành khảo sát nồng độ HCl tới hiệu suất phản ứng. Thực nghiệm được tiến hành trên các dung dịch HCl có nồng độ lần lượt là 10%, 20% và HCl đặc (35 - 37%) với tổng lượng mol HCl đưa vào là như nhau. Kết quả cho thấy ở các nồng độ HCl 10% và 20% gần như không thu được glu.HCl. Do đó với phản ứng này yêu cầu phải dùng HCl đặc (36 - 37%). Qua đó chúng tôi đưa ra yêu cầu để thu được glu.HCl với hiệu suất tương đối cao thì điều kiện của phản ứng là dùng HCl đặc (35 - 37%), nhiệt độ phản ứng là 90 - 95oC, thời gian phản ứng là 4 giờ. 4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan Phương trình phản ứng: Chitosan HCl 36% H2O, T0cao glu.HCl Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 46 O NH2 OH CH2OH O O O NH2 OH CH2OH O O OH OH NH3Cl OH CH2OH HCl 36% H2O, T0cao Phương pháp tiến hành thí nghiệm và điều kiện như đã làm với chitin, nhưng chất tham gia là chitosan. Chọn điều kiện tối ưu của chitin để tiến hành thí nghiệm. Kết quả cho thấy thời gian để tan hết lượng chitosan tương đối dài (từ 1h15 phút - 1h30 phút). Dung dịch đặc quánh làm cho việc khuấy từ rất khó khăn. Kết thúc thời gian phản ứng, chúng tôi lọc nóng nhằm loại bỏ các chất không tan, kết quả là trên phễu lọc chúng tôi thu nhận được một lượng lớn chất không tan dạng keo nhớt đặc. Dịch lọc được tẩy màu bằng than hoạt tính, lọc, cô để loại bớt dung môi, để kết tinh qua đêm. Thấy có rất ít tinh thể glu.HCl được kết tinh. Sản phẩm keo đã được hút kiệt nước được kiểm tra sơ bộ bằng cách cho lượng mẫu keo vào hai cốc thuỷ tinh, cốc 1 chứa nước cất, cốc 2 chứa dung dịch axit acetic 1% và khuấy trong 20 phút thì nhận được kết quả : +) Cốc 1: Chất keo không tan tạo thành dung dịch huyền phù. +) Cốc 2: Chất keo tan tạo thành dung dịch trong suốt. Từ hai kết quả trên, chúng tôi cho rằng phản ứng chuyển hoá chitosan thành glu.HCl ở điều kiện HCl 36%, T0 = 90 - 950C, Ts = 4 giờ là khó thực hiện, tuy có sản phẩm glu.HCl tạo ra nhưng hiệu suất rất thấp (12%). Theo chúng tôi có thể lý giải như sau: Khi cho HCl đặc vào dung dịch sau đó đun đến nhiệt độ phản ứng, axit HCl sẽ kết hợp trước với nhóm –NH2 của chitosan tạo ra sản phẩm chitosan hydroclorua (-NH2.HCl), sản phẩm này tồn tại dạng keo bền không tan trong nước gây cản trở quá trình thuỷ phân cắt mạch liên kết glucozit, do đó mà sản phẩm glu.HCl được tạo ra rất ít. Nếu nhìn công thức cấu tạo của chitin và chitosan thì dường như việc tạo ra glu.HCl từ chitosan sẽ dễ dàng và cho hiệu suất cao hơn so với là đi từ chitin, nhưng thực tế thì ngược lại. Điều này có thể lý giải là do chitosan bị cắt mạch để tạo thành các polyme đơn giản hơn như oligome – phần không tan nằm lại trên phễu lọc. Chỉ có một phần rất nhỏ được thủy phân triệt để để tạo thành glu.HCl dẫn đến là hiệu suất thu được từ chitosan rất thấp. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 47 Phản ứng xảy ra như sau: O NH2 OH CH2OH O O O NH2 OH CH2OH O O OH OH NH2HCl OH CH2OH O NH2 OH CH2OH O O NH2 OH CH2OH O O NH2.HCl OH CH2OH O O O NH2HCl OH CH2OH O O NH2 OH CH2OH O O NH2HCl OH CH2OH O HCl 36% H2O T0cao HCl 36% H2O T0cao Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 48 KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của đề tài trên cơ sở các mục tiêu đề ra. Chúng tôi đã đạt được một số kết quả như sau: 1. Điều chế ra chitin, chitosan từ vỏ tôm phế thải. Với hàm lượng chitin thu được 27,18 – 35,83%, chitosan thu được 63,3÷74,7%. 2. Điều chế ra glucosamin hydroclorua đi theo con đường từ chitin. Với hàm lượng glu.HCl thu được tương đối cao (62,8%). 3. Sơ bộ khảo sát tìm được điều kiện tối ưu hóa cho quá trình điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin. Với điều kiện axit HCl đặc 36%; nhiệt độ phản ứng 90 – 950C; thời gian phản ứng là 4 giờ. Một số kiến nghị và đề xuất: Do điều kiện thời gian và kinh phí có hạn nên một số thực nghiệm chưa có điều kiện thực hiện. Vì vậy, nếu sau này có điều kiện xin được tiếp tục các nghiên cứu sau: 1. Hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, chitosan từ vỏ tôm phế thải từ các nhà máy chế biến thủy sản, đông lạnh,… sao cho điều kiện là tối ưu hóa và áp dụng được trên quy mô sản xuất công nghiệp. 2. Điều chế glucosamin dạng tự do từ chitin, chitosan làm nguyên liệu sạch cho các nghiên cứu tổng hợp các hợp chất quan trọng khác có ứng dụng lớn tới đời sống con người. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Đức Ý (Texas-Hoa Kỳ) “Dinh dưỡng với viêm khớp”. Tạp chí sức khỏe đời sống, N0 344, tr 9-10, 2006. 2. Bách khoa toàn thư bệnh học. NXB từ điển BKHN, tập 2, tr 68-70. 2000. 3. Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và một số cộng sự. “Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua”. Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ. Nha Trang.2000. 4. Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền và cùng các cộng sự . “Vật liệu sinh học từ chitin”. Viện hóa học - Viện công nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia. Hà Nội.1997. 5. Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào & cộng sự. “Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia trong sản xuất giò lụa, bánh cuốn”. Viện dinh dưỡng. Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam. 6. Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền. “Nghiên cứu thủy phân chitosan bằng axít hữu cơ” và “Nghiên cứu phản ứng chitosan bằng axít Fomic và axít Acetic”. Hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ III, tr 210-221. 2005. 7. Nguyễn Thị Đông, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Hoan. “Ứng dụng chitosan khối lượng phân tử thấp để kích thích sinh trưởng đối với cây lúa”. Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 3, tr 445-449.2005 8. BS.Huỳnh Bá Lĩnh. “Glucosamine, thuốc mới điều trị bệnh viêm khớp”. Bệnh Viện Việt Đức Hà Nội. Tài liệu truy cập mạng internet, theo địa chỉ : vietduchospital.edu.vn. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 50 9. Ts. Nguyễn Vĩnh Ngọc. “Thuốc điều trị thoái hóa khớp” Khoa xương khớp Bệnh Viện Bạch Mai Hà Nội. Tạp chí Sức khỏe & đời sống ra ngày 30/5/2006, số 964. 10. Lưu Vǎn Chính, Châu Vǎn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận. “Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu của N,N,N-trimethyl chitosan (TMC)”. Tạp chí Dược học số 9, mục 5, năm 2000. 11. Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty. “Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen của chitosan trong điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm”. Tạp chí Dược học số 9, mục 9, năm 2000. 12. Nguyễn Xuân Hoài, Hoàng Kim Huyền “Đánh giá tác dụng phụ của thuốc chống viêm không steroid (NSAID) trong điều trị các bệnh xương khớp tại một bệnh viện tuyến trung ương”. Tạp chí Dược học số 9, mục 10, năm 2000. 13. Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan”. Các bài giảng và báo cáo chuyên đề, tập 2, tr 27-35, 1995. 14. Đỗ Đình Rãng, Phạm Đình Cường, “Xác định hàm lượng chitin của một số loài thủy sản ở Việt Nam và chuyển hóa thành glucosamin”. Tạp chí khoa học, N0 4, tr 66- 71, 1990. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI. 15. Sydney London. “Encyclopedia ò polymer Sciene and Technology”. Vol 3, p 605-704. 1965. 16. Kim. S. S., Kim. S. H. and Lee.Y. M. (1996). “Preparation, characterization and properties of β-Chitin and N-Acetylated β-Chitin”, J.Polymer Sci., Part B: Polymer physics. Vol 34, p.2367-2374. 17. Richard Carl Capozza, US. Pat. N0 4074713. 18. Singh Dinesh.K., Ray Alok.R., Macromol.J. “Biomedical Applications of Chitin, Chitosan and their derivatives”.Sci., Res. Macromol. Chem. Phys.2000, C40 (1), p. 69-83. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 51 19. Richrdson, Simon.C.W., Kolbe Hanno.V.J., Duncan Ruth., “Chitosan copolymers for intranasal Delivery of Insulin”. et al. C.A, Vol. 130, N0 25, 1999, p. 1141(342,853u), England. 20. Onishi Hiraku, Machida Yoshiharu et al. “Biodegradation and distribution of weter – soluble PDP in mice”. C.A, Vol. 130, N0 2, 1999, p.1158(286,935h), Japan. 21. Mosbay.M., Deral.T. Pat. N0 EP 0356060. A2 900228, 1998, England. 22. Schuzczyk Henryk, Pomoell Harri, Wulff Marketta, Saynatjok Elina et al. “Chitosan – based pharmaceuticals for reduction of cholesterol and lipid contents”. C.A, Vol 132, N0 23, 2000, p.1170(313724P, Finland). 23. Jing. S. B., L. Li, D. Ji. Y. Takiguchi, T. Yamaguchi 1997 : “Effect of chitosan on renal function in patients with chronic renal failure”, J. Pharm. Pharmacol. Jun; 49 (7), p.721-723. 24. Yao Kangde, Yin Yuji, Cheng Guoxian, Zhou Jun. “Biomedical developments in Chitosan – based polymers”. C.A, Vol 130, N0 13, 1999, p. 1052(172813, China). 25. Shigehiro Hirano, Haruyoshi Seino, Yasutoshi Akiyama and Isao Nonaka. “Progress in Biomedical Polymers”. New York, 1990, p. 283- 290. 26. “Supramolecular Biopolymers II – Polysaccharides”. 07 – Jun - 2006 10:40AM, p. 24 - 39. 27. Inui Hiroshi Appl. Biol. Sci., 1997; Vol 2, N0 2, p 55 - 65.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfdo_an_glucosamin_pp_hoa_hoc_9124.pdf
Tài liệu liên quan