Đề tài Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: Tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng

u g¾n èng sinh hµn håi l­u trong 2 giê Dung dÞch chuÈn: KNO3 (®· sÊy kh« ë 105oC) 0,1631 g N­íc cÊt 500 ml CHCl3 1 ml N­íc cÊt ®ñ 1000 ml TiÕn hµnh: - MÉu n­íc (chøa kh«ng qu¸ 5 mg/L nitrate) lÊy vµo èng nghiÖm, trung hßa ®Õn pH 7. - ChuyÓn mÉu sang chÐn sø, c« c¹n b»ng ®un c¸ch thñy. - Thªm 2 ml dung dÞch acid disulfofemic, hßa tan phÇn cÆn b»ng ®òa thñy tinh. - Thªm 20 ml n­íc cÊt, 6 ml NH3 ®Æc hoÆc 6 ml KOH 12N. - Thªm n­íc cÊt cho ®ñ 50 ml (trong b×nh ®Þnh møc). - §o OD t¹i b­íc sãng 410 nm. - §­êng chuÈn ®­îc x©y dùng trªn c¸c nång ®é dung dÞch chuÈn tõ 0 - 10 mM c) Ph­¬ng ph¸p formaldoxime, ®Þnh l­îng Mn(II) (Brewer vµ Spencer, 1971) Nguyªn lý: Ion mangan ph¶n øng mµu víi formaldoxime (formaldehyde oxime) trong m«i tr­êng kiÒm t¹o thµnh phøc cã mµu cam ®á ®Ëm, x¸c ®Þnh ë b­íc sãng 450 nm. §Ó kh«ng h×nh thµnh c¸c kÕt tña hydroxit, pH tèi ­u cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ 8,8 - 8,9. ChuÈn bÞ: Formaldoxime: 20 g Hydroxylamine hydrochloride hßa tan trong 450 ml n­íc cÊt, thªm 10 ml dung dÞch Formaldehyde 37% vµ thªm n­íc ®Õn 500 ml. Ammonia (NH3) Hçn hîp Formaldoxime:Ammonia víi tØ lÖ 5:2 Dung dÞch chuÈn (100 μg Mn(II)/ml): Hßa tan 0,2876 g permanganate kali (KMnO4) trong 100 ml n­íc cÊt, thªm 3 ml dung dÞch H2SO4 ®Ëm ®Æc, dÉn acid sunfurous (SO2 trong n­íc) cho ®Õn khi dung dÞch mÊt mµu. §un s«i dung dÞch ®Ó lo¹i bá SO2 thõa, sau ®ã lµm l¹nh dung dÞch. Bæ sung n­íc cho ®ñ 1 lÝt. TiÕn hµnh: - §­a 35 ml mÉu vÒ pH = 8,8 - 8,9. - Thªm 3 ml hçn hîp formaldoxime/ammonia vµo l¾c xoay trßn, ®Òu. - Sau 2 - 30 phót ®o quang phæ hÊp thô ë b­íc sãng 450 nm. - §­êng chuÈn ®­îc x©y dùng trªn c¸c nång ®é dung dÞch chuÈn tõ 0 - 10 mM. Ch­¬ng 3 - KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. X¸c ®Þnh sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate t¹i c¸c m«i tr­êng sinh th¸i kh¸c nhau (B) (A) Số lượng tế bào (×103 · g -1) H×nh 8. X¸c ®Þnh sè l­îng vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate trong c¸c m«i tr­êng sinh th¸i kh¸c nhau. (A) - NhËn biÕt sù cã mÆt cña vi khuÈn trong c¸c èng MPN th«ng qua biÕn ®æi mµu s¾c cña m«i tr­êng tõ tr¾ng xanh (Fe(II)) sang vµng n©u (Fe(III)). (B) - Sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate x¸c ®Þnh th«ng qua ph­¬ng ph¸p MPN. Ba m«i tr­êng ®¹i diÖn ®­îc lùa chän ®Ó tiÕn hµnh nghiªn cøu gåm cã bïn ®¸y ao n­íc ngät, ch©n ruéng lóa ngËp n­íc vµ trÇm tÝch n­íc lî ven biÓn. §©y lµ nh÷ng m«i tr­êng cã sù tham gia ho¹t ®éng tÝch cùc cña vi khuÈn trong chu tr×nh chuyÓn ho¸ s¾t vµ nit¬ (Ratering vµ Schnell, 2001). Sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate trong c¸c mÉu bïn ®¸y vµ trÇm tÝch thu thËp t¹i ba m«i tr­êng sinh th¸i kh¸c nhau ®­îc x¸c ®Þnh th«ng qua ph­¬ng ph¸p MPN (Most Probable Number) sö dông m«i tr­êng dÞch thÓ chøa FeSO4 lµm chÊt cho ®iÖn tö vµ NaNO3 lµm chÊt nhËn ®iÖn tö cuèi cïng. Thµnh phÇn kho¸ng trong m«i tr­êng t­¬ng øng víi ®iÒu kiÖn n­íc ngät (®èi víi mÉu bïn ®¸y ao vµ bïn ch©n ruéng ngËp n­íc) hoÆc n­íc lî (®èi víi trÇm tÝch ven biÓn). Sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn sinh tr­ëng nhê oxy ho¸ Fe(II) ®ång thêi víi khö nitrate trong c¸c èng MPN ®­îc nhËn biÕt th«ng qua sù biÕn ®æi mµu s¾c cña m«i tr­êng tõ tr¾ng xanh (mµu cña Fe(II)) sang mµu vµng n©u (mµu cña Fe(III)) (h×nh 8A). KÕt qu¶ thÝ nghiÖm MPN (h×nh 8B) cho thÊy sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate cao nhÊt trong mÉu bïn ch©n ruéng ngËp n­íc (9,3 x 103 tÕ bµo/g bïn), cao h¬n h¼n so víi mÉu trÇm tÝch n­íc lî ven biÓn (4,3 x 103 tÕ bµo/g trÇm tÝch) vµ mÉu bïn ®¸y ao n­íc ngät (1,5 x 103 tÕ bµo/g bïn). MËt ®é vµ mèi t­¬ng quan gi÷a sè l­îng vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate víi c¸c ®iÒu kiÖn m«i tr­êng t¹i mçi vïng sinh th¸i nh­ trªn còng ®· ®­îc t×m thÊy trong mét sè nghiªn cøu tr­íc ®©y. Khi nghiªn cøu chu tr×nh chuyÓn ho¸ s¾t trong ®Êt trång lóa t¹i ý, Ratering ®· ph¸t hiÖn thÊy nång ®é c¸c ion s¾t trong m«i tr­êng nµy rÊt cao vµ c¸c loµi tham gia chu tr×nh chuyÓn ho¸ s¾t ®ãng vai trß quan träng trong chu tr×nh chuyÓn ho¸ vËt chÊt t¹i ®©y (Ratering, 1999). Bªn c¹nh ®ã, nhiÒu nghiªn cøu kh¸c còng cho thÊy sè l­îng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate t¹i nhiÒu vïng sinh th¸i kh¸c nhau trªn thÕ giíi dao ®éng trong kho¶ng tõ 1 × 103 ®Õn 5 × 108 tÕ bµo/g mÉu kh« (Straub vµ cs, 1996; Hauck vµ cs, 2001; Ratering vµ Schnell, 2001; Weber vµ cs, 2006 b, c). 3.2. Ph©n tÝch cÊu tróc quÇn x· vi khuÈn b»ng ®iÖn di biÕn tÝnh (DGGE) Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di biÕn tÝnh - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ®­îc øng dông phæ biÕn trong nghiªn cøu ®a d¹ng, ph©n tÝch cÊu tróc di truyÒn cña quÇn x· vi khuÈn còng nh­ x¸c ®Þnh c¸c nhãm vi khuÈn chiÕm ­u thÕ trong c¸c m«i tr­êng sinh th¸i kh¸c nhau (Norris vµ cs, 2002; Sekiguchi vµ cs, 2002; Bano vµ Hollibaugh, 2002; Avrahami, 2002; Nicol vµ cs, 2003; Crump vµ cs, 2003). Víi môc ®Ých x¸c ®Þnh nhãm vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate chiÕm ­u thÕ t¹i c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu, chóng t«i tiÕn hµnh ph©n tÝch cÊu tróc quÇn x· vi khuÈn trong c¸c èng MPN ë ®é pha lo·ng 10-3 (lµ nång ®é gÇn tíi h¹n cña d·y MPN ®èi víi c¶ 3 mÉu) b»ng ph­¬ng ph¸p PCR-DGGE ®o¹n gen 16S rDNA (h×nh 9). C¸c b¨ng ®iÖn di ®­îc c¾t tõ gel vµ sö dông lµm khu«n cho ph¶n øng PCR sau ®ã ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù vµ so s¸nh víi c¸c tr×nh tù 16S rDNA ®· c«ng bè trong ng©n hµng d÷ liÖu GeneBank. Anaeromyxobacter sp. Pseudomonas sp. A R B Paracoccus sp. H×nh 9. Phæ ®iÖn di biÕn tÝnh (DGGE) ph©n tÝch ®o¹n 16S rDNA cña quÇn x· vi khuÈn trong c¸c èng MPN cña c¸c mÉu nghiªn cøu. A - Bïn ®¸y ao n­íc ngät; R - Bïn ch©n ruéng ngËp n­íc; B - TrÇm tÝch ven biÓn. Cã thÓ thÊy r»ng nhãm vi khuÈn thuéc chi Anaeromyxobacter cã mÆt trong c¶ 3 d¹ng m«i tr­êng nghiªn cøu. §©y lµ nhãm vi khuÈn n»m trong ph©n líp d-Proteobacteria, hiÖn míi chØ cã mét loµi duy nhÊt ®­îc c«ng bè lµ A. dehalogenans cïng víi mét sè ®¹i diÖn ch­a ®Þnh danh ®Õn loµi. C¸c chñng Anaeromyxobacter ®· c«ng bè ®Òu sinh tr­ëng kþ khÝ khö Fe(III), ch­a cã chñng nµo ®­îc nghiªn cøu vÒ kh¶ n¨ng sinh tr­ëng khö nitrate, sö dông Fe(II) lµm chÊt cho ®iÖn tö (Treude vµ cs, 2003; Straub vµ cs, 1996, 1998). Trong m«i tr­êng nu«i cÊy sö dông ë ®©y (còng nh­ trong ®iÒu kiÖn tù nhiªn), Fe(III) ®ång thêi tån t¹i víi Fe(II) do kÕt qu¶ chuyÓn ho¸ Fe(II) b»ng con ®­êng ho¸ häc (ph¶n øng víi l­îng nhá oxy trong m«i tr­êng) vµ con ®­êng sinh häc (do c¸c vi sinh vËt oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate). Do vËy, sù cã mÆt cña c¸c loµi sinh tr­ëng kþ khÝ khö Fe(III) nh­ Anaeromyxobacter trong ®iÒu kiÖn m«i tr­êng nghiªn cøu ë ®©y (còng nh­ trong tù nhiªn) lµ m¾t xÝch khÐp kÝn chu tr×nh chuyÓn ho¸ s¾t t¹i ®©y. Hai nhãm vi khuÈn Paracoccus vµ Pseudomonas t­¬ng øng chiÕm ­u thÕ trong mÉu bïn ao n­íc ngät vµ ch©n ruéng ngËp n­íc. §©y lµ hai chi vi khuÈn thuéc líp Proteobacteria, cã nhiÒu ®¹i diÖn sinh tr­ëng kþ khÝ khö nitrate, bao gåm c¶ c¸c loµi cã kh¶ n¨ng sö dông Fe(II) lµm chÊt cho ®iÖn tö (Weber vµ cs, 2006b; Ratering vµ Schnell, 2001; Schafleigh, 2000). Nh­ vËy cã thÓ kÕt luËn r»ng trong m«i tr­êng n­íc ngät t¹i ViÖt Nam (®¹i diÖn lµ ao n­íc ngät vµ ruéng ngËp n­íc), Paracoccus vµ Pseudomonas lµ c¸c nhãm vi khuÈn ®ãng vai trß chÝnh trong viÖc oxy ho¸ Fe(II) b»ng nitrate. Tuy nhiªn, trong m«i tr­êng n­íc lî b»ng ph­¬ng ph¸p nµy hiÖn ch­a x¸c ®Þnh ®­îc nhãm vi khuÈn chiÕm ­u thÕ. Nguyªn nh©n cã thÓ do sù kÐm c¹nh tranh cña vi khuÈn khö nitrate nãi chung so víi c¸c nhãm kþ khÝ kh¸c, ®Æc biÖt lµ nhãm vi khuÈn khö sulfate trong m«i tr­êng nµy (Schafleigh, 2000). §¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn vi khuÈn trong c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu b»ng ph­¬ng ph¸p FISH FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) lµ ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh trùc tiÕp (kh«ng qua b­íc ph©n lËp vµ nu«i cÊy) mèi liªn quan ph¶ hÖ cña vi khuÈn trong m«i tr­êng sèng cña chóng th«ng qua c¸c ®Çu dß ®¸nh dÊu huúnh quang cã thÓ b¾t cÆp víi rRNA (Amann vµ cs, 1995). BET42a GAM42a ALF968 H×nh 10. H×nh ¶nh hiÓn vi cña tÕ bµo vi khuÈn trong c¸c mÉu nghiªn cøu b¾t cÆp víi ®Çu dß huúnh quang . Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña mét sè c«ng tr×nh ®· c«ng bè, nhãm vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate th­êng thuéc vµo ph©n líp a-, b- vµ g-Proteobacteria (Chaudhuri vµ cs, 2001; Edwards vµ cs, 2003) v× vËy, trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i sö dông ba ®Çu dß ALF968, BET42a vµ GAM42a t­¬ng øng b¾t cÆp ®Æc hiÖu víi rRNA cña c¸c vi khuÈn thuéc ba ph©n líp trªn. Tû lÖ vi khuÈn mçi nhãm ®­îc tÝnh theo tû lÖ sè tÕ bµo b¾t cÆp víi ®Çu dß (h×nh 10) t­¬ng øng trªn tæng sè tÕ bµo ®­îc nhuém DAPI. PhÇn kh«ng b¾t cÆp víi mét trong ba ®Çu dß ®­îc sö dông ë ®©y ®­îc gäi lµ phÇn kh«ng x¸c ®Þnh (KX§) (h×nh 11). ThÝ nghiÖm lai víi c¸c ®Çu dß chØ cho kÕt qu¶ ®èi víi mÉu tõ hai m«i tr­êng n­íc ngät lµ bïn ch©n ruéng ngËp n­íc vµ bïn ®¸y ao n­íc ngät. Riªng ®èi víi mÉu trÇm tÝch ven biÓn, kh«ng cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh ®èi víi c¶ 3 ®Çu dß. ë hai mÉu d­¬ng tÝnh ®Òu cho kÕt qu¶ víi ®Çu dß ALF968, riªng ®Çu dß GAM42a vµ BET42a chØ cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh t­¬ng øng ë mÉu bïn ch©n ruéng ngËp n­íc vµ mÉu bïn ®¸y ao n­íc ngät (h×nh 11). Nh­ vËy, b»ng ph­¬ng ph¸p nµy chóng t«i kh«ng x¸c ®Þnh ®­îc møc ®é ®a d¹ng di truyÒn cña mÉu trÇm tÝch ven biÓn víi 3 ®Çu dß sö dông. KX§ 60% ALF968 20% GAM42a 20% KX§ 50% ALF968 30% BET42a 20% Bïn ch©n ruéng ngập nước Bïn ®¸y ao nước ngọt H×nh 11. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn vi khuÈn trong c¸c mÉu nghiªn cøu b»ng ph­¬ng ph¸p FISH. 3.4. Møc ®é oxy hãa Fe(II) vµ khö nitrate cña vi khuÈn trong c¸c mÉu nghiªn cøu Nång ®é Fe(II) vµ nitrate trong m«i tr­êng nu«i cÊy ®­îc x¸c ®Þnh theo thêi gian ®Ó ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng sinh tr­ëng b»ng oxy hãa Fe(II) vµ khö nitrate cña vi khuÈn trong c¸c mÉu lµm giµu (h×nh 12). KÕt qu¶ cho thÊy quÇn x· vi khuÈn ®­îc lµm giµu qua d·y MPN thÓ hiÖn kh¶ n¨ng sinh tr­ëng víi Fe(II) vµ nitrate kh¸ cao. ë c¶ 3 mÉu, l­îng nitrate trong m«i tr­êng bÞ khö ®¸ng kÓ sau 4 ngµy (h×nh 12B), tuy nhiªn l­îng Fe(II) kh«ng gi¶m t­¬ng øng (h×nh 12A). HiÖn t­îng nµy cã thÓ lý gi¶i b»ng sù cã mÆt cña nhãm vi khuÈn Anaeromyxobacter trong c¶ 3 mÉu ph©n tÝch (kÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®iÖn di biÕn tÝnh, môc 3.2) cïng víi c¸c nhãm vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate lµm chuyÓn ho¸ liªn tôc gi÷a Fe(III) vµ Fe(II) trong m«i tr­êng. (B) (A) H×nh 12. Ho¹t tÝnh oxy ho¸ Fe(II) (A) vµ khö nitrate (B) cña quÇn x· vi khuÈn t¹i ba m«i tr­êng nghiªn cøu sau khi ®· lµm giµu th«ng qua ph­¬ng ph¸p MPN. Ký hiÖu: O ®èi chøng kh«ng cã VSV; ¡ mÉu bïn ®¸y ao n­íc ngät; —mÉu bïn ch©n ruéng ngËp n­íc;  mÉu trÇm tÝch n­íc lî ven biÓn. 3.5. Ph©n lËp vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate tõ c¸c mÉu nghiªn cøu Song song víi c¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch ®a d¹ng vµ cÊu tróc di truyÒn quÇn x· vi khuÈn kh«ng qua b­íc ph©n lËp vµ nu«i cÊy nh­ ph­¬ng ph¸p PCR-DGGE vµ FISH ®· tiÕn hµnh ë phÇn trªn, chóng t«i tiÕp tôc tiÕn hµnh ph©n lËp c¸c chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ®¹i diÖn víi môc ®Ých (i) ®¸nh gi¸ møc ®é ®a d¹ng di truyÒn cña quÇn x· vi sinh vËt th«ng qua ph©n lËp vµ nu«i cÊy; (ii) nghiªn cøu chi tiÕt c¸c ®Æc ®iÓm sinh lý, sinh hãa vµ t×m hiÓu kh¶ n¨ng øng dông cña c¸c chñng ®¹i diÖn vµ (iii) x¸c ®Þnh vÞ trÝ ph©n lo¹i vµ ®Þnh danh khoa häc cho c¸c chñng ®¹i diÖn ®ã. (A) (B) H×nh 13. Ph©n lËp vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate ®¹i diÖn t¹i c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu. (A) - Ph©n lËp chñng ®¬n th«ng qua ph­¬ng ph¸p èng th¹ch kþ khÝ b¸n láng; (B) - Nu«i cÊy chñng ®¬n vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate trong m«i tr­êng dÞch thÓ ë ®iÒu kiÖn kþ khÝ hoµn toµn. Vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ®­îc ph©n lËp theo ph­¬ng ph¸p pha lo·ng trªn d·y èng th¹ch b¸n láng (1%) ®Õn ®é pha lo·ng 10-8 (Widdel vµ Bak, 1992) (h×nh 13A). C¸c khuÈn l¹c ®¬n ®­îc ph©n lËp dùa trªn sù kh¸c nhau vÒ h×nh d¹ng, kÝch th­íc khuÈn l¹c. Mçi khuÈn l¹c ®­îc t¸ch ra vµ nu«i cÊy kþ khÝ trong m«i tr­êng dÞch thÓ chøa Fe(II) (10 mM) vµ nitrate (5 mM) trong b×nh serum cã nót cao su (h×nh 13B). 12 khuÈn l¹c ®¬n ®­îc chän läc vµ ph©n lËp tõ c¸c èng MPN ë ®é pha lo·ng cao nhÊt cã vi khuÈn ph¸t triÓn (b¶ng 8) lµ ®¹i diÖn cho vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate chiÕm ®a sè t¹i ba m«i tr­êng nghiªn cøu. Nguån gèc ph©n lËp, ký hiÖu tªn chñng vµ ®Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c cña 12 chñng ®¬n ®­îc tr×nh bµy chi tiÕt ë b¶ng 8 d­íi ®©y. B¶ng 8. Vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ph©n lËp ®­îc tõ c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu. IN1 - IN12: 12 chñng ®¬n ph©n lËp ®­îc tõ c¸c mÉu nghiªn cøu. Nguån ph©n lËp Tªn chñng §Æc ®iÓm h×nh th¸i khuÈn l¹c Bïn ch©n ruéng lóa ngËp n­íc ë Cæ NhuÕ, Hµ néi IN1 H×nh trßn, bÒ mÆt nh½n, kÝch th­íc 1-2 mm IN2 H×nh trßn, bÒ mÆt kh«ng nh½n, kÝch th­íc 0,25-0,5 mm IN3 H×nh trßn, bÒ mÆt xï x×, kÝch th­íc 0,25-0,5 mm IN4 H×nh trßn, bÒ mÆt xï x×, kÝch th­íc 1-2 mm TrÇm tÝch n­íc lî t¹i biÓn V©n §ån, Qu¶ng Ninh IN5 H×nh trßn, bÒ mÆt nh½n, kÝch th­íc 0,25 mm IN6 H×nh bÇu dôc, bÒ mÆt nh½n, kÝch th­íc 0,25-0,5 mm IN7 H×nh trßn, bÒ mÆt xï x×, kÝch th­íc 0,8 mm IN8 H×nh trßn tia, mËt ®é tÕ bµo ë ngoµi Ýt h¬n phÝa trong, kÝch th­íc 1-1,5 mm Bïn ®¸y ao n­íc ngät ë Cæ NhuÕ, Hµ néi IN9 H×nh trßn, bÒ mÆt xï x×, kÝch th­íc 0,5-1 mm IN10 H×nh trßn kh«ng ®Òu, kÝch th­íc 0,5-1 mm IN11 H×nh trßn, bÒ mÆt nh½n, kÝch th­íc 0,2-0,3 mm IN12 H×nh ®Üa låi hai mÆt, kÝch th­íc 2-2,5 mm 3.6. §¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate b»ng ph­¬ng ph¸p ARDRA TÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña 12 chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ®· ph©n lËp ë trªn ®­îc ph©n tÝch b»ng ph­¬ng ph¸p ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) sö dông hai enzyme giíi h¹n HaeIII vµ MspI (h×nh 14). KÕt qu¶ thu ®­îc cho thÊy 12 chñng vi khuÈn nµy cã thÓ xÕp vµo 5 nhãm di truyÒn kh¸c nhau (b¶ng 9). IN1 IN2 IN3 IN4 IN5 IN6 IN7 IN8 IN9 IN10 IN11 IN12 M IN1 IN2 IN3 IN4 IN5 IN6 IN7 IN8 IN9 IN10 IN11 IN12 HaeIII MspI H×nh 14. Phæ ®iÖn di gen 16S rDNA cña 12 chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate sau khi xö lý b»ng c¸c enzyme giíi h¹n HaeIII vµ MspI. IN1 - IN12: 12 chñng ®¬n ph©n lËp ®­îc tõ c¸c mÉu nghiªn cøu; M: Marker 1000 bp (Bioneer). B¶ng 9. TÝnh ®a d¹ng di truyÒn vÒ di truyÒn cña 12 chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II) khö nitrate ®· ph©n lËp (IN1 - IN12) dùa trªn ph©n tÝch ARDRA. Nhãm ARDRA Chñng vi khuÈn C¸c ®o¹n DNA t¹o ra sau khi xö lý gen 16S rDNA b»ng c¸c enzyme giíi h¹n (bp) HaeIII MspI 1 IN1, IN2, IN4, IN11 200, 300 300, 500 2 IN3, IN8 200, 300 500 3 IN5, IN9 200, 300 500, 800 4 IN6, IN10, IN12 200, 300, 500 300, 500 5 IN7 200, 900 500 Tõ kÕt qu¶ ph©n nhãm ë b¶ng 9 kÕt hîp víi nguån gèc ph©n lËp 12 chñng vi khuÈn nµy (b¶ng 8), cã thÓ nhËn thÊy tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña 12 chñng vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate phô thuéc vµo ®Þa ®iÓm thu mÉu ban ®Çu. MÉu trÇm tÝch n­íc lî ven biÓn thÓ hiÖn møc ®é ®a d¹ng di truyÒn cao nhÊt víi 4 chñng ph©n lËp tõ mÉu nµy (IN5, IN6, IN7, IN8) thuéc vµo 4 nhãm kh¸c nhau (nhãm ARDRA-2, nhãm ARDRA-3, nhãm ARDRA-4 vµ nhãm ARDRA-5). TiÕp ®Õn lµ mÉu bïn ®¸y ao n­íc ngät víi 4 chñng (IN9, IN10, IN11, IN12) thuéc vµo 3 nhãm kh¸c nhau (nhãm ARDRA-1, nhãm ARDRA-2 vµ nhãm ARDRA-4). ThÓ hiÖn tÝnh ®a d¹ng di truyÒn thÊp nhÊt lµ mÉu bïn ch©n ruéng ngËp n­íc víi 4 chñng (IN1, IN2, IN3, IN4) thuéc vµo 2 nhãm kh¸c nhau (nhãm ARDRA-1 vµ nhãm ARDRA-2). Ba chñng IN2, IN7 vµ IN12 ®¹i diÖn cho 3 nguån ph©n lËp vµ ®¹i diÖn cho c¸c nhãm ARDRA chÝnh (b¶ng 9, tªn chñng ®­îc in ®Ëm) ®­îc lùa chän ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch tr×nh tù gen 16S rDNA vµ ®Þnh danh khoa häc. Chñng IN2 ®¹i diÖn cho nhãm ARDRA-1 gåm 4 chñng tõ hai d¹ng m«i tr­êng n­íc ngät, chiÕm trªn 30% trong tæng sè c¸c chñng ph©n lËp ®­îc. T­¬ng tù, chñng IN12 ®¹i diÖn cho nhãm ARDRA-4 gåm 3 chñng tõ m«i tr­êng n­íc lî vµ ao n­íc ngät, chiÕm 25% trong tæng sè c¸c chñng ph©n lËp ®­îc. Chñng IN7 lµm thµnh mét nhãm riªng biÖt (ARDRA-5), chØ t×m thÊy ë m«i tr­êng n­íc lî ven biÓn. H×nh 15. C©y ph©n lo¹i thÓ hiÖn mèi liªn quan gi÷a c¸c chñng IN2, IN7, IN12 vµ c¸c loµi gÇn gòi dùa trªn tr×nh tù gen 16S rDNA. C©y ®­îc dùng theo ph­¬ng ph¸p neighbor-joining, ®¬n vÞ = 0,02 Knuc trong tr×nh tù nucleotide. C¸c sè hiÓn thÞ ë c¸c vÞ trÝ ph©n nh¸nh lµ kÕt qu¶ ph©n tÝch bootstrap ®èi víi 1000 phÐp so s¸nh (chØ cã c¸c gi¸ trÞ trªn 50% ®­îc tr×nh bµy trªn h×nh). B. subtilis lµ loµi vi khuÈn ®­îc chän lµm outgroup. KÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù gen 16S rDNA cña c¸c chñng nµy víi ng©n hµng d÷ liÖu GenBank cho thÊy chñng IN2 cã ®é t­¬ng ®ång cao nhÊt víi Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), chñng IN7 cã ®é t­¬ng ®ång cao nhÊt víi Pseudomonas stutzeri (98%) vµ chñng IN12 cã ®é t­¬ng ®ång cao nhÊt víi Paracoccus ferooxydant (97%) (h×nh 15). Nh­ vËy nhãm ARDRA-4 víi chñng IN12 lµm ®¹i diÖn lµ c¸c chñng thuéc chi Paracoccus vµ ®­îc t×m thÊy trong hai d¹ng m«i tr­êng n­íc lî ven biÓn vµ ao n­íc ngät. Paracoccus lµ chi vi khuÈn n»m trong ph©n líp a-Proteobacteria, gåm c¸c loµi sinh tr­ëng kþ khÝ tuú tiÖn, h« hÊp b»ng nitrate hoÆc oxy (Schapleigh, 2000). KÕt hîp víi kÕt qu¶ ph©n tÝch PCR-DGGE ë trªn cã thÓ thÊy r»ng Paracoccus vµ Pseudomonas lµ hai nhãm chÝnh oxy ho¸ Fe(II) khö nitrate chiÕm ­u thÕ trong ba d¹ng m«i tr­êng ®­îc nghiªn cøu, trong ®ã Paracoccus cã vai trß quan träng h¬n ë ao n­íc ngät vµ Pseudomonas ë ruéng ngËp n­íc. §¹i diÖn cña c¶ hai nhãm nµy ®­îc t×m thÊy ë m«i tr­êng n­íc lî ven biÓn, cã thÓ lµ do ¶nh h­ëng cña nguån n­íc ngät tõ ®Êt liÒn. Dùa trªn kÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù gen 16S rDNA ë trªn, c¸c chñng IN2, IN7 vµ IN12 ®­îc ®Þnh danh lÇn l­ît lµ Anaeromyxobacter sp. IN2, Pseudomonas sp. IN7 vµ Paracoccus sp. IN12. Trong ba chñng ®­îc nghiªn cøu chi tiÕt ë trªn chØ cã chñng IN7 lµ ®¹i diÖn ®­îc ph©n lËp tõ m«i tr­êng n­íc lî ven biÓn. B»ng ph­¬ng ph¸p PCR-DGGE tr×nh bµy ë trªn, nhãm vi khuÈn chiÕm ­u thÕ trong m«i tr­êng n­íc lî ch­a x¸c ®Þnh ®­îc. Tuy nhiªn viÖc ph©n tÝch c¸c chñng ®¹i diÖn ph©n lËp ®­îc tõ c¶ ba m«i tr­êng nghiªn cøu cho phÐp kÕt luËn Pseudomonas còng lµ mét nhãm chiÕm ­u thÕ trong d¹ng m«i tr­êng nµy. 3.7. Nghiªn cøu ®Æc ®iÓm sinh lý, ph©n lo¹i vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña c¸c chñng vi khuÈn ®¹i diÖn Hai chñng vi khuÈn IN2 vµ IN12 ®¹i diÖn cho hai nhãm vi khuÈn chiÕm ­u thÕ trong c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu lµ Anaeromyxobacter vµ Paracoccus (phÇn 3.6). H¬n thÕ, trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm chóng t«i nhËn thÊy r»ng ®©y lµ hai chñng thÓ hiÖn kh¶ n¨ng sinh tr­ëng cao nhÊt trong sè c¸c chñng ®· ph©n lËp ®­îc. §Ó t×m hiÓu kh¶ n¨ng øng dông cña nhãm vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu c¸c ®Æc ®iÓm sinh lý cña hai chñng nµy. KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy hai chñng IN2, IN12 rÊt kh¸c nhau vÒ ®Æc ®iÓm sinh lý (b¶ng 10). Trong khi chñng IN2 lµ vi khuÈn kþ khÝ b¾t buéc th× chñng IN12 lµ vi khuÈn kþ khÝ tïy tiÖn, cã kh¶ n¨ng h« hÊp b»ng oxy (sinh tr­ëng hiÕu khÝ). Ngoµi nitrate ®­îc sö dông lµm chÊt nhËn ®iÖn tö cuèi cïng, chñng IN2 cßn cã kh¶ n¨ng sö dông Fe(III) lµm chÊt nhËn ®iÖn tö cßn chñng IN12 kh«ng cã kh¶ n¨ng nµy. C¶ hai chñng ®Òu kh«ng sinh tr­ëng b»ng khö sulfate (SO42-). B¶ng 10. §Æc ®iÓm sinh lý cña hai chñng vi khuÈn IN2 vµ IN12. Ký hiÖu: (-): kh«ng sinh tr­ëng; (+ ®Õn +++): c¸c møc ®é sinh tr­ëng t¨ng dÇn. §Æc ®iÓm sinh lý IN2 IN12 H« hÊp b»ng oxy (sinh tr­ëng hiÕu khÝ) - + + Sinh tr­ëng phô thuéc ®é mÆn cña m«i tr­êng (% NaCl) 0% - + + + 1% + + + + + + 2% + + + + + + 3% + + + + + + 4% + + + + + 5% + + + + ChÊt cho ®iÖn tö (®Ó khö nitrate) Lactate + + + + + + Acetate + + + + + + Ethanol + + + + + + Benzoate + + + + ChÊt nhËn ®iÖn tö (oxy ho¸ lactate) Nitrate + + + + + + Fe(III) + + + - Sulfate - - §èi víi c¸c nguån ®iÖn tö kh¸c nhau phôc vô cho qu¸ tr×nh khö nitrate, ngoµi Fe(II) ®· ®­îc sö dông ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy tõ ban ®Çu, lactate, acetate, benzoate vµ ethanol ®Òu ®­îc oxy ho¸ bëi hai chñng IN2 vµ IN12. Trong tr­êng hîp benzoate, mét acid h÷u c¬ chøa vßng th¬m vµ th­êng khã bÞ oxy ho¸ h¬n c¸c hîp chÊt cßn l¹i, chñng IN12 thÓ hiÖn kh¶ n¨ng oxy ho¸ kÐm h¬n h¼n so víi chñng IN2. §é mÆn lµ mét trong c¸c yÕu tè m«i tr­êng quan träng ¶nh h­ëng ®Õn sinh lý cña vi khuÈn trong tù nhiªn, do vËy ë ®©y chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é muèi trong m«i tr­êng ®èi víi kh¶ n¨ng sinh tr­ëng cña hai chñng vi khuÈn quan t©m. KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy chñng IN2 cã nhu cÇu vÒ muèi ®Ó sinh tr­ëng cßn chñng IN12 th× kh«ng. Trong khi chñng IN12 cã thÓ sinh tr­ëng trong m«i tr­êng kh«ng cÇn bæ sung NaCl th× chñng IN2 chØ ph¸t triÓn khi NaCl cã mÆt ë nång ®é 1% trë lªn. Tuy nhiªn, chñng IN2 l¹i cã kh¶ n¨ng chÞu muèi cao h¬n IN12, chñng nµy vÉn ph¸t triÓn tèt ë nång ®é muèi 5% trong khi ®ã tèc ®é sinh tr­ëng cña IN12 bÞ ¶nh h­ëng ®¸ng kÓ ë c¸c nång ®é muèi cao h¬n 3%. §iÒu nµy còng phï hîp víi ®Æc ®iÓm ph©n bè cña hai chñng vi khuÈn trong tù nhiªn, cô thÓ lµ chñng IN2 ®¹i diÖn cho nhãm vi khuÈn ®­îc t×m thÊy ë nhiÒu d¹ng m«i tr­êng kh¸c nhau, bao gåm c¶ n­íc ngät vµ n­íc lî, trong khi ®ã chñng IN12 ®¹i diÖn cho nhãm chØ t×m thÊy ë bïn ®¸y thuû vùc n­íc ngät. Chñng IN2 gåm nh÷ng tÕ bµo d¹ng trùc khuÈn, kÝch th­íc 1 ´ 4 - 5 μm, chuyÓn ®éng tÝch cùc (h×nh 16). So s¸nh tr×nh tù gÇn ®ñ gen m· hãa cho gen 16S rDNA víi ng©n hµng d÷ liÖu GenBank cho phÐp xÕp chñng IN2 vµo chi Anaeromyxobacter (loµi gÇn gòi nhÊt lµ A. dehalogenans, 99% t­¬ng ®ång). Nh­ vËy chñng IN2 ®­îc bæ sung vµo danh s¸ch chi Anaeromyxobacter víi tªn khoa häc lµ Anaeromyxobacter sp. IN2 vµ m· tr×nh tù gen 16S rDNA trong GenBank lµ FJ939131 (h×nh 16). Anaeromyxobacter lµ mét chi ®­îc biÕt ®Õn víi c¸c ®¹i diÖn sinh tr­ëng kþ khÝ b¾t buéc b»ng oxy ho¸ c¸c hîp chÊt h÷u c¬ ®Ó khö Fe(III) (Treude vµ cs, 2003). Trong nghiªn cøu nµy, lÇn ®Çu tiªn vi khuÈn Anaeromyxobacter mµ ®¹i diÖn lµ chñng IN2 thÓ hiÖn kh¶ n¨ng sinh tr­ëng b»ng oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate, tuy nhiªn h×nh thøc sinh tr­ëng nµy kh«ng v­ît tréi so víi sinh tr­ëng kþ khÝ khö Fe(III). H×nh thøc sinh tr­ëng t­¬ng tù còng x¶y ra víi c¸c chñng thuéc chi Geobacter (Weber vµ cs, 2006 c). Nghiªn cøu nµy chØ ra r»ng trÇm tÝch cã chøa c¸c chñng vi khuÈn Geobacter sp. cã kh¶ n¨ng oxy hãa Fe(II) vµ khö Fe(III) cïng víi khö nitrate thµnh NH4+. Anaeromyxobacter sp. IN2 Paracoccus sp. IN12 0,5 μm H×nh 16. H×nh th¸i tÕ bµo vµ vÞ trÝ ph©n lo¹i cña hai chñng IN2 vµ IN12. H×nh th¸i tÕ bµo ®­îc quan s¸t trªn kÝnh hiÓn vi quang häc, ®é phãng ®¹i 1000 lÇn (®¬n vÞ = 5 mm). C©y ph©n lo¹i ®­îc dùng theo ph­¬ng ph¸p neighbor-joining, ®¬n vÞ = 0,02 Knuc trong tr×nh tù nucleotide. C¸c sè hiÓn thÞ ë c¸c vÞ trÝ ph©n nh¸nh lµ kÕt qu¶ ph©n tÝch bootstrap ®èi víi 1000 phÐp so s¸nh (chØ cã c¸c gi¸ trÞ trªn 500 ®­îc tr×nh bµy trªn h×nh). B. subtilis lµ loµi vi khuÈn ®­îc chän lµm outgroup. Chñng IN12 gåm nh÷ng tÕ bµo h×nh oval cã kÝch th­íc 1,5 ´ 1.5 - 2 μm, chuyÓn ®éng chËm. So s¸nh tr×nh tù gÇn ®ñ cña gen 16S rDNA víi ng©n hµng d÷ liÖu GenBank cho phÐp xÕp chñng IN12 vµo chi Paracoccus (loµi gÇn gòi nhÊt lµ P. aminovorans, 98% t­¬ng ®ång). Paracoccus lµ chi vi khuÈn n»m trong ph©n líp α-Proteobacteria, gåm nhiÒu loµi cã kh¶ n¨ng h« hÊp b»ng oxy (sinh tr­ëng hiÕu khÝ), ®ång thêi h« hÊp b»ng khö nitrate (Shapleigh, 2000). NhiÒu ®¹i diÖn cña chi Paracccus ®­îc t×m thÊy trong c¸c ®iÒu kiÖn tèi ­u cho khö nitrate, nh­ ®¸y c¸c thuû vùc (Shapleigh, 2000) hay trong c¸c hÖ thèng xö lý n­íc th¶i lo¹i bá nit¬, vÝ dô nh­ P. denitrificans, P. ferooxydans (Bitton, 1999). Chñng IN12 ®­îc ®Þnh danh khoa häc lµ Paracoccus sp. IN12 vµ cã m· tr×nh tù gen 16S rDNA trong GenBank lµ GU084390 (h×nh 16). MÆc dï cïng ®­îc ph©n lËp th«ng qua b­íc lµm giµu b»ng d·y MPN víi chÊt cho vµ nhËn ®iÖn tö t­¬ng øng lµ Fe(II) vµ nitrate, hai hñng IN2 vµ IN12 l¹i ®¹i diÖn cho hai nhãm vi khuÈn kh¸c nhau tham gia chu tr×nh s¾t ë m«i tr­êng trung tÝnh, cô thÓ lµ oxy ho¸ Fe(II) thµnh Fe(III) b»ng nitrate vµ khö Fe(III) thµnh Fe(II) b»ng c¸c hîp chÊt h÷u c¬. Tuy còng cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng cao trong m«i tr­êng cã Fe(II) vµ nitrate nh­ng chñng IN2 sÏ khã cã kh¶ n¨ng øng dông vµo môc ®Ých lo¹i bá Fe(II) vµ nitrate trong c¸c nguån n­íc « nhiÔm v× bÞ ¶nh h­ëng bëi kh¶ n¨ng sö dông Fe(III) lµm chÊt nhËn ®iÖn tö cuèi cïng ®Ó t¹o n¨ng l­îng. Kh¸c víi IN2, chñng IN12 lµ mét vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II) khö nitrate ®iÓn h×nh. H¬n thÕ n÷a, chñng vi khuÈn nµy cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng trong nhiÒu ®Òu kiÖn m«i tr­êng kh¸c nhau nh­ cã mÆt hay kh«ng cã mÆt oxy, thÝch nghi víi nhiÒu lo¹i nguån ®iÖn tö kh¸c nhau (nh­ Fe(II), c¸c acid h÷u c¬, r­îu) vµ sinh tr­ëng tèt trong m«i tr­êng cã ®é mÆn dao ®éng trong d¶i 0 - 3% (®Æc tr­ng cho c¶ m«i tr­êng n­íc ngät vµ n­íc lî). Víi nh÷ng ­u ®iÓm kÓ trªn, chñng IN12 høa hÑn cã tiÒm n¨ng øng dông vµo viÖc lo¹i bá nit¬ vµ Fe(II) trong c¸c nguån n­íc « nhiÔm. Ho¹t tÝnh oxy hãa Fe(II) vµ khö nitrate cña chñng IN12 ®­îc x¸c ®Þnh ë ®iÒu kiÖn kþ khÝ víi Fe(II) lµ chÊt cho ®iÖn tö vµ nitrate lµm chÊt nhËn ®iÖn tö cuèi cïng. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh nång ®é c¸c chÊt cho vµ nhËn ®iÖn tö trong m«i tr­êng biÕn ®æi theo thêi gian cho thÊy sù gi¶m nång ®é Fe(II) vµ nitrate diÔn ra song song víi tèc ®é ®¸ng kÓ (h×nh 17). Bªn c¹nh ®ã kh¶ n¨ng sö dông Mn(II) lµm chÊt cho ®iÖn tö ®Ó khö nitrate còng ®­îc kiÓm tra, tuy nhiªn chñng IN12 kh«ng thÓ hiÖn sinh tr­ëng râ rÖt trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nµy. Theo mét sè nghiªn cøu ®· c«ng bè, ho¹t tÝnh oxy ho¸ Mn(II), khö nitrate b»ng con ®­êng sinh häc ®­îc x¸c ®Þnh trong mét sè quÇn x· vi khuÈn ë ®¸y c¸c thuû vùc, nh­ng cho ®Õn nay ch­a cã chñng vi khuÈn nµo ®­îc ph©n lËp trong phßng thÝ nghiÖm víi ho¹t tÝnh kÓ trªn (Vandenebeele vµ cs, 1995; Gounot, 1994). H×nh 17. Lo¹i bá Fe(II) (·) vµ nitrate (¡) trong m«i tr­êng do t¸c ®éng cña chñng vi khuÈn IN12. KÕt luËn Sè l­îng vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate trong c¸c mÉu bïn thu thËp ë thñy vùc n­íc ngät, ch©n ruéng ngËp n­íc vµ vïng n­íc lî ven biÓn n»m trong kho¶ng 103 - 104 tÕ bµo/g, trong ®ã mÉu bïn ë ch©n ruéng ngËp n­íc cã sè l­îng tÕ bµo vi khuÈn nµy cao h¬n c¶ (9,3 ´ 103 tÕ bµo/g). KÕt qu¶ ph©n tÝch DGGE cho thÊy nhãm vi khuÈn thuéc chi Anaeromyxobacter chiÕm ­u thÕ ë c¶ ba d¹ng m«i tr­êng sinh th¸i nghiªn cøu vµ ®ãng vai trß khÐp kÝn chu tr×nh chuyÓn ho¸ s¾t trong c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu th«ng qua kh¶ n¨ng sinh tr­ëng kþ khÝ khö Fe(III). Paracoccus vµ Pseudomonas lµ hai nhãm vi khuÈn chÝnh thùc hiÖn qu¸ tr×nh oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate t­¬ng øng ë mÉu bïn ®¸y ao vµ ch©n ruéng ngËp n­íc. §¹i diÖn thuéc chi Pseudomonas (chñng IN7) còng ®­îc t×m thÊy trong m«i tr­êng n­íc lî ven biÓn, vµ cã thÓ ®ãng vai trß quan träng trong m«i tr­êng nµy. Vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate t¹i c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu cã tÝnh ®a d¹ng kh¸ cao. 12 chñng ®¬n ph©n lËp tõ c¸c mÉu MPN ®­îc xÕp vµo 5 nhãm kh¸c nhau trong ph©n tÝch ARDRA sö dông hai enzyme giíi h¹n HaeIII vµ MspI, trong ®ã mÉu trÇm tÝch ven biÓn thÓ hiÖn tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cao h¬n c¶ víi 4 chñng thuéc vµo 4 nhãm ARDRA kh¸c nhau. IN2 vµ IN12 ®¹i diÖn cho hai nhãm vi khuÈn tham gia chu tr×nh chuyÓn ho¸ s¾t t¹i c¸c m«i tr­êng nghiªn cøu, trong ®ã chñng IN2 tham gia khö Fe(III) thµnh Fe(II) b»ng c¸c hîp chÊt h÷u c¬ vµ chñng IN12 tham gia oxy ho¸ Fe(II) thµnh Fe(III) b»ng nitrate. Hai chñng nµy cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng víi nhiÒu chÊt cho ®iÖn tö (lactate, acetate, ethanol, benzoate) vµ nhËn ®iÖn tö (nitrate, Fe(III)) t¹i c¸c nång ®é muèi kh¸c nhau trong m«i tr­êng. So s¸nh tr×nh tù gÇn ®ñ cña gen 16S rDNA víi c¸c loµi ®· c«ng bè trªn GenBank cho phÐp ®Þnh danh hai chñng vi khuÈn IN2 vµ IN12 lÇn l­ît lµ Anaeromyxobacter sp. IN2 (m· tr×nh tù ®¨ng ký trªn GenBank lµ FJ939131) vµ Paracoccus sp. IN12 (m· tr×nh tù ®¨ng ký trªn GenBank lµ GU084390). h­íng nghiªn cøu tiÕp theo Víi ho¹t tÝnh cao trong viÖc oxy ho¸ Fe(II) vµ khö nitrate, chñng IN12 cã tiÒm n¨ng øng dông thùc tÕ trong viÖc xö lý c¸c nguån n­íc nhiÔm nit¬ vµ ion kim lo¹i Fe(II). Nghiªn cøu t×m gi¸ thÓ phï hîp ®Ó t¹o chÕ phÈm chøa vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate. Nghiªn cøu thö nghiÖm ¸p dông vi khuÈn oxy hãa Fe(II), khö nitrate ®Ó xö lý n­íc ngÇm nhiÔm s¾t vµ nit¬. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu TiÕng viÖt 1. Lª §øc (2004), Mét sè ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch m«i tr­êng, NXB §HQGHN. 2. Mai Thanh TruyÕt (1997), “¤ nhiÔm nitrate trong n­íc vïng ch©u thæ s«ng Cöu long”, 3. TCVN 5944 (1995), “ChÊt l­îng n­íc - Tiªu chuÈn chÊt l­îng n­íc ngÇm”, 4. TrÇn ThÞ KiÒu My, NguyÔn Hµ Thanh (2006), “ChuyÓn hãa s¾t trong c¬ thÓ vµ qu¸ t¶i s¾t ë mét sè bÖnh m¸u” Héi nghÞ Khoa häc ngµnh HuyÕt häc – TruyÒn m¸u Quèc gia. 5. ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ T©y nguyªn (2009) “§¸nh gi¸ « nhiÔm kim lo¹i nÆng t¹i nguån n­íc ë T©y nguyªn” Th«ng TÊn X· ViÖt Nam. Tµi liÖu TiÕng Anh 6. Amann RI, Krumholz L, Stahl DA (1990), “Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology” J Bacteriol, 172 (2), pp. 762-770. 7. Amann RI, Stromley J, Devereux R. Key R, Stahl DA (1992), “Molecular and microscopic identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms”, Appl Environ Microbiol, 58 (2), pp. 614-623. 8. Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH (1995), “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”, Microbiol Rev, 59 (1), pp. 143-169. 9. American public health association (1996), Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge, 604-609. 10. Appia-Ayme C, Guiliani N, Ratouchniak J, Bonnefoy V (1999), “Characterization of an operon encoding two c-type cytochromes, an aa3-type cytochrome oxidase, and rusticyanin in Thiobacillus ferrooxidans ATCC 33020”, Appl Environ Microbiol, 65 (11), pp. 4781-4787. 11. Avery AA (1999), “Infantile methemoglobinemia: Reexamining the role of drinking water nitrates”, Environ Health Perspect, 107 pp. 583-586. 12. Avrahami S (2002), Doctor thesis: Effects of temperature, soil ammonium concentration and fertilizer on activity and community structure of soil ammonia oxidizers, The faculty of Biology of the Philipps University of Marburg, Germany. 13. Bano N, Hollibaugh JT (2000), “Diversity and distribution of DNA sequences with affinity to ammonia-oxidizing bacteria of the β Subdivision of the class Proteobacteria in the Arctic Ocean”, Appl Environ Microbiol, 66 (5), pp. 1960-1969. 14. Bano N, Hollibaugh JT (2002), “Phylogenetic composition of bacterioplankton assemblages from the Arctic Ocean”, Appl Environ Microbiol, 68 (2), pp. 505-518. 15. Benz M, Brune A, Schink B (1998), “Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria”, Arch Microbiol, 169 pp. 159-165. 16. Bitton G (1999), Wastewater Microbiology, Wiley-Liss, Inc. Toronto, Canada. 17. Blake RC, Waskowsky J, Harrison AP (1992) “Respiratory components in acidophilic bacteria that respire on iron”, Geomicrobiol J, 10 pp. 173-192. 18. Brewer PG, Spencer DW (1971), “Colorimetric determination of manganese in anoxic waters”, Limnol Oceanogr, 16 (1), pp. 107-110. 19. Bruce RA, Achenbach LA, Coates JD (1999), “Reduction of (per)chlorate by a novel organism isolated from paper mill waste”, Environ Microbiol, 1 (4), pp. 319-329. 20. Chaudhuri SK, Lack JG, Coastes JD (2001), “Biogenic magnetite formation through anaerobic biooxidation of Fe(II)”, Appl Environ Microbiol, 67 (6), pp. 2844-2848. 21. Croal LR, Jiao Y, Newman DK (2007), “The fox operon from Rhodobacter strain SW2 promotes phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodobacter capsulatus SB1003”, J Bacteriol, 189 (5), pp. 1774-1782. 22. Crump BC, Kling GW, Bahr M, Hobbie JE (2003), “Bacterioplankton community shifts in an Arctic lake correlate with seasonal changes in organic matter source”, Appl Environ Microbiol, 69 (4), pp. 2253-3368. 23. Davies CE, Hill KE, Wilson MJ, Stephens P, Hill CM, Harding KG, Thomas DW (2004), “Use of 16S ribosomal DNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis for analysis of the microfloras of healing and nonhealing chronic venous leg ulcers”, J Clin Microbiol, 42 (8), pp. 3549-3557. 24. Delong EF, Wickham GS, Pace NR (1989), “Phylogenetic stain: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells”, Science, 243 (4896), pp. 1360-1363. 25. Dhillon A, Edwards K, Webb E, Roger D, Sogin M (2005), “Marinobacter aquaeolei gene expression studies for clues to neutrophilic iron oxidation”, NAI 2005 Biennial Meeting of the NASA Astrobiololy Institute. 26. DIN 38406-E1-1 (1983), German standard methods for the examination of water, waste water and sludge, cation (group E), determination of iron (E1). 27. Downes FP, Ito K (2001), Compendium of methods for the microbiological examination of foods, American Public Health Association, Washington, D.C. 28. Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003), “Isolation and characterization of novel psychrophilic, neutrophilic, Fe-oxidizing, chemolithoautotrophic α- and γ-Proteobacteria from the deep sea”, Appl Environ Microbiol, 69 (5), pp. 2906-2913. 29. Ehrenberg (1919), “Gallionella ferruginea”, In Ellis D, Iron bacteria, Methuen & Co. Ltd. 30. Ehrenreich A, Widdel F (1994), “Anaerobic oxidation of ferrous iron purple bacteria, a new type of phototrophic metabolism”, Appl Environ Microbiol, 60 (12), pp. 4517-4526. 31. Ehrlich HL, Newman DK (2008), Geomicrobiology, fifth edtion, CRC Press. 32. Emerson D, Moyer C (1997), “Isolation and characterization of novel iron-oxidizing bacteria that grow at circumneutral pH”, Appl Environ Microbiol, 63 (12), pp. 4784-4792. 33. Emerson D (2000), “Microbial oxidation of Fe(II) and Mn(II) at circumneutral pH”, In Lovley DR, Environmental microbe-metal interaction, ASM Press. 34. Emerson D, Weiss JV (2004), “Bacterial iron oxidation in circumneutral freshwater habitals: findings from the field and the laboratory”, Geomicrobiol J, 21 pp. 405-414. 35. Felsenstein J (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap”, Evolution, 39 pp. 783-791. 36. Fischer SG, Lerman LS (1979), “Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis”, Cell, 16 (1), pp. 191-200. 37. Ghiorse WC (1984), “Biology of iron- and manganese- depositing bacteria”, Annu Rev Microbiol, 38 pp. 515-550. 38. Giovannoni SJ, Delong EF, Olsen GJ, Pace NR (1988), “Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identificatio of single microbial cells” J Bacteriol, 170 (2), pp. 720-726. 39. Giovannoni SJ, Britschgi TB, Moyer CL, Field KG (1990), “Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton”, Nature, 345 pp. 60-63. 40. Gounot AM (1994), “Microbial oxidation and reduction of manganese: Consequences in groundwater and applications”, FEMS Microbiol Rev, 14 (4), pp. 339-349. 41. Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossagel P, Burggraf S, Huber H, Stetter KO (1996), “Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., A novel hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions”, Arch Microbiol, 166 (5), pp. 308-314. 42. Harder EC (1919), Iron-depositing bacteria and their geologic relations, U. S. Geologycal Survey, Professional Paper 113. 43. Hauck S, Benz M, Brune A, Schink B (2001), “Ferrous iron oxidation by denitrifying bacteria in profundal sediments of a deep lake (Lake Constance)”, FEMS Microbiol Ecol, 37 pp. 127-134. 44. Heising S, Schink B (1998), “Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium vannielii strain”, Microbiology, 144 pp. 2263-2269. 45. Heising S, Richter L, Ludwig W, Schink B (1999), “Chlorobium ferrooxidans sp. nov., a phototrophic green sulfur bacterium that oxidizes ferrous iron in coculture with a “Geospirillum” sp. strain”, Arch Microbiol, 172 pp. 116-124. 46. Jiao Y, Kappler A, Croal LR, Newman DK (2005), “Isolation and characterization of a genetically tractable photoautotrophic Fe(II)-oxidizing bacterium, Rhodopseudomonas palustris strain TIE-1”, Appl Environ Microbiol, 71 (8), pp. 4487-4496. 47. Jiao Y, Newman DK (2007), “The pio operon is essential for phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodopseudomonas palustric TIE-1” J Bacteriol, 189 (5), pp. 1765-1773. 48. Kappler A, Newman DK (2004), “Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing photoautotrophic bacteria”, Geochim Cosmochim Acta, 68 pp. 1217-1226. 49. Kützing (1919), “Leptothrix ochracea”, In Ellis D, Iron bacteria, Methuen & Co. Ltd. 50. Kross BC, Hallberg GR, Bruner DR, Cherryholmes K, Johnson K (1993), “The nitrate contamination of private well water in Iowa”, Am J Public Health, 83 (2), pp. 270-272. 51. Lack JG, Chaudhuri SK, Kelly SD, Kemner KM, O’Connor SM, Coates JD (2002), “Immobilization of radionuclides and heavy metals through anaerobic bio-oxidation of Fe(II)”, Appl Environ Microbiol, 68 (6), pp. 2704-2710. 52. LagacÐ L, Pitre M, Jacques M, Roy D (2004), “Identifiacation of the bacterial community of maple sap by using amplified ribosomal DNA (rDNA) restriction analysis and rDNA sequencing”, Appl Environ Microbiol, 70 (4), pp. 2052-2060. 53. Ludwig W, Schleifer KH (1994), “Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis”, FEMS Microbiol Rev, 15 (2-3), pp. 155-173. 54. Lundberg JO, Weitzberg E, Cole JA, Benjamin N (2004), “Nitrate, bacteria and human health”, Nature, 2 pp. 593-602. 55. Marmur J (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms”, J Mol Biol, 3 pp. 208-218. 56. MartÝnez-Murcia AJ, Acinas SG, Rodriguez-Valera F (1995), “Evaluation of prokaryotic diversity by restrictase digestion of 16S rDNA directly amplified from hypersaline environments”, FEMS Microbiol Ecol, 17 (4), pp. 247-255. 57. Miot J, Benzerara K, Obst M, Kappler A, Hegler F, Schäedler S, Bouchez C, Guyot F, Morin G (2009), “Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic iron-oxidizing bacteria”, Appl Environ Microbiol, 75 (17), pp. 5586-5591. 58. Moyer CL, Dobbs FC, Karl DM (1994), “Estimation of diversity and community structure through restriction fragment length polymorphism distribution analysis of bacterial 16S rRNA gens from a microbial mat at an active, hydrothermal vent system, Loihi Seamount, Hawaii”, Appl Environ Microbiol, 60 (3), pp. 871-879. 59. Moon J (2008), Iron - The most deadly metal, George Ohsawa Macrobiotic Foundation Chico, California. 60. Muyzer G, De Waal EC, Utterlinden AG (1993), “Profiling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA”, Appl Environ Microbiol, 59 pp. 695-700. 61. Myers RM, Fischer SG, Lerman LS, Maniatis T (1985), “Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradietnt gel electrophoresis”, Nucl Acids Res, 13 (9), pp. 3131-3145. 62. Nicol GW, Glover LA, Prosser JI (2003), “The impact of grassland management on archaeal community structure in upland pasture rhizosphere soil”, Environ Microbiol, 5 (3), pp. 152-162. 63. Norris TB, Wraith JM, Castenholz RW, McDermott TR (2002), “Soil microbial community structure across a thermal gradient following a geothermal heating event”, Appl Environ Microbiol, 68 (12), pp. 6300-6309. 64. Ratering S (1999), Iron cycle in italian rice field soil: localization of the redox processes and charactarization of the involved microorganisms, PhD Dissertation, University Marburg (Germany). 65. Ratering S, Schnell S (2001), “Nitrate-dependent iron(II) oxidation in paddy soil”, Environ Microbiol, 3 pp. 100-109. 66. Ravenschlag K, Sahm K, Pernthaler J, Amann R (1999), “High bacterial diversity in permanently cold marine sediments”, Appl Environ Microbiol, 65 pp. 3982 - 3989. 67. Rentz JA, Kraiya C, Luther GW, Emerson D (2007), “Control of ferrous iron oxidation within circumneutral microbial iron mats by cellular activity and autocatalysis”, Environ Sci Technol, 41 (17), pp. 6084-6089. 68. Saitou N, Nei M (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4 pp. 406-425. 69. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977), “DNA sequencing with chain-terminating inhibitors”, Proc Natl Acad Sct USA, 74 (12), pp. 5463-5467. 70. Sekiguchi H, Watanabe M, Nakahara T, Xu B, Uchiyama H (2002), “Succession of bacterial community structure along the Changjiang river determined by denaturing gradient gel electrophoresis and clone library analysis”, Appl Environ Microbiol, 68 (10), pp. 5142-5150. 71. Senko JM, Dewers TA, Krumholz LR (2005), “Effect of oxidation rate and Fe(II) state on microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation”, Appl Environ Microbiol, 71 (11), pp. 7172-7177. 72. Senn DB, Hemond HF (2002), “Nitrate controls on iron and arsenic in an urban lake”, Science, 296 pp. 2373-2376. 73. Shapleigh JP (2000), The Denitrifying Prokaryotes. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.H. Schleifer, E. Stackerbrandt, eds. The prokaryotes: an evolving electronic resource for the microbiological community, Springer-Verlag, New York. 74. Sheffield VC, Cox DR, Lerman LS, Myers RM (1989), “Attachment of a 40-base-pair G+C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes”, Proc Natl Acad Sci, 86 pp. 232-236. 75. Sobolev D, Roden EE (2001), “Suboxic deposition of ferric iron by bacteria in opposing gradients of Fe(II) and oxygen at circumneutral pH”, Appl Environ Microbiol, 67 (3), pp. 1328-1334. 76. Straub KL, Benz M, Schink B, Widdel F (1996), “Anaerobic, nitrate-dependent microbial oxidation of ferrous iron”, Appl Environ Microbiol, 62 (4), pp. 1458-1460. 77. Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998), “Enumeration and detection of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments”, Appl Environ Microbiol, 64 (12), pp. 4846-4856. 78. Straub KL, Rainey FA, Widdel F (1999), “Rhodovulum iodosum sp. nov. and Rhodovulum robiginosum sp. nov., two new marine phototrophic ferrous-iron-oxidizing purple bacteria”, Int J Syst Bacteriol (IJSB), 49 pp. 729-735. 79. Straub KL, Benz M, Schink B (2001), “Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH”, FEMS Microbiol Ecol, 34 pp. 181-186. 80. Straub KL, Schber W, Buchholz-Cleven B, Schink B (2004), “Diversity of ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria and their involvement in oxygen-independent iron cycling”, Geomicrobiol J, 21 (6), pp. 371-378. 81. Temple KL, Colmer AR (1951), “The autotrophic oxidation of iron by a new bacterium: Thiobacillus ferrooxidans”, J Bacteriol, 62 (5), 605-611. 82. Thauer RK, Jungermann K, Decker K (1977), “Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriol Rev, 41 (1), pp. 100-180. 83. Treude N, Rosencrantz D, Liesack W, Schnell S (2003), “Strain FAc12, a dissimilatory iron-reducing member of the Anaeromyxobacter subgroup of Myxococcales”, FEMS Microbiol Ecol, 44 pp. 261-269. 84. Tricker AR, Preussmann R (1991), “Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential”, Mutat Res, 259 (3 - 4), pp. 277-289. 85. USDA (United States Department of Agriculture) (2008), Laboratory Guidebook: Most probable number procedure and tables. 86. Vandenebeele J, De Beer J, Germonpre R, Van De Sande R, Verstraete W (1995), “Influence of nitrate on manganese removing microbial consortia from sand filters”, Wat Res Vol, 29 (2), pp. 579-587. 87. Ward DM, Weller R, Bateson MM (1990), “16S rRNA sequences reveal numerous uncultuted microorganisms in a natural community”, Nature, 345 pp. 63-65. 88. Weber KA, Picardal FW, Roden EE (2001), “Microbially catalyzed nitrate-dependent oxidation of biogenic solid-phase Fe(II) compounds”, Environ Sci Technol, 35 (8), pp. 1644-1650. 89. Weber KA, Achenbach LA, Coates JD (2006 a) “Microorganisms pumping iron: anaerobic microbial iron oxidation and reduction”, Nature, 4 pp. 752-764. 90. Weber KA, Pollock J, Cole KA, O’Connor SM, Achenbach LA, Coates JD (2006 b), “Anaerobic nitrate-dependent iron(II) bio-oxidation by a novel Lithoautotrophic Betaproteobacterium, Strain 2002”, Appl Environ Microbiol, 72 (1), pp. 686-694. 91. Weber KA, Urrutia MM, Churchill PF, Kukkadapu RK, Roden EE (2006 c), “Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms”, Environ Microbiol, 8 (1), pp. 100-113. 92. Widdel F, Bak F (1992), “Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria”, In The Prokaryotes, 2nd ed. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp. 3352-3378. 93. Widdel F, Schnell S, Heising S, Ehrenreich A, Assmus B, Schink B (1993), “Ferrous iron oxidation by anoxygenic photophic bacteria”, Nature, 362 pp. 834-836. 94. Woese CR, Kandler O, Wheelis ML (1990), “Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya”, Proc Natl Acad Sci USA, 87 pp. 4576-4579. 95. Yamanaka T, Fukumori Y (1995), “Molecular aspects of the electron transfer system which participates in the oxidation of ferrous ion by Thiobacillus ferrooxidans”, FEMS Microbiol Rev, 17 (4), pp. 401-413. 96. Yarz¸bal A, Brasseur G, Ratouchniak F, Lund K, Lemesle-Meunier D, DeMoss JA, Bonnefoy V (2002 a), “The high-molecular-weight cytochrome c Cyc2 of Acidithiobacillus ferrooxidans is an outer membrane protein”, J Bacteriol, 184 (1), pp. 313-317. 97. Yarz¸bal A, Brasseur G, Bonnefoy V (2002 b), “Cytochromes c of Acidithiobacillus ferrooxidans”, FEMS Microbiol Let, 209 pp. 189-195. 98. Yarz¸bal A, Appia-Ayme C, Ratouchniak F, Bonnefoy V (2004), “Regulation of the expression of Acidithiobacillus ferrooxidans rus operon encoding two cytochromes c, a cytochrome oxidase and rusticyanin”, Microbiology, 150 pp. 2113-2123. 99. Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996), “DNA recovery from soils of diverse composition”, Appl Environ Microbiol, 62 pp. 316-322. Phô lôc C¸c tr×nh tù gen IN2 16S rDNA (1429 bp), Anaeromyxobacter sp. tacacatgcagtcgagcgagaaagcccgcaagggtgagtaaagcggcgcacgggtgcgtaacacgtgggtaatctgccctagagtccggaataactcgccgaaaggcgtgctaatgccggatgagaccacgggagcctcggctcctgcgggaaaaggtggcctctgtacacaagctatcgctctaggatgagcccgcggcccatcagctcgttggcggggtaatggcccaccaaggcaacgacgggtagctggtctgagaggacgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatcttgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggtcttcggatcgtaaagcactgtcgcgagggacgaataagggacgggcgaacagtccgtttcgatgacggtacctcgagaggaagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttgttcggaattattgggcgtaaagcgcgtgtaggcggcctagcaagtcggatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagtgcgttcgaaactactgggcttgagtaccggagagggtggcggaattcccggtgtagaggtgaaattcgtagatatcgggaggaacaccagtggcgaaggcggccacctggacggatactgacgctgagacgcgaaagcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgagcgctaggtgttgcgggtgttgacccctgcagtgccgcagctaacgcattaagcgctccgcctgggaagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgcagaaccttacctggtcttgacatcctcggaatccctcagagatgagggggtgcccgcaagggaaccgagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgccgttagttgccatcattcagttgggcactctaacgggactgccggcgtcaagccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcctttatgaccagggctacacacgtgctacaatggccggtacagagggtcgccaagtcgcgagacggagctaatcccagaaaaccggtctcagttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtcagttgctccagaagtggccgcgccaacccgcaagggaggcaggtc IN7 16S rDNA (576 bp), Pseudomonas sp. TGCAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATAAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCA IN12 16S rDNA (1319 bp), Paracoccus sp. TAACGCGTGGGAATGTGCCCTTCTCTACGGAATAGCCCTGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACNATGNGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTGAAACTATCGGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGCAGGACAGCCCGAGAGATCGGGTCTTCTCGTAAGAGACCTGTGGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAAGAAACTGCCGATGATAAGTCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCCAACCTCGCAAGAGGAGGCAGCGGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGT C¸c c«ng tr×nh khoa häc ®· c«ng bè trong thêi gian thùc hiÖn luËn v¨n STT Tªn c«ng tr×nh c«ng bè T¸c gi¶ N¬i ®¨ng 1 §a d¹ng vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate t¹i mét sè m«i tr­êng sinh th¸i ë ViÖt Nam NguyÔn ThÞ TuyÒn, §inh Thuý H»ng T¹p chÝ C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc ViÖt Nam 2 Nghiªn cøu vi khuÈn ­u thÕ tham gia chu tr×nh Fe trong c¸c ®iÒu kiÖn m«i tr­êng kh¸c nhau t¹i ViÖt Nam NguyÔn ThÞ TuyÒn, NguyÔn Minh Gi¶ng, §inh Thuý H»ng T¹p chÝ Khoa häc Tù nhiªn vµ C«ng nghÖ, §HQGHN 3 §a d¹ng vi khuÈn khö nitrate trong mét sè m«i tr­êng sinh th¸i ë ViÖt Nam vµ c¸c chñng ®¹i diÖn NguyÔn ThÞ TuyÒn, NguyÔn Minh Gi¶ng, Vò Hoµng Giang, §inh Thóy H»ng T¹p chÝ Khoa häc Tù nhiªn vµ C«ng nghÖ, §HQGHN 4 Nghiªn cøu ®a d¹ng vi khuÈn oxy ho¸ Fe(II), khö nitrate t¹i mét sè m«i tr­êng sinh th¸i ë ViÖt Nam vµ kh¶ n¨ng øng dông. NguyÒn ThÞ TuyÒn, §inh Thuý H»ng Poster tham gia Héi nghÞ toµn quèc vÒ ®a d¹ng vµ sinh th¸i sinh vËt, Hµ Néi 10/2009 5 Tr×nh tù gen 16S rDNA cña chñng vi khuÈn Anaeromyxobacter sp. IN2 NguyÔn ThÞ TuyÒn, §inh Thuý H»ng FJ939131, GenBank 6 Tr×nh tù gen 16S rDNA cña chñng vi khuÈn Paracoccus sp. IN12 NguyÔn ThÞ TuyÒn, §inh Thuý H»ng GU084390, GenBank