Đồ án Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces Cerevisiae trên bã mía để sản xuất rượu dâu tằm

MỤC LỤC: CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 5 1.1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI: 2 1.2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI: 3 1.3.NỘI DUNG NGIÊN CỨU: 3 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 4 2.1.NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae: 5 2.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men: 5 2.1.2.Đặc điểm sinh lý của nấm men: 7 2.2.1. Ưu & nhược điểm của nấm men cố định: 11 2.2.2. Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào: 11 2.2.3. Kỹ thuật cố định tế bào: 13 2.3. SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN BÃ MÍA: 16 2.3.1. Nguồn bã mía: 16 2.3.2. Cấu tạo hóa học bã mía: 16 2.4. PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BÃ MÍA: 20 2.4.1. Vật liệu: 20 2.4.2. Nguyên tắc và phương pháp thực hiện: 20 2.5. QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RỰƠU VANG DÂU TẰM: 23 2.5.1. Bản chất của quá trình lên men: 23 2.5.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae: 25 2.5.3. Dâu tằm: 25 2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: 27 2.5.5. Quá trình lên men rựơu vang: 31 CHƯƠNG III: TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 35 3.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI: 36 3.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM: 42 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 45

doc52 trang | Chia sẻ: maiphuongtl | Ngày: 29/05/2013 | Lượt xem: 1885 | Lượt tải: 11download
Tóm tắt tài liệu Đồ án Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces Cerevisiae trên bã mía để sản xuất rượu dâu tằm, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
màng tế bào. Đặc tính này phụ thuộc enzyme phospholipase và lipase [5]. Hình 2.3. Cấu trúc màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)[14] Tế bào chất: Ở thể keo, được cấu tạo từ protein, lipid, khoáng, nước (90%) và các hợp chất khác. Có độ nhớt cao, chứa các bào quan. Cấu trúc thay đổi tùy theo tuổi của nấm men [5]. Ti thể: Dạng hạt nhỏ hoặc hình que, dạng sợi. Hình dáng thay đổi trong quá trình nuôi cấy, hình que, hình sợi đơn hoặc kết chuỗi. Số lượng ti thể dao động mạnh từ 1 – 50. Trong môi trường có nồng độ glucozse thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ti thể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40. Hầu hết các phản ứng năng lượng đều xảy ra ở đây. Cấu trúc của ti thể biến đổi khi nấm men chuyển từ điều kiện kỵ khí sang hiếu khí. Ở môi trường kỵ khí với không có lipid thì ti thể rất đơn giản gồm: hai lớp màng, nhưng không có nếp gấp. Nếu thêm lipid sẽ tạo nếp gấp [5]. Nhân: Cấu tử bất biến, nhân thật chứa DNA và RNA. Kích thước nhân không đồng nhất ở các chủng nấm men và ngay cả cùng một chủng [5]. Các bào quan khác: không bào, ribosome, mạng lứơi nội chất,thể gogi…Có cấu tạo giống như tế bào thực vật [5]. 2.1.2.Đặc điểm sinh lý của nấm men: 2.1.2.1.Thành phần hóa học của tế bào nấm men: Nước chiếm 75% khối lượng. Thành phần sinh khối khô là: Chất vô cơ 5 – 10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4,8 – 12 Protein (N x 5,25) 30 – 75 Lipit 2 – 5 Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% chất tro. [5] 2.1.2.2.Dinh dưỡng nấm men: Cacbon: Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực tiếp tinh bột, cellulose, hemicellulose. Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose, melibiose. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp là axit béo tùy thuộc vào thành phần của các axit này. Trong đó axit acetic và glucose được sử dụng đồng thời. Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước. Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO2 trong trao đổi chất của nấm men, vì CO2 là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết với CO2 đều cần thiết cho nấm men, như axit pyruvic, axit cacbonic, và hàng loạt acid hữu cơ khác[5]. Nitơ: Nguồn nitơ cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào, là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Tuy nhiên nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni: amoni sulfat, phosphat, muối axetat, lactat, malat,... Trong môi trường chứa muối amoni, đặc biệt là sulfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc axit sử dụng sau hoặc làm axit hóa môi trường. Môi trường lỏng ammoniac (NH4+), là môi trường lý tưởng cho nấm men chỉ sau axit amin. Nấm men sử dụng cả ure và pepton. Nấm men tiêu hóa tốt acid amin tự nhiên, các nucleotide purin, pyrimidin, protein, một số amin, còn pepton kém hớnvà không sử dụng protein. Các acid amin đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng nitơ và cacbon. Nấm men chỉ sử dụng axit amin dạng tự nhiên. Hàm lượng nitơ phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện hiếu khí, chủng loại nấm men.[5] Chất vô cơ: Các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng. Trong đó nhu cầu phospho là được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh, … Hình 2.4. Chức năng của chất dinh dưỡng [14] Phospho chứa trong nhiều hợp chất quan trong của tế bào. Nấm men sử dụng tốt nguồn phosphor vô cơ là ortophosphat. Thiếu phosphor trong môi trường dẫn đến sự thay đổi đáng kể sự trao đổi chất, phá hỏng nhu cầu và sự hấp thu cacbon, nitơ. Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp enzyme, protein. Trong điều kiện kỵ khí, S bị khử thành H2S. Nguyên tố vi lượng cũng cần thiết cho quá trình sinh lý tế bào như: mangan, đồng, sắt, kẽm, …[5] 2.1.2.3. Đặc tính sinh sản của nấm men: Nghiên cứu đặc tính di truyền của nấm men tại Đan Mạch (1935), ông Carlsberg phát hiện: các loài thuộc giống Saccharomyces có thể biến đổi giữa 2 dạng đơn bội và nhị bội. Tế bào nấm men có hai giới tính α và a. Các tế bào đơn bội sinh ra α và a được hình thành qua nguyên phân bằng cách nảy chồi. Chúng kết hợp với nhau thành bào tử lưỡng bội aα. Khi gặp điều kiện dinh dưỡng kém, chúng giảm phân tạo nang chứa 4 bào tử: 2α và 2a. Sau đó, tế bào sinh sản theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Hình 2.5. Chu kỳ sinh sản của nấm men Saccharomyces [13] (1): Quá trình sinh sản vô tính ( nảy chồi ) (2): Quá trình sinh sản hữu tính ( giao hợp ) (3): Quá trình tạo nang chứa 4 bào tử. Quá trình sinh sản của nấm men liên quan chặt chẽ đến sự nảy chồi. Chồi tách khỏi tế bào mẹ khi có kích thước bằng tế bào mẹ và bắt đầu sinh sản. Thời gian thế hệ là chu kỳ sinh sản được tính là khoảng thời gian giữa hai lần phân chia. Thời gian thế hệ của nấm men Saccharomyces cerevisiae là 2h. Quá trình nảy chồi diễn ra đồng thời với bắt đầu tổng hợp AND. Quá trình này liên quan đến hiện tượng làm mềm vỏ tế bào bằng enzyme lytic, enzyme này tác dụng lên polysaccarit của thành vỏ tế bào. Từ chồi mới hình thành các vật liệu mới của tế bào lớn dần lên, hình thành vách ngăn chitin, mannan, glucan. Chồi tách ra và để lại sẹo. [5] 2.1.2.4. Sinh trưởng của nấm men: Hình 2.6. Đồ thị sinh trưởng và thành phần dinh dưỡng trong lên men vi sinh [14] Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong lên men, gồm 4 pha: pha thích nghi, pha tăng trưởng, pha cân bằng, pha suy vong. Pha thích nghi: ( pha lag ) nấm men mới cấy vào môi trường, đang thích nghi với môi trường mới. Vận tốc sinh trưởng coi như bằng không, nồng độ chất dinh dưỡng còn rất nhiều. Đây là thời kỳ tiềm phát của nấm men, trong đó một số tế bào bị ức chế, thậm chí có thể chết. Số lượng tế bào nấm men trong giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ. Kích thước tế bào tăng, hàm lượng protein, axit nucleic tăng lên. Trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm men cấy vào càng trẻ khỏe và pha lag càng ngắn. Pha tăng trưởng: ( pha log ) tăng sinh khối, tế bào phát triển ồ ạt theo cấp số nhân: 20 à 21 à 22 à 23 à 24 à … à2n với tốc độ tăng trưởng là cực đại. Kích thước tế bào nấm men ở pha này nhìn chung là nhỏ nhất, vì chúng cón phải sinh sản. Đối với tế bào trong pha này chúng có hoạt tính sinh lý, sinh hóa rất đặc trưng và rất nhạy cảm với những nhân tố bất lợi của môi trường. Trong pha này, chất dinh dưỡng giảm mạnh và bắt đầu xuất hiện sản phẩm trao đổi chất không cần thiết đối với giống và quá trình chuyển sang pha ổn định. Nếu là quá trình thu sinh khối ta nên thu vào cuối giai đoạn này. Pha cân bằng: quần thể tế bào ổn định, tỉ lệ sinh ra bằng tỷ lệ mất đi. Sản phẩm trao đổi chất tích tụ nhiều, chất dinh dữơng cạn kiệt. Thu sản phẩm trao đổi chất trong pha này. Pha suy vong: tế bào chết, dinh dưỡng cạn kiệt và tế bào chất tăng dần. Tế bào nấm men có khả năng tự phân do enzyme proteaza nội bào. Các tế bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt. Tế bào chất bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn lại những hạt cầu béo nhỏ. [5] 2.2. PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH VI SINH VẬT: 2.2.1. Ưu & nhược điểm của nấm men cố định: Ưu điểm: Có thể tái sử dụng nhiều lần. Sản phẩm sạch, giảm chi phí tinh sạch. Bền với môi trường nhờ sự bảo vệ của chất mang. Điều chỉnh hình dạng kích thước để phù hợp với thiết bị. Hạn chế sự rửa trôi của tế bào trong quá trình sản xuất liên tục. Giảm chi phí, giá thành. Nhược điểm: Hoạt lực tế bào thấp hơn tế bào tự do, vì tế bào tiếp xúc với cơ chất phải thông qua chất mang, nên việc trao đổi chất diễn ra khó khăn hơn. Cơ chất và sản phẩm phải thông qua chất mang để trao đổi, nên vận tốc phản ứng chậm. Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh giữa chất mang và cơ chất. 2.2.2. Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào: 2.2.2.1 .Yêu cầu chất mang: Có tính trơ cao ( bền hóa học), không bị hòa tan, không tác dụng với những sản phẩm thứ cấp sinh ra trong dịch. Bền sinh học ( không bị vi sinh vật phá hùy). Tính chất cơ lý bền vững, ổn định, để chịu được tác động của môi trường. Có độ xốp, để quá trình trao đổi chất được thực hiện dễ dàng. Không gây ức chế hay làm mất hoạt tính enzyme của vi sinh vật. Có khả năng bám dính tốt dễ gắn vi sinh vật vào. An toàn với môi trường. Không cạnh tranh với cơ chất. Phù hợp hình dạng thiết bị. Rẻ tiền, dễ tìm[2][3]. 2.2.2.2. Phân loại chất mang: Có hai loại chất mang: Chất mang tự nhiên: Tinh bột, cellulose, agar, alginate, BC ( bacterial cellulose), .. Chất mang nhân tạo: polyme từ mủ cao su, poly striren, poly acetate... Bảng 2.1. Phân loại chất mang [3]. Phân loại Tên chất mang Hữu cơ Tự nhiên Agarose, cellulose, alginate, BC (bacterial cellulose), … Nhân tạo Polyacrylamide, poly striren, poly vinyl Vô cơ Tự nhiên Seolit, silicate, … Nhân tạo Allumimium oxide ( Al2O) Các chất mang hay sử dụng: Cellulose: giá rẻ, tính cơ lý khá tốt, nhưng không đồng nhất và ổn định nên chỉ sử dụng dạng sợi và vi hạt. Agarose: ổn định, đồng nhất, dễ tạo hạt, tuy nhiên giá đắt nên khônng sử dụng trong sản xuất mà chỉ dùng trong nghiên cứu, y học. Alginate: tạo gel trong môi trường có CaCl2, để nhốt enzym và tế bào, nhưng tính chất không ổn định trong môi trường có phosphat. Dù vậy, đây là vật liệu dễ tìm, rẻ ( acid alginic có trong rong biển), có khả năng tạo gel, tạo hạt. Nên ứng dụng nhiều trong công nghiệp, cố định tế bào và enzym. Poly acrilamide: có nhiều đặc tính quý báo: bền, tính trơ cao, độ trương tốt, độ đồng nhất cao, kích thước lỗ gel có khả năng điều chỉnh, diện tích tiếp xúc lớn. Tuy nhiên giá hơi cao. Seolite: Men/2 O. Al2O3.xSiO2. yH2O. Là các tinh thể alluminosilicat, có cấu trúc không gian ba chiều, mang các lỗ xốp kích thước cỡ phân tử. Được dùng nhiều trong cố định nấm men. 2.2.3. Kỹ thuật cố định tế bào: 2.2.3.1. Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang: Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang: Vật liệu: Thủy tinh xốp, cellulose, than, các oxit kim loại, đất hiếm, cao lanh, … Nguyên tắc thực hiện: Thông qua các liên kết cộng hóa trị( giữa nhóm amin và nhóm cacboxyl), liên kết tĩnh điện giữa những bề mặt mang điện tích, lực Vandewalls. Các phương pháp gắn này cụ thể dựa trên, những nguyên tắc sau: + Gắn tế bào bằng liên kết ion: dựa vào sự tích điện trái dấu giữa tế bào và chất mang. + Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị: có thể xảy ra 2 trường hợp: Trường hợp 1: Chất mang có chứa các nhóm có thể tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein vi sinh vật. Trường hợp 2: Phải hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang những chất có khả năng phản ứng . Tiếp theo đó, là tạo liên kết giữa các nhóm trên chất mang với tế bào vi sinhvật. Ưu & nhược diểm của phương pháp: Phương pháp này có thể tạo được những liên kết hóa học mạnh giữa tế bào và chất mang. Tuy nhiên, để tạo ra các mối nối đồng hóa trị này thường tốn công và mắc tiền [2][3]. Phương pháp hấp phụ: Vật liệu: Sử dụng các chất có hoạt tính bề mặt mạnh như: cellulose, agarose, polyacrylamide, chitin, nylon, thủy tinh, … Nguyên tắc thực hiện: Dựa vào cơ chế hấp phụ. Có thể xảy ra các trường hợp sau: + Thứ nhất là, chất mang có nhiều lỗ xốp, tế bào vi sinh vật bám vào các lỗ xốp và toàn bộ bề mặt chất mang. + Thứ hai, đối với chất mang không có lỗ xốp (thủy tinh) tế bào sẽ bám trên bề mặt chất mang. + Thứ ba, khi chất mang tích điện (nhựa trao dổi ion) chúng sẽ tạo liên kết ion. Phương pháp thực hiện: tế bào vi sinh vật được phối trộn với chất mang trong môi trường lỏng, khuấy trộn trong điều kiện thích hợp, sau đó rửa bã để loại bỏ phần tế bào vi sinh vật dư. Ưu & nhược điểm: Ưu điểm của phương pháp là dễ thực hiện, đơn gản. Tuy nhiên, có nhược điểm là liên kết vật lý này rất yếu nên vi sinh vật dễ tuột khỏi chất mang [2][3]. 2.2.3.2. Phương pháp nhốt tế bào vào hệ gel: Vật liệu: Có thể sửa dụng các loại sau: Ion gel: các polymer mà tế bào gắn kết với nhau tạo thành mạng lưới bằng liên kết ion. Covalent gel: polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, tạo thành mạng lưới Non-covalent gel: polymer gắn với nhau thường bằng liên kết hydro. Cryogel: là cấu trúc gel polymer mới được tạo bởi phương pháp lạnh đông các tiểu phần polymer có phân tử lượng cao hay thấp Aginate là vật liệu lấy từ rong biển, có khả năng tạo gel tốt, rất tốt để bao gói enzym hay tế bào. Nguyên tắc thực hiện: Trong hệ gel cac polymer sẽ tạo thành mạng lưới bao bọc tế bào. Mạng lưới có lỗ nhỏ đến mức tế bào không thể ra ngoài, nhưng đủ lớn để cơ chất và sản phẩm chui vào. Đối với chất mang tạo liên kết ion, ta trộn chung huyền phù tế bào và hỗn hợp chất mang đa điện tích và dung dịch đa điện tích trái dấu. Với chất mang polymer như covalent: trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với các monomer rồi đem trùng hợp, hoặc trộn chung với polymer tạo liên kết giữa các sợi polymer. Gel aginate: tiến hành như sau: Đầu tiên gel alginate được đun sôi để nguội đến 30oC. Sau đó, khuấy trộn alginate và huyền phù tế bào tỷ lệ 1:1, khuấy nhẹ 30vòng / phút, trong 5’ – 10’. Tạo hình, cố định hình trong dung dịch CaCl2. Tiếp theo, rửa nước vô trùng. Cuối cùng bảo quản lạnh. Ưu & nhược điểm: Phương pháp này có ưu điểm là: hiệu suất cao, tế bào ít bị rửa trôi. Tuy nhiên, vì nằm trong khuôn gel nên không chịu được khuấy trộn. Các tế bào trong khuôn gel phân bố không đồng đều, các tế bào nằm trên bề mặt sẽ tham gia lên men. Đồng thời sản phẩm trao đổi chất làm trương nở hạt gel, gây bể vỡ [2][3]. 2.2.3.3. Phương pháp cố định không có chất mang: Vật liệu: Sử dụng các tác nhân liên kết như: glutaraldehyde, toluen, hexamethylen, … Nguyên tắc: Sử dụng các tác nhân liên kết để gắn tế bào thành một khối. Các tác nhân này phải có tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật và liên kết với thành tế bào vi sinh vật [2][3] Bảng 2.2. So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào. Tên phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Hấp phụ lê bề mặt rắn Phương pháp đơn giản, điều kiện nhẹ nhàng, đảm bảo sự sống tốt cho tế bào. Lực liên kết yếu, tế bào dễ bị tách khỏi nếu có lực cơ học, số lượng tế bào bị hấp thụ thấp. Tạo liên kết cộng hóa trị Độ bền giữa các liên kết tốt, khả năng trao đổi chất cao. Tế bào gắn vào khả năng sống thấp, hoạt lực thấp. Do đó, đòi hỏi tế bào phải có khả năng tạo liên kết vơi chất mang. Nhốt vào hệ gel Hiệu suất nhốt cao, độ bền cao, có khả năng ứng dụng với nhiều loại tế bào. Hoạt tính tế bào thấp hơn tế bào tự do, vì bị chất mang cản trở. Có thể xảy ra sự cạnh tranh giữa chất mang và cơ chất. Những sản phẩm bậc hai tích tụ có khả năng làm hư hỏng chất mang. Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng, nên tùy vào mục đích công nghệ, cách tiến hành mà chọn phương pháp cố định phù hợp. 2.3. SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN BÃ MÍA: 2.3.1. Nguồn bã mía: Việt Nam là một đất nước nhiệt đới, rất thuận lợi cho việc phát triển mía đường. Hiện nay mía đường, được trồng trên cả nước, nhiều nhất là vùng Đồng bằng sông Cửu Long, Đông Nam Bộ, và Duyên hải Nam Trung Bộ [12]. Hình 2.7. Sản lượng và năng suất mía [12]. Theo như thống kê, sản lượng mía mỗi năm là 1,3 triệu tấn dùng trong công nghiệp, tức là có khoảng hơn 1 triệu tấn bã mía được thải ra mỗi năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất. 2.3.2. Cấu tạo hóa học bã mía: Bã mía chứa khoảng 40% cellulose, 24% hemicellulose và 25% lignin. Trong tế bào thực vật, bao gồm bã mía, có một vách có cấu tạo gồm 3 lớp ( S1, S2, S3) được bao quanh bởi lignin. Các lớp S1, S3 chứa chủ yếu là cellulose và hemicellulose vô định hình. Lớp S2 chứa cellulose kết tinh. Vùng kết tinh được định dạng bởi liên kết hydrogen theo một sắp xếp có thứ tự. Tuy nhiên, các vùng vô định hình cũng tồn tại trong cellulose. Cellulose, hemicellulose, lignin hiện diện giữa ba lớp S1, S2, S3. Sự minh họa cấu trúc thành tế bào được thể hiện qua hình 2.8. Hình 2.8. Cấu trúc của lignocellulose. Lớp S1 vàS3 chứa hemicellulose và cellulose vô định hình nhiều hơn. Lớp S2 chứa các vùng cellulose kết tinh [11]. Bảng2. 3.Thành phần hóa học của bã mía [6]. Thành phần hóa học % trọng lượng chất khô Cellulose 40% Hemicellulose 24% Glucan 40,2 Manan 0,5 Galactan 1,4 Xylan 22,5 Arabinan 2,0 Lignin 25,0 Tro 1,1 Cellulose: Cellulose chiếm 40% trong thành phần bã mía. Cellulose là một polymer mạch thẳng, gồm nhiều phân tử đường D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid. Liên kết glucoside giúp sợi khó cắt, và vì phân tử glucose định hướng thành dạng trans với phân tử glucose bên cạnh nên không tạo liên kết với nước, không tan trong nước. Ngoài ra có sự hình thành liên kết hydro nội phân tử, làm cellulose cứng và dai. Và chính liên kết hydro giữa các mạch cellulose cạnh nhau giúp định hình thành bó sợi song song. Cấu trúc cellulose không đồng nhất nên tồn tại vùng vô định hình và vùng kết tinh. Vùng vô định hình ít hơn vùng kết tinh. Vùng kết tinh có trật tự cao, khó bị phá hủy bởi enzym cellulase, hóa chất dung môi, đây là vùng mà các vi sợi được định hướng. Vùng vô định hình thì cấu trúc hỗn độn, nằm lẫn với vùng kết tinh, dễ bị thủy phân. Các vi sợi trong tế bào tập trung thành phiến mỏng, giữ các vi sợi là lignin và glycan liên kết ngang với nhau gọi là hemicellulose. Hình 2.9. Cấu tạo cellulose [11] Hemicellulose: Là một polusaccharide có thể tan trong kiềm và acid. Công thức phân tử (C5H8O4)n , có cấu tạo phức tạp do 50 – 200 phân tử đường tạo nên. Các đường tạo nên hemicellulose là pentose ( arabinose, xylose), hexose ( galactose, glucose, mannose). Trong đó nhiều nhất là xylose. Xylan được cấu tạo từ D – glucose liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 glycoside. Hemicellulose là một polymer phân nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên, vô định hình. Mạch nhánh có cấu trúc đơn giản là disaccharide hoặc trisaccharide. Hemicellulose liên kết với các polysaccharide khác và lignin nhờ các nhánh này. Hình 2.10. Cấu trúc Hemicellulose [11] Lignin: Là chất kết dính các xơ sợi. Lignin là một polymer phân nhánh tìm thấy trong tế bào thực vật có khả năng chống lại sự phát triển của vi sinh vật, và tích tụ nhiều năng lượng mặt trời hơn các polysaccharide khác. Cấu trúc phức tạp, chứa chủ yếu là các vòng thơm, nên lignin có khả năng tăng tính đàn hồi, mềm dẻo như một hàng rào bảo vệ trước sự tấn công của enzym hoặc các hóa chất khác. Hình 2.11. Cấu tạo Lignin. [11] Các thành phần khác: Chất béo, parafin, axit béo, alcohol, resin. Chiếm 4% tổn khối lượng chất khô. Các chất này hình thành đầu kỵ nước và ưa nước. Do đó, có thể loại những chất này bằng dung môi phân cực mà không phá hủy cấu trúc biomass. Tùy theo nguồn lấy mẫu mà thành phần và hàm lượng các chất này khác nhau. 2.4. PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BÃ MÍA: 2.4.1. Vật liệu: Nguyên liệu bã mía, phế phẩm của nhà máy đường, hay phế phẩm do mục đích sử dụng khác và nấm men Saccharomyces cerevisiae 2.4.2. Nguyên tắc và phương pháp thực hiện: Cố định nấm men trên bã mía, dựa vào cơ chế hấp phụ. Ban đầu, phải xử lý bã mía. Vì thành phần bã mía có nhiều hợp chất phức tạp nên phải được xử lý trước bằng dung dịch NaOH 0,5M, theo phương pháp Brangik et al (2001). Mục đích quá trình xử lý: + Loại bỏ lignin (để vi sinh vật dễ xâm nhập) và các thành phần khác như chất béo, parafin, alcohol, ... để vi sinh vật không phá hủy chất mang. + Giảm bớt cấu trúc kết tinh của cellulose. + Tăng trạng thái xốp của nguyên liệu. SƠ ĐỒ TIỀN XỬ LÝ BÃ Bã mía Cắt thành 0,5 cm Sàng lọc, phân chia Tiệt trùng 121oC, 20’ Trộn NaOH 0,5M Sấy (khối lượng không đổi) Rửa Ủ, lắc 120 vòng/ phút, 24h Rửa, nước vô khuẩn Sấy Bã mía đã xử lý Sau đó, cho bã mía đã xử lý vào huyền phù nấm men, đặt vào tủ lắc ở chế độ: 30oC, 200 vòng/ phút, 24h. Cứ sau 3h kiểm tra mật độ tế bào. Nấm men sẽ phát triển ở trên bề mặt bã mía và cả ở bên trong bã. Liên kết của nấm men ở bên ngoài không bền vững như nấm men ở bên trong. Nấm men bám vào những nhu mô bên trong của bã mía và sinh trưởng và tạo những liên kết bền vững. Thêm vào đó, dinh dưỡng có sẵn bên tron nhu mô bã mía kích thích sự phát triển của tế bào nấm men, nên tế bào nấm men có khuynh hướng di chuyển vào bên trong nhu mô. Hình 2.12. Cấu trúc của chất mang bã mía.(a) Hình sợi bã mía ,(b) Hình nấm men bên trong bã mía, (c) Hình nấm men bám vào nhu mô bã mía [8] Tuy nhiên, trong quá trình lên men do hạn chế của bề mặt chất mang, nên tế bào nấm men bị rơi ra , lẫn vào môi trường. Nồng độ tế bào tự do này thay đổi tùy theo thời gian, nhiệt độ. Nhưng tế bào cố định bên trong bã mía vẫn được duy trì. Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy, chất mang bã mía sử dụng tốt như chất mang kỹ thuật, nó có thể tồn tại đến 220 ngày liên tiếp. Hệ thống nấm men cố định, tái sử dụng đến 20 lần. (theo nghiên cứu của Lebaka Veeranjaneya Reddy & Lebaka Prasannanjaneya Reddy & Young-Jung Wee & Obulam Vijaya Sarathi Reddy) [8]. 2.5. QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RỰƠU VANG DÂU TẰM: 2.5.1. Bản chất của quá trình lên men: Quá trình lên men rượu là quá trình lên men kỵ khí. Ở đây xuất hiện hiêu ứng Pasteur: Pastuer quan sát quá trình sống của men rượu Saccharomysces và đã phát hiện ra hiệu ứng mang tên ông. Nấm men sống trong môi trường đủ oxi chúng sinh trưởng tăng sinh khối. Nếu thiếu hoặc không có oxi, chúng chuyển sang lên men ( hô hấp kỵ khí). Khi cung cấp oxi vào môi trường thì nấm men chuyển từ trạng thái lên men sang hô hấp. Quá trình hấp thu glucose trong tế bào đang hô hấp diễn ra chậm hơn trong lên men. Pasteur đã giải thích: trong trạng thái lên men 1 phân tử glucose sinh ra ít năng lượng hơn trong hô hấp. Vì vậy trong điều kiện lên men cần nhiều glucose hơn. Vì trong điều kiện kỵ khí, chức năng tạo năng lượng ở ti thể bị giảm gần hết. Để bù đắp năng lượng, tăng cường giai đoạn đường phân. Axit pyruvic sản sinh ra ethanol và axit acetic được tạo ra trong tế bào. Chính vì thế mà trong điều kiện kỵ khí nấm men chủ yếu sinh ethanol. Quá trình lên men rượu từ glucose qua 13 bước: mỗi giai đoạn có enzym xúc tác. Phản ứng tổng quát, như sau. Trong lên men kỵ khí, nấm men sử dụng năng lượng từ quá trình đường phân. Đầu tiên, glucose đi vào chu trình đường phân tạo pyruvate. Acid pyruvic tạo acetaldehyde nhờ enzyme decacbonxylase, acetaldehyde nhận H+ tạo ethanol. Hình 2.13.a. Quá trình đường phân [7] Hình 2.13.b. Quá trình chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol [7] 2.5.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae: Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang cần đảm bảo một số yêu cầu sau:[2] Lên men cồn đạt hiệu suất cao. Khả năng lắng nhanh. Chịu được nhiệt độ thấp. Chịu được acid thấp. Có khả năng tạo hương. Nhìn chung, nấm men dùng trong sản xuất rượu vang cũng giống như nấm men dùng trong sản xuất bia, có khác là nó cần có khả năng tạo hương. Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men được dùng nhiều trong sản xuất ethanol. Nó có nhiều ưu điểm như: hiệu suất lên men cao, chịu được độ acid thấp (của cả vi khuẩn lactic), chịu được nồng độ ethanol và chất ức chế cao, ít tạo sản phẩm phụ. Tuy niên nhược điểm của nó là khả năng tạo hương kém, có thể khắc phục nhược điểm này bằng những nguyên liệu có nồng độ hương cao. Những chủng nấm men thuần khiết thường sử dụng trong sản xuất rượu vang như: Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces oviforis. 2.5.3. Dâu tằm: Cây dâu tằm có tên chung là Mulberry, chúng có nhiều giống khác nhau như: White Mulberry ( Morus alba L.), Black Mulberry ( Morus nigra L.), American Mulberry, Red Mulberry (Morus rubra L.). Chúng có họ hàng gần với giống Korean Mulberry ( Morus australis), Himalayan Mulberry ( Morus laevigata). Trong nghiên cứu này ta sử dụng giống dâu tằm đen ở Đà Lạt. Dâu tằm đen có nguồn gốc từ Iran, trồng nhiều nhất ở vùng Địa Trung Hải, Nam châu Âu, Tây Nam châu Á, Trung Quốc. Tùy theo tùng loài mà cây dâu tằm có hình dáng khác nhau. Mùa ra hoa, cho quả thường vào tháng 5 – 7. Một cây dâu tằm trưởng thành có tuổi đời từ 100 – 200 năm. Chiều cao cây dâu tằm đen thường đạt 9 – 23 m, tuy nhiên ngày nay để thuận tiện cho việc thu hoạch chiều cao cây dâu tằm được rút ngắn, đường kính 1 – 3,5m, lá dâu hình tim , có răng cưa, dùng để nuôi tằm nhả tơ. Hình 2.14. Cây dâu tằm Đà Lạt Hình 2.15. Dâu tằm đen Đà Lạt Quả dâu tằm đường kính 15,34 – 16,25mm, dài 22,23 – 25,15mm, nặng 3,11 – 4,49g. Hàm lượng chất khô là 13,91% - 18,36%, hàm lượng đường cao xấp xỉ 10%, pH = 3,35 – 3,82. Đặc biệt màu dâu tằm có đặc điểm rất riêng, và nồng độ hương cũng rất cao, thích hợp để sản xuất vang đỏ Tuy nhiên, nguồn trái dâu tằm ở nước ta hiện nay vẫn rất hạn chế và bị lãng phí khá nhiều, vì việc trồng dâu theo truyền thống “trồng dâu, nuôi tằm”. Hơn hết, dâu tằm có nhược điểm là khó bảo quản vì thế nguồn nguyên liệu khá khó khăn. Bảng 2.4. Thành phần hóa học của dâu tằm [17] Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Năng lượng (Kcal) 73 Chất xơ (%) 0,8 Hàm lượng ẩm (%) 80,8 Chất tro (%) 0,6 Protein (%) 1,3 Fe (mg) 2,5 Chất béo(%) 0,7 P (mg) 31 Carbonhydrat (%) 16,6 Ca (mg) 42 Bảng 2.5. Hàm lượng vitamin có trong dâu tằm [17] Vitamin A 174IU Thiamine 9mg Riboflavin 184mg Nicotinic acid 0,8mg Ascorbic acid 28mg Ngoài sản xuất rượu, dâu tằm đen có nhiều chức năng chủ yếu nhờ vào khả năng chống oxy hóa của nó, sử dụng làm siro màu, mùi trong thực phẩm, làm thuốc trị bệnh nhuận tràng, và cón nhiều ứng dụng khác. 2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho nấm men Saccharomyces cerevisiae là 28 – 32oC. Nếu nhiệt độ quá thấp vi sinh vật hoạt động kém. Nhiệt độ quá cao, sẽ kích thích những vi sinh vật khác phát triển đặc biệt là vi khuẩn lactic, đồng thời sinh ra những sản phẩm phụ như aldehide, este, giảm hiệu suất sản sinh ethanol. Nhiệt độ lên men cao khoảng 30 – 35oC tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm, nhưng đường vẫn chưa sử dụng hết. Điều này rất nguy hiểm vì đường sót sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic hoạt động làm chua dịch. Nhiệt độ lên men cao dẫn đến việc tích tụ nhiều sản phẩm thứ cấp, rượu bậc cao, acetaldehyde. Nhiệt độ lên men tăng từ 10 – 25oC kéo yheo hàm lượng acetaldehyde tăng từ 1,25 – 21,5mg/l. Lên men rượu thích hợp nhất là nhiệt độ 10 - 30oC Giữa nhiệt độ và oxi lien quan chặt chẽ với nhau. Nấm men thường sinh trưởng manh trong thời gian đầu, trong thời gian này có một lượng oxi hòa tan và nhiệt độ thích hợp là 25 – 30oC. Ở vùng nhiệt đới khí hậu nóng, nhất là vào mùa hè, để đảm bảo chất lượng rượu luôn ổn định tốt nhất ta nên chọn chủng giống có khả năng chịu nhiệt tốt, lên men ở nhiệt độ cao 36 – 38oC mà khả năng lên men không đổi. pH: pH tối ưu là 3,5 -3,8. Nếu pH quá cao thì sản phẩm độ chua thấp, vi sinh vật khác dễ phát triển. Dịch trái cây pH khá thấp đối với dâu tằm khoảng pH thích hợp để lên men. Đối với men rượu thì những chủng men vang chịu được độ axit cao hơn. Trong quá trình lên men pH giảm rồi lại tăng lên. Nguyên nhân là do sự tạo thành CO2 và axit hữu cơ. Nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất chính là đường, nồng độ quá cao ức chế nấm men, quá thấp không đủ cho hoạt động lên men, vi sinh vật tạp, vi khuẩn lactic phát triển. Trong môi trường có 4 nhóm thành phần chính là: nguồn cacbon (đường), nguồn nitơ, chất khoáng, chất sinh trưởng vitamin, peptit, axit amin, … Nồng độ đường thích hợp là 16 %– 18% tổng chất khô trong dung dịch. Tùy theo hàm lượng đường có sẳn mà ta tính toán lượng đường bổ sung, sao cho mỗi mẻ lượng đường đồng nhất. Cần lưu ý lượng đường chưa được sử dụng trong dịch quả vì nó sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển. Nồng độ oxy: Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí, tuy nhiên Saccharomyces cerevisiae là loài kỵ khí tùy nghi. Trong điều kiện hiếu khí, tăng sinh khối, kỵ khí lên men rượu. Thế nên, trong giai đoạn đầu của quá trình lên men cần để nấm men tiếp xúc với không khí, thực hiện quá trình tăng sinh. Để quá trình lên men rượu xảy ra, cần điều kiện yếm khí nghiêm ngặt vì trong điều kiện này, hoạt động hô hấp ngừng lại, hoạt động lên men diễn ra, sinh ra năng lượng. Trong quá trình này không được để oxy lẫn vào vì oxy sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic. Nhưng sản phẩm quá trình lên men ngoài rượu còn có CO2, nên cần tạo điều kiện lên men sao cho, O2 không thể vào, CO2 không thể ra. Vì thế khi lên men rượu vang trong thùng gỗ sồi, hoặc trong thiết bị hác người ta chỉ dể môi trường chiếm 2/3 thiết bị hoặc tạo mặt nghiêng (mặt nón) để có khoảng không cho CO2 thoát lên. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt nấm men không sinh sản. Nhưng qua thực nghiệm cho thấy, nấm men sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí rồi đưa vào điều kiện kỵ khí, qua 4 – 5 thế hệ chúng sẽ tổng hợp hệ enzyme hô hấp trong điều kiện kỵ khí và sinh sản. Ở đây cần biết rằng, nấm men nuôi ở nhiệt độ cao, khả năng hòa tan oxi tốt hơn ở nhiệt độ thấp. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp, ban đầu ta có thể sục oxi và khuấy để oxi hòa tan tốt hơn, thực hiện quá trình tăng sinh. Mật độ tế bào càng cao thì thời gian lên men sẽ được rút ngắn, nồng độ O2 là 2,6 – 5,2 mg/l thì mật độ nấm men là 30 – 90 triệu /ml. Khi tăng lượng oxi lên 17mg/l thì tế bào lên dến 174triệu/ml, thời gian lên men lại được rút ngắn và acetaldehyde, rượu bậc cao, axit bay hơi, aceton, … cũng tăng lên. Do đó phải tính toán lượng khí đưa vào cho phù hợp. Nồng độ CO2: Dưới áp suất CO2 sinh trưởng nấm men không bị ảnh hưởng. Nếu loại CO2 bằng nitơ, hoặc không khí thì quá trình lên men được rút ngắn thời gian, nhưng nếu rút dần CO2 bằng bơm chân không thì lên men có mạnh hơn nhưng không nhiều. CO2 là một sản phẩm trao đổi nhưng nó cũng có khả năng kìm hãm sinh sản của nấm men. Đồng thời CO2 có tác dụng bảo quản dịch quả, rượu vang trắng, vang đỏ, … Rượu etylic: Rượu etylic tích tụ trong môi trường ở giai đoạn tăng sinh, rượu tích tụ ngày càng nhiều, làm nấm men sinh trưởng chậm, đến nồng độ nào đó làm giảm hoạt tính nấm men. Các lọai rượu khác nhau có tác dụng sát khuẩn và ức chế nấm men khác nhau. Khả năng chịu được nồng độ rượu cao do các chủng nấm men không giống nhau, dựa vào khả năng trao đổi chất của tế bào. Một chủng có khả năng sinh cồn cao nghĩa là chịu được cồn cao. Những sản phẩm thứ cấp khác: Glycerin đượctạo thành trong quá trình lên men do acetaldehyde lien kết với bisulfitnatri. Glycerin được tạo thành mạnh mẽ từ khi bắt đầu lên men. Nhờ vị ngọt và sánh như dầu glycerin đóng vai trò nhất định trong việc điều vị. Các axít bay hơi thường thấy là: axit acetic, axit propionic, acit butyric, …Các axit bay hơi được tích tụ chủ yếu trong giai đoạn dầu quá trình lên men, nhưng gần cuối giảm ( do nấm men sử dụng).Axit lactic là thường xuyên có mặt khoảng 5%. Axit sucxinic khoảng 0,1 – 0,4%. Axit malic có trong nước quả khoảng 3 – 4,5g/l, axit này có trong vang gây vị chua gắt. Các este là những hợp chất quan trọng trong việc tạo hương, trong đó etylacetate là nhiều nhất, nó có mùi hoa quả tự nhiên. Sự tạo thành những este không đồng nhất, và phức tạp tùy thuộc vào giống loài. Các rượu bậc cao được tạo thành bằng khử hoặc chuyển amin của các axit amin, tiếp đó là khử cacboxyl của cetoacid và khử aldehyde trong quá trình lên men. Các rượu bậc cao thường thấy là methanol, propanol, izopropanol, butanol, hexanol, ... Đặc biệt các rượu mạch vòng như β-phenyletylic, triptofol,tiozol, …có tác dụng làm cho hương vị vang êm dịu Ngoài ra còn có các sản phẩm khác như lipid, aceton, diacetyl, H2S, … Hệ vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men: Các nguồn tạp nhiễm chính là: từ giống men gốc do nhân giống ( loại tạp nhiễm này khá nguy hiểm vì giống sản xuất bị nhiễm làm toàn bộ quá trình lên men bị nhiễm), từ nguyên liệu loại này có thể xử lý được, từ nước, từ không khí loại này do quá trình vệ sinh, hoặc thiết bị, nhiễm loại này gây tác hại trên diện rộng. Vi sinh vật tạp nhiễm có thể có hại hoặc vô hại. Trong số này vi khuẩn gây tác hại cho nấm men là nhiều nhất. Chúng làm thay đổi mùi vị của dịch lên men, làm giảm độ bền và làm xấu màu, hương vị của sản phẩm. Nhiễm nhẹ thì làm hiệu suất lên men giảm. Thành phần vi sinh vật tạp nhiễm thay đổi trong quá trình sản xuất. Nhóm vi khuẩn: Vi khuẩn Lactic: Lactobacillus, là trực khuẩn làm chua dịch đường, sử dụng đường trước khi nấm men sử dụng, loại này rất phổ biến và dễ nhiễm. Pediococcus, cầu khuẩn vi hiếu khí, cần CO2 trong quá trình phát triển, thường gặp là Pediococcus cerevisiae trong sản xuất rượu trái cây (vang), vì điều kiện sống gần giống với nấm men nên dễ nhiễm vào gây đục, cặn, vị chua, tuy nhiên không sống được trong môi trường 8% độ cồn. Vi khuẩn Acetic: chủng này không yêu cầu nhiều về dinh dưỡng, chúng có khả năng phát triển khi có mặt nitơ ở dạng axit amin ( glutamine, prolin, aspartate). Cúng sử dụng rượu etylic và đường tạo axit acetic, CO2 , và nước. Tuy nhiên chủng này là vi khuẩn hiếu khí, nên không phát triển được trong lên men kỵ khí, mà có thể sống trong điều kiện hiếu khí lúc đầu. Không phát triển ở 6% độ cồn. Vi khuẩn đường ruột: E.coli, không phát triển trong giai đoạn lên men, thậm chí giảm số lượng vì pH thấp. Nhưng trong giai đoạn lên men phụ và tàng trữ pH cao hơn chúng có thể phát triển gây đục sản phẩmvà làm chua sản phẩm. Flavobacterium trực khuẩn, kỵ khí tùy nghi, sống ở pH 5, và nhiệt độ 30 – 35oC, có khả năng sử dụng glucose và fructose trong dịch quả. Trong dịch lên men bị nhiễm Flavobacterium bị đục có mùi H2S nhẹ và mùi táo, pH giảm 4,4 – 4,5. Ờ pH 2 hoặc thấp hơn không thể phát triển và kết lắng Nhóm nấm men: Monilia có khả năng lên men dịch đường có thể bị nhiễm từ vỏ quả, thùng chứa. Phát triển trong vang sẽ gây ra mùi chuột. Schizosaccharomyces xuất hiện trong dịch lên men tạo được 12% độ cồn, có khả năng thủy phân hoàn toàn axit malic thành CO2 và nước, làm giảm độ chua khà mạnh. Có thể nhiễm từ vỏ quả, thùng chứa. Nhóm nấm mốc: Penicillium yêu cầu dinh dưỡng ở mức tối thiểu nhưng độ ẩm và khoảng nhiệt độ rộng, có khả năng phát triển ở kho lạnh 0oC Aspergillus rất phổ biến trong tự nhiên, rất giàu các enzyme thủy phân ngoại bào ( amylase, pectinase, lipase,…). Thường gặp trên nguyên liệu, thùng chứa, kho, …Chúng và hình thành lớp mốc đỏ. Mucor có khả năng lên men yếu, tranh giành cơ chất với nấm men nuôi cấy. Chúng phát triển khá manh trong diều kiện có oxi. Hệ sợi ban đầu màu trắng, sau ngả sang màu đen. Sphaerulina thường thấy trên than lá quả, thùng chứa, dụng cụ, sàn kho, …Nấm có hệ sợi màu đen trong điều kiện thuận lợi. Nhìn chung, nếu là tạp nhiễm nấm mốc ít nguy hiểm hơn vi khuẩn và men dại. Song nếu bị nhiễm mốc sẽ gây mùi rất khó chịu khó khắc phục. 2.5.5. Quá trình lên men rựơu vang: Quá trình lên men rượu vang gồm 4 bước:[2] Chuẩn bị dịch trích Lên men chính Lên men phụ Tàng trữ 2.5.5.1. Chuẩn bị dịch trích: Dâu tằm rửa, tránh bị dập nên rửa sơ qua. Đem ép dịch hoặc trích ly bằng đường tỷ lệ 1:1( trong vài ngày ). Lưu ý, tránh để xảy ra hiện tượng lên men trước do hệ vi sinh vật có sẳn trên nguyên liệu gây ra, ảnh hưởng đến chất lượng rượu sau này. Để tránh hiện tượng lên men trước có nhiều cách, có thể dùng SO2 để đưa vào, với nồng độ hợp lý. Nấm men có khả năng tạo màng khả năng chịu nồng độ SO2 cao. Dịch quả được xử lý bằng sulfit sẽ lên men chậm hơn. Do đó để tăng hiệu suất ta phải huấn luyên giống trước khi lên men, để chịu được nồng độ SO2 cao. Ngoài ra nếu dịch bị nhiễm khuẩn ta có thể thanh trùng pasteur trước khi lên men, hạn chế sử dụng nhiệt do trong dịch quả chứa vitamin C, flavol, … là những chất nhạy cảm với nhiệt dễ bay hơi. Điều chỉnh lượng đường, vì lượng đường trong dâu tằm không đủ cho nấm men sử dụng, ngoài ra để đồng nhất nồng độ đường cho tất cả dung dịch lên men cho mọi loại rượu. Để ức chế vi sinh vật tạp trong quá trình lên men, người ta đưa SO2 vào để hạn chế sự phát triển. Hàm lựơng SO2 là 30 – 120mg/l. Không được quá cao vì nó sẽ ức chế ngược lại nấm men. Trong sản xuất, người ta bổ sung thêm chế phẩm enzym pectinase và cellulase để tăng hiệu quả thu hồi dịch trích. 2.5.5.2. Lên men chính: Giai đoạn lên men chính diễn ra trong 7 – 10 ngày. Nếu nhiệt độ lên men cao 28 – 30oC, lên men từ 6 – 7 ngày. Nhiệt độ thấp 20 – 22oC, thì lên men từ 10 – 20 ngày. Tỷ lệ giống đưa vào là 2 – 3% so với khối lượng dịch trái cây.Trong quá trình lên men chính bằng tế bào tự do, nấm men sẽ lắng xuống đáy. Người ta có thể thu nấm men này và sử dụng cho mẻ tiếp theo nhưng chất lượng rượu sẽ biến đổi, và chỉ có thể thực hiện 5 – 7 lần. Không thể tận thu hết nấm men có trong dịch lên men vì một phần bị lẫn vào dung dịch. Nếu sử dụng nấm men cố định, tỷ lệ thu hồi nấm men cao, sản phẩm sạch hơn giảm bớt chi phí tinh sạch. Tuy nhiên, nấm men non sinh ra, sẽ lắng xuống đáy, sử dụng trong lên men phụ. Quá trình chuyển hóa của tế bào cố định trên bã mía không bị ảnh hưởng nên hiệu suất lên men chỉ có tăng chứ không giảm. Có khả năng tái sử dụng mà hoạt tính không giảm. Kết thúc lên men chính, vớt nấm men cố định ra, độ cồn đạt 8 – 10%. 2.5.5.3. Lên men phụ: Mục đích: ổn định chất lượng rượu, làm sàng trong rượu, tăng hương. Lên mên phụ tiến hành ở nhiệt độ thấp, 15oC – 18oC, trong 2- 3 tháng. Trong quá trình này sự chuyển hóa đường thành cồn diễn ra rất chậm, thay vào đó là những quá trình chuyển hóa chất thơm, nhằm đạt độ đồng nhất. Trong quá trình này nấm men tiếp tục phát triển sinh cồn nhưng rất chậm. Sau giai đoạn lên men phụ, có thể bổ sung thêm cồn thực phẩm nhằm ngăn sự phát triển của vi sinh vật tạp ( vi khuẩn lactic ) và để hiệu chỉnh độ cồn sao cho phù hợp với người tiêu dùng, đạt được chất lượng rượu đồng đều. Cồn thực phẩm bổ sung phải đảm bảo các điều kiện theo qui định an toàn vệ sinh chất lượng thực phẩm. Tuy nhiên, đối với nguyên liệu có hàm lượng axit malic cao sẽ tạo vị chua gắt. Theo yêu cầu cảm quan vị chua của axit lactic dễ chịu hơn vị chua của axit malic, nên cần kiểm tra nồng độ axit malic có trong nguyên liệu ban đầu.Nếu hàm lượng axit malic cao ( pH 2,5 – 3,2 ), tiến hành lên men malolactic trước , chuyển axit malic thành axit lactic, rồi lên men phụ sau. Giống lên men malolactic là: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconotos, Oenococcus. 2.5.5.4. Tàng trữ: Sau khi điều chỉnh độ cồn xong, ta tàng trữ rựơu trong hầm lạnh 10oC. Ở nhiệt độ này các thành phần không tan sẽ lắng xuống đáy, người ta gạn cặn ra. Tiếp tục tàng trữ, càng lâu chất lượng càng tốt, mùi vị đồng đều. Trong lên men vang truyền thống, rượu được trữ trong thùng gỗ sồi, vì trong quá trình tàng trữ sẽ xảy ra phản ứng tạo hương giữa rượu vang và thùng gỗ sồi, tạo ra hợp chất phenolic. Sau thời gian tàng trữ ( 1-2 năm ), rượu được lấy ra từ thùng gỗ sồi, qua lọc và làm trong, rồi mang đóng chai thành phẩm. Rượu dâu tằm là một loại rượu trái cây, cách chế biến tương tự vang truyền thống, cách bảo quản, và thưởng thức cũng sẽ tương tự. Điểm khác biệt lớn nhất là rượu từ nho khá đa dạng chủng loại màu sắc, rượu dâu tằm không thể sản xuất vang trắng ví màu dâu tắm rất đậm. SƠ ĐỒ QUI TRÌNH Sản phẩm Đóng chai Lọc Làm trong Tàng trữ Lên men phụ SO2 30mg/l Sulfit hóa Ép dịch Rửa Lọc Lên men chính Nấm men cố định Bã mía xử lý Cố định, 30oC, 200vòng/ph, 24h Nhân giống Nấm men Dâu tằm Đường Nấm men cố định CHƯƠNG 3: TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI: Trên thế giới hiện nay có rất nhiều những nghiên cứu liên quan đến việc cố định nấm men trên bã mía để sản xuất ethanol, xylitol…. Nghiên cứu về chất lượng rượu vang sản xuất bằng nấm men Saccharomyses cerevisae CF TRI 101. cố định trên bã mía Nghiên cứu này do Lebaka Veeranjaneya Reddy &Lebaka Prasannanjaneya Reddy & Young-Jung Wee &Obulam Vijaya Sarathi Reddy thực hiện. Nhằm khảo sát quá trình chuyển hóa của nấm men cố định. Chất lượng sản phẩm tạo thành, tỷ lệ lên men và khả năng tồn tại của tế bào Qua nghiên cứu cho thấy, mật độ tế bào gắn vào bã mía là 3x107 tế bào/g bã mía khô. Có thể tái sử dụng đến 20 lần, sau mỗi lần tái sử dụng, khả năng thích ứng với môi trường của nấm men càng cao. Tuy nhiên năng suất có sự suy giảm sau ba lần tái sử dụng, do tế bào nấm men đã được đồng nhất, ít lẫn vào môi trường nên sự trao đổi có phần khó khăn. Khối lượng bã mía liên tục suy giảm, nhưng từ lần thứ 8 trở di thì khối lượng không đổi, nguyên nhân có thể do ban đầu đường còn sót lại trong bã mía về sau nấm men đã sử dụng hết. Hình 3.1. Đồ thị cho thấy sự giảm khối lượng bã mía theo thời gian [8] Thời gian lên men được rút ngắn: 30oC – 24h, 10oC – 98h. Năng suất ethanol 4,2g/l/h, tăng 3,33 lần ở 30oC, và 2,31 lần ở 10oC. Theo khảo sát thì, năng suất đã tăng trong diều kiện nhiệt độ thấp (10oC – 15oC), nguyên nhân có thể do sự thích nghi của tế bào nấm men cố định cao hơn. Đối với các hợp chất dễ bay hơi như ethyl acetate, methanol, acetaldehyde, amyl alcol, các lọai rượu khác ( propanol, butanol) có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi điều kiện. Acetaldehyde 15 – 36 mg/l cao hơn tiêu chuẩn bình thường 13 – 40 mg/l tuy nhiên vẫn chấp nhận được. Isobutanol giảm đáng kể khi giảm nhiệt độ. Ethyl acetate tăng khi giảm nhiệt độ, có khi lên đến 88mg/l – 10oC ( lần thứ 12), nó là một chất có ảnh hưởng tích cực đến tính cảm quan của rượu. Methanol 45 – 76 mg/l thấp hơn nồng độ bình thường có trong rượu 100 – 200mg/l. Amyl alcohol giảm khi giảm nhiệt độ. Theo nghiên cứu trên, cho thấy bã mía là chất mang tuyệt vời cho ngành sản xuất rượu vang vì nhiều ưu tính. Nấm men cố định trên bã mía có thể thích nghi tốt trong điều kiện nhiệt độ thấp, không gây ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men. Hiệu quả kinh tế rất cao, có thể ứng dụng trong sản xuất nhiều loại rượu trái cây, đặc biệt ở vùng nhiệt đới bã mía là nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm. Ngoài ra trong những nghiên cứu xa hơn, người ta có thể ứng dụng nó trong công nghiệp probiotic. Nghiên cứu: “ Sử dụng nấm men cố định trên thân mía, để sản xuất ethanol bằng phương pháp lên men liên tục”. Một trong những quốc gia nghiên cứu nhiều về vấn đề này là Brazil. Nhóm tác giả J. N. de Vasconcelos, C. E. Lopes and F. P. de França, đã nghiên cứu cố định nấm men trên thân cây mía để ứng dụng vào việc sản xuất ethanol, phương pháp lên men liên tục với công nghệ cải tiến nhất của quốc gia. Thời gian lên men rút ngắn từ 18 – 24h, còn 5 – 8h, hiệu suất tăng từ 70% - 80% lên 88% - 92%. Tuy nhiên sản lượng thấp nên phải dùng phương pháp lên men liên tục . Theo nghiên cứu này, họ sử dụng thân cây mía dài 2,0cm để làm chất mang cố định. Sử dụng môi trường mật rỉ để lên men, pH =4,2, có bổ sung acid sulphuric, và chất kháng khuẩn Kamoran HJ 10ppm, hoặc penicillin 10ppm và tetracyline 10ppm. Nghiên cứu này khảo sát hiệu suất lên men liên tục trong fermenter 3,5L với những nồng độ pha loãng khác nhau khi sử dụng nấm men cố định, và hoạt động của nấm men trong môi trường pha loãng. Ban đầu, pha loãng môi trường ở nồng độ 111,67 ÷ 1,5 g/l, pH = 4,21÷ 0,14 mật độ tế bào nấm men sử dụng trong thí nghiệm 2x108 tế bào/ml. Phải xử lý thân mía trước khi tiến hành cố định, thân mía dài 2cm, đường kính 2,57 ÷ 0,34cm, rỗ khí đạt 49,26 ÷ 2,34%. Tại thời điểm cố định mật độ trong thân là 1,02÷ g/cm3, ở vỏ là 1,02 ÷ 0,01g/ml. Kết quả cho thấy, nấm men cố định trên thân cây mía ổn định đến 60 ngày, khi tỷ lệ pha loãng biến dổi từ 0,05 h-1, đến 3 h-1 . Nồng độ tế bào đạt 109 tế bào / g thân mía khô khi fermenter hoạt động ở nồng độ pha loãng cao nhất 3 h-1. Nồng độ pha loãng thích hợp nhất là 0,83 h-1, tại nồng độ này hiệu quả lên men đạt 85,56%, nồng độ ethanol dao động trong khoảng 36 – 40g/l, tổng lượng đường chuyển đổi 74,61%, sản phẩm phụ sinh ra là 29,64g/l. Với tỷ lệ pha loãng này mở đầu cho cuộc cải tiến trong lĩnh vực công nghiệp hoặc phi công nghiệp. Hình 3.2. Đánh giá các thông số của quá trình lên men rượu liên tục trên thân cây mía với các nồng độ pha loãng. [10] TRSf: tổng lượng đường trong môi trường (g/l). Ethanol: hàm lượng ethanol sinh ra (g/l). Ef. Fern: hiệu quả lên men dựa trên lượng đường tiêu thụ (%). P: năng suất ethanol, tính theo lượng chất lỏng trong môi trường (g/l.h) P = EF V/V, EF: nồng độ ethanol. Nghiên cứu: “Sử dụng nấm men cố định trên bã mía để sản xuất Xylitol” Nghiên cứu được thực hiện bởi nhóm tác giả: Diego T. Santos , Boutros F. Sarrouh , Juan D. Rivaldi, Attilio Converti , Silvio S. Silva, năm 2007. Xylitol là chất ngọt , có độ ngọt cao, chống sâu răng, được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm và y sinh. Xylitol ứng dụng để điều trị phần lớn các loại bệnh lý khác nhau như viêm da dị ứng ( Masako et al. 2005a. b ), viêm tai giữa cấp tính ( Kontiokari et al. 1998 ), thiếu máu tán huyết (Wang và Van Eys, 1981), xơ nang (Zabner et al. 2000). Ngày nay xylitol được sản xuất bắng cách hydro hóa D – xylose, nhưng phương pháp này khá đắt tiền do phải thực hiện ở nhiệt độ cao, áp suất cao và trải qua nhiều bước thanh lọc nguyên liệu ( Winkelhausen và Kusmanova, 1998). Chính ví lý do đó, đã dẫn đến nhiều nghiên cứu nhằm cải thiện sản xuất bằng phương pháp rẽ hơn, thủy phân hemicelluloses, và trong sản phẩm còn lẫn sản phẩm thủy phân lignocellulosic, tuy nhiên hàm lượng này có thể điều chỉnh sao cho hợp lý. Những nghiên cứu sau này áp dụng nấm men sản xuất xylitol, Saccharomyces cerevisiae, Candidaspp mặc dù năng suất thu được không bằng phương pháp hóa học. Tuy nhiên lợi thế của phương pháp là cho người tiêu dùng sản phẩm từ D – xylose tự nhiên, và giảm được quá trình oxy hóa sản phẩm. Những nhà khoa học vào cuộc nhằm nghiên cứu biện pháp tăng năng xuất, và phương pháp cố định là một trong số đó. Đối với mục đích công nghiệp, ngưới ta quan tâm nhiều đến sản phẩm phụ và khả năng tái sử dụng phụ phẩm, vật liệu chứa lignocellulosic được sử dụng như chất mang tế bào, và bã mía có hàm lượng lignocelluloses cao nhất đã được sử dụng. Nghiên cứu này đã đóng góp một phần to lớn cho sự phát triển sản xuất xylitol nhờ sự thủy phân hemicellulose của tế bào Candida guilliermondii cố định trên bã mía. Tế bào cố định trên khung lignocelluloses, do đó khâu tiền xử lý khá quan trong nhằm tăng ái lực của lignocelluloses. Bã mía được cắt nghiền, di qua tấm lứoi lọc 1,41mm (tiêu chuẩn Tyler), rồi đến lưới 0,5mm. Sau sang lọc rửa bằng nước cất, sấy ở 1000C đến khối lượng không đổi, hấp tiết trùng 1210C, 20’. Bã mía xử lý với NaOH, sau đó cố định tế bào. Sau 21h, pH = 4 đạt giá trị tối đa là 50,5% và 0,31g tế bào / g bã mía, sau đó giảm mạnh. Tốc độ tăng trưởng của tế bào liên tục tăng trong quá trình cố định, và kết quả lên men cũng rất khả quan: sản lượng xylitol: 0,65g/g , năng suất 0,66 g/l/h ; sinh khối đạt: 0,18 g/g và 0,13 g/l/h. Hiệu suất đạt 70,8%. Hình 3.3. Cố định và duy trì hiệu quả tế bào cố định theo thời gian [9] Tế bào cố định (g/g), Hiệu quả duy trì tế bào (%) Hình 3.4. Tốc độ tăng trưởng theo thời gian của tế bào cố định [9] Tổng lượng tế bào, tế bào đánh dấu, tế bào cố định Trong quá trình tăng trưởng của tế bào, pH bị giảm xuống, đến 21h xuống thấp hơn pKa của cacboxylic, nên kích thích các nhóm kiềm trên bề mặt tế bào hoạt động , bề mặt tích điện dương, tăng lực đẩy của tế bào và giảm mức độ bám dính trên chất mang. Hình 3.5. Sự thay đổi của pH theo thời gian [9] Hình 3.6. Tế bào Candida guilliermondii cố định trên bã mía sau 24h lên men, dưới kính hiển vi (x400) TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM: Hiện nay ở nước ta, vấn đề cố định nấm men trên bã mía chỉ dừng ở qui mô nghiên cứu nhỏ, chưa được áp dụng vào công nghiệp. Mặc dù vậy, vẫn phải thừa nhận rằng nước ta có nhiều tiềm lực sẳn có để phát triển hướng nghiên cứu cố đĩnh tế bào trên chất mang bã mía vào sản xuất. Việc cố định tế bào nấm men cũng đạt được thành tựu ở nước ta như: Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt, thuộc trường đại học Đà Lạt(Việt Nam) đã nghiên cứu thành công việc cố định nấm men Saccharomyces cerevisea lên giá thể PHEMA ( là một vật liệu hydrogel, một loại polymer gồm nhiều monomer hydroxyethylmethacrylte) Hơn nữa ngành rượu vang ở nước ta phát triển rất khiêm tốn, phần lớn là sản xuất thủ công truyền thống. Do truyền thống ăn uống của người xưa, nay rượu vang chưa được sử dụng phổ biến. Nguồn nguyên liệu là vấn đề lớn vbì nghề trồng dâu nuôi tằm. Tuy nhiên rượu dâu tằm có nhiều ưu tính cần quan tâm và có tiềm năng phát triển rất lớn. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN KẾT LUẬN: Từ những nghiên cứu trên cho thấy, việc ứng dụng bã mía trong cố định tế bào nấm men áp dụng vào sản xuất, đang rất phổ biến, và hiệu suất thu được khá cao. Hướng nghiên cứu mới này rất thích hợp áp dụng ở nước ta nói riêng, các nước châu Á nói chung. Ví những lý do sau: + Nguồn nguyên liệu rẻ, dễ tìm + Chất mang an toàn. + Hiêu suất cố định khá cao + Khả năng tái sử dụng nhiều + Không ô nhiễm môi trường. Vì vậy, tế bào cố định trên bã mía có thể ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm: rượu vang, sản xuất xylitol, sản xuất cồn, …với tiềm năng rất lớn. TÀI LIỆU THAM KHẢO: [1].Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2: thí nghiệm vi sinh vật học , Nhà xuất bản Đại học quốc gia TpHCM. [2]. Nguyễn Đức Lượng(2006), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản đại học quốc gia TpHCM. [3]. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền, Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản đại học quốc gia TpHCM. [4]. Bộ môn công nghệ sinh học, Thí nghiệm hóa sinh, Nhà xuất bản đại học quốc gia TpHCM. [5]. Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. [6]. Đồng Thị Thanh Thu (2006), Giáo trình Hóa Sinh Hiện Đại, Nhà xuất bản Khoa Học Tự Nhiên. [7]. Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2007), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. [8]. Lebaka Veeranjaneya Reddy &Lebaka Prasannanjaneya Reddy & Young-Jung Wee &Obulam Vijaya Sarathi Reddy (2009), Production and Characterization of Wine with Sugarcane Piece Immobilized Yeast Biocatalyst, Food bioprocess technol [9]. Diego T. Santos , Boutros F. Sarrouh , Juan D. Rivaldi, Attilio Converti , Silvio S. Silva (2008), Use of sugarcane bagasse as biomaterial for cell immobilization for xylitol production, Journal food of engineering, 86, 542 - 548 [10]. J. N. de Vasconcelos, C. E. Lopes and F. P. de França (2004), Continuos ethanol production using yeast immobilized on sugar-cane stalks, Brazilian journal of chemical engineering, 21, 357-365. [11]. Yong-Jae Lee (2003), Oxidation of sugarcane bagasse using a combination of hypochlorite and peroxide, B.Sc., Chonnam National University [12]. [13]. [14]. [15]. [16]. [17].

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docDAMH_HOA.doc
Tài liệu liên quan