Đồ án Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia

LỜI MỞ ĐẦU Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Enzyme protease là nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, trong công nghiệp thuộc da, trong công nghiệp sữa và phomat. Đặc biệt trong quá trình sản xuất bia, protease đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu suất trích ly, thủy phân hoàn toàn các chất protein, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục bia. Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người. Hiện nay, các nhà máy bia ở nước ta chưa chú ý tới việc sử dụng enzyme trong quá trình sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên em chọn đề tài “Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” với mong muốn những ứng dụng của enzyme này sẽ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bia nói riêng. MỤC LỤC Mở đầu Chương 1: Tổng quan về enzyme protease 1. Tổng quan về enzyme protease 1.1. Giới thiệu chung 1.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật 1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease 2. Nguồn thu nhận protease 3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme protease có hoạt lực cao 3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme protease 3.2.1. Nguồn cacbon 3.2.2. Nguồn Nitơ 3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng 3.3. Nuôi cấy thu nhận phế phẩm enzyme protease bằng phương pháp bề mặt 3.4. Thu nhận enzyme 3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme 4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae 4.1. Quy trình thu nhận 4.2. Thuyết Minh Quy Trình và đề xuất thiết bị 4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae 4.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy 4.2.3. Thu nhận sản phẩm 4.2.4. Đề xuất thiết bị 5. Tình hình nghiên cứu enzyme protease 5.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước 5.2. Vấn đề sản xuất enzyme protease trên thế giới Chương 2: Đối tượng nghiên cứu và thiết bị I. Đối tượng nghiên cứu 1.Giới thiệu nguyên liệu [6] 1.1. Malt đại mạch 1.1.1. Vai trò của malt trong sản xuất bia 1.1.2. Thành phần cấu tạo của malt 1.1.3. Thành phần hoá học của malt 1.3.3. Các hợp chất chứa nitơ 1.3.4. Các hợp chất không chứa nitơ 1.3.5. Chất béo và lipid 1.3.6. Enzyme 1.3.7. Yêu cầu về chất lượng 1.2. Nguyên liệu thay thế đại mạch 1.2.1. Giới thiệu chung về nguyên liệu thay thế 1.2.2. Vai trò của nguyên liệu thay thế 1.2.3. Đặc tính của nguyên liệu thay thế 1.2.4. Yêu cầu chất lượng của nguyên liệu thay thế 1.3. Nước 1.3.1. Vai trò của nước trong công nghệ sản xuất bia 1.3.2. Nước sử dụng trong nhà máy bia 1.3.3. Yêu cầu chất lượng của nước đối với công nghệ sản xuất bia 1.4.1. Vai trò 1.4.2. Thành phần hoá học 1.5. Men bia 1.5.1. Vai trò 1.5.2. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất bia II. Thiết bị trong sản xuất bia. 1. Thiết bị. 2. Nguyên lý hoạt động 2.1. Sơ đồ thiết bị nhà nghiền 2.1.1. Nghiền gạo (Van V2, V7 đóng) 2.1.2. Nghiền malt (Van V1, V6 đóng) 2.1.3. Làm vệ sinh 2.2. Sơ đồ thiết bị nhà nấu 2.3. Sơ đồ hoạt động của khâu trộn màu và houlon 2.4. Quá trình lên men và lọc bia 2.5. Máy rửa chai 2.6. Máy chiết 2.7. Máy đóng nắp chai 2.8. Máy thanh trùng 2.9. Máy dán nhãn. 2.10. Máy in ngày sản xuất. Chương 3 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE TRONG SẢN XUẤT BIA I. QUY TRÌNH SẢN XUẤT BIA II. Thuyết minh quy trình. 1. Xử lý nguyên liệu. 2. Nghiền nguyên liệu: 3. Nấu nguyên liệu: 4. Lọc tách bã malt. 5. Houblon hoá: 6. Lắng trong và làm lạnh. 7. Lên men chính. 8. Lên men phụ và tàng trữ bia non: 9. Lọc trong bia: 10. Ổn định bia sau khi lọc: 11. Chiết chai. 12. Thanh trùng. KẾT LUẬN

doc71 trang | Chia sẻ: maiphuongtl | Ngày: 28/05/2013 | Lượt xem: 435 | Lượt tải: 4download
Tóm tắt tài liệu Đồ án Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
. - Khối lượng riêng của malt: 520 ÷ 600 g/l - Độ ẩm của malt không quá 6% - Malt có thời gian đường hoá 10 ÷ 35 phút, hoạt lực amylaza là 100 ÷ 300 đơn vị. Malt sau khi nhập từ nước ngoài về được bảo quản trong kho với thời gian dự trử sản xuất khoảng một tháng. 1.2. Nguyên liệu thay thế đại mạch 1.2.1. Giới thiệu chung về nguyên liệu thay thế Hình 1.14. Nguyên liệu thay thế Ngoài đại mạch là nguyên liệu chủ yếu được dùng trong sản xuất thì trong công nghiệp sản xuất bia người ta còn đưa ra một số nguyên liệu khác để thay thế. Mục đích: - Giảm giá thành sản phẩm. - Cải thiện một vài tính chất của sản phẩm. - Tạo ra chủng loại bia có mức độ phẩm chất khác nhau. - Đáp ứng yêu cầu đơn đặt hàng của người tiêu dùng. Các loại nguyên liệu thay thế có thể được chia làm hai nhóm: nhóm dạng hạt và nhóm dạng đường. Nhóm dạng hạt thường là các hạt thường loại cốc dùng để thay thế malt đại mạch chủ yếu là gạo, ngô, tiểu mạch…Các loại hạt này thường đưa vào chế biến cùng với bột malt dưới dang bột nghiền mịn. Nhóm dạng đường thường là đường saccharoza và glucoza. Đường saccharoza có nhiều trong mía và củ cải đường, lượng saccharoza đưa vào thay thế không quá 20% so với lượng chất khô đã được trích ly từ malt vào dịch đường. Hai loại đường này đưa vào sử dụng ở dạng hạt tinh luyện. Còn đường glucoza (đường thủy phân) thu nhận bằng cách thủy phân tinh bột khoai tây hoặc tinh bột ngô bằng acid sau đó trung hòa ,lọc, cô chân không đến 77 - 84% chất khô. Lượng đường thủy phân thường dùng là 10 - 15%. 1.2.2. Vai trò của nguyên liệu thay thế Thực tế hiện nay thì có nhiều nhà máy bia sử dụng nguyên liệu thay thế là gạo điển hình là nhà máy bia Tân Hiệp Phát với tỷ lệ malt/gạo là 8/2.Gạo được coi là thế liệu hàng đầu trong sản xuất bia do hàm lượng gluxit và protein khá cao, khả năng chuyển hóa thành chất hòa tan tốt (có thể đạt đến 90% chất khô). 1.2.3. Đặc tính của nguyên liệu thay thế Cũng giống như malt đại mạch hạt khác bao gồm các bộ phận : Vỏ trấu, vỏ hạt, vỏ quả, lớp alơron, nội nhủ và phôi. Trong thành phần chất khô của gạo thì tinh bột chiếm 75% protein 8% , chất béo 1- 1,5%, xenluloza 0,5- 0,8%, chất khoáng 1- 1,2% . Qua thành phần của gạo ta thấy hàm lượng tinh bột cao, protein ở mức vừa phải còn chất béo và xenluloza ở giới hạn thấp vì vậy có thể nói gạo là một loại nguyên liệu thay thế khá lý tưởng cho việc sản xuất bia với lượng gạo thay thế đến 20% hoàn toàn có thể sản xuất được các loại bia có chất lượng hảo hạng. 1.2.4. Yêu cầu chất lượng của nguyên liệu thay thế Màu sắc đồng nhất . Không có hạt mốc,không có mùi lạ. Tỉ lệ tạp chất < 2%. Hàm lượng tinh bột > 65%. Hàm lượng protein 8%. Chất béo 1,9%. Xenluloza 0,9%. Độ hòa tan 79 - 80%. 1.3. Nước 1.3.1. Vai trò của nước trong công nghệ sản xuất bia Nước có vai trò quan trọng nó ảnh hưởng đến chất lượng của bia đặc biệt là hương vị của thành phẩm. Với một tỷ lệ lớn 77- 90% trong bia thành phẩm, nước được xem là một trong những nguyên liệu chính để sản xuất bia vì hàm lượng các chất hòa tan trong dung dịch đường trước lúc lên men là 10 – 13% trọng lượng đối với bia vàng và 16 –22% ở bia đen. Hình 1.15. Nước 1.3.2. Nước sử dụng trong nhà máy bia Ø Nước dùng để ngâm đại mạch Yêu cầu quan trọng nhất đối với nước dùng để ngâm đại mạch là không chứa nhiều tạp chất hữu cơ và vi sinh vật. Mặc dù khi đại mạch đưa vào thùng ngâm không được sạch lắm song vi sinh vật trong nước gây tác dụng xấu đối với dại mạch nhanh hơn nhất là trong thời gian hạt bắt đầu trương nở. Ảnh hưởng của thành phần các muối trong nước đối với quá trình ngâm đại mạch qua hai chiều hướng: hòa tan các chất trong vỏ hạt và sau đó các muối hòa tan ngấm vào bên trong hạt. Muối trong nước ảnh hưởng đến những quá trình bên trong thời kì bắt đầu này mầm. Qua đó cho thấy ảnh hưởng của muối đến quá trình ngâm hạt rất phức tạp. Do đó nước dùng để ngâm đại mạch phải là nước mềm với môi trường acid yếu (pH = 6 – 7) riêng trong bước rửa hạt nên dùng nước có độ cứng tạm thời cao. Nếu nước có nhiều sắt và mangan nên loại bỏ bớt trước khi ngâm vì nó ảnh hưởng xấu trực tiếp đến hạt. Để rửa hạt tốt hơn và sát trùng nhiều trường hợp người ta cho thêm Ca(OH)2 vào nước ngâm. Ø Nước dùng để sản xuất dịch đường Thành phần và tính chất của nước ảnh hưởng đến mùi vị và một vài tính chất của bia. Các biacacbonat và cacbonat trong nước sẽ hòa tan những chất đắng trong vỏ malt tạo vị đắng khó chịu cho dịch đường và bia đặc biệt là NaCO3 và NaHCO3. Tất cả bicacbonat và cacbonat có trong nước dùng để chế biến dịch đường đều làm kém chất lượng của thành phẩm vì chúng có ảnh hưởng xấu đến các quá trình hồ hóa và đường hóa. Ø Nước dùng để rửa men và thiết bị Giống như nước dùng để ngâm đại mạch, nước dùng để rửa men và thiết bị đòi hỏi phải sạch không chứa nhiều tạp chất hữu cơ và vi sinh vật. Đặc biệt các vi sinh vật và vi khuẩn có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sản xuất bia, nên phải dùng thường xuyên kiểm tra bằng kính hiển vi, nếu lượng này nhiều quá phải sát trùng nước. Nước dùng để rửa thiết bị không được chứa NH3 các nitrit, nên dùng nước có độ cứng thấp đến độ cứng trung bình. Các cơ sở làm bia thường dùng hơi nước trực tiếp để gia nhiệt phải đảm bảo hơi nước đạt chất lượng thực phẩm. 1.3.3. Yêu cầu chất lượng của nước đối với công nghệ sản xuất bia Nước dùng trong lên men nói chung phải đạt tiêu chuẩn dùng cho nước uống, không có mùi vị lạ, không màu, trong suốt, đặc biệt không cho phép có mùi amoniac, vết của kim loại nặng (thủy ngân, bari…). Chỉ tiêu Yêu cầu Mùi vị Tinh khiết, không mùi Độ đục 1 – 9% pH 6.8 – 7.2 Độ mặn 11.7 mg/l Độ cứng tạm thời 0.72 mg/l Độ cứng vĩnh cửu 0.26 – 0.72 mg/l Độ kiềm tổng ≤ 4.0 (0F) Độ cứng tổng cộng ≤ 5.0 (0F) Hàm lượng muối CO32- <50 mg/l lit H2O Hàm lượng muối Mg2+ <100 mg/l lit H2O Hàm lượng clorua 75 – 100mg/l Hàm lượng CaSO4 130 – 200 mg/l lit H2O Hàm lượng Fe2+ < 0.2 – 0.5 mg/l Vi sinh vật <100 tế bào / 1 lít H2O Chỉ số E.coli < 3 tế bào/ 1 lit H2O NH3 và muối NO3- , NO2- Không được có Bảng 1.2. Một số chỉ tiêu chất lượng 1.4. Hoa houblon Hình 1.16. Hoa houblon 1.4.1. Vai trò Hoa houblon là nguyên liệu không thể thiếu được trong sản xuất bia. Làm cho bia có vị đắng dễ chịu, hương thơm đặc trưng, làm tăng khả năng tạo và giữ bọt, làm tăng độ bền keo và ổn định thành phần sinh học của sản phẩm. Trong sản xuất bia người ta sử dụng hoa cái chưa thụ phấn vì hoa đã thụ phấn sẽ tạo hạt làm giảm chất lượng bia. Hoa được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau: dạng hoa nguyên cánh, hoa viên, cao hoa,… Tuy nhiên, không sử dụng 100% cao hoa vì sẽ làm cho mùi, vị của bia bị giảm sút. Nhà máy sử dụng hoa houblon ở dạng hoa nguyên và dạng viên. Sử dụng hoa nguyên có ưu điểm là bảo toàn được chất lượng, nhưng đồng thời cũng có nhược điểm là giá thành cao, khó bảo quản. 1.4.2. Thành phần hoá học - Thành phần hoá học của hoa houblon gồm nhiều chất khác nhau, nhưng các chất có giá trị trong công nghệ sản xuất bia là nhựa hoa houblon, các tanin và tinh dầu. Ngoài ra trong hoa còn chứa một số các chất khác như: protein, mỡ, sáp, các tạp chất phi protein. - Nhựa hoa là thành phần chính, bao gồm nhựa cứng và nhựa mềm: Trong nhựa mềm gồm các dạng axit đắng là α, β, γ, δ - axit đắng. Vị đắng của bia chủ yếu là do α - axit đắng tạo nên, còn các dẫn xuất của β - axit đắng tạo nên vị đắng hài hoà dễ chịu. - Các chất tanin của hoa houblon là các polyphenol, dễ hoà tan trong nước, dễ bị oxi hoá nên nó bảo vệ nhựa hoa houblon. Trong quá trình nấu bia, hầu hết tanin của hoa houblon liên kết với protein của malt, do đó hàm lượng polyphenol ở trong bia chủ yếu là của malt và chỉ khoảng 10÷20% là polyphenol của hoa. - Tinh dầu hoa houblon là một hỗn hợp phức tạp của các hyđratcacbon và nhiều hợp chất chứa oxi dạng tecpen. Tinh dầu hoa houblon không hoà tan trong nước nhưng dễ bay theo hơi nước. Trong quá trình sản xuất khoảng 98% lượng tinh dầu bị bay hơi, chỉ tồn tại khoảng 2% để tạo hương thơm cho bia. Trong quá trình bảo quản, tinh dầu sẽ dần mất đi do bay hơi và bị oxi hoá. Do đó không dùng hoa cũ để sản xuất bia vì các sản phẩm chuyển hoá của tinh dầu nếu đưa vào bia sẽ làm giảm chất lượng bia. 1.5. Men bia Hình 1.17. Nấm men bia 1.5.1. Vai trò Nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành cồn ethylic, khí cacbonic, nước, các sản phẩm trung gian và sản sinh ra nhiệt trong quá trình lên men. Ø Chủng loại nấm men trong sản xuất bia. Trải qua quá trình sàng lọc và phân lập rất kỹ lưỡng qua hàng trăm năm, một loại nấm men được lựa chọn để chuyên dùng trong sản xuất bia: đó là chủng nấm men Saccharomyces Cerevisiae, Saccharomysec Carlsbergensis. 1.5.2. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất bia Việc lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất bia là việc hết sức quan trọng góp phần quyết định chất lượng của sản phẩm. Dưới đây là các đặc tính cơ bản mong muốn có đối với bất kì chủng nấm men nào dùng trong sản xuất bia: Tốc độ len men nhanh. Sử dụng đường có hiệu quả, tạo độ cồn cao. Có khả năng chịu cồn, áp suất thẩm thấu, oxy, nhiệt độ và nồng độ CO2 phù hợp với từng nhà máy. Có khả năng kết lắng tốt. Có khả năng sống sót cao cho khả năng tái sử dụng. Sản phẩm tạo ra bao gồm các hợp chất hương và vị đặc trưng cho bia. Đặc tính di truyền ổn định cao. II. Thiết bị trong sản xuất bia. Thiết bị. Hình 1.18. Hệ thống xử lý nguyên liệu Hình 1.19. Hệ thống xử lý nước nấu Hình 1.20. Thiết bị lên men. Hình 1.21. Hệ thống lò hơi. Hình 1.22. Nồi nấu hoa bia Hình 1.23. Hệ thống máy làm lạnh Hình 1.24. Hệ thống nồi nấu bia Hình 1.25. Hệ thống tank lên men Hình 1.26. Hệ thống chiết lon Hình 1.27. Hệ thống chiết chai 2. Nguyên lý hoạt động 2.1. Sơ đồ thiết bị nhà nghiền Hình 1.28. Sơ đồ thiết bị nhà nghiền 2.1.1. Nghiền gạo (Van V2, V7 đóng) Cảm biến mức trong thùng chứa gạo sẽ báo mức gạo, nếu mức gạo trong thùng nằm trong phạm vi cho phép thì hệ thống làm việc (nếu không đủ lượng gạo băng tải liệu hoạt động để cấp liệu). Van V3 đóng van V1 mở, gạo sẽ vào cân nếu khối lượng gạo đạt mức yêu cầu thì van V1 đóng van V3 mở máy nghiền hoạt động. Đồng thời van V4 mở để cho nước trộn cùng với gạo. Van V6 mở (van V7 đóng) máy bơm M2 sẽ đẩy nguyên liệu sang nồi nấu gạo. 2.1.2. Nghiền malt (Van V1, V6 đóng) Cảm biến mức trong thùng chứa malt sẽ báo mức malt, nếu mức malt trong thùng nằm trong phạm vi cho phép thì hệ thống làm việc (nếu không đủ lượng malt băng tải liệu hoạt động để cấp liệu). Van V3 đóng van V2 mở, malt sẽ vào cân nếu khối lượng malt đạt mức yêu cầu thì van V1 đóng van V3 mở máy nghiền hoạt động. Đồng thời van V4 mở để cho nước trộn cùng với malt. Van V7 mở (van V6 đóng) máy bơm M2 sẽ đẩy nguyên liệu sang nồi nấu malt. 2.1.3. Làm vệ sinh Quá trình làm vệ sinh máy thực hiện khi kết thúc một mẻ nấu, công đoạn làm vệ sinh được tiến hành như sau: Máy ngừng hoạt động, các van V1, V2, V3, V4 đóng. Van V5 mở để cho dịch CIP vào trong máy nghiền (hai lô nghiền) làm vệ sinh. Dịch CIP chính là dung dịch sút (NaOH) nồng độ loãng có tác dụng tẩy rửa. Van V6, V7 mở và bơm M2 hoạt động để bơm dịch CIP sang hai tank nấu gạo và malt, thực hiện làm vệ sinh nhà nấu. Quá trình nghiền gạo và malt được thực hiện riêng biệt, sau khi nghiền gạo hoàn thành thì mới nghiền malt hay ngược lại. 2.2. Sơ đồ thiết bị nhà nấu Nhà nấu gồm có hai tank lớn, trong đó một tank để nấu gạo và một tank để nấu malt. Gạo và malt từ nhà nghiền sẽ được đưa đến hai tank này có pha trộn với nước nhờ bơm M2, quá trình bơm nhiên liệu kết thúc khi cảm biến báo mức đầy trong tank có tín hiệu. Nhiệt để cung cấp cho nhà nấu là hơi nước nóng được gia nhiệt tại khu vực cung cấp nhiệt và CO2. Quá trình nấu được diễn ra trong một thời gian nhất định, nguyên liệu sẽ được gia nhiệt đến nhiệt độ không đổi và được duy trì nhiệt độ này trong thời gian nhất định. Quy trình nấu đòi hỏi yêu cầu kỹ thuật về thông số nhiệt độ là rất cao, độ chính xác nhiệt độ trong tank nấu là yếu tố góp phần quyết định chất lượng sản phẩm bia. Quá trình trao đổi nhiệt nhờ hệ thống ống dẫn hơi nước nóng, nguyên liệu đi từ trên xuống và hơi nước nóng đi theo chiều ngược lại từ dưới lên. Hình 1.29. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của tank nấu. Hoạt động đồng bộ cùng với quá trình nghiền, khi bắt đầu nghiền lò sẽ được gia nhiệt. Nguyên liệu từ nhà nghiền sẽ được bơm M2 chuyển sang, khi nguyên liệu vượt quá mức thấp thì lò bắt đầu hoạt động. Van V8 mở để tăng lượng nước vào tank lượng nước và nguyên liệu sẽ được pha trộn theo đúng tỷ lệ đã quy định.Thì van V12 mở hơi nước nóng theo hệ thống ống đi vào tank, quá trình gia nhiệt bắt đầu. Cho đến khi nguyên liệu vào đầy tank, cảm biến báo mức cao L1 có tín hiệu thì sẽ tạm dừng hoạt động nghiền nguyên liệu cần nấu và sẽ chuyển sang nghiền nguyên liệu khác, bơm M2 (bơm nguyên liệu từ nhà nghiền ) dừng hoạt động đồng thời van V9 đóng. Quá trình nấu bắt đầu, hơi nước nóng cung cấp nhiệt cho nhà nấu. Các cảm biến nhiệt độ có nhiệm vụ đo các thông số nhiệt độ và khối lượng được thể hiện trên panel điều khiển. Nhiệt độ trong tank nấu, có ba cảm biến nhiệt độ để tổng hợp nhiệt độ từ tank nấu nhằm tăng sự đồng đều nhiệt độ trong tank. Quá trình nấu kết thúc, van V12 đóng, van V10 mở đồng thời bơm M3 hoạt động để tháo nguyên liệu. Quá trình làm vệ sinh tank nấu tiến hành như sau: Khi kết thúc quá trình tháo nguyên liệu, tất cả các van sẽ đóng. Quá trình làm vệ sinh này tiến hành cùng với nhà nghiền, dịch CIP từ nhà nghiền theo van V9 chảy vào tank để làm vệ sinh tank. Đồng thời van V11 mở để tháo dịch CIP ra khỏi tank. Sau đó, van V8 mở để cho nước sạch chảy vào làm sạch dịch CIP còn lại trong tank. Van V11 mở để tháo sạch các chất còn lại trong tank. Tại nhà nấu có ba tank nấu, trong đó có hai tank nấu hoạt động giống hệt nhau là tank nấu gạo và malt. Một tank còn lại là nấu houblon để cung cấp dịch cho nhà lọc và đồng thời trộn với nguyên liệu sau khi nấu nhằm tạo hương vị và màu cho bia. Nguyên lý hoạt động của tank này cũng tương tự như trên. Tuy nhiên kích thước của tank này là không lớn, cho nên nó chỉ sử dụng một cảm biến đo nhiệt độ. Sau khi nấu xong, nguyên liệu gạo và malt sẽ được các bơm chuyển sang bộ phận lọc để loại bỏ bã nguyên liệu. Bộ phận lọc này có nhiệm xới trộn hai nguyên liệu trên lại với nhau trước khi lọc .Kết thúc quá trình lọc sẽ được dịch gạo và malt. Dịch gạo và malt tiếp tục chuyển đến tank trộn cùng với houblon để tạo hương vị bia chuẩn bị lên men. Ngoài ra khu vực nấu còn có một tank trung gian phòng khi sự cố nồi nấu thì có thể nồi còn lại nấu xong chuyển đến nồi trung gian chứa .Sau đó cho nguyên liệu còn lại vào tank để nấu tiếp. Nấu xong thì trộn hai nguyên liệu vào nồi lọc để tiến hành lọc bả và nước dịch. 2.3. Sơ đồ hoạt động của khâu trộn màu và houlon như sau Hình 1.30. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của khâu trộn. Nguyên lý hoạt động: Van V13, V14 (van V15 đóng) đồng thời mở cảm biến báo mức thấp L3 có tín hiệu, động cơ M4 quay tốc độ chậm cho đến khi nguyên liệu vào đầy. Cảm biến báo mức cao L4 có tín hiệu van V13, V14 đóng đồng thời động cơ M4 chuyển sang chế độ quay nhanh sau thời gian định trước. Sau thời gian này, động cơ M4 chuyển sang chế độ quay chậm van V15 mở, bơm M5 hoạt động chuyển dịch sang nhà lên men. Kết thúc chu kỳ trộn. 2.4. Quá trình lên men và lọc bia Khâu hạ nhiệt Dịch từ khâu trộn được bơm M5 chuyển đến nhà lên men. Trước khi đưa vào tank lên men thì dịch phải hạ nhiêt độ xuống còn 100c nhờ bộ phận hạ nhiệt. Hình 1.31. Quá trình hạ nhiệt. Quá trình hạ nhiệt bao gồm: Cánh tản nhiệt có nhiệm vụ thoát nhiệt. Ống dẫn nước lạnh ( nước được làm lạnh xuống 20c ). Ống dẫn dịch nước nha. Hình 1.32. Nguyên lý hoạt động Nguyên lý hoạt động: Dựa trên nguyên lý trao đổi năng lượng, nhiệt trong dịch sẽ truyền qua nước lạnh, cánh tản nhiệt ra ngoài môi trường. Lưu lượng dịch và nước lạnh sẽ được điều khiển bằng van lưu lượng V16, V17 đảm bảo dịch ra khỏi bộ phận hạ nhiệt đạt 100C. Dịch sau khi được hạ nhiệt độ, sẽ được chuyển đến một tank để trộn men. Sau khi quá trình trộn men kết thúc sẽ được đưa vào tank lên men. Trong nhà lên men có tổng cộng 12 tank lên men. Mỗi tank đều có cảm biến nhiệt độ (cặp nhiệt độ) để đo nhiệt độ, thiết bị điều khiển nhiệt độ. Quá trình lên men: Quá trình lên men được tóm tắt làm 4 giai đoạn chính: Giai đoạn đầu: Tạo bọt trắng và mịn xung quanh bề mặt dịch lên men, nấm men nảy chồi và phát triển, giai đoạn này kéo dài từ 1 – 5 ngày. Giai đoạn 2: Giai đoạn bọt rất thấp, có rất nhiều bọt đặc trắng, chật, bồng lên một lớp trên bề mặt dịch trong thời gian 1 – 2 ngày. Giai đoạn 3: Giai đoạn bọt cao, quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ nhất, bọt xốp và bồng lên rất cao, bề mặt bọt chuyển từ trắng sang màu nâu. Giai đoạn này kéo dài 3 – 4 ngày. Giai đoạn cuối: Bọt bệt xuống, bề mặt bọt lên men phủ lớp màu nâu. Tế bào nấm men tạo thành lớp bông và lắng xuống đáy thùng. Sản phẩm thu được là bia non tiến hành tiếp quá trình ủ bia từ 6 – 10 ngày để nồng độ CO2, hàm lượng cồn diaxentin, độ axit ...đạt chỉ tiêu yêu cầu. Làm trong bia Để đạt được độ trong cần thiết phải tiến hành lọc làm trong bia. Có thể sử dụng nhiều thiết bị khác nhau và nhiều chất trợ lọc khác nhau. Lọc tách triệt để các phần tử rắn lóng, khuyếch tán trong bia, lọc loại bỏ hầu hết các vi sinh vật, kể cả nấm men, làm cho bia có độ trong sáng đúng yêu cầu chất lượng làm ổn định và gia tăng độ bền vững sinh học, hoá học. Các quá trình khác Ngoài ra trong nhà lên men còn có các tank chứa NaOH để làm vệ sinh cho các tank lên men sau khi kết thúc quá trình lên men. Kết thúc quá trình hoạt động tại nhà lên men và lọc, dịch sẽ chuyển thành bia. Sau đó bia được chuyển đến nhà chiết. 2.5. Máy rửa chai Dùng dung dịch NaOH 2% và nước nóng phun xịt rửa sạch cả bên trong lẫn bên ngoài vỏ chai bia và bóc nhãn, để đưa vào máy chiết bia. Chai bẩn được đưa vào máy rửa bằng băng tải đầu vào. Khi chai đến cửa vào của máy rửa, động cơ chọn lựa sẽ đưa chai vào hệ thống rọ chai, hệ thống rọ chai được động cơ chính dẫn động thông qua hộp giảm tốc, sẽ chuyển động theo chu kỳ khép kín hệ thống rọ sẽ mang chai đi qua các hầm tẩy rửa như : hầm ngâm nước nóng, hầm xút, và các vòi phun. Nhờ hệ thống vòi phun xút và nước nóng với áp suất lớn, nên chai ra khỏi máy rửa theo cửa ra chai hầu hết đều rất sạch và được băng tải đưa vào máy chiết bia. Quá trình hoạt động của máy diễn ra như sau: Chai sẽ được ngâm vào bể chứa nước nóng 350C để thấm ướt nhãn trên vỏ chai nhằm loại bỏ nhãn. Sau đó chai tiếp tục được rửa bằng vòi phun nước nóng. Hình 1.33. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy rửa chai Kế đến là chai được ngâm vào trong một bể chứa dung dịch NaOH có nhiệt độ là 750C. Sau khi ngân sút kết thúc, chai được qua vòi phun nhằm loại bỏ hoàn toàn nhãn trên chai bia. Nhãn bia được lấy đi và đưa ra ngoài nhờ một băng tải, trên băng tải này có trang bị một bàn chải xoay để làm sạch các nhãn bám trên băng tải này. Chai tiếp tục đưa lên phía trên của máy rửa cao áp, máy rửa này có nhiệm vụ rửa sạch cả bề mặt bên trong lẫn bên ngoài chai nhờ vào một dãy các vòi phun cao áp đặt kế tiếp nhau. Kết thúc bằng vòi phun nước sạch có nhiệt độ bình thường. 2.6. Máy chiết Công suất của máy chiết bia là 15000 chai/h, quá trình chiết hoạt động theo nguyên tắc chiết đẳng áp. Hình 1.34. Hoạt động của cơ cấu nâng chai bằng cam và con lăn Cơ cấu cam cố định với thân máy, còn các con lăn chuyển động xoay tròn. Khi con lăn quay, kết hợp cùng với cơ cấu cam thực hiện nâng chai tiếp xúc với đầu chiết bia. Nguyên lý làm việc: Chu kỳ 1: Nhờ có trục vít dẫn hướng chai mà chai đi đúng vào vị trí cần chiết. Cơ cấu cam nâng vỏ chai vào đúng vị trí của đầu chiết, lúc này đường đẳng áp ngược chiều được thông giữa chai và thùng trữ bia và do chênh lệch áp suất giữa thùng và chai mà khí CO2 đi vào trong chai theo ống. Chu kỳ 2: Lúc này đường đẳng áp mở ra để thông khí ra ngoài, khí CO2 vào để thổi hết không khí trong chai. Đường đẳng đóng lại, trong chai còn CO2 đến khi nào áp suất trong chai bằng áp suất trong thùng thì bia chảy vào chai. Chu kỳ 3: Bia tự động chảy vào chai theo đúng định mức do cân bằng áp suất. Lúc này CO2 không tạo áp suất ngược chiều được do đó bia ngừng chảy vào chai. Quá trình chiếc một chai bia kết thúc một khi chai quay đến vị trí đóng cưỡng bức vòi chiếc. Chu kỳ 4: Phải mở cửa với thời gian nhất định để áp suất trong chai bia cân bằng với áp suất bên ngoài. Rồi mới đưa chai bia ra khỏi chụp chai, điều này nhằm mục đích tránh trào bia khi mở đột ngột đầu chụp chai. 2.7. Máy đóng nắp chai Yêu cầu kỹ thuật - Để bia không bị giảm chất lượng thì thời gian từ khi bia được rót đến lúc đóng nắp xong không được quá 5 giây. - Nắp phải được đóng kín không được làm thất thoát CO2 và nhiểm khuẩn. - Không được gây mẻ miệng chai. Hình 1.35. Sơ đồ máy đóng nắp chai Nguyên lý hoạt động - Nắp chai từ thùng chứa xuống đầu đóng nắp chai nhờ có cơ cấu dẫn hướng nắp chai. - Khi chai vào đúng vị trí đóng nắp (nhờ cảm biến quang phát hiện), sẽ có trục chuyển động tịnh tiến dọc để đóng nắp chai. - Chai sau khi được đóng nắp sẽ tiếp tục theo băng tải đi vào máy thanh trùng. 2.8. Máy thanh trùng Công dụng Đình chỉ sự hoạt động của nấm lên men bia, tiêu diệt các vi sinh vật còn sót lại trong bia (do công nghệ sản xuất ). Để làm tăng thời gian bảo quản bia, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. Hình 1.36. Sơ đồ máy thanh trùng Yêu cầu kỹ thuật - Đảm bảo đúng nhiệt độ yêu cầu ở từng khoang thanh trùng. - Thời gian chai lưu lại trong mỗi khoan. - Tốc độ chai chạy tùy theo lượng chai có trong máy mà biến tần sẽ điều chỉnh tốc độ của băng tải để đưa chai ra ngoài theo đúng tiến độ. Nguyên lý hoạt động - Ngăn 1 (Heating 1): Ở ngăn này chai từ máy chiết đi vào, nên chai được giữ ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ đặt là 280C). Chai tiếp tục đi vào ngăn hai nhờ băng tải. - Ngăn 2 (Heating 2): Tại ngăn này chai được gia nhiệt, nhiệt độ trong ngăn được tăng nhiệt đến 400C. Tốc độ chai chạy qua ngăn này phụ thuộc vào nhiệt độ trong ngăn. Nếu nhiệt độ đặt cao thì chai sẽ chạy nhanh để đảm bảo nhiệt độ trong chai không vượt quá mức cho phép. Tốc độ chai được điều khiển bởi các động cơ xoay chiều và biến tần VLT series 5004, VLT 3004. - Ngăn 3 (Heating 3): Trong ngăn tiếp tục gia nhiệt lên đến520C, nhờ nhiệt trong ngăn mà nhiệt độ trong chai tăng lên khoảng 500C. Với nhiệt độ này, tốc độ chai đi qua ngăn chậm để đảm bảo nhiệt độ của chai. Kết thúc ngăn này chai sẽ được hạ nhiệt. - Ngăn 4: ngăn tiếp tục được gia nhiệt, nhiệt độ trong ngăn được tăng lên 680C. Tốc độ chai đi qua ngăn này là tương đối chậm để đảm bảo nhiệt độ trong chai là 680C và diệt khuẩn an toàn. Nhiệm vụ của ngăn này là “tiền diệt khuẩn ” vì ở nhiệt độ này sẽ hạn chế được sự hoạt động, phát triển của các vi sinh vật còn sót lại. - Ngăn 5: nhiệt độ trong ngăn được hạ xuống 640C, đây là giai đoạn diệt khuẩn toàn bộ. - Ngăn 6 ( Cooling 1 ): Chai được hạ nhiệt độ xuống nhiệt độ520C. - Ngăn 7 ( Cooling 2 ): Chai được hạ xuống nhiệt độ 420C. - Ngăn 8 ( Cooling 3): Chai đưa về nhiệt độ bình thường (thông thường là 280C). Hình 1.37. Bố trí nhiệt độ trong các ngăn Nhiệt cung cấp cho quá trình thanh trùng được cung cấp nhờ hơi nước nóng ở nhà nhiệt. Hơi nước nóng sẽ được thổi vào bộ trao đổi nhiệt giữa nước với hơi nước nóng. Nhiệt độ nước được đảm bảo yêu cầu nhờ các bơm để tăng giảm tốc độ trao đổi nhiệt. Nước được gia nhiệt sẽ được phun vào trong ngăn, nhiệt độ ngăn tăng lên là nhờ quá trình trao đổi nhiệt giữa nước nóng với không khí trong ngăn. Vì do yêu cầu nhiệt độ trong ngăn phải đảm bảo chính xác so với nhiệt độ đặt nên trong mỗi ngăn đều có các quạt thông gió, các quạt này đảm bảo nhiệt độ trong ngăn không tăng đột ngột. Khi nhiệt độ trong ngăn vượt quá nhiệt độ đặt thì quạt sẽ hoạt động cho đến khi nhiệt độ trong ngăn thấp hơn nhiệt độ đặt 5%. 2.9. Máy dán nhãn. Nguyên lý hoạt động Chai từ băng tải đi vào, bàn xoay I có nhiệm vụ đưa chai vào bàn xoay II. Bàn xoay II mang chai chạy theo đường tròn, lúc đó bàn thoa keo IV sẽ quay tròn, thực hiện việc lấy nhãn tai hộp chứa nhãn và dán vào chai. Sự ăn khớp giữa chai vào nhãn giống với sự ăn khớp của bánh răng. Sau khi được dán nhãn xong chai tiếp ttục theo bàn xoay III ra ngoài băng tải. Hình 1.38. Nguyên lý hoạt động của máy dán nhãn 2.10. Máy in ngày sản xuất. Hình 1.39. Nguyên lý hoạt động máy in ngày sản xuất Nguyên lý hoạt động của máy in ngày sản xuất Chai chạy trên băng tải chai, khi cảm biến quang mất tín hiệu (tức là có chai đi qua vị trí in ngày) thì máy in phun thực hiện in ngày sản xuất lên chai. Với vị trí vòi phun đã định vị sao cho phun đúng cổ chai. Chai bia sau khi đã in ngày sản xuất sẽ được băng tải chuyển lên máy bốc. Chương 3 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE TRONG SẢN XUẤT BIA Nguyên liệu I. QUY TRÌNH SẢN XUẤT BIA Bã malt Xử lý nguyên liệu Nghiền nguyên liệu Nấu nguyên liệu Lọc tách bã malt Houblon hóa Lắng trong và làm lạnh Lên men chính Lên men phụ và tàng trữ bia non Lọc trong bia Ổn định bia sau khi lọc Chiết chai Thanh trùng Bia thành phẩm Bã hoa Men giống II. Thuyết minh quy trình. 1. Xử lý nguyên liệu. Nguyên liệu nấu bia có thể 100% malt đại mạch hoặc hỗn hợp malt đại mạch với thứ liệu. Thứ liệu lớn hơn 30%. Ø Làm sạch nguyên liệu. Mục đích: Tách hết bụi bẩn, loại bỏ tạp chất kim loại lẫn trong nguyên liệu, đối với malt còn để loại bỏ mầm rễ còn sót lại. Quá trình này đảm bảo nguyên liệu phải được sạch, kích thước hạt đồng đều, không ảnh hưởng đến chất lượng bia, thuận lợi cho quá trình nghiền. Ø Phương pháp làm sạch: Dùng sàng, nam châm... Ø Cân nguyên liệu: Cân để biết chính xác khối lượng nguyên liệu chính xác đưa vào nấu để tính được hiệu suât nấu. 2. Nghiền nguyên liệu: Mục đích: Dùng lực cơ học phá vỡ cấu trúc nguyên liệu thành những mảnh nhỏ giup cho quá trình ngấm nước, hồ hoá, thuỷ phân xảy ra nhanh. Nguyên tắc nghiền: Đối với thứ liệu là hạt chưa nảy mầm thì nghiền càng mịn càng tốt, đối với malt đại mạch chỉ cần nghiền thô không cần nghiền mịn vì làm nát vỏ trấu gây chát và lọc chậm và do cấu trúc malt đại mạch đã bị phá vỡ. Phương pháp nghiền: Dùng nghiền trục. 3. Nấu nguyên liệu: Ø Mục đích: Chuyển các chất có trong nguyên liệu từ trạng thái không hoà tan sang trạng thái hoà tan nhờ tác động của các hệ enzim thuỷ phân.Và cùng với các chất hòa tan trong quá trình thủy phân tạo thành chất chiết của dịch đường (nước nha). Ø Phương pháp nấu: Có ba phương pháp nấu bia là phương pháp ngâm, phương pháp đun sôi và phương pháp kết hợp giữa đun sôi với ngâm. Ưu điểm của phương pháp ngâm là thời gian nấu ngắn nên ít tốn năng lượng, nhưng có nhược điểm là khối nấu không được đun sôi nên đường hoá không triệt để. Ưu điểm của phương pháp đun sôi là phá vỡ triệt để cấu trúc tế bào tinh bột nên tăng hiệu suất quá trình thuỷ phân. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian nấu kéo dài, tốn nhiều năng lượng và có thể xảy ra các phản ứng phụ không cần thiết. Ø Lựa chọn phương pháp đun sôi: Các biện pháp xử lý nguyên liệu khi nấu bia dùng nguyên liệu thay thế lớn hơn 30%: Bổ sung chế phẩm enzyme: β – glucanase; α, β – amylase; protease. Thứ liệu nghiền mịn, malt nghiền thô. Dùng nước mềm và điều chỉnh PH = 5,2 – 5,6. Nồi nấu nguyên liệu thay thế: Toàn bộ nguyên liệu thay thế (đã nghiền mịn) 10 – 15% bột malt trộn đều với nước ấm, nâng đến nhiệt độ 500C, điều chỉnh PH= 5,2 – 5,5 (thường dùng acid lactic… để điều chỉnh). Duy trì ở nhiệt độ 500C trong vòng 30 – 40 phút. Bổ sung chế phẩm enzyme Sau đó nâng nhiệt độ lên 750C trong vòng 10 – 20 phút tạo điều kiện cho enzyme α – amylase hoạt động cắt ngắn mạch tinh bột tạo thành các dextrin, làm giảm độ nhớt của khối cháo. Nâng nhiệt 90 – 950C trong vòng 25 phút. Nồi malt: Bột malt còn lại hoà với nước ấm nâng lên nhiệt độ 500C trong vòng 20 phút, pH = 5,2 – 5,6, bổ sung muối và enzyme, bơm khối cháo ở nồi nấu nguyên liệu thay thế về nồi malt và khống chế nhiệt độ 650C trong vòng 40 phút, sau đó nâng nhiệt độ lên 750C trong 10 – 15 phút, cuối cùng nâng nhiệt độ lên 780C rồi tiến hành lọc. Kết thúc quá trình nấu ta được dịch đường hoá. Các quá trình xảy ra khi nấu nguyên liệu: Quá trình dịch hoá: (cnez nguyễn đức lượng chủ biên) Dịch hoá là quá trình cắt tinh bột thành những đoạn ngắn, tạo điều kiện cho quá trình đường hoá và tránh hiện tượng thoái hoá tinh bột. Ở giai đoạn này, người ta thường sử dụng enzyme amylase và protease của vi khuẩn. Các loại enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao và có khả năng chịu nhiệt độ cao rất tốt, nhiệt độ cao thường làm biến tính enzyme có trong malt, do đó việc bổ sung enzyme có khả năng chịu nhiệt từ nguồn vi sinh vật là rất cần thiết. Khi ta cho nguyên liệu thay thế malt vào trong hỗn hợp, các loại nguyên liệu này không được thủy phân triệt để, dễ dàng tạo ra độ nhớt cao, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng đường hoá và lên men sau này. Nếu ta cho enzyme chịu nhiệt từ nguồn vi sinh vật thì sẽ cải thiện được những nhược điểm trên. Quá trình đường hoá: (cnsxm&bnxbkh&kt pgs ts hoang dinh hoa, cnlm nxbđn chu biên kỹ sư phan bich ngọc ) Khi đường hoá dưới tác dụng của các enzyme protease protein bị thuỷ phân thành các axitamin, các peptide, polypeptide… một phần các chất này sẽ là thức ăn cho nấm men, một phần khác là phần không thể thiếu được của bia thành phẩm. Có khoảng 30 – 40% tổng số lượng đạm trong nguyên liệu được chuyển vào nước dưới dạng hòa tan làm cho nước nha trở nên giàu chất dinh dưỡng cho nấm men sinh trưởng và phát triển. Khi đường hoá enzyme protease thuỷ phân proteinase thể hiện hoạt tính lớn nhất. Nó thuỷ phân protein thành các polypeptide không đông tụ. Tiếp theo dưới tác dụng của enzyme polypeptidase các polypeptide chuyển thành axitamin, lúc chế biến malt nếu sấy malt cao quá nhiệt độ quy định, enzyme này bị mất hoạt lực nên khâu chuyển hoá quan trọng này không thể tiến hành nhanh chòng được, trong trường hợp này bản thân protease phải phân cắt không chỉ các mối liên kết peptide trong protein, mà trong cả polypeptide khác nhau thậm chí cả trong dipeptide. Mặc dù lượng protein có trong dịch lên men rất ít nhưng nó ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo bọt và độ bền của bia. Các sản phẩm thuỷ phân của protein không tách khỏi dung dịch khi đun sôi, nhưng nó có tính keo. Albumoza, pepton và các polypeptide tham gia vào việc tạo bọt và tăng vị cho bia, còn peptide và axitamin cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men về sau. Quá trình thuỷ phân protein dưới tác dụng của enzyme protease phụ thuộc vào nhiệt độ và PH của môi trường. Ở nhiệt độ 500C và PH = 5,6 – 5,9 là điều kiện thuận lợi để tích luỹ các sản phẩm thuỷ phân có phân tử lượng nhỏ như axitamin. Ngược lại ở nhiệt độ 600C sẽ tích luỹ các sản phẩm thuỷ phân có phân tử lượng cao như polypeptide. Cùng với sự thuỷ phân, trong quá trình đường hoá một phần protein bị đông tụ dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Sự đông tụ bắt đầu ở nhiệt độ trước 600C ở nhiệt độ này leucozin bắt đầu đông tụ. Khi tăng nhiệt độ đến 900C globulin bắt đầu đông tụ. Khi đun sôi một số protein khác bắt đầu biến tính và đông tụ. Mặt khác một phần protein kết tủa do liên kêt với các tannin có trong vỏ malt, quá trình đông tụ và kết tủa này rất quan trọng đối với các giai đoạn công nghệ về sau. 4. Lọc tách bã malt. Ø Mục đích: Tách các chất hoà tan ra khỏi các chất không hoà tan. Ø Tiến hành: Quá trình lọc dịch đường gồm hai giai đoạn: lọc dịch và rửa bã. Chọn thiết bị lọc thùng vì cho dịch đường có chất lượng cao và dễ vệ sinh. Trước hết là lọc khối cháo thu được dịch đường đầu, sau đó dùng nước nóng 780C để rửa bã. Không được dùng nước có nhiệt độ lớn hơn 780C để rửa bã vì nước quá nóng sẽ làm vô hoạt hệ enzyme amylaza và các tinh bột sót được hồ hoá nhưng không được đường hoá, kết quả làm cho dịch lên men bị đục và bia cũng đục theo. Khi tiến hành lọc, phải cho nước nóng vào dưới đáy lưới. Nước vào đáy lưới chiếm đầy các ống dẫn, khoá, khoảng không gian giữa đáy chính và đáy lưới nên đẩy không khí ra ngoài. Sau khi lọc xong thì tiến hành rửa bã bằng nước nóng 780C cho đến khi nồng độ chất hoà tan còn lại trong bã khoảng 1% là được. Nếu rửa quá kỹ thì chất đắng, chất cay trong bã sẽ tan vào dịch đường làm cho bia có mùi, vị lạ, dịch đường sẽ bị loãng. Quá trình lọc và rửa bã kéo dài khoảng 4h. Sau khi rửa xong, bã được tháo ra và đưa ra ngoài, thiết bị phải vệ sinh, sát trùng để chuẩn bị cho mẻ sau. Ø Yêu cầu: Dịch đường và nước rửa bã sau khi lọc phải trong hoàn toàn. 5. Houblon hoá: Ø Mục đích: Trích ly các chất có giá trị của hoa như chất đắng, tinh dầu để cho dịch đường có mùi thơm va đắng đặc trưng. Polyphenol + protein làm trong dịch đường (tạo kết tủa, kết tủa kếo theo các chất lơ lửng làm trong dịch đường.). Sát trùng dịch đường. Xảy ra phản ứng tạo màu và tạo mùi. Loại bỏ, làm bay hơi các chât gây mùi không tốt. Điều chỉnh nồng độ dịch đường trước khi lên men. Ø Tiến hành: Thiết bị houblon hoá về cấu tạo cũng giống với thiết bị nấu nhưng bề mặt truyền nhiệt lớn hơn vì cần bốc hơi một lượng lớn hơi nước trong quá trình đun sôi. Liều lượng hoa houblon được sử dụng là 3g/1 lít dịch đường. Hoa được dử dụng dưới hai dạng: hoa nguyên cánh chiếm 35% và hoa viên chiếm 65%. Chọn phương án cho hoa 3 lần: - 1/2 hoa viên cho vào lúc dịch đường vừa lấp đáy nồi. - 1/2 hoa viên còn lại cho vào sau khi sôi 30 phút. - Hoa nguyên cánh cho vào 30 phút trước khi nấu kết thúc. Tiến hành: dịch đường và nước rửa bã từ thiết bị lọc chuyển vào nồi houblon hoá. Khi dịch đường vừa lấp đáy nồi thì bắt đầu cung cấp nhiệt để nhiệt độ dịch đường luôn giữ ở 750C, đồng thời cho 1/2 lượng hoa viên vào để lấy chất đắng. Sau khi dịch đường và nước rửa bã chuyển hết vào nồi houblon thì tiến hành nâng nhiệt đến nhiệt độ sôi. Giữ sôi 30 phút rồi cho 1/2 lượng hoa viên còn lại vào nhằm lấy chất đắng, tạo hương và kết lắng protein. Trước khi kết thúc quá trình houblon hoá 30 phút thì cho hoa nguyên cánh vào để tạo hương vị đặc trưng của bia. Tổng thời gian đun sôi là 120 phút. Sau khi đun sôi xong, dịch đường được bơm sang thiết bị lắng trong. Ø Tách bã hoa: Sau khi đun sôi xong, dịch đường được chuyển sang thùng lọc bã hoa để tách dịch đường ra ngoài, còn bã thì được giữ lại bên trong. Sau khi giải phóng hết dịch đường, thiết bị houblon hoá được tráng qua nước nóng, nước nóng này dùng để rửa bã hoa, nước rửa bã được dùng vào việc đường hoá mẻ sau hoặc bổ sung vào dịch đường ở phân đoạn nấu bia. Bã được thu gom và chuyển ra ngoài như một loại phế thải. Dịch đường nóng nhờ bơm ly tâm chuyển đến thiết bị lắng trong và làm lạnh. 6. Lắng trong và làm lạnh. Ø Mục đích: Hạ nhiệt độ dịch đường đến nhiệt độ lên men, kết tủa các huyền phù và bão hoà oxi cho dịch đường. Ø Tiến hành: Đảm bảo thiết bị kín, vô trùng, tiến hành nhanh. Tiến hành lắng trong trong thiết bị whirlpool và làm lạnh bằng thiết bị làm lạnh bản mỏng với chất tải lạnh là glycol. Thiết bị whirlpool có ưu điểm là đảm bảo vô trùng vì dịch đường khi đưa vào thiết bị cũng như ra khỏi thiết bị ở nhiệt độ rất cao (khoảng 900C) và thời gian lắng chỉ khoảng 20 phút. Dịch đường vào thiết bị ở nửa phần dưới và theo phương tuyếp tuyến với vận tốc khoảng 10 ÷ 14 m/s, dịch đường sẽ chuyển động tròn trong thiết bị, các kết tủa sẽ lắng xuống tâm của thiết bị. Sau khi để lắng 20 phút, dịch trong được đưa đi làm lạnh đến nhiệt độ lên men, còn cặn được loại bỏ. Tại thiết bị làm lạnh, dịch lên men nóng tiến hành trao đổi nhiệt gián tiếp với glycol, nhiệt độ của dịch đường hạ dần xuống khoảng 90C, thời gian làm lạnh không vượt quá 1 giờ. Bổ sung oxy nhằm mục đích bổ sung một lượng oxi thích hợp để tạo điều kiện hiếu khí cho nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Cần phải khống chế hàm lượng oxi 6 – 8 g/lít nước nha. 7. Lên men chính. Ø Mục đích: Chuyển hoá các chất đường và dextrin thấp phân tử trong nước nha thành C2H5OH, CO2. Đồng thời, còn tạo ra các sản phẩm phụ như este, axit hữu cơ, rượu bậc cao, aldehyt, glyxerin … hoà tan vào dịch lên men tạo thành bia non. Tiến hành: Dịch lên men sau khi làm lạnh được bổ sung không khí vô trùng (khoảng 8mg O2/lít dịch đường) rồi đưa vào thùng lên men. Dịch men giống được chuyển vào thùng lên men theo luồng dịch đường với tỷ lệ 1 lít men giống đặc/100 lít dịch lên men nhằm tạo điều kiện cho nấm men tiếp xúc tốt với môi trường. Nhiệt độ lên men chính là 90C, áp suất dư trong thiết bị lên men chính là 0,2 ÷ 0,4at, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ hoà tan vào bia non một phần. Độ hoà tan của CO2 vào bia non sẽ tăng khi nhiệt độ giảm, do đó để đảm bảo lượng CO2 hoà tan trong bia nhiều thì nhiệt độ thời kỳ cuối của quá trình lên men khoảng 50C, hàm lượng CO2 trong bia non phải đạt 0,2%. Thời gian lên men chính phụ thuộc vào nồng độ dịch lên men đầu tiên và nhiệt độ lên men. Lên men chính được xem là kết thúc khi chất chiết trong dịch lên men giảm đi từ 0,15÷0,2% ngày đêm. Đối với dịch lên men có nồng độ 16% thì thời gian lên men chính chọn 9 ngày. Ø Nấm men bia: Có 2 chủng: + Saccharomyces cerevisiae: thuộc loại lên men nổi + Saccharomyces carlsbergensis: thuộc loại lên men chìm Nhà máy sử dụng chủng nấm men chìm, quá trình lên men xảy ra trong lòng môi trường, khi lên men xong các tế bào kết thành chùm lắng xuống đáy. Do đó, bia chóng tự trong hơn so với lên men nổi. Dịch lên men có nồng độ khá cao nên yêu cầu chủng nấm men có khả năng chịu được áp suất thẩm thấu lớn. Ø Các quá trình cơ bản xảy ra khi lên men chính: Ø Quá trình sinh lý: Xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Trong giai đoạn này do dịch đường có khí oxi, nấm men hô hấp hiếu khí tăng sinh khối, tổng hợp enzyme. Ø Quá trình sinh hóa: Xảy ra cuối quá trình sinh lý khi trong dịch đường không còn khí oxi, nấm men trở sang hô hấp kị khí. Trong quá trình sinh hóa có các quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khác để tạo ra các sản phẩm thứ cấp như glycerin, andehyt, rượu bậc cao, diacetyl. Quá trình lên men đường thành rượu etylic va dioxide cacbon. C6H12O6 → C2H5OH + CO2 + Q. Các lọai đường khác nhau thì tốc độ lên men khác nhau: - Hecxose: Glucose, fructose là đường lên men khởi động. - Disaccharide: maltose, saccharose lên men chính. - Maltotniose: Đường có 3 gốc glucose lên men chậm hơn, lên men phụ ủ chín bia. Quá trình hình thành và chuyển hóa các hợp chất thứ cấp: Mùi bơ trong bia là do 80% diacetyl và 20% các Vicinal Diketon gây ra. Diacetyl nguyên chất là chất lỏng không màu hoặc có màu vàng nhạt có mùi hôi mạnh tác động nhiều đến hệ thần kinh. Với hàm lương > 0,1ppm gây ra mùi vị khó chịu cho bia. Do vậy bia có hàm lượng diacetyl < 0,1ppm là đạt yêu cầu. Đường bậc cao: Không tan trong nước, có dạng như dầu có mùi hôi do vậy còn có tên là dầu fusel. Nhìn chung đường bậc cao có ảnh hưởng không tốt đặc biệt khi hàm lượng lớn hơn 100mg/lít. Andehyl: Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Gây mùi bia non không thơm dịu, trong quá trình ủ chín bào tử bia thì hàm lượng andehyt giảm dần. Các biến đổi lý hóa khác: Giảm pH: pH trong quá trình lên men giảm dần, trước khi lên men pH = 5,2 – 5,6, sau khi lên men pH = 4,2 – 4,6. Giảm độ màu: (EBC) Trong quá trình lên men độ màu giảm khoảng 3EBC do pH giảm và so tế bào nấm men phát triển hấp thụ màu. Sự tạo bọt: Là hệ khí trong lỏng, trong quá trình lên men tạo CO2 và tạo thành bọt. Protein kết hợp với acid đắng làm bền bọt. 8. Lên men phụ và tàng trữ bia non: Ø Mục đích: Tiếp tục lên men phần đường còn lại sau khi lên men chính, bão hoà CO2 và tăng cường mùi vị cho bia. Thực hiện quá trình chín của bia (ổn định chất lượng bia). Ø Tiến hành: Quá trình lên men phụ được tiến hành trong các thùng kín đặt trong phòng lạnh từ 1 ÷ 20C. Nhiệt độ lên men phụ khoảng 10C, áp suất dư 0,3 ÷ 0,7 at. Trong quá trình lên men phụ cần theo dõi áp suất trong thiết bị lên men, mức độ trong của bia, nhiệt độ trong phân xưởng. Bia non được chuyển vào từ đáy thiết bị nhằm giảm sự tạo bọt và giảm mất mát CO2. Đầu tiên có thể cho bia chảy nhanh nhưng về sau do có sự tạo bọt nên cho bia chảy gián đoạn. Khi bia non đã đầy thùng bắt đầu thải không khí trên bề mặt bia non. Để đảm bảo bia thành phẩm có chất lượng như nhau về màu sắc, mùi vị cũng như thành phần hoá học thì bia non từ một thùng lên men chính có thể chuyển vào nhiều thùng lên men phụ. Quá trình chuyển bia non vào thiết bị lên men phụ có thể tiến hành từ từ và kéo dài 1 ÷ 2 ngày đêm. Tuy nhiên, sau 2 ngày đêm thì thùng lên men phụ cần phải chứa đầy bia non nếu không thì dễ bị nhiễm vi sinh vật và sự bão hoà CO2 khó do sự bốc hơi của nó. Khi bia chứa đầy thùng thì đóng van điều chỉnh áp suất, tiến hành thải không khí trên bề mặt bia và nâng áp suất đạt theo yêu cầu. Quá trình nâng cao áp suất kéo dài 1 ÷ 3 ngày kể từ lúc chuyển xong bia non vào. Nếu nâng áp suất quá nhanh thì không khí trên bề mặt bia sẽ hoà tan vào bia và oxy không khí sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng bia thành phẩm. Thời gian lên men phụ là 40 ngày. Sau khi lên men phụ bia được chuyển vào thùng chứa và đem đi lọc. Trong giai đoạn ủ chín bia các quá trình oxi hóa khử có ý nghĩa rất quan trọng vì nhờ các quá trình này mà lượng diacetyl có thể giảm đi 50%. Cũng ở giai đoạn ủ chín bia này, một số tế bào nấm men chết và tự phân bởi các enzyme protease. Sản phẩm tự phân là các peptid, các axitamin, vitamin và một vài thành phần của axit nucleic, các enzyme trong đó chủ yếu là nhom peptidase và protease. Chính các sản phẩm tự phân của nấm men có ảnh hưởng nhiều đến hương vị của bia. Nếu quá trình công nghệ diễn ra bình thường, lượng nấm men tự phân vừa phải thì các sản phẩm này có lợi ngược lại nếu có quá nhiều tế bào tự phân thì mùi vị bia sẽ không bình thường thậm chí hơi khó chịu. Một trong các phương pháp phổ biến thường được dùng để nâng cao độ bền của bia là xử lý bia bằng các enzyme và các chất ổn định khác. Phương pháp đơn giản và có hiệu quả cao là dùng các chế phẩm enzyme để phân huỷ các chất protein có trong bia. Chế phẩm protease được đưa vào trong bia trong giai đoạn lên men phụ, ủ chin bia hoặc ngay trong khâu lọc sẽ làm giảm hàm lượng các chất protein cao phân tử xuống mức tối thiểu. Nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficip, chế phẩm protease nấm sợi và papain đều có tác dụng rất tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia. Do đó papain thường được ứng dụng nhiều hơn cả. Khi tiến hành lên men phụ, người ta thường cho papain vào, kết quả của những tác động của papain, dịch bia trở nên trong hơn và quá trình bảo quản bia, chất lượng bia không thay đổi. Sau khi tàng trữ, vị bia trở nên mềm và dịu hơn. Sự tự phân của nấm men và dưới tác dụng của enzyme protease đã sinh ra các sản phẩm như peptide, aminoaxit, các vitamin đã có ảnh hưởng tốt đến chất lượng của bia. sự kết tủa của nấm men đã làm mất đi dư vị của chúng, còn sự keo tụ và lão hoá nhựa houblon đã làm nên dư vị đắng của bia. 9. Lọc trong bia: 9.1. Mục đích: Để loại bỏ các hạt nhỏ bé như: tế bào nấm men, protein, các huyền phù … làm cho bia đạt được độ trong đúng yêu cầu chất lượng, ổn định và tăng độ bền sinh học, hoá học cho bia. 9.2. Tiến hành: Bia được lọc bằng thiết bị lọc khung bản với chất trợ lọc là bột diatomit. Đầu tiên, bột diatomit được trộn với nước vô trùng theo một tỷ lệ nhất định và tạo thành một dung dịch huyền phù, sau đó dung dịch huyền phù được bơm vào máy lọc ép để tạo một lớp diatomit trên vải lọc. Tiếp theo, bia được lọc qua lớp diatomit này, bia lúc đầu còn đục nên phải trở lại thùng tiếp liệu. Áp suất lọc của thiết bị là 1,2 ÷ 1,3 at. Nếu vượt khỏi 3 at thì lớp vải lọc có thể bị rách. 10. Ổn định bia sau khi lọc: Sau khi lọc thì hàm lượng CO2 trong bia bị giảm. Do đó, để khôi phục lại sự bão hoà CO2 trong bia thì sau khi lọc, bia được giữ trong thùng chứa ở nhiệt độ 0,5 ÷ 10C dưới áp suất của CO2 là 0,5 at và thời gian tối thiểu là 4 giờ. Hàm lượng CO2 trong bia thành phẩm phải đạt ít nhất là 0,3% khối lượng. Nếu chưa đạt được yêu cầu thì phải bổ sung CO2 cho bia. 11. Chiết chai. 11.1 Mục đích: Để thuận tiện cho việc tiêu thụ, vận chuyển, bảo quản thì rót bia vào chai thuỷ tinh màu sẫm hoặc lon. 11.2 Tiến hành. Yêu cầu chai và lon: đảm bảo độ bền cơ học, loại chai thường phải có màu. Trước khi rót, chai được rửa và sát trùng kỹ bằng nước nóng 750C và dung dịch NaOH 2% có bổ sung stabilon để làm bóng chai. Sau đó, chai được làm nguội rồi rót bia vào. Bia rót trong điều kiện đẳng áp để tránh tổn thất CO2 và tránh trào bọt gây tổn thất sản phẩm. Dây chuyền chiết bia được cơ giới hoá hoàn toàn và bao gồm các công đoạn sau: rửa chai, kiểm tra chai, chiết bia vào chai, đóng nắp chai, kiểm tra độ kín của chai bia thành phẩm, thanh trùng bia, hoàn thiện sản phẩm. 12. Thanh trùng. 12.1. Mục đích: Thanh trùng bia để tăng độ bền cho bia. Trong điều kiện thanh trùng, phần lớn các vi sinh vật, nấm men bia sót lại bị tiêu diệt, các vi sinh vật chịu nhiệt bị yếu đi và mất khả năng sinh sản. 12.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thanh trùng. Loại vi sinh vật: Các loại vi sinh vật khác nhau chịu nhiệt độ khác nhau. Số lượng vi sinh vật: Vi sinh vật càng nhiều thì thời gian thanh trùng càng lâu. pH thấp thì khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật càng kém. 12.3. Những biến đổi xảy ra khi thanh trùng. Khi thanh trùng bia, áp suất bia tăng dễ làm chai nứt vỡ, có thể xảy ra phản ứng melanoid làm cho bia bi sẩm màu. Thanh trùng có thể gây đục bia. Thay đổi về mùi vị của bia, đặc biệt là khi bia bị oxi xâm nhập. 12.4. Tiến hành. Nhà máy sử dụng thanh trùng kiểu tunel phun tuyến tính với thời gian thanh trùng là 45 phút ở 630C. Các vùng nhiệt độ mà bia phải đi qua là: 290C, 350C, 450C, 630C, 450C, 350C và 290C. 13. Giới thiệu một số sản phẩm bia. Hình 1.40. Một số sản phẩm bia KẾT LUẬN Với việc nghiên cứu “ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” mong muốn đưa đến cho bạn đọc những thông tin bổ ích từ việc chiết tách và ứng dụng của enzyme trong đời sống cũng như trong sản xuất bia. Qua quá trình tìm hiểu này còn tồn tại nhưng vấn đề, em mong muốn thầy cô và các bạn tìm hiểu và đóng góp thêm ý kiến để quy trình được hoàn thiện hơn. Việt nam chỉ bước đầu ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất nên việc nghiên cứu và ứng dụng của enzyme là việc cần được chú ý và đầu tư hơn nữa. Những khó khăn gặp phải trong quá trình làm đề tài. Trong quá trình làm đề tài em gặp rất nhiều khó khăn, chủ yếu là vấn đề tìn tài liệu. Các loại tài liệu liệu liên quan về ứng dụng của enzyme protease trên sách báo nói rất ít và tài liệu đã không còn mới… tài liệu tham khảo trên internet nói rất ít, và chỉ nói ngoài rìa chứ không đi sâu vào vấn đề. Ngoài ra trong quá trình lưu giữ tài liệu cũng găp rất nhiều khó khăn như: mất USB, bị virus ăn hay sự cố cúp điên trong khi làm bài. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn cô Hồ Thị Tuyết Mai đã hướng dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình làm đồ án. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng. [2]. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. [3]. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [4]. Lưu Thị Nguyệt Minh (2007), “Phân tách Protease của Bacillus Subtilis bằng hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp. [5]. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên),(2004), Công Nghệ EnZyme, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. [6]. Công nghệ lên men. Bùi ái (chủ biên). [7]. Vũ Ngọc Bội (2004), luận án tiến sĩ sinh học: “Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme Protease từ B.subtilis S5”, Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. [8]. Hồ Thị Tuyết Mai(2006), bài giảng Công nghệ E, Trường Cao Đẳng Lương Thực Thực Phẩm. [9]. enzyme Vi Sinh Vật, tập 1, Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 1982. [10]. Tạp chí sinh học, tập2(2)-2006: “Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Protease của chủng Serratia sp. DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi viện CNSH. [11]. Tạp chí sinh học, tập4(2)-2006: “ Xác định một số tính chất hóa lý của Protease chủng Serratia sp. DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Hương viện CNSH, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội. [12]. Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập9, số11- 2006. [13]. Tạp chí Công nghệ sinh học, tập5, số2- 2007. [14]. Tạp chí Công nghệ sinh học, tập5, số3- 2007. Tài liệu tham khảo internet. [1]. [2]. [3]. [4]. MỤC LỤC Mở đầu Trang 1 Chương 1: Tổng quan về enzyme protease Trang 2 1. Tổng quan về enzyme protease Trang 2 1.1. Giới thiệu chung Trang 2 1.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Trang 3 1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease Trang 5 2. Nguồn thu nhận protease Trang 6 3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật Trang 7 3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme protease có hoạt lực cao Trang 7 3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme protease Trang 8 3.2.1. Nguồn cacbon Trang 8 3.2.2. Nguồn Nitơ Trang 8 3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng.....Trang 9 3.3. Nuôi cấy thu nhận phế phẩm enzyme protease bằng phương pháp bề mặtTrang 9 3.4. Thu nhận enzyme Trang 11 3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme ...................................................Trang 11 4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae .............Trang 14 4.1. Quy trình thu nhận ...................................................................................Trang 14 4.2. Thuyết Minh Quy Trình và đề xuất thiết bị..............................................Trang 15 4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae ..Trang 15 4.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy .. Trang 15 4.2.3. Thu nhận sản phẩm .. Trang 16 4.2.4. Đề xuất thiết bị .. Trang 18 5. Tình hình nghiên cứu enzyme protease.............................................................Trang 20 5.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước .................................Trang 20 5.2. Vấn đề sản xuất enzyme protease trên thế giới .........................................Trang 22 Chương 2: Đối tượng nghiên cứu và thiết bị Trang 2

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docloi_mo_dau_da_chinh_sua_4923.doc