Khảo sát độc tính bán trường diễn và tác dụng kháng viêm, giảm đau của cao phối hợp thiên niên kiện và bách bệnh trên thực nghiệm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 156 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM, GIẢM ĐAU CỦA CAO PHỐI HỢP THIÊN NIÊN KIỆN VÀ BÁCH BỆNH TRÊN THỰC NGHIỆM Phan Phước Hiền*, Nguyễn Thị Thu Hương**, Lê Thị Mỹ Thảo**, Dương Thị Mộng Ngọc** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Thiên niên kiện (Homalomena occulta) thường được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với các dược liệu khác để giảm các triệu chứng đau nhức và giúp tăng cường thể lực. Cây Bách bệnh (Erycoma longifolia) được sử dụng với tác dụng chống oxy hóa, tăng cường thể lực và sức khỏe tình dục cho nam giới. Với mục đích ứng dụng hai cây thuốc này trong việc bảo vệ sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống cho đối tượng người cao tuổi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát độc tính bán trường diễn và tác dụng kháng viêm, giảm đau của cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh trên chuột nhắt trắng”. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát in vitro hoạt tính ức chế peroxid hóa lipid của cao phối hợp được thực hiện bằng thực nghiệm malonyl dialdehyd trên não chuột. Khảo sát in vivo gồm khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đường uống, khảo sát tác dụng kháng viêm cấp của cao phối hợp trên chuột nhắt trắng bằng thực nghiệm carragenin và khảo sát tác dụng giảm đau bằng thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic. Kết quả: Cao phối hợp Thiên niên kiện-Bách bệnh thể hiện hoạt tính ức chế peroxid hóa lipid với IC50 là 751,5 µg/ml. Cao phối hợp có thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng với liều LD0 = 21,5g cao/kg thể trọng chuột. Cao phối hợp ở liều 2,15 g/kg (liều tương đương 1/10 LD0) sau 2 tháng uống không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Các thông số về huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc về chức năng gan - thận đều nằm trong giới hạn bình thường. Cao phối hợp ở hai liều uống 1,075 g/kg và 2,15 g/kg có tác dụng giảm đau. Tác dụng kháng viêm của cao phối hợp tăng theo thời gian sử dụng thuốc và đạt tối đa ở thời điểm 72 giờ kháng viêm. Kết luận: Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có thể định hướng nghiên cứu thành dạng chế phẩm phù hợp (viên nang hoặc rượu thuốc) trong hỗ trợ điều trị các loại bệnh mạn tính ở người cao tuổi như đau nhức xương khớp hoặc tăng cường thể trạng tổng quát. Từ khóa: Thiên niên kiện, Bách bệnh, hoạt tính ức chế peroxid hóa lipid, độc tính bán trường diễn, tác dụng kháng viêm, tác dụng giảm đau ABSTRACT STUDY ON SUBCHRONIC TOXICITY, ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC EFFECTS OF COMBINED EXTRACT OF HOMALOMENA OCCULTA AND EURYCOMA LONGIFOLIA ON EXPERIMENTATION Phan Phuoc Hien, Nguyen Thi Thu Huong, Le Thi My Thao, Duong Thi Mong Ngoc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 156 - 163 Aim of study: Homalomena occulta rhizome has been used in traditional medicine as single or combined form of herb with tonic and analgesic purposes. Erycoma longifolia root was used as antioxidants, tonic and androgenic drug. The present study was conducted in the aim of evaluating the acute and subchronic toxicity, the anti-inflammatory and analgesic effects of the combined extract of Homalomena occulta and Erycoma longifolia. ∗ Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh ∗∗ Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: PGS.TS. Phan Phước Hiền ĐT: 0945734433 Email: pphien@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 157 Materials and Methods: Anti-lipid peroxidation activity of the combined extract was determined by malonyl dialdehyde test using mouse brain as substrate. Oral acute toxicity test and subchronic toxicity test were carried out to evaluate the safety of the combined extract. Carrageenan-induced acute inflammatory model and acetic acid-induced abdominal pain in mice were performed to determine anti-inflammatory and analgesic effects of the combined extract. Results: The combined extract showed anti-lipid peroxidation activity with IC50 of 751.5 µg/ml. The combined extract had oral acute toxicity at the infralethal dose of 21.5 g/kg mouse body weight. After 2-month treatment of the combined extract at the dose of 2.15 g/kg (equal to 1/10 of infralethal dose), there were no abnormal changes in hematological and biochemical parameters, indicating that the combined extract did not show subchronic toxicity. The combined extract at doses of 1.075 g/kg and 2.15 g/kg mouse body weight had anti- inflammatory and analgesic effects. The anti-inflammatory effect of the combined extract was time-dependent and reached the highest effect after 72 hrs of treatment. Conclusion: The results of this study (combined extract of Homalomena occulta and Erycoma longifolia) might be useful for further study on natural drugs used in supporting the treatment of chronic conditions of elderly people as osteoarthritis and enhancing physical strength. Keywords: Homalomena occulta, Erycoma longifolia, anti-lipid peroxidation activity, subchronic toxicity, anti-inflammatory effect, analgesic effect ĐẶT VẤN ĐỀ Đau nhức xương khớp đã dần trẻ hóa thấy rõ nhất ở những người làm việc văn phòng và lao động khuân vác nặng nhọc, gây khó chịu, mệt mỏi đau đớn kéo dài. Người bệnh có thể phải ngồi một chỗ, không thể tự thực hiện được các sinh hoạt hàng ngày và phát sinh các bệnh khác. Bệnh đau nhức xương khớp ít nhiều ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sống, hiệu quả của công việc và gây tổn thất kinh tế cho người bệnh và xã hội. Việc lạm dụng các thuốc giảm đau, đặc biệt là các chế phẩm có corticoid, khiến cho bệnh nhân có thể có rất nhiều tai biến (tổn thương dạ dày, tá tràng, tăng huyết áp, đái tháo đường, loãng xương, nhiễm khuẩn, suy thượng thận...). Theo xu hướng hiện nay thì con người đã hạn chế sử dụng các thuốc nhóm này và thay thế bằng các loại thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên. Trong dân gian người dân thường sử dụng Thiên niên kiện (Homalomena occulta) riêng lẻ hoặc kết hợp Thiên niên kiện với các loại thuốc để giảm các triệu chứng đau nhức và giúp tăng cường thể lực (7). Cây Bách bệnh (Erycoma longifolia) được sử dụng với tác dụng tăng cường sức khỏe tình dục cho nam giới (1,7). Với mục đích ứng dụng hai cây thuốc này trong việc bảo vệ sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống cho đối tượng người cao tuổi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát độc tính bán trường diễn và tác dụng kháng viêm, giảm đau của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách trên chuột nhắt trắng”. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cao phối hợp được phối chế từ cao chiết Thiên niên kiện (65,45%) và cao chiết Bách bệnh (34,55%). Cao được tiêu chuẩn hóa theo các quy định của Dược điển Việt Nam IV và tiêu chuẩn cơ sở. Độ ẩm của cao Thiên niên kiện là 17,8%, hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao Thiên niên kiện là: 1,49%, hàm lượng coumarin toàn phần trong cao Thiên niên kiện là: 6,71%. Độ ẩm của cao Bách bệnh là 16,42%, hàm lượng alkaloid toàn phần trong cao Bách bệnh là: 0,75%, hàm lượng coumarin toàn phần trong cao Bách bệnh là: 22,85%. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 25 g ± 2 g) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, nuôi trong điều kiện ổn định về Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 158 chế độ dinh dưỡng. Hóa chất-Thuốc đối chiếu Carragenin (Sigma-Aldrich, USA), Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), Aspirin pH8 (viên bao phim, chứa acid acetylsalicylic 500 mg, Mekophar), Celebrex® (viên nang chứa celexcocib 200 mg, Pfizer). Các bộ kit định lượng protein toàn phần, triglyceride, urea, creatinin, GOT, GPT được cung cấp bởi hãng Human, Đức. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipid (2). 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não và thêm đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ 100oC. Làm lạnh và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 532 nm. Trolox, đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu. Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100 Trong đó, ODC: Mật độ quang của chứng dung môi và ODT: Mật độ quang của mẫu thử. Thử nghiệm độc tính cấp (3, 6) Chuột nhắt chia thành các lô tương tự, những chuột ở cùng một lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống để ghi nhận những triệu chứng bất thường (nếu có). Khảo sát độc tính bán trường diễn(6) Thời gian thử nghiệm độc tính bán trường diễn được thực hiện trên chuột nhắt trắng là hai tháng. Chuột được chia thành các lô chứng (uống nước cất) và lô thử (uống cao phối hợp), mỗi lô 12 con. Các chỉ tiêu quan sát sau 1 tháng và 2 tháng: - Huyết học: Số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, tiểu cầu, tỷ lệ thể tích huyết cầu trong máu (hematocrit), hemoglobin. - Thông số thuộc chức năng gan: Men gan transaminase GOT và GPT. - Thông số thuộc chức năng thận: Creatinin, urea. - Các thông số khác: Triglycerid, protein - Giải phẫu đại thể-vi thể các cơ quan: Tim, gan, thận: tiến hành sau khi kết thúc thí nghiệm. Thực nghiệm gây phù chân chuột bằng carragenin-Khảo sát tác dụng kháng viêm cấp(6, 8). Chuột được chia thành các lô với số lượng 10 chuột và được cho uống nước cất (lô chứng) hoặc thuốc thử nghiệm (lô thử, lô thuốc đối chiếu celecoxib) 30 phút trước khi tiêm carragenin 1% (50 µl) vào gang bàn chân phải của chuột. Do không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê thể tích chân chuột phải và trái nên đề tài chọn chân trái (không tiêm carrageenin) làm lô đối chứng. Mẫu thử nghiệm được tiếp tục cho uống mỗi ngày liên tục trong 3 ngày sau khi tiêm carragenin và 1 giờ trước khi đo thể tích chân chuột. Để đánh giá mức độ viêm, đo thể tích chân chuột bằng thiết bị đo thể tích chân chuột (Plethysmometer của UgoBasile, Italy) vào các thời điểm sau khi tiêm carragenin 3 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Tiến hành đo 2 lần và lấy trị số trung bình. Độ sưng phù chân chuột biểu thị mức độ viêm và được tính theo công thức: Mức độ giảm viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm so với lô chứng được tính theo công thức: % V = x 100 Số đo thể tích chân trái Số đo thể tích chân phải – số đo thể tích chân trái Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 159 % ức chế = (X – Y)/X *100 X: mức độ viêm chân chuột ở lô chứng. Y: mức độ viêm chân chuột ở lô đối chiếu, hoặc lô thử nghiệm. Thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic để khảo sát tác dụng giảm đau (6). Chuột được cho uống nước cất (lô chứng) hoặc cao thử nghiệm (lô thử) hàng ngày trong 7 ngày và 60 phút trước khi tiêm phúc mô acid acetic 0,6% vào ngày 7. Sau 10 phút, ghi nhận số lần xoắn bụng do đau của súc vật thử trong từng thời gian 10 phút gồm 3 giai đoạn: 1 - 10 phút, 11 - 20 phút, 21 - 30 phút và tổng số lần xoắn bụng trong 30 phút. Thuốc đối chiếu Aspirin pH8 được cho uống liều duy nhất 200 mg/kg, 60 phút trước khi tiêm phúc mô acid acetic. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Số liệu thực nghiệm thể hiện bằng số trung bình (M) ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2007, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One– Way ANOVA và Student-Newman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat-98). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05 so với lô chứng tương ứng. KẾT QUẢ Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thực nghiệm MDA Bảng 1: Hoạt tính chống oxy hóa của cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh. Mẫu Nồng độ (µg/ml) OD1 OD2 ODtb HTCO(%) Chứng 0 0,421 0,557 0,4890 - Cao phối hợp 2000 0,099 0,107 0,1030 78,94 1000 0,167 0,208 0,1875 61,66 500 0,312 0,303 0,3075 37,12 250 0,347 0,341 0,3440 29,65 125 0,412 0,399 0,4055 17,08 62,5 0,457 0,413 0,4350 11,04 Từ bảng kết quả 1, thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0513x + 11.448 và xác định được IC50 của cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh là 751,5 µg/ml. Tuy nhiên, khi so sánh với chứng dương Trolox (IC50 là 562,7 µg/ml), hoạt tính của cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh thấp hơn. Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống Cao phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh có thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng. Sau khi uống cao phối hợp ở liều 25 g/kg (liều cao nhất có thể bơm qua kim) chuột có biểu hiện đầu tiên là gãi mõm liên tục, hoạt động chậm, lông hơi xù, khó thở khoảng 2 – 3 giờ. Sau 8 - 24 giờ thấy xuất hiện chuột chết (tỉ lệ chuột chết 60 %). Sau 72 giờ cho uống, số chuột sống sót vẫn ăn uống và sinh hoạt bình thường. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nhận các triệu chứng bất thường. Liều dưới liều chết LD0 của cao phối hợp được xác định là 21,5g cao/kg thể trọng chuột. Liều tương đối an toàn Ds trên chuột nhắt trắng có thể được lấy giá trị bằng 1/5-1/10 LD0. Liều tương đối an toàn trên người được ngoại suy từ liều trên chuột nhắt trắng như sau: Liều trên chuột nhắt trắng x 0,085 (= hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa chuột nhắt trắng và người) x thể trọng trung bình ở người trưởng thành (# 50 kg). Do đó, liều thử nghiệm được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo: 1/10 LD0 = 2,15 g/kg và 1/20 = 1,075 g/kg LD0. Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn Chuột được thử nghiệm là chuột đực 6 tuần tuổi, đang trong giai đoạn tăng trưởng và phát triển để chuyển sang giai đoạn trưởng thành (5,4) nên các thông số hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, protein, creatinin của lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, 2 tháng đều tăng so với trước thử nghiệm. Các thông số trở nên ổn định hơn sau 1 tháng và sau 2 tháng (Bảng 2). Lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg có tác dụng làm tăng hồng cầu so với lô chứng sau 1 tháng. Có thể giải thích Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 160 rằng cao thuốc có thể làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của chuột thử nghiệm, gián tiếp làm tăng tốc độ trưởng thành của hồng cầu dẫn đến tăng số lượng hồng cầu hơn so với lô chứng(4). Số lượng tiểu cầu, bạch cầu ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg ở mức bình thường. Hàm lượng GOT, GPT, protein, triglycerid và creatinin ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Hàm lượng urea khi uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg giảm so với lô chứng sau 2 tháng. Lượng urea thấp có thể là do quá trình khử acid amin trong cơ thể ở chuột uống cao thuốc thấp hơn lô chứng. Kết quả giải phẫu đại thể-vi thể các cơ quan tim, gan, thận đều không có sự khác biệt giữa lô uống cao phối hợp và lô chứng uống nước cất. Như vậy, cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 2,15 g/kg (liều tương đương 1/10 LD0) sau 2 tháng uống không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Các thông số về huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc về chức năng gan - thận đều nằm trong giới hạn bình thường(5). Bảng 2: Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn của cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh. Chỉ tiêu khảo sát Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Hồng cầu (triệu tế bào/µl) Chứng 5,10 ± 0,19 6,64 ± 0,42 a 6,23 ± 0,22 a Cao phối hợp 5,17 ± 0,14 8,43 ± 0,20 ab 6,39 ± 0,24 a Hemoglobin (g/dl) Chứng 7,59 ± 0,75 11,12 ± 0,65 a 11,37 ± 0,71 a Cao phối hợp 7,40 ± 0,10 13,35 ± 0,37 ab 10,75 ± 0,31 a Hematocrit(%) Chứng 27,90 ± 0,76 34,70 ± 1,72 a 29,65 ± 1,46 Cao phối hợp 28,65 ± 0,67 43,20 ± 1,37 ab 31,10 ± 1,01 Tiểu cầu 103 tế bào/µl) Chứng 533,9 ± 41,4 513,1 ± 40,8 472,0 ± 62,1 Cao phối hợp 535,0 ± 30,7 417,0 ± 21,0a 418,0 ± 56,8 Bạch cầu (tế bào/µl) Chứng 5050 ± 456,1 5800 ± 366,7 4900 ± 541,6 Cao phối hợp 5500 ± 258,2 5150 ± 428,5 4850 ± 494,7 GOT (IU/l) Chứng 48,6 ± 5,2 40,1 ± 2,0 38,1 ± 3,5 Cao phối hợp 45,1 ± 0,9 41,8 ± 1,8 36,6 ± 2,8 a GPT (IU/l) Chứng 45,9 ± 3,4 47,6 ± 2,3 44,0 ± 3,3 Cao phối hợp 45,8 ± 1,6 47,0 ± 2,5 43,0 ± 2,7 Protein toàn phần (g/l) Chứng 4,94 ± 0,14 5,16 ± 0,19 5,06 ± 0,19 Cao phối hợp 4,55 ± 0,16 5,26 ± 0,12 a 5,28 ± 0,14 a Triglycerid (mg/dl) Chứng 113,8 ± 10,3 113,5 ± 4,8 121,0 ± 8,9 Cao phối hợp 107,7 ± 10,4 119,6 ± 4,6 121,6 ± 6,2 Creatinin (mg/dl) Chứng 0,50 ± 0,03 0,77 ± 0,06 a 0,71 ± 0,04 a Cao phối hợp 0,50 ± 0,04 0,70 ± 0,04 a 0,81 ± 0,03 a Urea (mg/dl) Chứng 52,46 ± 3,32 50,51 ± 2,29 51,72 ± 1,34 Cao phối hợp 51,34 ± 1,47 47,99 ± 3,83 44,27 ± 3,01 ab Thể trọng (g) Chứng 24,10 ± 0,23 30,90 ± 1,93 35,80 ± 1,76 Cao phối hợp 25,30 ± 0,33 29,20 ± 1,16 34,30 ± 1,78 a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm; b: P < 0,05 so với lô chứng Kết quả khảo sát tác dụng kháng viêm Carragenin (viscarin) là chất sulfopolygalactocid, chiết xuất từ Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm cấp. Mức độ viêm tối đa ở trong khoảng thời gian 3-4 giờ (6). Kết quả thực nghiệm cho thấy độ sưng phù chân chuột tăng tối đa sau 3 giờ tiêm carragenin (đạt 119,9 %) và giảm dần sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi tiêm. Mức độ viêm chân chuột sau 3 giờ tiêm carragenin: Mức độ viêm chân chuột của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 161 liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg, lô đối chiếu uống Celebrex® (celexcocib liều 25 mg/kg) đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Bảng 3). Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg có tác dụng kháng viêm cấp sau 3 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Mức độ giảm viêm ở lô uống cao thử nghiệm giảm từ 22 - 27% so với lô chứng uống nước cất (Bảng 4). Mức độ viêm chân chuột sau 24 giờ tiêm carragenin: Mức độ viêm chân chuột ở lô uống Celebrex® giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Mức độ viêm chân chuột ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không có tác dụng kháng viêm sau 24 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Mức độ viêm chân chuột sau 48 giờ tiêm carragenin: Mức độ viêm chân chuột ở lô uống Celebrex® giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Mức độ viêm chân chuột ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg giảm so với lô chứng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không có tác dụng kháng viêm sau 48 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Mức độ viêm chân chuột sau 72 giờ tiêm carragenin: Mức độ viêm chân chuột của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg, lô đối chiếu uống Celebrex® đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg có tác dụng kháng viêm sau 72 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Mức độ giảm viêm ở lô uống cao thử nghiệm giảm từ 39-40% so với lô chứng uống nước cất. Thuốc đối chiếu Celebrex® liều uống 25 mg/kg ở các thời điểm khảo sát thể hiện tác dụng kháng viêm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Tác dụng kháng viêm tăng theo thời gian sử dụng thuốc và đạt tối đa ở thời điểm 72 giờ (giảm viêm 65,88%). Bảng 3: Mức độ viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm. Lô thử nghiệm N = 12 Mức độ giảm viêm chân chuột (%) Sau 3 giờ Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ Chứng 119,94 ± 8,12 72,47 ± 6,55 64,02 ± 4,80 65,53 ± 7,69 Cao phối hợp 1,075 g/kg 87,22 ± 5,21* 73,44 ± 4,73 60,71 ± 4,59 39,73 ± 6,07* 2,15 g/kg 93,11 ± 5,88* 65,93 ± 7,72 54,89 ± 8,66 40,90 ± 6,54* Celebrex 25 mg/kg 71,67 ± 2,33* 41,82 ± 2,32* 29,47 ± 2,08* 22,36 ± 2,01* * P < 0,05 so với lô chứng tại các thời điểm sau 3 giờ, sau 24 giờ, sau 72 giờ. Bảng 4: Mức độ giảm viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm so với lô chứng. Lô thử nghiệm N = 12 Mức độ giảm viêm chân chuột (%) Sau 3 giờ Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ Cao phối hợp 1,075 g/kg 27,28 -1,34 5,17 39,37 2,15 g/kg 22,37 9,02 14,27 37,59 Celebrex 25 mg/kg 40,25 42,29 53,97 65,88 BÀN LUẬN Bàn luận về tác dụng kháng viêm cấp Ở thời điểm sau 3 giờ gây viêm thì độ sưng phù chân chuột lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh giảm rõ rệt so với lô chứng (liều 1,075 g/kg giảm 32,72%, liều 2,15g/kg giảm 18,83 % so với lô chứng). Tuy nhiên ở thời điểm sau 24 giờ và sau 48 giờ gây viêm thì độ sưng phù ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh không khác biệt so với lô chứng, điều này có thể do có sự giảm đột ngột mức độ viêm so với thời điểm sau khi tiêm carragenin 3 giờ nên cao phối hợp chưa thể hiện rõ hoạt tính kháng viêm. Sau 72 giờ, lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh lại có tác dụng kháng viêm, chứng tỏ cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 162 bệnh có thể có tác dụng kháng viêm mạn tính. Kết quả khảo sát tác dụng giảm đau Thời điểm từ 0 đến phút thứ 10 Số lần xoắn bụng giữa lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Số lần xoắn bụng của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg giảm nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg có tác dụng giảm đau ở phút thứ 0 – 10 sau khi gây đau xoắn bụng bằng acid acetic. Tác dụng giảm đau ở liều 1,075 g/kg tương đương với thuốc đối chiếu aspirin liều 200 mg/kg. Thời điểm từ phút thứ 11 đến phút 20 Số lần xoắn bụng của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg và liều 2,15 g/kg đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg có tác dụng giảm đau ở phút thứ 11 – 20 sau khi gây đau xoắn bụng bằng acid acetic. Tác dụng giảm đau ở liều 1,075 g/kg tương đương với thuốc đối chiếu aspirin liều 200 mg/kg. Thời điểm từ phút thứ 20 đến phút thứ 30 Số lần xoắn bụng của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng với. Số lần xoắn bụng của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg giảm nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. So sánh tổng số lần xoắn bụng trong 30 phút sau khi tiêm Số lần xoắn bụng của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg và liều 2,15 g/kg đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Bảng 5). Bàn luận khảo sát tác dụng giảm đau cấp Cao thử nghiệm thể hiện tác dụng giảm đau đạt ý nghĩa thống kê ở hai liều uống 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg. Mức độ giảm đau là 48,35% ở liều 1,075 g/kg và 22,03% ở liều 2,15 g/kg so với lô chứng uống nước cất. Tác dụng giảm đau của cao thử nghiệm yếu hơn thuốc đối chiếu aspirin (mức độ giảm đau là 59,51%). Mức độ giảm đau xoắn bụng ở lô uống cao thử nghiệm liều 1,075g/kg điển hình hơn liều 2,15g/kg khi ghi nhận chi tiết ở từng giai đoạn 10 phút trong 30 phút. Lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có tác dụng giảm đau cấp trong 30 phút sau khi tiêm acid acetic chứng tỏ cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có thể có tác dụng ức chế các chất trung gian hóa học gây đau. Bảng 5: Kết quả khảo sát tác dụng giảm đau của cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh. Lô thử nghiệm N = 12 Số lần xoắn bụng Tổng số lần xoắn bụng trong 30 phút % giảm đau so với chứng 0-10 phút 11-20 phút 21-30 phút Chứng 24,50 ± 2,66 20,25 ± 1,72 13,50 ± 1,51 58,25 ± 2,76 - Cao phối hợp 1,075 g/kg 17,67 ± 1,15* 8,92 ± 1,32* 4,20 ± 1,04* 30,08 ± 2,00* 48,35 2,15 g/kg 19,08 ± 2,58 15,08 ± 1,54* 11,25 ± 2,20 45,42 ± 3,92* 22,03 Aspirin 200 mg/kg 16,42 ± 1,62* 6,00 ± 1,23* 1,17 ± 0,41* 23,58 ± 2,86* 59,51 * P < 0,05 so với lô chứng KẾT LUẬN Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có biểu hiện độc tính cấp đường uống với liều LD0 là 2,15 g/kg. Cao phối hợp Thiên niên kiện-Bách bệnh liều 2,15 g/kg (liều = 1/10 LD0) sau 2 tháng uống làm tăng số lượng hồng cầu và không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Cao phối hợp Thiên niên kiện-Bách bệnh ở hai liều uống 1,075 g/kg và 2,15 g/kg có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế bào. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 163 Đề tài này được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ Tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ang HH, Nga TH, Tan TH (2003). Effects of Eurycoma longifolia Jack on sexual qualities in middle-aged male rats. Phytomedicine10 (6 - 7): pp. 590 - 593. 2. Cheseman K.H (1985). Studies on lipid peroxidation in normal and tumor tissues, J. Biol. Chem., pp. 235, 507 – 514. 3. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác xác định độc tính cấp của thuốc. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr. 7 - 24. 4. Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng (2000). Sinh lý học người và động vật. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 7 – 91, 187 – 188, 235 – 237. 5. Suckow MA, Danneman P, Brayton C (2001). The laboratory mouse, CRC Press, pp. 18 – 21. 6. Viện Dược Liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 57 – 63, 140 – 141, 171 - 183, 279 – 284, 295, 311 - 313, 355 - 367, 377 - 387. 7. Viện Dược liệu (2007). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tập I, tập II, tr. 116 – 118, 868. 8. Winter CA, Risley EA, and Nuss GW (1962). Carrageenin- induced edema in hind paw of the rat as an assay for antiiflammatory drugs. Proc Soc Exp Biol Med.,111:pp. 544 - 547. Ngày nhận bài báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 02/10/2013, 14/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014