Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa Willd) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

.2.2.1. Hóa chất ly trích DNA HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân. Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC. Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp. Dung dịch gốc. Ethanol 70% Rửa DNA. Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng. Isopropanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối sodium acetate. Dung dịch gốc. Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm. Dung dịch gốc. Isoamyl alcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao. Dung dịch gốc. Hỗn hợp Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng Pha với tỷ lệ 24 thể tích chloroform và 1 thể tích isoamyl alcohol. 30 thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên. EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++. Pha 100 ml: - 18,622 g bột EDTA + 80 ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100 ml. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M=157,6 g/mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH = 8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất. Pha 100 ml: - 15,7 g bột tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100 ml. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA. Pha 100 ml: - 29,25 g NaCl + 100 ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 10X Dung dịch Stock. Pha 100 ml: - 10 ml tris-HCl 1M + 2 ml EDTA 0,5M + 88 ml nƣớc cất 2 lần. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA. Pha 100 ml: 10 ml TE 10X + 90 ml nƣớc cất 2 lần. EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích. Pha 100 ml: - 57 ml nƣớc cất 2 lần + 2 g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho 31 tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28 ml NaCl 5M + 10 ml tris-HCl 1M + 4 ml EDTA 0,5M + 1 ml mercapto ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4 oC, tránh ánh sáng trực tiếp. EB (Extraction Buffer) có thêm PVP 2% Dung dịch ly trích. Pha 100 ml: - 57 ml nƣớc cất 2 lần + 2 g PVP + 2 g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65 oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28 ml NaCl 5M + 10 ml tris-HCl 1M + 4 ml EDTA 0,5M + 1 ml mercapto ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4 oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC. Pha 100 ml: - 24,6 g bột sodium acetate + 100 ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. β-mercapto ethanol Bảo vệ DNA. Dung dịch gốc. 3.2.2.2. Hóa chất kiểm tra định lƣợng DNA - Nƣớc cất 2 lần khử ion (đã hấp khử trùng) - TE 1X 3.2.2.3. Hóa chất thực hiện phản ứng RAPD - Taq buffer - dNTP - Taq DNA polymerase - MgCl2 - Nƣớc cất 2 lần khử ion chiếu tia UV - DNA mẫu - Primer 32 3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả - Agarose - Loading dye 6X - TAE 1X - Ethidium bromide - TAE 0,5X - Nƣớc cất siêu sạch khử ion - Ladder 100 bp (Invitrogen) 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm - Tủ lạnh các loại (Sanyo – Nhật Bản) - Cân điện tử (Ohaus – Mỹ) - Nồi hấp Autoclave (ToMy – Nhật Bản) - Tủ sấy (Jencons - Anh) - Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) - Đầu típ các loại (Đức) - Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản) - Chén và chày giã (Đức) - Máy hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam - Anh) - Máy Vortex (IKA – Đức) - Máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức) - Bồn ủ nhiệt (Memmenrt - Anh) - Lò Viba (Electrolux) - Máy điện di (Biorad) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP – Mỹ) - Máy PCR (PTC 100 - MJ) - Máy chụp ảnh DNA (Biorad – Thụy Điển) 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA Trong đề tài nghiên cứu này, nhằm tìm đƣợc quy trình ly trích DNA tốt nhất từ lá Cóc trắng, chúng tôi tiến hành ly trích DNA tổng số từ lá Cóc trắng theo 3 quy trình: quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1998)) và 2 quy trình ly trích mẫu cải tiến. 3.3.1.1. Quy trình 1 (quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle và Doyle (1988)) Quy trình gồm 11 bƣớc: - Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch, nghiền lá với 1,2 ml dịch trích EB. Vortex thật kỹ. Ủ dịch ở 65oC trong 45 phút. 33 - Bƣớc 2: Thêm 500 µl chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1), Vortex kỹ trong 10 phút, ly tâm 14.000 vòng ở 10oC trong 5 phút. Hút dịch trong. - Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Hút dịch trong. - Bƣớc 4: Thêm 250 µl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở -20oC trong 30 phút (tốt nhất nên để qua đêm). - Bƣớc 5: Ly tâm 14.000 vòng ở 10oC trong 5 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 6: Thêm 300 µl TE 1X, ủ ở 37oC trong 1 giờ. - Bƣớc 7: Thêm 20 µl sodium acetate 3 M và 640 µl ethanol 100%, trộn đều. Để tủa -20oC trong 30 phút. - Bƣớc 8: Ly tâm 14.000 vòng ở 10oC trong 10 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 9: Rửa cặn bằng 400 µl ethanol 70%, ly tâm 14.000 vòng ở 10oC trong 2 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 µl TE 1X, ủ ở 37 oC trong 30 phút. - Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 4oC. 3.3.1.2. Quy trình 2 (quy trình ly trích mẫu cải tiến) Quy trình này dựa trên quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) nhƣng có thay đổi tốc độ và thời gian ly tâm nhằm hạn chế sự đứt gãy của DNA. Quy trình gồm 11 bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: - Bƣớc 1: Cân 0,3 g lá đã rửa sạch, nghiền lá với 1,2 ml dịch trích EB. Vortex thật kỹ cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ dịch ở 65oC trong 60 phút. - Bƣớc 2: Thêm 500 µl chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1), đảo nhẹ, ly tâm 9000 vòng ở 10oC trong 25 phút. Hút dịch trong. - Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Hút dịch trong. - Bƣớc 4: Thêm 250 µl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở -20oC qua đêm. - Bƣớc 5: Ly tâm 9000 vòng ở 10oC trong 25 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 6: Thêm 300 µl TE 1X, ủ ở 37oC trong 1 giờ. - Bƣớc 7: Thêm 20 µl sodium acetate 3 M và 640 µl ethanol 100%, trộn đều. Để tủa -20oC trong 30 phút. 34 - Bƣớc 8: Ly tâm 8000 vòng ở 10oC trong 25 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 9: Rửa cặn bằng 400 µl ethanol 70%, ly tâm 6000 vòng ở 10oC trong 10 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 µl TE 1X, ủ ở 37 oC trong 30 phút. - Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở -20oC 3.3.1.3. Quy trình 3 (quy trình ly trích mẫu cải tiến bằng N2 lỏng) Sử dụng quy trình 2 nhƣng nghiền mẫu trong N2 lỏng, có bổ sung thêm PVP 2% vào thành phần dịch trích EB và gồm 11 bƣớc nhƣ sau: - Bƣớc 1: Cân 0,6 g lá Cóc trắng. Nghiền lá thật kỹ trong N2 lỏng cho đến khi thu đƣợc dạng bột mịn, cho vào eppendorf. - Bƣớc 2: Thêm 1 ml dịch trích EB (có PVP). Vortex kỹ cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở 65oC trong 60 phút (lƣu ý cứ cách 30 phút vortex dịch lại một lần). - Bƣớc 3: Thêm 500 µl chloroform: isoamyl alcohol, đảo nhẹ trong 30 phút. Ly tâm 9000 vòng ở 10oC trong 25 phút. Hút dịch trong. - Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Hút dịch trong. - Bƣớc 5: Thêm 300 µl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở -20oC qua đêm. - Bƣớc 6: Ly tâm 9000 vòng ở 10oC trong 25 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 7: Thêm 300 µl TE 1X. Ủ ở 37oC trong 60 phút. - Bƣớc 8: Thêm 20 µl sodium acetate và 640 µl ethanol 100%, trộn đều. Để tủa ở -20oC trong 60 phút. - Bƣớc 9: Ly tâm 8000 vòng ở 10oC trong 25 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 10: Rửa tủa bằng 400 µl ethanol 70%, ly tâm 8000 vòng ở 10oC trong 10 phút. Đổ bỏ dịch trong. - Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Đổ bỏ dịch trong. Để tủa thật khô. Hòa tan tủa trong 100 µl TE 1X. Ủ ở 37oC trong 30 phút. - Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở -20oC. 35 3.3.2. Kiểm tra kết quả ly trích DNA 3.3.2.1. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Cách tiến hành: - Dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. - Pha loãng dung dịch DNA: Dùng TE 1X để pha loãng DNA đến nồng độ thích hợp (thƣờng pha loãng 100 lần). Hút 20 µl dịch DNA mẫu cho vào curvette, thêm 1,8 ml TE 1X. - Tiến hành đo OD trên máy ở các bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Công thức tính hàm lƣợng DNA DNA (ng/µl) = [(62,9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * n Với: - OD260 nm: Giá trị mật độ quang của DNA ở bƣớc sóng 260 nm. - OD280 nm: Giá trị mật độ quang của DNA ở bƣớc sóng 280 nm. - n: Độ pha loãng DNA (thƣờng n = 100). 3.3.2.2. Kiểm tra định tính DNA bằng điện di trên gel Cách tiến hành: - Pha gel agarose nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi trong lò Viba khoảng 2 phút cho agarose tan thật đều. - Đổ gel, chờ agarose đông (lƣu ý khuôn đổ gel phải thật cân bằng, tránh tạo bọt khi đổ gel). - Load DNA vào các giếng theo tỷ lệ 2 µl loading dye: 4 µl DNA mẫu. - Chạy điện di ở 100 V, 400 mA trong khoảng 20 phút. - Nhuộm ethidium bromide trong khoảng 15 phút, sau đó rửa sạch bản gel. - Đƣa bản gel vào máy Geldoc đọc kết quả bằng tia cực tím. 36 3.3.3. Phản ứng RAPD 3.3.3.1. Primer Phản ứng RAPD đƣợc tiến hành sử dụng 7 primer: primer 1, primer 2, primer 9, OPAC10, RAH8, OPA5, OPA10. - Trình tự primer 1 (OPA02): 5’– TGCCGAGCTG –3’ và Tm = 40,7 o C. - Trình tự primer 2 (OPA03): 5’– AGTCAGCCAC –3’ và Tm = 34,3 o C. - Trình tự primer 9 (OPN02): 5’– GGTACTCCCC –3’ và Tm = 33,9 o C. - Trình tự primer OPAC10: 5’– AGCAGCGAGG –3’ và Tm = 34 o C. - Trình tự primer RAH8: 5’– GAGAGCCAAC –3’ và Tm = 31,9 o C. - Trình tự primer OPA5: 5’– AGGGGTCTTG –3’ và Tm = 30,2 o C. - Trình tự primer OPA10: 5’– GTGATCGCAG –3’ và Tm = 30,7 o C. 3.3.3.2. Bố trí thí nghiệm Nhằm tìm ra đƣợc thành phần hóa chất và chu trình nhiệt tốt nhất cho phản ứng RAPD trên cây Cóc trắng, chúng tôi đã chọn một số mẫu DNA đạt độ tinh sạch cao để tiến hành 4 thí nghiệm phản ứng RAPD – PCR. Thí nghiệm 1: - Mục đích thí nghiệm: Khảo sát chu trình nhiệt thích hợp. - Chỉ tiêu đánh giá: Có band trên gel điện di. - Phƣơng pháp thực hiện: Phản ứng đƣợc thực hiện với primer OPAC10 với thành phần hóa chất trong bảng 3.1 và chu trình nhiệt trong bảng 3.2, 3.3. 37 Bảng 3.1. Thành phần hóa chất phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng PCR buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 25 mM 2,5 mM 2,5 l dNTP 10 mM 0,1 mM 0,25 l Primer 100 pmol/ l 26 pmol/ µl 6,5 l Taq DNA polymerase 5 U 1 U 0,2 l DNA mẫu 20 ng/ l 20 ng 1 l H2O 12,05 l Tổng thể tích 25 l Bảng 3.2. Chu trình nhiệt 1 cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 36 1 72 2 1 72 15 Giữ 40 C Bảng 3.3. Chu trình nhiệt 2 cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 1 94 5 40 94 1/2 36 1/2 72 1 1 72 5 38 Giữ 4oC Thí nghiệm 2: - Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ các thành phần phản ứng. - Chỉ tiêu đánh giá: Chất lƣợng band trên gel điện di. - Phƣơng pháp thực hiện: Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện trên cả 7 primer với thành phần hóa chất trong bảng 3.4 và chu trình nhiệt trong bảng 3.5. Bảng 3.4. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 Hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ cuối Thể tích sử dụng PCR buffer 25 mM 2,5 mM 2,5 µl MgCl2 25 mM 3 mM 3 µl dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 µl Primer 100 pmol/ µl 1,2 pmol/ µl 0,3 µl Taq DNA polymerase 5U 1U 0,2 µl DNA mẫu 20 ng 20 ng 1 µl H2O 17,8 µl Tổng thể tích 25 µl Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 1 94 5 40 94 1/2 Ta 1/2 72 1 1 72 5 Giữ 4oC - Primer 1 có Ta = 40 o C. - Các primer: primer 2, OPAC10 có Ta = 36 o C. 39 - Các primer: RAH8, OPA5, OPA10 có Ta = 34 o C. Thí nghiệm 3: - Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng tạo sản phẩm RAPD của các mẫu DNA ly trích đƣợc nghiền trong EB và nghiền trong N2 lỏng. - Chỉ tiêu đánh giá: Độ nét của band trên gel điện di. - Phƣơng pháp thực hiện: Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện sử dụng primer OPAC với thành phần hóa chất trong bảng 3.6 và chu trình nhiệt trong bảng 3.7. Sử dụng DNA mẫu là 6 mẫu ly trích đƣợc nghiền trong EB, 2 mẫu ly trích đƣợc nghiền trong N2 lỏng. Thí nghiệm 4: - Mục đích thí nghiệm: Thực hiện phản ứng RAPD – PCR. - Chỉ tiêu đánh giá: Chất lƣợng và số lƣợng của các band trên gel điện di. - Phƣơng pháp thực hiện: Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện sử dụng primer OPAC10 với thành phần hóa chất trong bảng 3.6 và chu trình nhiệt trong bảng 3.7 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất trong thí nghiệm 3 và 4 Hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ cuối Thể tích sử dụng PCR buffer 25 mM 2,5 mM 2,5 µl MgCl2 25 mM 3 mM 3 µl dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 µl Primer 100 pmol/ µl 1 pmol/ µl 0,25 µl Taq DNA polymerase 5U 1U 0,2 µl DNA mẫu 20 ng 20 ng 1 µl H2O 17,8 µl Tổng thể tích 25 µl 40 Bảng 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 và 4 Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 1 94 5 40 94 ½ 36 ½ 72 1 1 72 5 Giữ 4oC Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD: - Các thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ, đặc biệt là Taq polymerase (thể tích hút 0,2 µl) và không có pipet nào có thể hút chính xác một thể tích nhỏ nhƣ vậy. Do đó, để đảm bảo độ chính xác cho các thể tích hút, thông thƣờng ngƣời ta trộn (mix) một lần nhiều phản ứng, sau đó chia ra từng ống nhỏ và thêm DNA mẫu vào. - Thao tác trộn phản ứng phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo không bị tạp nhiễm. Hóa chất dùng để trộn phải đƣợc giữ lạnh trong nƣớc đá. - Thao tác trộn phải đều và nhẹ nhàng, lƣu ý tránh tạo bọt trong quá trình trộn. - Taq polymerase hoạt động ngay sau khi bỏ vào phản ứng, vì vậy phải bỏ Taq vào sau cùng. Sau khi bỏ Taq các thao tác còn lại phải đƣợc tiến hành nhanh chóng. - Taq polymerase rất dễ hƣ hỏng và bay hơi, thể tích trong ống gốc ban đầu rất ít (20 µl) nên thao tác hút Taq phải thật cẩn thận, tránh để Taq dính thành eppendorf. Nên ly tâm Taq trƣớc và sau khi trộn để tránh hiện tƣợng dính trên thành eppendorf. - Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản lạnh -20oC, hạn chế thay đổi nhiệt độ đột ngột vì sẽ làm phân hủy DNA trong sản phẩm. 41 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu lá Cóc trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều khó khăn trong việc tìm kiếm những mẫu có đặc tính khác lạ nhƣ dự kiến ban đầu đề ra. Nguyên nhân chính là do việc đi lại trong rừng rất hạn chế vì có nhiều vùng đất lún và ngập nƣớc. Chúng tôi đã không thể đi sâu vào rừng để lấy những mẫu có đặc điểm khác lạ. Chúng tôi đã tiến hành 4 đợt thu mẫu thực địa tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, lấy đƣợc tổng cộng 45 mẫu lá Cóc trắng theo hai đƣờng chéo: đƣờng bộ và đƣờng thủy xuyên rừng. Vị trí lấy mẫu và đặc điểm mẫu thu thập đƣợc thể hiện trong hình 4.1 và bảng 1 phần phụ lục. 42 Hình 4.1. Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 43 Các mẫu đƣợc thu thập từ nhiều tiểu khu và từ những cây đã trƣởng thành, đa số đã có hoa và quả. Các cây lấy mẫu theo đƣờng bộ có dấu hiệu bị sâu ăn lá, lá có đốm bệnh màu nâu, trong khi các cây lấy mẫu theo đƣờng thủy rất xanh tốt, ít thấy hiện tƣợng này. Hai đƣờng chéo lấy mẫu đi xuyên diện tích rừng, khoảng cách lấy mẫu khá xa và cách đều nhau khoảng 800 m. Vì vậy, mặc dù lƣợng mẫu lấy đƣợc (45 mẫu) là ít so diện tích quần thể Cóc trắng có trong rừng nhƣng cũng đã đại diện cho quần thể Cóc trắng tại đây. 4.2. Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA 4.2.1. Bảo quản mẫu Khác với các loài đƣớc và mắm thƣờng bị hóa nâu khi bảo quản trong điều kiện -20oC, mẫu lá Cóc trắng có thể bảo quản lâu dài ở nhiệt độ này. Mẫu lá có thể trữ đƣợc khoảng 30 ngày mà lá vẫn còn màu xanh và không bị hóa nâu khi lấy ra nhiệt độ phòng để ly trích (xem hình 4.2). Khi tiến hành ly trích trên những mẫu lá đƣợc bảo quản sau 30 ngày, chúng tôi vẫn thu đƣợc kết quả tốt thể hiện trong hình 4.6. Đây là một ƣu điểm rất thuận lợi cho chúng tôi trong điều kiện tiến hành thí nghiệm phải lấy mẫu ở xa, việc lấy mẫu khó khăn và cần bảo quản mẫu trong thời gian dài. Hình 4.2. Mẫu lá Cóc trắng sau 30 ngày bảo quản 44 Qua một số thí nghiệm về thời gian và phƣơng pháp bảo quản mẫu, chúng tôi có một số nhận xét nhƣ sau: - Mẫu lá Cóc trắng có thể bảo quản trên 30 ngày ở -20oC. - Cách bảo quản mẫu tốt nhất là sau khi lấy mẫu tƣơi từ cây, lau thật sạch mẫu, cho vào túi nilon, ép hết không khí trong túi ra ngoài, buộc chặt miệng túi. Vận chuyển mẫu bằng thùng lạnh và bảo quản mẫu trong tủ lạnh -20oC. - Mẫu lá Cóc trắng sau 30 ngày bảo quản vẫn cho kết quả tốt khi ly trích DNA. 4.2.2. Hoàn thiện quy trình ly trích Giai đoạn đầu chúng tôi thực hiện ly trích DNA theo quy trình 1 (quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)). Kết quả là chúng tôi không thu đƣợc DNA mẫu hoặc là lƣợng DNA mẫu ít, lẫn tạp và bị gãy vụn rất nhiều (bị smear trên gel điện di). Chỉ số đo OD của những mẫu này rất thấp, chỉ từ 1,2 – 1,4 (xem kết quả chi tiết tại bảng 2 phần phụ lục). Điều này có thể là do quá trình bảo quản mẫu trong giai đoạn đầu chƣa tốt làm mẫu bị hƣ hỏng. Ngoài ra còn có thể là do thao tác ly trích chƣa tốt nhƣ nghiền mẫu quá mạnh, vortex quá mạnh làm DNA bị gãy, thao tác hút ở bƣớc 2 và 3 không tốt làm mẫu DNA bị lẫn tạp. Mẫu DNA ly trích theo quy trình này hoàn toàn không tinh sạch, không đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD. Sau khi tiến hành thay đổi một số yếu tố nhƣ thời gian ủ, lƣợng mẫu, tốc độ ly tâm theo quy trình 2, thao tác ly trích đã thành thục hơn, thao tác nghiền nhẹ và đều tay hơn, chúng tôi đã cải thiện đƣợc chất lƣợng DNA mẫu. Kết quả ly trích DNA tốt hơn, DNA ít bị smear hơn khi điện di nhƣng lƣợng DNA còn ít và tạp rất nhiều. Chỉ số đo OD của những mẫu này cũng chỉ từ 1,3 – 1,6 và chỉ có 6 mẫu đạt 1,8 ≤ OD ≤ 2,2 (xem kết quả chi tiết tại bảng 3 phần phụ lục). Điều này có nghĩa là quy trình 2 vẫn chƣa phải là quy trình ly trích phù hợp cho cây Cóc trắng, và những mẫu DNA ly trích từ quy trình này không đủ tiêu chuẩn để thực hiện các phân tích 45 tiếp theo. Ngoài ra, sau một thời gian trữ DNA, khi chạy điện di lại những mẫu này, chúng tôi nhận thấy có sự mất mát một lƣợng lớn DNA. Theo chúng tôi nhận định, điều này có thể là do Cóc trắng là cây ngập mặn nên hàm lƣợng muối, sắc tố cũng nhƣ các hợp chất thứ cấp khác trong lá cao hơn so với cây bình thƣờng. Việc ly trích theo quy trình 1 và 2 không loại bỏ đƣợc hết các hợp chất này. Sự hiện diện của chúng làm hạn chế tác dụng của các hóa chất trong dịch ly trích, làm DNA bị gãy khi vortex hay ly tâm và làm DNA bị phân hủy trong quá trình bảo quản. Mặt khác, lá Cóc trắng là lá mọng nƣớc và dai nên lƣợng DNA trong 1 g lá thấp hơn so với các loại cây ngập mặn khác, lƣợng DNA thu đƣợc cũng ít hơn. Khi nghiền trong dịch EB lỏng, lá dễ nát thành mảng nhƣng khó nhuyễn. Vì vậy, để đồng nhất mẫu lá và dịch EB, việc nghiền mẫu trong thời gian kéo dài và nghiền tƣơng đối mạnh làm DNA bị gãy là không thể tránh khỏi. Chất lƣợng DNA ly trích phụ thuộc quá nhiều vào thao tác nghiền mẫu. Để khắc phục tình trạng trên, chúng tôi đã tiến hành nghiền mẫu thử nghiệm trong N2 lỏng, bổ sung thêm PVP 2% để loại bớt các hợp chất phenol, các bƣớc tiến hành theo quy trình 3. Kết quả chúng tôi thu đƣợc DNA vƣợt trội hơn hẳn so với quy trình 1 và 2 về chất lƣợng DNA và thuận tiện trong thao tác. 46 Quy trình 3 gồm 12 bƣớc đƣợc thực hiện theo hình 4.3. Hình 4.3. Quy trình 3 (quy trình ly trích nghiền trong N2 lỏng) So sánh kết quả ly trích DNA theo quy trình 3 với hai quy trình còn lại, chúng tôi nhận thấy chất lƣợng DNA đƣợc cải thiện đáng kể, lƣợng DNA thu đƣợc nhiều hơn, DNA ít bị gãy và lƣợng tạp cũng giảm đáng kể. Điều này đƣợc thể hiện rõ qua độ sáng của band DNA trên gel điện di hình 4.4. Thêm 20 µl sodium acetate + 640 µl ethanol 100%. Trộn đều. Để tủa -20oC trong 60 phút Ly tâm 8000v, 10 oC, 20 phút. Bỏ dịch trong. Thêm 400 µl ethanol 70%. Ly tâm 8000v, 10oC, 10 phút. Bỏ dịch trong. Bảo quản mẫu ở -20oC. Thêm 1 ml dịch trích EB. Vortex kỹ. Ủ 65oC trong 60 phút. Thêm 500 µl chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Đảo nhẹ trong 30 phút. Ly tâm 9000v,10oC, 25phút 0,6 g lá nghiền trong N2 lỏng Thêm 300 µl isopropanol. Đảo nhẹ. Để tủa -20oC qua đêm. Ly tâm 9000v, 10 oC, 25 phút. Bỏ dịch trong. Thêm 300 µl TE 1X. Ủ 37oC trong 30 phút. Bƣớc 5 Bƣớc 6 Bƣớc 7 Bƣớc 1 Bƣớc 2 Bƣớc 3, 4 Bƣớc 8 Bƣớc 9 Bƣớc 10, 11 Bƣớc 12 Hút dịch trong 47 Hình 4.4. Gel điện di kết quả ly trích DNA theo quy trình 2 và 3 Ly trích theo quy trình 3 sử dụng N2 lỏng trong quá trình nghiền mẫu giúp hiện tƣợng đứt gãy DNA giảm xuống mức thấp nhất, việc sử dụng PVP và tủa DNA 2 lần cũng giúp loại bỏ các tạp chất nhƣ protein, polysaccharide… giúp nâng cao chất lƣợng DNA thu đƣợc. Nhìn chung, quy trình 3 đảm bảo đủ các yếu tố cần thiết khi ly trích, DNA mẫu thu đƣợc từ quy trình này có chất lƣợng tốt và ổn định, có thể đƣợc sử dụng cho tất cả các kỹ thuật nghiên cứu đa dạng di truyền đòi hỏi DNA có độ tinh sạch cao. Ngoài ra, phƣơng pháp nghiền có nhiều tiện lợi nhƣ lá dễ nghiền hơn do lá trở nên giòn trong N2, có thể nghiền mẫu mạnh tay mà không sợ DNA bị đứt gãy, không cần nghiền mẫu trong tủ hút, không có mùi khó chịu trong quá trình nghiền, việc rửa chày cối sau khi nghiền cũng đơn giản hơn, giúp tiết kiệm thời gian (trung bình 1 mẫu 0,6 g nghiền trong 10 phút so với 30 phút khi nghiền với EB). Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng quy trình 3 để ly trích DNA đồng loạt từ mẫu lá Cóc trắng. Chúng tôi thực hiện ly trích theo quy trình 3 trên tổng số 45 mẫu, thu đƣợc DNA từ 35 mẫu đạt tiêu chuẩn dùng cho các kỹ thuật sinh học phân tử chiếm 77,78%. Trong 35 mẫu thu đƣợc có 30 mẫu đạt 1,8 ≤ OD ≤ 2,2 chiếm 66,67%, 35 mẫu có hàm lƣợng DNA lớn hơn 50 ng/µl chiếm 100%. (kết quả chi tiết ở bảng 4 phần phụ lục) Quy trình 2 Quy trình 3 20E 22E 24E 6E 20N 22N 24N 30N 32N 21E 238E 25E 21N 23N 25N 31N 33N 6N 12N 16N 19N 27N 7N 14N 18N 26N 48 Đối với 10 mẫu ly trích thu đƣợc DNA không đạt tiêu chuẩn hoặc không thu đƣợc DNA đều là những mẫu lấy từ tuyến đƣờng bộ và bị đốm bệnh màu nâu (quan sát lá bệnh trên hình 4.5). Điều này có thể là do cây Cóc trắng là cây ngập mặn thật sự (true mangrove) sống trong nƣớc ngập triều, nên những cây sống dọc theo tuyến đƣờng bộ không đƣợc đáp ứng đủ điều kiện sống tốt, hơn nữa những cây này có lá bị đốm bệnh màu nâu nên đã ảnh hƣởng đến hoạt tính của hóa chất ly trích và làm mất lƣợng lớn DNA trong quá trình loại bỏ tạp chất. Hình 4.5. Lá Cóc trắng bị đốm nâu và sâu ăn Trong quá trình ly trích DNA, chúng tôi nhận thấy những mẫu lá đƣợc bảo quản trên 30 ngày khi ly trích theo quy trình 3 vẫn cho kết quả tốt, tạo band sáng và ít tạp trên gel điện di trong hình 4.6. Điều này cho thấy lá Cóc trắng sau bảo quản 30 ngày vẫn cho kết quả khi ly trích. 49 Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA từ mẫu lá tƣơi ban đầu theo quy trình 2 và mẫu lá bảo quản sau 30 ngày theo quy trình 3 Trong quá trình ly trích, chúng tôi nhận thấy về mặt thao tác cần lƣu ý một số vấn đề sau: - Trƣớc khi cân mẫu lá, nên dùng khăn giấy lau sạch mẫu lá và gói mẫu trong giấy bạc, không rửa mẫu với nƣớc vì sẽ làm mẫu dễ bị dập. - Khi nghiền mẫu với N2 lỏng, mẫu lá chƣa nghiền, eppendorf đựng mẫu và các dụng cụ sử dụng để nghiền mẫu phải luôn để trong N2 lỏng. - Nghiền mẫu thật kỹ, không dùng lực quá mạnh và nghiền đều tay cho đến khi có dạng bột mịn, không để mẫu chảy nƣớc trong suốt quá trình nghiền cho đến khi thêm EB. - Dịch trích EB khi bảo quản ở 4oC thƣờng có hiện tƣợng kết tủa (CTAB) làm ảnh hƣởng đến hiệu quả ly trích DNA, do đó nên ủ EB ở 65oC trƣớc khi sử dụng. - -mercapto ethanol là chất dễ bay hơi và có mùi khó chịu, do đó chỉ nên thêm -mercapto ethanol vào EB ngay trƣớc khi sử dụng để không làm mất hoạt tính của chất này. - Nên thêm chloroform: isoamyl alcohol bằng với thể tích dịch trong giúp tác dụng loại bỏ các hợp chất thứ cấp tốt hơn. Các bƣớc tiếp theo sau khi thêm Mẫu tƣơi Sau 30 ngày 20N 22N 20N 22N 21N 23N 21N 23N 50 chloroform: isoamyl alcohol, chỉ nên khuấy trộn nhẹ nhàng và đem ly tâm, không nên vortex để tránh làm gãy DNA. - Ở bƣớc 3 và 4, khi chuyển lấy dịch trong cần cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dƣới, sẽ làm giảm độ tinh sạch của DNA. Do đó, ở hai bƣớc này nên hút dịch trong thật nhẹ, thƣờng thể tích hút dịch trong ở bƣớc 3 là 450 µl, ở bƣớc 4 là 300 µl. - Ở bƣớc 11, khi phơi khô tủa nên chú ý là nếu tủa quá khô sẽ làm hỏng DNA, nếu còn ethanol sẽ ảnh hƣởng xấu đến DNA trong quá trình bảo quản và phản ứng PCR. - Sau một thời gian trữ DNA ở -20oC, chúng tôi nhận thấy có sự suy giảm chất lƣợng DNA, biểu hiện ở band DNA bị mờ, bị smear và lƣợng tạp chất tăng. Điều này có thể là do trong quá trình trữ DNA, chúng tôi đã lấy DNA ra khỏi tủ -20oC để thực hiện một số phân tích khác nhƣ đo OD, điện di lại lấy kết quả, pha loãng và điện di mẫu pha loãng để chuẩn bị cho phản ứng RAPD, nên đã làm DNA bị shock nhiệt khi thay đổi đột ngột từ nhiệt độ lạnh sang nhiệt độ phòng. Do đó nên hạn chế lấy DNA ra khỏi tủ âm. Khi cần phân tích thêm, nên để eppendorf chứa DNA lên đá lạnh để hạn chế shock nhiệt. Sau khi hoàn thiện quá trình ly trích và kiểm tra kết quả ly trích DNA, chúng tôi có một số kết luận nhƣ sau: - Ly trích DNA tốt nhất nên thực hiện trên lá trƣởng thành vì lá non có nhiều nhựa và hợp chất phenol, lá già lại có quá nhiều chất xơ và hàm lƣợng muối trong lá cao. - Nghiền mẫu trong N2 lỏng và thực hiện ly trích theo quy trình 3 cho DNA kết quả tốt và ổn định, có thể sử dụng đƣợc cho tất cả các kỹ thuật sinh học phân tử đòi hỏi DNA có độ tinh sạch cao. - Phƣơng pháp nghiền có nhiều tiện lợi, giúp tiết kiệm thời gian. - Tăng thời gian ủ giúp thu đƣợc nhiều DNA hơn. 51 Chu trình nhiệt 1 Chu trình nhiệt 2 - Giảm tốc độ ly tâm và tăng thời gian ly tâm tránh cho DNA bị đứt gãy nhƣng vẫn đảm bảo kết tủa tốt. - Sau ly trích nên trữ DNA trong điều kiện -20oC. Khi tiến hành các bƣớc phân tích tiếp theo nên để DNA trong đá lạnh để tránh cho DNA bị shock nhiệt làm hao hụt lƣợng DNA ban đầu. - Mẫu lá Cóc trắng bảo quản sau 30 ngày vẫn còn xanh tốt, khi ly trích DNA theo quy trình 3 vẫn cho kết quả tốt. 4.3. Thực hiện phản ứng RAPD 4.3.1. Thí nghiệm 1 Trong thí nghiệm 1, chúng tôi sử dụng primer OPAC10 với chu trình nhiệt 1 và 2 nhằm tìm ra chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng RAPD trên cây Cóc trắng. Qua thí nghiệm 1, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.7. Hình 4.7. Hình điện di sản phẩm PCR ở thí nghiệm 1 Kết quả điện di cho thấy thành phần hóa chất và chu trình nhiệt 1 của phản ứng RAPD trong thí nghiệm 1 không phù hợp cho cây Cóc trắng. Chúng tôi không thu đƣợc sản phẩm PCR ở hầu hết các mẫu, có hai mẫu có đoạn DNA đƣợc khuếch đại nhƣng rất mờ, không xác định đƣợc band nên kết quả không sử dụng đƣợc trong phân tích đa dạng di truyền. Việc tạo band mờ có thể là do các nguyên nhân sau: 7N 12N 14N 20N 7N 12N 14N 20N 52 - Nồng độ MgCl2 không phù hợp. - Nồng độ primer quá lớn. - Chu trình nhiệt chƣa phù hợp. - Thao tác trộn phản ứng chƣa tốt. Với thành phần hóa chất không thay đổi, thứ tự mẫu DNA không đổi, trong thí nghiệm 1 chúng tôi khảo sát thêm chu trình nhiệt 2, tăng thời gian biến tính ở chu kỳ 1 giúp DNA tách rời nhau hoàn toàn, giảm thời gian ở các chu kỳ tiếp theo giúp tránh các thành phần hóa chất chịu tác dụng nhiệt quá lâu. Kết quả điện di cho thấy có sản phẩm DNA đƣợc khuếch đại. Tuy các band chƣa tách rõ nhƣng band sáng và có xác định đƣợc một vài band. Điều này cho thấy chu trình nhiệt 2 phù hợp với cây Cóc trắng hơn và chúng tôi quyết định sử dụng chu trình nhiệt này để thực hiện các phân tích tiếp theo. Vấn đề còn lại là thay đổi các thành phần hóa chất để có đƣợc sản phẩm PCR tốt hơn. 4.3.2. Thí nghiệm 2 Trong thí nghiệm 2, chúng tôi sử dụng chu trình nhiệt 2, kết hợp với việc thay đổi một số nồng độ của các hóa chất trong phản ứng RAPD và khảo sát trên tất cả 7 primer để tìm ra primer thích hợp sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây Cóc trắng. Kết quả khảo sát các mồi đƣợc thể hiện trong các hình 4.8, 4.9, 4.10, 4.11. 53 Hình 4.8. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer 1 Hình 4.9. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer 2 và 9 30N Primer 2 Primer 9 30N 30N 30N 31N 54 Hình 4.10. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 Hình 4.11. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer RAH8, OPA5, OPA10 Kết quả điện di cho thấy: - Các primer 9, OPA5, không cho sản phẩm PCR với cây Cóc trắng. Điều này có thể là do mồi không thích hợp, hoặc các thành phần hóa chất chƣa tốt, chu trình nhiệt có nhiệt độ bắt cặp không phù hợp. - Các primer RAH8, OPA10 có tạo sản phẩm PCR với cây Cóc trắng, nhƣng band điện di bị mờ, không tách band rõ rệt. Nếu muốn sử dụng hai primer này cần phải tối ƣu hóa quy trình phản ứng qua nhiều giai đoạn nhƣ nồng độ các thành phần hóa chất và chu trình nhiệt, mất nhiều thời gian công sức nên chúng tôi quyết định không sử dụng hai primer này. 30N 31N 12N 30N 31N 12N 30N 31N Primer RAH8 OPA5 OPA10 30N 31N 30N 31N 12N 30N 31N 12N 30N 31N 55 - Các primer 1, primer 2, OPAC10 tạo sản phẩm PCR cho kết quả điện di có band sáng, gọn, ít bị nhòe, tách band rõ. Ba primer này có thể dùng trong phản ứng RAPD trên cây Cóc trắng. Tuy nhiên, khi so sánh số band trên gel điện di thì primer OPAC10 tạo nhiều band hơn (5 band) so với primer 2 (3 band), và tạo band đẹp hơn so với primer 1 nên khả năng tạo đa hình cao hơn. Do đó, chúng tôi quyết định chọn primer OPAC10 để thực hiện thí nghiệm 3. 4.3.3. Thí nghiệm 3 Trong thí nghiệm 3, chúng tôi sử dụng primer OPAC10 để thực hiện phản ứng RAPD trên 6 mẫu ly trích DNA đƣợc nghiền trong EB có chỉ số OD là 1,8 và 2 mẫu ly trích đƣợc nghiền trong N2 lỏng. Chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.12. Hình 4.12. Hình điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 3 Kết quả điện di cho thấy các mẫu DNA ly trích đƣợc nghiền trong EB cho sản phẩm RAPD không tốt, band mờ, tách band không rõ, còn các mẫu DNA ly trích nghiền trong N2 lỏng cho sản phẩm RAPD sáng rõ. Điều này có thể là do DNA ly trích theo quy trình 2 bị mất dần lƣợng DNA sau thời gian bảo quản, và các tạp chất còn sót lại gây ảnh hƣởng xấu đến phản ứng PCR. Điều này càng khẳng định hơn tính vƣợt trội của quy trình nghiền mẫu trong N2 lỏng. Mẫu nghiền trong EB Mẫu nghiền trong N2 lỏng 7E 16E 21E 24E 31N 12E 20E Lad 30N 56 4.3.4. Thí nghiệm 4 Trong thí nghiệm 4 chúng tôi sử dụng primer OPAC10 với thành phần hóa chất ở bảng 3.6 và chu trình nhiệt ở bảng 3.7. Chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.13. Hình 4.13. Hình điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 4 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR chƣa tốt, các band có độ sáng không đồng đều, một số band mờ, sự tách band ở một số mẫu không rõ rệt, gây khó khăn khi đọc kết quả. Điều này có thể là do chu trình nhiệt và thành phần hóa chất dùng trong phản ứng RAPD vẫn chƣa đƣợc tối ƣu, và thao tác trộn phản ứng còn chƣa tốt, chúng tôi cũng không loại trừ khả năng DNA mẫu bị thay đổi chất lƣợng sau một thời gian bảo quản. Tuy nhiên, với sự hỗ trợ của công cụ “Detected band” trên phần mềm Quantity one, chúng tôi đã ghi nhận đƣợc kết quả nhƣ sau: - Thu đƣợc tổng cộng 38 band từ 11 mẫu phân tích, số band nhiều nhất xuất hiện trong 1 mẫu là 6, ít nhất là 2, trung bình 3,5 band/ 1 mẫu. Số lƣợng band/ mẫu không cao nhƣng vẫn thể hiện đƣợc sự đồng hình và đa hình giữa các mẫu phân tích 25N 29N 33N 34N 36N Lad 38N 40N 42N 7N 14N 20N 57 - Có 2 band đồng hình xuất hiện ở 11 mẫu, kích thƣớc band là 700 bp và 800 bp chiếm tỷ lệ 5,3%. - Có 4 band đa hình, chiếm tỷ lệ 10,5%. Các band đa hình là cơ sở phân biệt các mẫu có tính trạng khác nhau. Trong các band đa hình thì band có kích thƣớc 150 bp, 300 bp chỉ xuất hiện ở các mẫu 7N, 14N; band đa hình 450 bp xuất hiện ở đa số các mẫu, chỉ không xuất hiện ở 3 mẫu 36N, 38N, 7N; band đa hình 1000 bp chỉ xuất hiện ở các mẫu 34N, 36N, 42N, 14N. Tuy chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD với lƣợng mẫu không lớn nhƣng trong các mẫu cho sản phẩm luôn có sự xuất hiện 2 band đồng hình có kích thƣớc 700 bp và 800 bp, trong khi các cây ngập mặn khác nhƣ Đƣớc đôi, Đƣng, Mắm trắng, Mắm đen và Mắm biển không thấy xuất hiện band đồng hình ở các kích thƣớc này. Hai band này có thể là band đặc trƣng dùng để phân biệt Cóc trắng với các loài cây ngập mặn khác . Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác xác định và chọn tạo giống. Từ kết quả thể hiện trên gel điện di, chúng tôi mã hóa các band đồng hình và đa hình ở các mẫu thành ma trận nhị phân (0: không có band, 1: có band) dƣới dạng file .xls. Sau đó dùng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để phân tích số liệu trong file này để xây dựng bảng hệ số đồng dạng di truyền (bảng 4.1) và vẽ cây phát sinh loài (hình 4.14). Qua đó, chúng tôi phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu. 58 Coefficient 0.50 0.63 0.75 0.88 1.00 10BL20 6BL25 6BL29 7L33 10BL20 2BL40 2BL38 7L34 7L42 7L36 21L7 10L14 Hình 4.14. Cây phân loại một số cây Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Việc phân tích sản phẩm RAPD bằng phần mềm NTSYS cho các kết quả nhƣ sau: - Mƣời một mẫu Cóc trắng chạy RAPD đƣợc chia làm 2 nhóm với hệ số đồng dạng là 0,5. Nhóm I gồm hai mẫu 21L7 và 10L14 có hệ số đồng dạng 0,67. Đây là hai mẫu Cóc trắng đƣợc lấy từ các cây mọc dọc theo tuyến lấy mẫu đƣờng bộ. Nhóm II gồm 9 mẫu 6BL25, 6BL29, 7L33, 10BL20, 2BL40, 2BL38, 7L34, 7L42, 7L36 có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,76 – 1. Đây là các mẫu lấy từ các cây mọc dọc theo tuyến lấy mẫu đƣờng thủy. Nhƣ vậy, các cây lấy mẫu thuộc đƣờng thủy và đƣờng bộ có thể xuất phát từ các nguồn giống khác nhau. Chúng tôi vẫn chƣa tìm đƣợc thông tin về nguồn gốc giống cây Cóc trắng tại rừng Cần Giờ một cách chi tiết. Tuy nhiên, nếu tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền với số lƣợng mẫu lớn có thể xác định chính xác hơn nhận định trên. - Các cây Cóc trắng thuộc cùng một tiểu khu có hệ số đồng dạng di truyền khá cao: 6BL25 và 6BL29, 7L34 và 7L42 có hệ số đồng dạng di truyền là 1; 7L33, 7L34, 7L36, 7L42 có hệ số đồng dạng di truyền là 0,83; 2BL38, 2BL40 cũng có hệ 59 số đồng dạng di truyền là 0,83. Các mẫu thuộc các tiểu khu nằm kề nhau trên tuyến lấy mẫu cũng có hệ số đồng dạng là 0,76 (các tiểu khu 6, 7 và 2 nằm kề nhau theo tuyến lấy mẫu đƣờng thủy). Nhƣ vậy, các cây trong cùng tiểu khu có thể có nguồn giống gần nhau, cá biệt có một vài cây hoàn toàn giống nhau về mặt di truyền. Điều này chứng tỏ sự đa dạng di truyền trong tiểu khu thấp, cần phải có kế hoạch cải thiện. - Các mẫu lấy từ đƣờng bộ và các mẫu lấy từ đƣờng thủy có hệ số đồng dạng di truyền thấp hơn các mẫu lấy trong cùng tiểu khu hoặc các mẫu lấy ở các tiểu khu liền nhau nhƣng vẫn lớn hơn 0,5. Hệ số này cho thấy các mẫu chạy RAPD có sự đa dạng di truyền ở mức độ thấp. Theo chúng tôi nhận định, điều này có thể là do chúng tôi chỉ tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên dọc theo hai đƣờng chéo xuyên rừng, không có điều kiện đi sâu vào các tiểu khu ở xa để lấy các mẫu có đặc tính khác lạ. Mặt khác, chúng tôi cũng không có điều kiện thu thập mẫu trên cơ sở những dòng giống đã đƣợc xác định trƣớc nên độ đa dạng của quần thể mang tính ngẫu nhiên. Ngoài ra còn có thể là do quần thể Cóc trắng tại rừng Cần Giờ là quần thể tái sinh tự nhiên sau chiến tranh (khác với quần thể Đƣớc đôi đƣợc tái sinh nhân tạo bằng cách lấy các nguồn giống khác về trồng tại rừng), các cây phân bố theo sự phát tán tự nhiên (phát tán theo gió, theo dòng chảy của kênh rạch) nên việc quần thể Cóc trắng tại đây có độ đa dạng di truyền thấp là hoàn toàn có thể xảy ra. Nhƣ vậy, càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền càng cao, hiện tƣợng “lại giống” có thể xảy ra làm giảm sức sống, cây dễ bị sâu bọ và các mầm bệnh tấn công trên diện rộng đe dọa sự tồn tại của quần thể Cóc trắng tại rừng Cần Giờ. Do đó, việc có kế hoạch cụ thể để khoanh nuôi, tái sinh, trồng mới cây Cóc trắng, ví dụ nhƣ lấy cây ở các tiểu khu 21 và 10 trồng xen vào các tiểu khu 2B, 6B, 7 và ngƣợc lại để tăng tính đa dạng di truyền của quần thể loài cây này là cần thiết, giúp quần thể Cóc trắng có thể tồn tại lâu dài, giữ nguyên và làm phong phú hơn sinh cảnh và sự đa dạng sinh học của rừng. 60 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thu chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:  Sử dụng lá trƣởng thành và nghiền lá trong N2 lỏng để thu đƣợc DNA có chất lƣợng tốt, đủ tiêu chuẩn dùng trong các bƣớc phân tích tiếp theo. Quá trình bảo quản DNA lâu dài ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA, làm phân hủy DNA. Do đó nên giữ nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình bảo quản. DNA ly trích xong nên sử dụng thực hiện phản ứng RAPD ngay.  Primer OPAC10 có khả năng tạo đa hình với cây Cóc trắng, tạo hai band đa hình và bốn band đồng hình. Hai band đồng hình ở kích thƣớc 700 bp và 800 bp có thể là chỉ thị phân tử cho cây Cóc trắng.  Quần thể Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền cao trên cây phân loại (từ 0,5 – 1), độ đa dạng di truyền thấp. Càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền càng cao, độ đa dạng di truyền càng giảm. Do đó cần có sự can thiệp của con ngƣời giúp trồng mới rừng, cải thiện sự đa dạng di truyền của quần thể cây ngập mặn, trong đó có Cóc trắng. 61 5.2. Đề nghị  Có kế hoạch điều tra thu thập số liệu cụ thể về nguồn gốc giống cây Cóc trắng tại các tiểu khu, số năm tuổi, tình trạng quần thể hiện nay để phục vụ cho công tác thu mẫu nghiên cứu đƣợc tốt hơn.  Tối ƣu hóa quy trình RAPD trên cây Cóc trắng để có một quy trình ổn định cho hiệu quả cao.  Khảo sát thêm các primer khác để tìm ra đƣợc primer tạo độ đa hình cao trên cây Cóc trắng. Thực hiện phản ứng RAPD trên lƣợng mẫu lớn hơn nhằm đánh giá một cách chính xác hơn mức độ đa dạng di truyền của quần thể Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Tách riêng band 700 bp và 800 bp khi thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 để giải trình tự nhằm phân biệt loài Cóc trắng với các loài khác thuộc họ Combretaceae trong rừng ngập mặn.  Kết hợp thêm việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) là loài cây quý hiếm trong Sách đỏ để xác định độ tƣơng đồng của bộ gene hai loài này, xác định thêm chỉ thị phân tử cho chi Lumnitzera. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Quỳnh Anh, 2005. Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Luận văn tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 83 trang. 2. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Luận văn tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 59 trang. 3. Trịnh Đình Đạt, 2006. Công nghệ sinh học – tập bốn – Công nghệ di truyền. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP. Hồ Chí Minh. 171 trang. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2003. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh. 301 trang. 5. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP. Hồ Chí Minh. 612 trang. 6. Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái Rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh (1978 - 2000). Giải thưởng Hồ Chí Minh về Khoa học và Công nghệ năm 2005. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, 2006. 134 trang. 7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 219 trang. 8. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 238 trang. 9. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (Rhizophora apiculata BLUME) ở Khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Luận văn tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 55 trang. 10. Nguyễn Tấn Việt, 2006. Rừng Cần Giờ, bây giờ cần gì?. Sài Gòn Giải Phóng thứ bảy: số ra ngày 19/08/2006. 63 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 11. Ambike Baldev Gaikwad. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) technique. National Bureau of Plant Genetic Resources, New Delhi-12. 12. IPGR and Cornell University, 2003. Using molecular marker technology in studies on plant genetic diversity – AFLP TRANG WEB 13. 14. 15. 16. ocean.org/bioinformatics/mangrove/mangcd/fightm/PF17.htm 17. 18. 19. 20. 21. 22. 64 PHỤ LỤC Bảng 1. Danh sách các mẫu Cóc trắng thu thập tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ MẪU TIỂU KHU TỌA ĐỘ ĐỊA LÝ ĐẶC ĐIỂM 17L1 17 48P 0708583 UTM 1150288 Chiều cao 2.5 m, đƣờng kính 15 cm Lá nhỏ, có nhiều đốm nâu. Có nhiều trái, không có hoa 17L2 17 48P 0707988 UTM 1150623 Chiều cao 5 m, đƣờng kính 20 cm. Lá to, xanh tốt, bị sâu ăn lá. Có nhiều trái, không có hoa. 17L3 17 48P 0707448 UTM 1152105 Chiều cao 10 m, gốc to, phân nhiều cành từ gốc nên không xác định đƣợc đƣờng kính Lá nhỏ, có nhiều đốm nâu. Có nhiều trái, có ít hoa. 21L4 21 48P 0706752 UTM 1154072 Chiều cao 1.5 m, đƣờng kính 5 cm. Lá nhỏ, có nhiều đốm nâu, lá bị sâu ăn. Có nhiều trái, ít hoa. 17L5 17 48P 0706678 UTM 1154972 Chiều cao 5 m, đƣờng kính 10 cm. Lá xanh tốt, bị sâu ăn. Có ít trái, ít hoa. 21L6 21 48P 0706898 UTM 1156443 Chiều cao 8 m, đƣờng kính 15 cm. Lá có nhiều đốm nâu. Trái rất nhiều, không hoa. 21L7 21 48P 0706380 UTM 1157741 Chiều cao 10 m, đƣờng kính 20 cm. Lá nhiều đốm nâu. Có nhiều trái, không có hoa. 11L8 11 (trái) 48P 0705765 UTM 1158774 Chiều cao 5 m, đƣờng kính 5 cm. Lá xanh tốt. Có ít trái, có hoa. 11L9 11 (phải) 48P 0705441 UTM 1159250 Chiều cao 10 m, đƣờng kính 25 cm. Lá xanh tốt, có ít đốm nâu. Có trái, không có hoa. 11L10 11 (phải) 48P 0705161 UTM 1159715 Chiều cao 10 m, đƣờng kính 5 cm. Lá rậm rạp, xanh tốt, có ít đốm nâu. Có trái, có hoa. 11L11 11 (trái) 48P 0704781 UTM 1160407 Chiều cao 1.5 m, đƣờng kính 3 cm. Lá thƣa, xanh tốt, ít đốm nâu. Có nhiều trái, có hoa. 11L12 11 48P 0704086 Chiều cao 1.5 m, đƣờng kính 3 cm. 65 (trái) UTM 1161940 Lá có nhiều đốm nâu, bị sâu ăn. Có nhiều trái, không có hoa. 10L13 10 (phải) 18P 0703881 UTM 1162362 Chiều cao 5 m, đƣờng kính 15 cm. Lá rậm rạp, xanh tốt, có ít đốm nâu, Có nhiều trái, không có hoa. 10L14 10 (phải) 48P 0703258 UTM 1163077 Chiều cao 5 m, đƣờng kính 10 cm. Lá rậm rạp, xanh tốt. Có nhiều trái, không có hoa. 10L15 10 (phải) 48P 0702913 UTM 1163559 Chiều cao 3 m, đƣờng kính 3 cm. Lá nhỏ, nhiều đốm nâu, bị sâu ăn. Có quả, có hoa. 10L16 10 (phải) 48P 0702489 UTM 1164263 Chiều cao 1 m, đƣờng kính 3 cm. Lá thƣa, có nhiều đốm nâu, bị sâu ăn. Có ít trái, không có hoa. 10L17 10 (trái) 48P 0701380 UTM 1165102 Chiều cao 1 m, đƣờng kính 3 cm. Lá có nhiều đốm nâu. Có trái, không có hoa. 5BL18 5B 48P 0700650 UTM1166971 Chiều cao 2m, đƣờng kính 5 cm. Lá xanh tốt. Không có trái, không có hoa. 5BL19 5B 48P 0699673 UTM 1169617 Chiều cao 10 m, đƣờng kính 7 cm. Lá xanh tốt, ít đốm nâu. Không có trái, có hoa. 10BL20 10B 48P 0704645 UTM 1161886 Lá xanh tốt, có ít đốm nâu. Có trái, không có hoa. 10BL21 10B 48P 0704353 UTM 1162004 Lá rậm rạp, có nhiều đốm nâu. Có trái, có hoa. 10AL22 10A 48P 0704558 UTM 1162782 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 6BL23 6B 48P 0705498 UTM 1163894 Lá thƣa thớt, xanh tốt, có ít đốm nâu. Không có trái, không có hoa. 6BL24 6B 48P 0705911 UTM 1163727 Cây cao khẳng khiu, nhiều cành khô xơ. Lá thƣa thớt, xanh tốt, có ít đốm nâu. Không có trái, không có hoa. 6BL25 6B 48P 0706393 UTM 1163652 Lá rậm rạp, xanh tốt. Có trái, không có hoa. 6BL26 6B 48P 0706852 UTM 1163693 Lá xanh tốt, có ít đốm nâu, lá bị sâu ăn. Có trái, có hoa. 6BL27 6B 48P 0707424 UTM 1163700 Lá rậm rạp, xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 6BL28 6B 48P 0707851 UTM 1163576 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Không có trái, không có hoa. 6BL29 6B 48P 0708195 UTM 1163468 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 66 6BL30 6B 48P 0709080 UTM 1163798 Cây khẳng khiu, phân nhiều nhánh, cành khô. Lá thƣa, xanh tốt, không có đốm nâu. Không có trái, có hoa. 13L31 13 48P 0709814 UTM 1164396 Lá thƣa, xanh tốt, không có đốm nâu. Không có trái, không có hoa. 7L32 7 48P 0710845 UTM 1165053 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 7L33 7 48P 0711177 UTM 1165656 Cây nhiều cành nhánh. Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, có hoa. 7L34 7 48P 0711348 UTM 1166061 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 7L35 7 48P 0711394 UTM 1166150 Lá xanh tốt, có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 7L36 7 48P 0711567 UTM 1166474 Lá nhỏ, xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 7L37 7 48P 0711726 UTM 1166759 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 2BL38 2B 48P 0711903 UTM 1167160 Lá rậm rạp, xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 7L39 7 48P 0712166 UTM 1167209 Lá xanh tốt, có ít đốm nâu. Có trái to, không có hoa. 2BL40 2B 48P 0712389 UTM 1167331 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 7L41 7 48P 0713150 UTM 1167524 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Không có trái, không có hoa. 7L42 7 48P 0714263 UTM 1168125 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 2BL43 2B 48P 0714899 UTM 1168188 Lá xanh tốt, không có đốm nâu. Có trái, không có hoa. 2BL44 2B 48P 0713738 UTM 1170168 Lá xanh tốt, có nhiều đốm nâu. Có trái, không có hoa. 2BL45 2B 48P 0712365 UTM 1170955 Cành lá sum suê, có ít đốm nâu. Có trái, không có hoa. 67 Bảng 2. Giá trị OD của các mẫu ly trích theo quy trình 1 STT TÊN MẪU TỶ LỆ Abs Abs 1 21L7 1,35870 0,35140 0,25863 2 11L12 1,47090 0,31942 0,21717 3 10L14 1,37410 0,16093 0,11712 4 10L16 1,25410 0,20660 0,16474 5 10BL20 1,25280 0,20780 0,16586 6 10BL21 1,41340 0,42324 0,29945 7 10AL22 1,36460 0,37607 0,27560 8 6BL23 1,35540 0,35472 0,26170 9 6BL24 1,36040 0,35592 0,26164 10 6BL25 1,36130 0,33904 0,24906 Bảng 3. Giá trị OD của các mẫu ly trích theo quy trình 2 STT TÊN MẪU TỶ LỆ Abs Abs 1 21L6 1,63470 0,14783 9,0428 E-2 2 21L7 2,04280 0,18781 9,1937 E-2 3 11L11 1,51890 0,28739 0,18921 4 11L12 1,97540 0,19388 9,8145 E-2 5 10L14 1,46500 0,32831 0,22448 6 10L16 2,01140 0,18798 9,3460 E-2 7 5BL18 1,64890 0,34692 0,21040 8 5BL19 1,3690 0,16403 0,11982 9 10BL20 1,80010 0,13046 7,2470 E-2 10 10BL21 2,00030 0,19039 9,5182 E-2 11 10AL22 1,56970 0,24052 0,15323 12 6BL23 1,67880 0,13645 8,1275 E-2 13 6BL24 2,02680 0,18795 9,2736 E-2 14 6BL25 1,52650 0,28197 0,18471 68 Bảng 4. Giá trị OD của các mẫu ly trích theo quy trình 3 STT TÊN MẪU TỶ LỆ Abs Abs 1 17L1 Không cho kết quả 2 17L2 Không cho kết quả 3 17L3 Không cho kết quả 4 21L4 Không cho kết quả 5 17L5 Không cho kết quả 6 21L6 1,85950 9,9663 E-2 5,3596 E-2 7 21L7 2,00540 9,8450 E-2 4,9093 E-2 8 11L8 Không cho kết quả 9 11L9 Không cho kết quả 10 11L10 Không cho kết quả 11 11L11 1,61780 0,15273 9,4405 E-2 12 11L12 2,05230 0,14587 7,1075 E-2 13 10L13 Không cho kết quả 14 10L14 2,09790 0,15192 7,2417 E-2 15 10L15 1,78460 0,26338 0,14759 16 10L16 1,98180 9,1039 E-2 4,5937 E-2 17 10L17 1,54030 0,24343 0,15804 18 5BL18 1,95020 6,8969 E-2 3,5365 E-2 19 5BL19 1,98150 6,2750 E-2 3,1669 E-2 20 10BL20 2,11070 1,6807 E-2 7,9627 E-2 21 10BL21 2,18210 2,5607 E-2 1,1735 E-2 22 10AL22 2,16600 2,5790 E-2 1,1907 E-2 23 6BL23 2,03590 0,14718 7,2293 E-2 24 6BL24 1,91300 0,12156 6,3545 E-2 25 6BL25 2,08880 0,15239 7,2957 E-2 26 6BL26 2,02050 0,11123 5,5050 E-2 27 6BL27 1,83270 7,9355 E-2 4,330 E-2 28 6BL28 1,84070 7,8523 E-2 4,2660 E-2 29 6BL29 2,03000 8,8066 E-2 4,3383 E-2 30 6BL30 2,03360 8,7981 E-2 4,3263 E-2 31 13L31 2,04050 0,10603 5,1963 E-2 32 7L32 1,96280 0,12397 6,3162 E-2 33 7L33 2,04170 0,18972 9,2922 E-2 34 7L34 1,97520 0,12302 6,2280 E-2 35 7L35 2,01925 0,18792 9,3068 E-2 36 7L36 2,16300 2,0506 E-2 9,4805 E-2 37 7L37 1,80010 0,13046 7,2470 E-2 38 2BL38 2,23550 1,9769 E-2 8,8434 E-2 39 7L39 1,96040 0,12060 6,1522 E-2 69 40 2BL40 2,0976 3,6278 E-2 1,7295 E-2 41 7L41 1,88520 2,2685 E-2 1,2033 E-2 42 7L42 1,98990 0,11276 5,6663 E-2 43 2BL43 1,64770 0,34552 0,20970 44 2BL44 1,53290 0,26463 0,17263 45 2BL45 Không cho kết quả Bảng 5. Ma trận nhị phân mã hóa sản phẩm phản ứng RAPD của thí nghiệm 4 Mẫu Locus 6B 25 6B 29 7L 33 7L 34 7L 36 2BL 38 2BL 40 7L 42 21L 7 10L 14 10BL 20 1000 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 800 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 700 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 450 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 300 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 150 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0