Khóa luận Bước đầu nghiên cứu sản xuất bột cacao bằng phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật

ese (1964) thì: Hình 2.2: Sơ đồ tác động enzyme cellulase lên cellulose theo Mandels và Reese Trong đó C1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương tạo thành các chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn công bởi Cx. Các vi sinh vật sinh trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai C1 và Cx. Trong tự nhiên người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là C1 sinh ra từ loài nấm mốc này nhưng Cx lại sinh ra từ một loài nấm mốc khác. β-glucozitase ở cuối chuỗi có tác dụng lớn trong việc phân giải hoàn toàn cellobiose thành glucose. 2.3.3 Giới thiệu về pectin Khối lượng phân tử pectin trong khoảng 3.000 – 280.000, ty nguồn gốc thực vật. Dung dịch pectin có độ nhớt cao. Độ hòa tan của pectin trong nước phụ thuộc vào mức độ ester hóa nhóm cacbonyl. Mức ester hóa càng cao độ hòa tan càng cao. Dưới tác dụng của axit, protopectinase hay đun sôi protopectin chuyển thành pectin hòa tan. Pectin hòa tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzym pectase sẽ giống nhóm metoxi tạo rượu metylic và axit pectic tự do. Pectin là dẫn xuất polysaccharide phân tử của chúng bao gồm các đơn vị mắt xích là axit -D-galacturonic. Các đơn vị này nối với nhau nhờ liên kết 1-4 glucozit. Cellulose hoạt động Cellulose Cellobiose Glucose C1 Cx -glucozitase β 22 Mỗi đơn vị mắt xích chứa một nhóm cacboxyl ở vị trí C6, các nhóm axit này tồn tại ở dạng tự do hay dưới dạng liên kết ester (như metyl ester). Trong pectin tự nhiên có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa. Các nhóm hydroxyl ở C2 và C3 của mỗi đơn vị mắc xích có thể bị ester hóa một phần bởi axit acetic hoặc axit phosphoric. Một phần nhóm axit không ester hóa tham gia tạo liên kết ngang với ion canxi và magie. O COOH OH O O COOH OH OH O O COOH OH OH O O OH Hình 2.3: Cấu trúc của axit polygalacturonic. 2.3.4 Giới thiệu enzyme pectinase i. Nhóm hydrolase Gồm có enzym pectinesterase và enzym polygalacturonase ™ Pectinesterase (PE) Theo H. lineviver, pectinesterase có ái lực với nhóm metoxy ở vị trí 5 lớn hơn với các nhóm metoxy ở vị trí 3 và 7. Hình 2.4: Sơ đồ phân cắt của enzym pectinesterase. COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3COOH 1 2 3 4 5 6 7 COOCH3 8 COOCH3 9 II I II Như vậy, sự phân cắt nhóm metoxy sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm −COOH tự do. Kết quả tạo thành axit pectinic hoặc axit pectic và rượu metanol. 23 ™ Polygalacturonase (PG) PG còn có tên gọi là poly-α-1,4-galacturonit glucanohydrolase. PG là enzym xúc tác sự phân cắt các liên kết glucozit 1-4 ở trong các mạch của pectin . PG là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao khi tác dụng với cơ chất. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác động trên cơ chất, H.Deuel và E.Stutz (1958) đã chia ra như sau: 9 Polymetilgalacturonase (PMG):Enzym tác dụng trên axit polygalacturonic đã được metoxyl hóa (tức là pectin). Enzym này thường có tên gọi hệ thống là poly-α-1-4-galacturonic metil esteglucanohydrolase và có mã số 3.2.1.11. PMG lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt liên kết ở trong hay ở cuối mạch của pectin là: Endoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu I (endo-PMG-I) và Exo- glucosidase-polimetilgalacturonase kiểu III (exo-PMG-III). 9 Poligalacturonase: Enzym này tác dụng trên axit pectic hoặc axit pectinic, chia thành hai nhóm nhỏ: Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II (endo-PG-II) và Exoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu IV (ex-PG- IV) ™ Nhóm Transeliminase (TE) Nhóm enzym này mới được tìm ra cách đâu không lâu. Nhóm enzym này phân cắt phi thủy phân chất pectin với sự tạo ra nối kép ở trong gốc galacturonic giữa nguyên tử carbon thứ 4 và thứ 5. Khi đứt liên kết α-1-4 bởi transeliminase thì hydro từ nguyên tử carbon thứ 5 của gốc axit galacturonic này được chuyển đến nguyên tử carbon thứ nhất của gốc axit galacturonic khác. Phản ứng xảy ra dễ dàng trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Hình 2.5: Sơ đồ phân cắt của enzym transeliminase. O OH OH H H H H O O COOH OH OHH H O H O H C OH OH O H H H H OH OH3C O H C OH OH H H H O OH3C O C OH3C 24 Transeliminase tác dụng được trên pectin cũng như trên axit pectic. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng có thể phân thành những nhóm enzym sau: 9 Pectin−traseliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 galacturonit- metilesterglucano-liase và mã số là 4.2.99.8. Những enzym tác dụng trên pectin và axit pectinic. Các enzym này lại phân thành: Endo- pectintranseliminase kiểu I ( Endo-PTE-I) và Exo-pectintransemilinase kiểu III ( Exo–PTE–III). 9 Poligalacturonat–transeliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 D- galacturonit glucanoniase và mã số là 1.2.99.3. Đây là những enzym tác dụng trên axit pectinic và axit pectic. Enzym này lại chia làm 2 loại: Endo polygalacturonat-transeliminase kiểu II (Endo-PGTE-II) và Exopolygalacturonat-transeliminase kiểu IV (Exo-PGTE-IV). 25 PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Thời gian thực hiện : từ ngày 15/3/2005 đến 15/7/2005 Địa điểm thực hiện : đề tài được nghiên cứu và thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh hoá thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 NGUYÊN LIỆU 3.2.1 Trái cacao Trái ca cao tươi được lấy từ huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Trước khi lấy hạt để lên men trái ca cao được lưu trữ ở nơi thoáng mát trong 7 - 9 ngày. Mục đích của quá trình này là giúp cho lớp cơm nhầy bao quanh hạt giảm đi giúp làm giảm độ ẩm của khối lên men sau này. Sau khi lưu trữ hạt được tách khỏi trái tươi. Sau khi tách hạt cần phải ủ ngay và không được lưu quá 20 ngày (Phạm Hồng Đức Phước, 2004). 3.2.2 Giống vi sinh vật Chủng được sử dụng là Aspergillus niger được lấy từ hai nguồn: ¾ Nguồn thứ nhất: từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học bộ môn Công nghệ sinh học đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh ¾ Nguồn thứ 2: từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên Chủng Aspergillus niger Thuộc nhóm: Aspergillus niger Giống: Aspergillus Họ: Aspergillaceae 26 Giống đưa vào nghiên cứu được bảo quản trong môi trường PGA giữ ở nhiệt độ 4oC. 3.2.3 Nguyên liệu làm môi trường Malt: là thành phần chính của môi trường malt để nuôi cấy nấm mốc. Malt rất giàu đường và các khoáng chất cho sự phát triển của nấm mốc. Malt được sử dụng trong thí nghiệm này là loại malt đã được xay nát dùng để sản xuất bia lấy từ khoa Công nghệ thực phẩm trường Cao đẳng công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Cám: trong cám gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng giúp cho nấm mốc phát triển tốt như: protein, lipid, tro, cellulose; các loại khoáng Na, Ca, K, Zn, Fe và các loại vitamin. Cám được sử dụng trong thí nghiệm là cám gạo được mua tại chợ Bình Tây thành phố Hồ Chí Minh. Trấu: được đưa vào môi trường với mục đích tạo độ thoáng, xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Đồng thời theo một số nghiên cứu cho thấy trấu là nhân tố kích thích hệ enzyme cellulase rất tốt ở các loài nấm mốc. Trong thí nghiệm này trấu được mua từ chợ Kim Biên thành phố Hồ Chí Minh là loại trấu khô, không bị mục nát, không lẫn nhiều các tạp chất khác Cà rốt: là thành phần kích thích sự tổng hợp của enzyme pectinase. Cà rốt sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từ nông trường Sông Hậu. Agar: sử dụng agar của công ty đồ hộp Hạ Long Muối sunfat amon (NH4)2SO4 là nguồn đạm bổ sung cho sự phát triển bình thường của nấm mốc. 3.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 3.3.1 Môi trường thạch malt Chúng tôi sử dụng môi trường malt để cấy truyền và phục hồi giống. Cách tiến hành làm môi trường Malt như sau 27 Lấy 200 g malt đã được xay nát cho vào becher 1000 ml. Thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Đặt becher trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 oC trong 1 giờ, sau đó tăng lên 65 oC trong 1 giờ sau. Trong quá trình thủy phân dịch malt được khuấy trộn để tăng khả năng thủy phân tinh bột. Quá trình thủy phân tinh bột tạo một lớp nước có màu nâu đục phía trên. Khi kết thúc quá trình thủy phân ta gạn thu phần dịch malt có màu nâu đục ở phía trên. Lọc qua bông gòn thấm nước để loại bỏ một số tạp chất còn sót lại. Dịch malt sau khi lọc được bổ sung agar với hàm lượng 18 ‰ thể tích dịch malt Đun sôi dịch malt và agar trên bếp ở nhiệt độ không quá cao và tiến hành khuấy liên tục tránh hiện tượng caramel hóa Chuẩn bị ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống khoảng 3 ml dịch malt Làm nút bằng bông gòn y tế không thấm nước và bao đầu ống nghiệm bằng giấy báo. Đem thanh trùng ở 121 oC, 1 atm, trong 15 phút Đặt nghiêng ống nghiệm tạo môi trường thạch nghiêng. Giữ môi trường malt ở nhiệt độ 4 oC 3.3.2 Môi trường nhân giống Chúng tôi sử dụng môi trường nhân giống có thành phần môi trường được lấy theo kết quả nghiên cứu của thạc sĩ Lê Hồng Phú trong luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ”. Môi trường này đã được xác định là thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme cellulase và pectinase của Aspergillus niger. Cụ thể nuôi cấy trên môi trường nhân giống có thành phần: cà rốt 9 %, trấu 15 %, cám 75 % và (NH4)2SO4 1 %, độ ẩm 64 %, thời gian 40 giờ. 28 Cách thực hiện môi trường nhân giống: Cấy Asp. niger trên môi trường thạch malt Thêm 10ml nước cất vào mỗi ống 48 giờ; 34,5 oC Dùng que cấy mài nhẹ trên mặt thạch tách bào tử Cân 75% cám, 9% cà rốt, 15% trấu, 1% (NH4)SO4 Thêm nước (V ml), trộn đều và cho vào erlen Thanh trùng ở 121oC, 1atm, 20 phút Lưu trữ ở nhiệt độ 34,5 oC trong 40 giờ Trộn đều Thể tích nước cất thêm vào (V ml) khi trộn các thành phần của môi trường nhân giống theo công thức: V ml = 64%.m – (w1.m1 + w2.m2 + w3.m3 + 10) Trong đó: V ml: lượng nước thêm vào để trộn các thành phần môi trường nhân giống 64%: độ ẩm của môi trường nhân giống m: khối lượng môi trường nhân giống w1, w2, w3: độ ẩm của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt m1, m2, m3: khối lượng của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt 10: thể tích nước cất thêm vào để tách bào tử Asp. niger từ môi trường thạch malt 3.3.3 Chế phẩm sinh học Mục đích của việc tạo chế phẩm là tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển, dễ sử dụng, và dễ bảo quản 29 Aspergillus niger sau khi được nhân giống trên môi trường bán rắn được trộn với bột mì rang vàng. Thêm nước cất để chỉnh độ ẩm của môi trường chế phẩm về độ ẩm mong muốn. Chế phẩm sau đó được đưa vào bịch nylon có sử dụng bông gòn làm nút. Mục đích của việc sử dụng bông gòn làm nút để giúp cho môi trường chế phẩm ở trạng thái hiếu khi nhưng vẫn không làm phát tán bào tử Asp. niger ra ngoài môi trường. Chế phẩm sau đó được cất giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 34,5 oC trong 3 ngày. 3.4 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.4.1 Dụng cụ và thiết bị Máy khúc xạ kế Cân phân tích Máy đo mật độ quang OD Tủ sấy Tủ ấm Tủ lạnh Bình hút ẩm Máy đo pH Bình tam giác Máy xay Bercher Erlen Pipette Bình định mức Ống đong Phễu lọc Que cấy Các loại chai lọ đựng hóa chất Đũa thủy tinh Bể điều nhiệt Máy vortex 30 Máy lắc mẫu Máy ép thủy lực Máy khuấy từ Tủ hấp Bình Kjeldahl 3.4.2 Hóa chất cho phân tích Nước cất NaOH HCl CMC (sodium carboxymethyl – cellulose) H2SO4 Cồn (C2H5OH) 96o Thuốc thử anthrone Antron Glucose C6H12O6 Saccharose Phenol Thuốc thử orcinol Dextrin Acid acetic DNS (dinitrosalicylic acid) Pectin ZnSO4 Pectinase Iod Ag(NO3) Ete ethylic H2O2 KNaC4H4O6.4H2O 31 H3BO3 HClO3 Lactose Na2HPO4 CaCl2 CuSO4 Na2CO3 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 3.5.1.1 Tuyển chọn giống Asp. niger thích hợp nhất cho quá trình lên men Nuôi cấy hai giống Asp. niger nghiên cứu trên hai môi trường có cùng điều kiện. Giống Asp. niger được cấy truyền trên môi trường thạch malt. Sau đó hai giống Asp. niger nghiên cứu được nhân giống trên môi trường bán rắn có thành phần 75 % cám gạo, 15 % trấu, 9 % bột cà rốt và 1 % (NH4)SO4, độ ẩm 64 % trong 40 giờ. Sau khi kết thúc quá trình nhân giống chúng tôi tiến hành xác định họat tính của 2 loại enzyme: cellulase, pectinase. 3.5.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ: giống Asp. niger/bột mì rang của chế phẩm lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Kết quả tuyển chọn giống vi sinh vật ở trên được áp dụng cho thí nghiệm này. Giống Asp. niger đã tuyển chọn sau khi thu từ môi trường nhân giống được trộn với bột mì rang. Tỷ lệ giống Asp. niger so với bột mì rang sử dụng trong thí nghiệm là 1:1, 1:2, 1:3 và 1:4. Độ ẩm của chế phẩm là 55 %, giữ chế phẩm ở 34.5 oC trong 5 ngày. Độ ẩm khối lên men là 55 %. Cố định lượng chế phẩm dùng lên men là 3 % khối lượng khối hạt ca cao lên men. 3.5.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng chế phẩm enzyme sử dụng để lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Kết quả khảo sát thu được từ hai thí nghiệm trên tiếp tục được sử dụng trong thí nghiệm này. Cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm tối ưu, giữ độ ẩm chế phẩm ở 32 55 %. Độ ẩm khối lên men được giữ ở 55 % trong suốt quá trình lên men. Thay đổi lượng chế phẩm lên men như sau: 0.5 %, 1 %, 3 %, 5 % so với khối lượng hạt ca cao đem lên men. Thời gian lên men là 5 ngày. 3.5.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm của khối lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Áp dụng những kết quả tối ưu thu được từ các thí nghiệm trước đó chúng tôi cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm, lượng chế phẩm sử dụng. Chúng tôi bố trí các mẫu mẫu lên men có độ ẩm thay đổi lần lượt: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. Thời gian lên men là 5 ngày. 3.5.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Sử dụng các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cố định các yếu tố sau: giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm lên men, lượng chế phẩm lên men sử dụng và độ ẩm của chế phẩm. Bố trí thí nghiệm lên men các mẫu cacao kết thúc ở các thời điểm: 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày và 7 ngày. 3.5.1.6 So sánh độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao từ phương pháp lên men truyền thống và bột ca cao từ phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật Ứng dụng những kết quả đã đạt được ở các thí nghiệm trên trong việc lên men Mẫu ca cao lên men không bổ sung vi sinh vật được lấy từ hộ nông dân Nguyễn Văn Lập tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Tiến hành qui trình sản xuất bột ca cao trong cùng điều kiện cho cả hai mẫu hạt ca cao nói trên 3.5.2 Phương pháp vi sinh vật 3.5.2.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống Môi trường PGA pha chế và bỏ vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng ở 121 oC trong 15 phút, lấy ra và để nghiêng 45o cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử dụng que cấy móc đã thanh trùng cấy truyền sang môi trường PGA. Giống sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 3 ngày sau đó được bảo quản ở 4 oC. Sau 2 tháng phải cấy truyền sang môi trường giữ giống mới. 33 3.5.2.2 Phương pháp nhân giống Cho 10 ml nước cất đã thanh trùng vào ống nghiệm chứa nấm mốc đã cấy chuyền ở trên, dùng que cấy đã thanh trùng cào nhẹ trên mặt thạch để bào tử hòa vào trong nước càng nhiều càng tốt. Sau đó đổ dung dịch đó môi trường bán rắn đã chuẩn bị ở trên, trộn đều, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để sử dụng tiếp. 3.5.3 Phương pháp hóa lý 3.5.3.1 Xác định độ ẩm Sấy khô đĩa petri đến khối lượng không đổi rồi đem cân xác định trọng lượng đĩa (m1). Cân một lượng chính xác 10 g mẫu cần phân tích đựng trên đĩa petri. Đem sấy khô mẫu ở 100-105 oC đến trọng lượng không đổi (m2). Thời gian sấy khô có thể lên đến 3 - 4 giờ. Trong quá trình sấy có thể dùng đũa thủy tinh đảo trộn để nước bốc hơi hết. Sau khi sấy xong đem ra để nguội trong bình hút ẩm trong 30 phút, sau đó đem cân. Trọng lượng được coi là không đổi khi chênh lệch giữa 2 lần cần kế tiếp không quá 0.03g. Độ ẩm được tính theo công thức: W(%) = (10 – (m2 – m1)) x 100/10 Trong đó: W: độ ẩm của mẫu (%) 10: khối lượng mẫu ban đầu (g) m1: khối lượng đĩa petri (g) m2: khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g) m2 – m1: khối lượng mẫu sau khi sấy 3.5.3.2 Phương pháp xác định độ hòa tan và cường độ màu của dung dịch ca cao Độ hòa tan trong luận văn này được định nghĩa là lượng chất tan (tính bằng g) có trong 10 g bột ca cao, chỉ tiêu này được xác định bằng khúc xạ kế Cân 10 g bột ca cao cho vào một becher, bổ sung 30 ml nước sôi, lọc lấy dịch giữ lại cặn, thêm 20 ml nước sôi vào cặn trên, lọc lấy dịch. Dung dịch này được đem đi xác định độ hòa tan bằng cách dùng khúc xạ kế. 34 Cũng dung dịch trên được đem đi xác định cường độ màu bằng máy đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng thích hợp 3.5.3.3 Phương pháp xác định bước sóng mà dung dịch ca cao hấp thu mạnh nhất Thu dung dịch ca cao như trên. Tiến hành pha loãng lần lượt dung dịch trên thành 6 nồng độ khác nhau: pha loãng 1 lần, 2 lần. 3 lần. 4 lần. 5 lần. 6 lần. Đem đo độ hấp thụ ánh sáng bằng máy đo quang phổ ở các bước sóng khác nhau. Bước sóng mà cho giá trị hấp thụ cao nhất được xác định là bước sóng để đo độ hấp thụ của dung dịch ca cao. 3.5.4 Phương pháp hóa sinh 3.5.4.1 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu của hạt cacao i. Phương pháp xác định độ tro của hạt cacao Cân chính xác khoảng 2 – 5 g hạt cacao trong một chén sứ đã biết trọng lượng khô tuyệt đối, cho thêm vào chén sứ 5 giọt HNO3 đậm đặc và 1 – 2 giọt H2O2 30%, cho vào lò nung ở 500 – 550 oC cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá. Lấy chén sứ ra và cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân chính xác. Tổng lượng tro được tính như sau: Tổng lượng tro (%) = Trọng lượng tro x 100/ trọng lượng mẫu khô ii. Tổng hữu cơ Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá huỷ bởi các tác nhân kiềm hay acid mạnh có tính oxy hoá ở nhiệt độ cao. Các chất hữu cơ bị oxy hoá hoàn toàn chuyển thành CO2 và nước bay ra khỏi chén sứ. Vì thế cách tính tổng hữu cơ như sau: iii. Phương pháp xác định N tổng số của hạt cacao Tổng hữu cơ (%) = 100 % - Tổng tro hữu cơ (%) N tổng số = N protein + N phi protein Trước tiên ta phải vô cơ hóa mẫu để biến đổi tất cả các loại đạm nằm dưới dạng nào đều trở thành dạng hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH4)SO4 Vô cơ hóa Nguyên tắc 35 Sự vô cớ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù dưới dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH4)SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác Thực hành : Cân chính xác 1 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho vào một bình cổ cao có dung tích 60 ml đến 100 ml (bình Kieldahl). Thêm vào đó 5 ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0.5 g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành 100 ml với nước cất. Chất xúc tác là hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 tỷ lệ 9 : 1 Phương pháp Kieldahl Nguyên tắc : Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng amonium sulfate đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac (NH4)2SO4 + 2NaOH Æ 2NH4OH + Na2SO4 Sau đó lượng amoniac được hơi nước lôi cuốn bằng dụng cụ máy Parnas- Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây cho phép ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu. Tiến hành Đun sôi bình nước của máy Parnas – Warner. Đặt bình tam giác có chứa 20ml H2SO4 N/100 và vài giọt methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút 10 ml dung dịch vô cơ hóa cho vào máy Parnas – Wargner, thêm vào đó 10 ml NaOH đậm đặc. Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang bình tam giác trong 3 phút, hạ bình tam giác xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào bình tam giác đựng H2SO4 N/100. Lấy bình tam giác ra và định phân H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH N/100 cho đến khi dung dịch đổi màu. Tính toán Hàm lượng nitơ có trong mẫu được xác định theo công thức 1 2( ).1, 42. .100( %) V V fN mg w −= 36 Trong đó V1: số ml H2SO4. 0,1N cho vào bình hứng V2: số ml NaOH dùng để chuẩn độ acid dư trong bình hứng f: hệ số điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở bình hứng, f=1 khi nồng độ H2SO4 chính xác 0,1 N w: khối lượng mẫu dùng để vô cơ hóa mẫu ứng với thể tích dung dịch lấy mẫu để định lượng nitơ tương ứng với 1 ml H2SO4 1,42: số mg nitơ iv. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan Nguyên tắc Sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4. Để tạo phản ứng màu có thể dùng thuốc thử khác nhau như phenol, antron hay orcinol Sự chính xác của kết quả này phụ thuộc: ¾ Độ sạch dụng cụ ¾ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H2SO4 ¾ Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun Tiến hành Nguyên liệu: lấy 1-2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50 mg đường Cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 90 % V vào. Đun sôi trên nồi cách thủy 3 lần Sau khi để nguội lọc qua lọc không tro Sau đó thêm 10 ml cồn 80 % V vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun hai lần tới sôi trên nồi cách thủy. Để nguội lại tiếp tục lọc. Chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa bã lên lọc và rửa sạch 2 - 3 lần bằng rượu nóng 80o Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong nồi cách thủy Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất Thực hiện phản ứng màu Hút 1 ml dung dịch đường cho vào ống nghiệm rồi đổ thêm 1 ml dung dịch phenol 5 %. Sau đó cho chính xác vào ống nghiệm 5 ml H2SO4 đậm đặc. 37 Để 10 phút rồi lắc và giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30 oC để xuất hiện màu. Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở bước sóng 490 nm Xây dựng đồ thị mẫu Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0.1% mẫu trên, cho nước cất vào đến vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H2SO4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg saccharose. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu. Mẫu thử không với 1ml nước cất thế dung dịch đường v. Phương pháp định lượng cellulose Nguyên tắc Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic Tiến hành Cân 2 g hạt cacao đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 105 oC), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml Thêm vào bình 16.5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đậm đặc và 15 ml acid acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng Rửa kết tủa cellulose 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 – 15 ml) Rửa bằng rượu ethylic 96 % 1 – 2 lần, mỗi lần 10 – 15 ml Rửa bằng ete ethylic Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 – 105 oC đến trọng lượng không đổi (2 – 3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose chủ yếu là pentosan và lignin. Do đó cellulose xác định gọi là cellulose thô Tính kết quả Hàm lượng cellulose tính bằng công thức sau 38 .100aX w = Trong đó X: hàm lượng cellulose tính bằng % a: trọng lượng cellulose (g) w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: hệ số chuyển thành % vi. Phương pháp định lượng pectin Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa Tiến hành Cân 0.15 g mẫu hạt cacao có chứa pectin vào becher 100 ml Cho thêm 100 ml NaOH 0,1 N Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic Thêm 50 ml dung dịch CH3COOH Sau 5 phút thêm 50 ml dung dịch CH3COOH Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tro đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clo nữa (thử nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1 % không có kết tủa trắng) Sau khi rửa xong cho giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi Tính kết quả Hàm lượng của canxi pectat bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau: .0,92.100wP B = Trong đó w: trọng lượng kết tủa canxi pectat (g) 39 B: lượng pectin lấy đem xà phòng hóa khoảng 0.15 (g) 0.92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin chiếm 92 % trọng lượng canxi pectat) 100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo %. 3.5.4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme của Asp. niger i. Phương pháp trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy Asp. niger Cân chính xác 1g môi trường nhân giống Asp. niger. Nghiền mẫu cùng bột thủy tinh trong môi trường lạnh 4 oC để tránh mất hoạt tính enzyme. Thêm 100 ml nước muối 0,3 %, khuấy đều rồi đem lọc qua giấy lọc thu dung dịch enzyme 1%. Giữ lạnh dung dịch và sử dụng trong vòng 2 ngày. ii. Xác định hoạt tính CMCase Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl-cellulose) bằng enzyme ở pH 5.0 và 40 oC. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Cách thực hiện Phản ứng enzyme Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 40 oC trong 10 phút Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng enzyme. Để tránh bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút. Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (AT) Phản ứng thử không Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. 40 Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều Để tránh sự bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút. Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh. Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (AB) Phản ứng của các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Hút lần lượt 1 ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Thêm vào 1 ml dung dịch cơ chất và lắc đều Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS. Lắc đều Dán nilon hay parafilm lên miệng ố nghiệm, đặt vào nồi nước sôi trong 15 phút. Đưa về nhiệt độ phòng bằng nồi nước lạnh Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (AG) Đối với nước cất: làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nước cất. Đo OD 540 nm (AW) Tính toán Tính hệ số glucose Hệ số glucose được tính bằng công thức ( /G G W C mg mlF A A = − ) Trong đó F: hệ số glucose CG: nồng độ của dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) AG: độ hấp thụ OD của dung dịch glucose chuẩn AW: độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất Xác định hoạt tính enzyme Sử dụng công thức sau: 1000 1 1 1( / ) ( ). . . . . 180 10 1T B CMCase u g A A F phut ml C = − 41 Trong đó AT: độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme AB: độ hấp thu OD của phản ứng thử không F: hệ số glucose (mg/ml) 1000: chuyển từ mg sang μg 180: trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ μg sang μmol 10 phút: thời gian phản ứng C: nồng độ dung dịch mẫu (g/ml) iii. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu Nguyên tắc Xác định lượng galacturonic acid là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới tác dụng của pectinase không kết tủa bằng ZnSO4 Cách tiến hành Cho 20 ml dung dịch pectin 1 % vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 10 ml dung dịch enzyme 1 %, lắc đều và cho vào tủ ấm ở 30 oC (dung dịch pectin có pH = 3,9 – 4,1). Sau 60 phút lấy ra thêm vào 2 ml ZnSO4 15 %, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được đem pha loãng gấp 5 lần dùng cho phản ứng với Antron Lấy 5 ml Antron cho vào ống nghiệm, rồi cho 2.5 ml dung dịch lọc đã pha loãng, lắc mạnh trong thời gian 10 phút. Sau đó đặt trong nồi cách thủy ở 70 oC trong thời gian 12 phút. Sau đó lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng 584 nm. Tính kết quả Hoạt tính pectinase được tính bằng công thức 0,340. 0,0104ODDVHT m −= Trong đó OD: mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron m: lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml) 42 3.5.5 Qui trình sản xuất bột ca cao trong phòng thí nghiệm Rửa sạch Sấy khô Làm nguội Hạt ca cao tươi Ủ Chế phẩm sinh học Sấy khô Loại hạt lép, sâu Rang, 20’, t = 140oC Tách vỏ Đập nhỏ hạt nhân Kiềm hóa bằng dd Na2CO3 3%, 80oC, 45’ Xay nhuyễn Ép bơ bằng máy ép thủy lực Xay nhuyễn ở nhiệt độ lạnh Bột ca cao 43 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA HẠT CA CAO Bảng 4.1: Các thành phần chủ yếu có trong hạt ca cao tươi STT Thành phần Phần trăm so với khối lượng Chất nhầy Hạt nhân 1 Độ pH 3.5 4.5 2 Đường tổng số hòa tan (%) 14 1.6 3 Hàm lượng đường khử (%) 9 4 Hàm lượng pectin (%) 9.568 11 5 Hàm lượng tro (%) 2.2 3 6 Tổng lượng hữu cơ (%) 97.78 97 7 Nitơ tổng % 2.26 8 Hàm lượng cellulose (%) 1.89 16 (nguồn từ kết quả thực nghiệm) Nhận xét Từ các số liệu thu thập được, chúng tôi nhận thấy rằng chất hữu cơ là một thành phần chiếm chủ yếu trong hạt ca cao. Trong đó, ở cả lớp nhầy và hạt nhân chúng tôi đều nhận thấy thành phần pectin và cellulose chiếm một tỷ lệ khá lớn. Ở lớp nhầy hàm lượng pectin và cellulose tương ứng là 9.568 % và 1.89 %. Còn trong phần hạt nhân tỷ lệ là 11 % pectin và 16 % cellulose. Cellulose và pectin là những thành phần rất bền và khó phân giải nếu chỉ sử dụng các tác nhân hóa học, nhiệt độ hay cơ học… Trong tế bào thực vật, cellulose và pectin phân bố chủ yếu ở lớp vỏ tế bào. Do khả năng khó bị phá vỡ nên chúng cản trở những thành phần hòa tan có trong tế bào chiết ra môi trường bên ngoài. Chính những thành phần hòa tan này mới dễ được cơ thể hấp thụ và sử dụng. Vì vậy để tăng khả năng hòa tan của bột ca cao cần phải phá vỡ những cấu 44 trúc pectin và cellulose bền vững bằng phương pháp sinh học. Chúng tôi chọn nấm mốc Aspergillus niger là loại vi sinh vật có khả năng tạo enzyme cellulase, pectinase cao và đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm để bổ sung vào quá trình lên men. 4.2 TUYỀN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO Chúng tôi tiến hành so sánh dựa trên hai giống nấm mốc được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên và tại phòng thí nghiệm công nghê sinh học trường Đại học Bách khoa. Nuôi hai giống Asp. niger trong cùng một điều kiện môi trường có 9 % cà rốt, trấu 15 %, cám 75 %, và 1% (NH4)SO4, độ ẩm 64 %, thời gian 48 giờ. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. Bảng 4.2:So sánh hoạt tính enzyme cellulase và pectinase do hai giống Asp. niger lấy từ trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Đại Học Bách Khoa tạo ra Giống Asp. niger Bách Khoa Asp. niger Tự Nhiên Hoạt tính cellulase 2.3 UI/g MT 1.9 UI/g MT Hoạt tính pectinase 650 đvht/g MT 600 đvht/g MT (nguồn từ thực nghiệm) Nhận xét Mục đích của việc tuyển chọn là chọn ra giống Asp. niger có khả năng tạo enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao nhất. Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng giống Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa cho enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao hơn hẳn so với giống Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đai học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh. Được biết giống Asp. niger của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Tp.HCM là giống nấm mốc đã được tuyển chọn không sinh độc tố thích hợp cho việc sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Chúng tôi quyết 45 định chọn giống Asp. niger của trường Đại học Bách Khoa để lên men trong các thí nghiệm tiếp theo. 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ GIỮA GIỐNG VI SINH VẬT VỚI BỘT MÌ RANG ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Chúng tôi sử dụng giống Asp. niger được lấy từ Bộ môn Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh trong thí nghiệm này. Tiến hành cùng lúc 4 thí nghiệm như đã nêu ở phần 3.5.1.2. 4.3.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến độ hòa tan Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Độ hòa tan 2.4 2.5 2.8 2.5 2.4 2.5 2.8 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1\1 1\2 1\3 1\4 Tỷ lệ giống/bột mì rang Đ ộ h òa ta n Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến độ hòa tan 46 Nhận xét Trong quá trình phát triển nấm Aspergillus niger tiết ra các enzyme như cellulase, pectinase phá vỡ cấu trúc cellulose và pectin trong hạt cacao nên những chất tan có trong hạt cacao có khả năng tan vào dung dịch dễ dàng hơn. Do đó độ hòa tan tỷ lệ thuận với khả năng phân giải của enzyme cellulase và pectinase. Một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tiết enzyme là thành phần môi trường dinh dưỡng. Bột mì rang được trộn chung với Asp. niger có tác dụng như là một nguồn dinh dưỡng giúp cho sự phát triển của nấm mốc. Trong bột mì có nhiều thành phần thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm mốc. Áp lực về nồng độ cơ chất lên nấm mốc sẽ điều chỉnh lượng enzyme tiết ra nhiều hay ít. Tuy nhiên, không phải cứ tăng hàm lượng cơ chất thì sự sinh tổng hợp enzyme cũng tăng theo, mà khi đến một ngưỡng nhất định thì sự tổng hợp enzyme không thể tăng nữa. Sự tổng hợp enzyme tùy thuộc vào năng lực tiết đối đa của từng loại vi sinh vật, mỗi loài có một ngưỡng nhất định. Ngoài ra nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do hai lý do, thứ nhất cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp; thứ hai cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định được tỷ lệ giống Asp. niger : bột mì rang tối ưu nhất để tăng độ hòa tan của cacao là 1:3. 4.3.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến cường độ màu Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Cường độ màu 1.98 2.134 2.229 2.028 47 1.98 2.056 2.229 2.028 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 1/2 1/3 1/4 Tỷ lệ giống/bột mì rang C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến cường độ màu Nhận xét Từ những khảo sát thực tế (như đã nêu ở mục 3.5.3.3) chúng tôi đã xác định được dung dịch ca cao hấp thụ bước sóng 390 nm cao nhất. Trong luận văn này chúng tôi sử dụng bước sóng 390 nm để xác định cường độ màu của dung dịch ca cao. Màu của dung dịch lọc từ bột ca cao là do các chất hòa tan tạo thành. Do đó cường độ màu của dung dịch ca cao càng cao thì độ hòa tan càng nhiều và ngược lại. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định được cường độ màu của dung dịch ca cao cao nhất ở tỷ lệ 3 bột mì rang : 1 giống Asp. niger 4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG ĐỂ LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Dựa vào kết quả thu được từ thí nghiệm trên chúng tôi chọn tỷ lệ 3 bột mì rang / 1 giống Asp. niger để tạo chế phẩm enzyme. Thí nghiệm được thiết kế như đã nêu ở phần 3.5.1.3. 48 4.4.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.5: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan Lượng chế phẩm sinh học (%) 0.5 1 3 5 Độ hòa tan 3.0 3.4 3.1 2.8 3 3.4 3.1 2.8 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0.5% 1% 3% 5% Lượng chế phẩm sinh học Đ ộ hò a ta n Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan Nhận xét Độ hòa tan của dung dịch là lượng chất hòa tan có trong dung dịch đó. Tỷ lệ chế phẩm cho vào càng nhiều thì khả năng phân giải các chất phức tạp càng cao. Khi đó các chất hòa tan càng dễ chiết ra khỏi ca cao để hòa tan vào dung dịch. Tuy nhiên không phải càng nhiều chế phẩm thì lượng chất hòa tan càng tạo ra nhiều. Vi sinh vật cần có đủ lượng cơ chất cần thiết để phát triển. Vì vậy nếu bổ sung lượng chế phẩm sinh học quá lớn thì nhu cầu về cơ chất của nấm mốc càng cao. Khi đó nấm mốc sẽ sử dụng những chất hòa tan để tiếp tục phát triển, làm cho độ hòa tan giảm đi. Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy ở tỷ lệ 0.5% chế phẩm lượng chế phẩm còn ít nên khả năng phân giải không cao dẫn đến tỷ lệ hòa tan thấp. Ở tỷ lệ 1% chế phẩm trên tổng lượng ca cao lên men cho kết quả độ hòa tan cao nhất. Những tỷ lệ chế phẩm cao hơn 3%, và 5% đều cho kết quả là độ hòa tan giảm mạnh. 49 4.4.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.6: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến cường độ màu Lượng chế phẩm sinh học 0.5 % 1 % 3 % 5 % Cường độ màu 2.163 2.178 2.148 2.174 2.163 2.306 2.248 2.204 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0.5% 1% 3% 5% Lượng chế phẩm sinh học C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm đến cường độ màu Nhận xét Những chất chiết hòa tan tạo ra màu sắc của dịch ca cao. Lượng chất hòa tan trong dung dịch càng cao thì cường độ màu khi đo càng lớn. Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận ra rằng khi lượng chế phẩm sử dụng ở mức 0,5 %, khả năng phân giải của nấm mốc không cao nên lượng chất tan sinh ra không nhiều, cường độ màu cũng ở mức thấp. Lượng chất tan thu được ở tỷ lệ chế phẩm 1% là cao nhất 2,178 kéo theo cường độ màu đạt được ở mức cao nhất. Ở những tỷ lệ chế phẩm cao hơn 3% và 5% khi nhu cầu cơ chất của nấm mốc tăng cao, nấm mốc phải sử dụng những chiết chất hòa tan do đó lượng chiết chất hòa tan trong dung dịch giảm xuống rõ rệt do đó cường độ màu cũng giảm theo tỷ lệ thuận. 50 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM KHỐI LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Từ kết quả đạt được ở những thí nghiệm trước chúng tôi chọn giống Asp. niger của trường Đại học Bách Khoa, tỷ lệ giống vi sinh vật / bột mì rang là 1:3 để tạo chế phẩm sinh học, lượng chế phẩm sử dụng để lên men là 1 % khối lên men để áp dụng cho thí nghiệm này. Thí nghiệm được thiết kế như đã đề cập ở mục 3.5.1.4 4.5.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan Độ ẩm khối lên men 50% 55% 60% 65% Độ hòa tan 2.8 3.3 3.8 3.5 2.8 3.3 3.8 3.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50% 55% 60% 65% Độ ẩm khối lên men Đ ộ h òa ta n Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan Nhận xét Hầu như các quá trình sống của nấm đều có liên quan đến nước do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp tức lượng nước trong môi trường thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc làm tế bào bị chết. Nhưng nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Chỉ ở 51 một độ ẩm nhất định, khi đó hoạt động trao đổi chất diễn ra tốt nhất thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc mới diễn ra tốt nhất. Sự sinh trưởng và phát triển mạnh thể hiện qua việc tiết ra một lượng lớn enzyme ngoại bào để phân giải cơ chất. Chúng tôi đã xác định độ ẩm của khối lên men 60% thì độ hòa tan của bột ca cao là cao nhất. 4.5.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu. Bảng 4.8: Ảnh hưởng của khối lên men đến cường độ màu Độ ẩm khối lên men 50% 55% 60% 65% Cường độ màu 2.232 2.286 2.349 2.304 2.23 2.264 2.349 2.289 0 0.5 1 1.5 2 2.5 50% 55% 60% 65% Độ ẩm khối lên men C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.6: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến cường độ màu Nhận xét Cũng như các trường hợp trên, chúng tôi nhận thấy rằng cường độ màu của dung dịch ca cao tỷ lệ với độ hòa tan. Lượng chất hòa tan càng cao thì cường độ màu của dung dịch càng cao và ngược lại. Trong thí nghiệm này chúng tôi ghi nhận ở độ ẩm 50% cường độ màu là 2.232, ở độ ẩm 55% cường độ màu là 2.286, ở độ ẩm 60% cường độ màu là 2.349 đây là giá trị cao nhất đạt được, còn ở độ ẩm 65% cường độ màu giảm xuống còn 2.304. 52 4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Sau khi đã xác định được một số điều kiện tối ưu cho quá trình lên men như giống Asp. niger Bách Khoa, tỷ lệ giống / bột mì rang là 1:3, độ ẩm chế phẩm 60%, lượng chế phẩm sử dụng là 1 % lượng hạt lên men. Chúng tôi sử dụng các kết quả trên cho thí nghiệm này. Thí nghiệm được bố trí như đã nêu ở mục 3.5.1.6 4.6.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan Thời gian lên men 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ 168 giờ Độ hòa tan 3.8 4.2 3.9 3.6 3.3 3.8 4.2 3.9 3.6 3.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 72 96 120 144 168 Thời gian lên men (giờ) Đ ộ h òa ta n Đồ thị 4.7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan Nhận xét Nấm mốc khi được cấy vào môi trường không có nghĩa chúng tiết ngay ra enzyme. Trong giai đoạn đầu, nấm mốc từ môi trường chế phẩm chuyển sang môi trường sản xuất chưa kịp thích ứng với môi trường mới, nấm mốc phát triển chưa nhiều nên chưa sử dụng hết những chất đơn giản trong ca cao để sinh trưởng, hơn nữa 53 lượng enzyme ngoại bào trong chế phẩm ít nên sử dụng chưa nhiều những chất phức tạp như pectin, cellulose trong hạt ca cao. Thêm vào đó thời gian đầu lớp chất nhầy bao quanh hạt ca cao còn dầy nên những enzyme chưa thể xâm nhập để phá vỡ những cấu trúc cellulose, pectin bên trong hạt ca cao được. Theo quan sát của chúng tôi trong hai ngày đầu lớp chất nhầy còn bám nhiều, đến ngày thứ 3 lớp chất nhầy hầu như bị loại bỏ và nấm mốc bắt đầu phát triển. Sau khi lớp nhầy bị loại bỏ, nấm mốc phát triển mạnh nhu cầu về nguồn cơ chất tăng cao nấm mốc phải tiết enzyme để phân hủy các chất phức tạp. Khi những cấu trúc phức tạp cellulose và pectin bị phá hủy, những chất hòa tan có thể dễ dàng hòa tan vào môi trường. Tuy nhiên không phải thời gian càng dài thì độ hòa tan càng cao. Khi nấm mốc phát triển mạnh, áp lực về cơ chất càng cao do đó nấm mốc phải sử dụng ngược lại những chất hòa tan làm độ tan giảm đi. Độ hòa tan đo được khi lấy mẫu ở 72 giờ là 3.8. Đến 96 giờ độ hòa tan đạt được giá trị cao nhất 4.2 sau đó ở các thời điểm 120, 144, 168 giờ độ hòa tan giảm dần. 4.6.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.10: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến cường độ màu Thời gian lên men 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ 168 giờ Cường độ màu 2.356 2.401 2.372 2.298 2.277 2.356 2.401 2.372 2.298 2.277 0 0.5 1 1.5 2 2.5 72 96 120 144 168 Thời gian lên men (giờ) C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.8: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến cường độ màu 54 Nhận xét Cũng như các thí nghiệm trước, độ hòa tan của dung dịch ca cao vẫn tỷ lệ với độ hòa tan. Trong 72 giờ đầu khi lớp nhầy bao quanh hạt còn nhiều lượng chất tan ít cường độ màu đo được chỉ 2,356. Nhưng sau 96 giờ, độ hòa tan cao nhất thì cường độ màu đạt được cũng ở giá trị cao nhất 2,401. Ở những thời điểm 120,144, 168 giờ lượng chất hòa tan giảm dần do sự tái sử dụng những chất hòa tan, lượng chất chất giảm dần do đó cường độ màu mà chúng tôi xác định được tương ứng 2,372; 2,298; 2,277. 4.7 SO SÁNH ĐỘ HÒA TAN VÀ CƯỜNG ĐỘ MÀU GIỮA BỘT CA CAO ĐƯỢC LÊN MEN CÓ VÀ KHÔNG BỔ SUNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN Ứng dụng những điều kiện tối ưu đã xác định trong quá trình lên men hạt ca cao. Hai mẫu ca cao lên men có và không bổ sung vi sinh vật được sản xuất tạo ra bột ca cao trong cùng điều kiện như nhau Bảng 4.11: So sánh độ hòa tan và cường độ màu của hai mẫu ca cao có và không bổ sung vi sinh vật trong quá trình lên men Mẫu ca cao Có bổ sung vi sinh vật Không bổ sung vi sinh vật Độ hòa tan 4.3 2.1 Cường độ màu 2.409 1.568 Nhận xét Như chúng tôi đã kết luận trong thí nghiệm đầu tiên, hàm lượng cellulose và pectin trong hạt ca cao tươi rất cao. Hai thành phần này lại rất bền vững và khó phân giải bằng các tác nhân nhiệt độ, cơ, hóa học…Các thành phần này sẽ cản trở những chất hòa tan trong tế bào chiết ra ngoài môi trường. Do đó, ở mẫu lên men không bổ sung vi sinh vật chúng tôi nhận thấy độ hòa tan và cường độ màu không cao chỉ ở mức 2.1 và 1.568. Ở mẫu lên men có bổ sung Asp. niger trong quá trình lên men đã tối ưu 55 chúng tôi thu được kết quả rất khả quan ở cả hai chỉ tiêu độ hòa tan và cường độ màu. Giá trị độ hòa tan và cường độ màu lần lượt đạt 4.3 và 2.409. Điều này cũng dễ hiểu do Asp. niger là loại nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase và pectinase cao. Do đó cấu trúc pectin và cellulose dễ dàng bị phân hủy bằng phương pháp sinh học. 56 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1. Hàm lượng cellulose và pectin chiếm tỷ lệ lớn trong thành phần của hạt ca cao tươi. Hai thành phần bền, khó phân giải này sẽ cản trở những chất hòa tan trong bột ca cao chiết ra môi trường bên ngoài. Chúng tôi sử dụng nấm Asp. niger là loại nấm mốc có khả năng sinh cellulase và pectinase cao bổ sung vào quá trình lên men để tăng khả năng phân giải cellulose và pectin. 2. Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi xác định rằng giống nấm mốc Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh là thích hợp nhất cho mục đích phân giải cellulose và pectin để gia tăng lượng chiết chất hòa tan 3. Chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đề ra là xác định điều kiện tối ưu nhất cho quá trình lên men có bổ sung vi sinh vật. Cụ thể chế phẩm sinh học có tỷ lệ giống Asp. niger : bột mì rang là 1 :3; độ ẩm tối ưu khối lên men là 60 %; lượng chế phẩm sử dụng lên men chiếm 1 % khối lượng hạt lên men; thời gian lên men kéo dài 96 giờ. 4. Kết quả khi đem so sánh hai chỉ tiêu độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao lên men có sử dụng vi sinh vật và bột ca cao lên men không sửng dụng vi sinh vật chúng tôi nhận thấy việc bổ sung vi sinh vật cho kết quả cao hơn hẳn. 5.2 KIẾN NGHỊ Đề tài mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá độ hòa tan của bột ca cao khi lên men bổ sung nấm mốc Asp. niger Thử nghiệm một số loại vi sinh vật khác để tăng hiệu quả của việc lên men. Tiến hành cảm quan chất lượng ca cao theo nhiều chỉ tiêu để có đánh giá chung nhất chất lượng sản phẩm cuối cùng của ca cao lên men. 57 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Lam Điền, 2002. Bước đầu nghiên cứu công nghệ chế biến cacao bằng phương pháp ủ đống. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ Sư Nông Học, Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 51 trang 2. Vương Thị Việt Hoa, 2002 - 2003. Thực tập vi sinh vật đại cương. Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 3. Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học: Thí nghiệm hóa sinh. Tập 1. NXB Đại học quốc gia Tp HCM, Tp HCM. 183 trang. 4. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ vi sinh học, tập 1, Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 5. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ vi sinh học, tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 6. Lê Hồng Phú, 2003. Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ. Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Bách Khoa, Tp HCM. Việt Nam. 7. Phạm Hồng Đức Phước, 2004. Kỹ thuật trồng ca cao ở Việt Nam. Dự án Success Alliance. 140 trang. 8. Phạm Trí Thông, 1999. Bài giảng: Bảo quản – chế biến cacao. Tủ sách Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh. 49 trang. 9. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tài Sum, 1996. Cây ca cao trên thế giới và triển vọng ở Việt Nam. NXB Nông Nghiệp, Tp HCM. TIẾNG ANH 10. Eustace A. Iyayi, 2004. Changes in the cellulose, sugar and crude protein contents of agro-industrial by-products fermented with Aspergillus niger, Aspergillus flavus and Penicillium sp. African Journal of Biotechnology Vol. 3, March 2004. p. 186-188. 58 11. F. Hardy, 1960. Cacao manual.American Institute of Agricultural. p.147-175. 12. ITDG intermediate technology development group pratical answers to poverty, 1999). Cocoa and chocolate. Technical brief, United kingdoms. 5 pages 13. Iwao Hachiya, 2003. Discourse on a history of chocolate: culture and science (part 1). Foods food ingredients J. Ipn. Vol .208. No.3. 2003. 14. Lerceteau, E.; Rogers, J.; Pétiard V. and Crouzillat D, 1999. Evolution of cacao bean proteins during fermentation: a study by two-dimensional electrophoresis. Journal Science Food Agriculture, vol. 79.p 619-625. 15. Masahiro Takagi, Tatsuya Kamiwaki, Hiroaki Ashitani, and Shunpei Sakamoto, 2003. Venezuela cacao beans and their fragrance and flavor characteristics. Foods food ingredients J. Jpn., Vol. 208, No. 12, 2003 16. Ronald P. DE Vries and Jaap Visser, 2001. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides. Microbiology and molecular biology reviews, vol. 65, No. 4. p.497–522 17. Reineccius, G. A.; Andersen, D. A.; Kavanagh, T. E. and Keeney, P. G, 1972. Identification and quantification of free sugars in cocoa beans. Journal Agriculture Food Chemistry, vol. 20. p 199-202. 18. Yoshiyama, M. and Ito, Y., 1996. Decrease of astingency of cacao beans by na enzymatic treatment. Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi, vol 43. p. 124-129.