Khóa luận Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó

o dài hơn. Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động độc lập về phía trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu hƣớng lội ngƣợc dòng 18 nƣớc. Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, mà đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định. Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng sử dụng năng lƣợng theo 3 phƣơng thức: Oxy hóa yếm khí: Fructose → acid lactic + CO2 + Q (27,7 Kcal) Với enzyme xúc tác là hexokinase, photphatase. Oxy hóa hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 674 Kcal Hệ số hô hấp của tinh trùng là số µl O2 tiêu hao cho 10 5 tinh trùng trong 1 giờ ở 37oC. Đây là chỉ tiêu đánh giá sức sống của tinh trùng. Phân giải ATP: do enzyme ATPase ở cổ và đuôi tinh trùng ATP → ADP + P + Q (7-12 Kcal) 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tuổi thọ và năng lƣợng vận động của tinh trùng phụ thuộc vào: Nhiệt độ: khi ở nhiệt độ cao, tinh trùng vận động mạnh làm tiêu hao nhiều năng lƣơng nên tinh trùng nhanh chết. Nhiệt độ thấp sẽ ức chế hoạt động của tinh trùng, do đó sẽ kéo dài tuổi thọ tinh trùng. Cơ sở này đã đƣợc ứng dụng trong công nghệ làm tinh đông viên hoặc tinh cọng rạ -196oC. pH: pH trung tính hay kiềm làm tinh trùng vận động mạnh, tiêu tốn nhiều năng lƣợng, dẫn đến giảm tuổi thọ tinh trùng. pH acid yếu ức chế vận động của tinh trùng nên sẽ kéo dài tuổi thọ của tinh trùng. 19 Áp suất thẩm thấu: môi trƣờng nhƣợc trƣơng hay ƣu trƣơng đều giảm thời gian sống của tinh trùng. Ánh sáng: tia tử ngoại và hồng ngoại kích thích vận động cuả tinh trùng, làm tinh trùng tiêu năng lƣợng và giảm tuổi thọ. Chất hóa học: tinh trùng mẫn cảm với muối kim loại nặng. Màng tinh trùng mang điện tích âm đẩy rời ra nhau, khi gặp điện tích dƣơng thì điện tích âm bị trung hòa, do đó tinh trùng dính vào nhau và mất khả năng vận động tiến thẳng. 2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 2.6.1 Lịch sử IVF Sau khi IVM thành công trên một số loài thì các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu về kỹ thuật IVF. IVF đã thành công trên rất nhiều loài động vật nhƣ chó, heo, thỏ, bò…Kỹ thuật ra đời đã mang lại một ý nghĩa to lớn trong việc giải quyết vấn đề vô sinh ở ngƣời. Năm 1959, con thỏ đầu tiên ra đời từ phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm Năm 1972, con chuột đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh. Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại, bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh. Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine ra đời bằng công nghệ này ở Pháp. Những năm 80 của thế kỷ XX, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm phát triển mạnh. Singapore đƣợc ghi nhận là nơi thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm đàu tiên ở châu Á vào năm 1983 Năm 1984, một phôi đông lạnh đƣợc rã đông để cấy vào tử cung, đã cho ra đời bé trai đầu tiên là Zoe. Năm 1986, Cheng và ctv đã thành công IVF heo Năm 1990, Gordon và Lu đã tạo thành công phôi bò IVF Năm 1992, Yamada và ctv đã tạo phôi chó thành công Năm 1994, Madan và ctv đã tạo thành công phôi trâu IVF Năm 2006, Kim và ctv thành công IVF trên chó. 20 Ở Việt Nam: Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM đã thành công trên bò, chuột và heo. Thụ tinh nhân tạo thành công trên ngƣời ở bệnh viện Từ Dũ, Hùng Vƣơng. 2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh (Phạm Thị Minh Đức và ctv, 2001) Khi còn trong tinh dịch, một lƣợng lớn cholesterol bọc quanh đầu tinh trùng, tạo thành màng bao bọc quanh đầu bền vững và ngăn chặn sự giải phóng enzyme. Khi di chuyển trong đƣờng sinh dục cái lớp cholesterol bị mất, màng tinh trùng yếu và tăng tính hấp thụ đối với Ca2+, Ca2+ cao trong bào tƣơng của đầu tinh trùng làm tăng vận động của tinh trùng và giải phóng enzyme. Đầu tinh trùng dự trữ lƣợng lớn hyaluronidase và enzyme thủy phân protein. Hyaluronidase phá hủy liên kết các tế bào hạt quanh noãn, sau đó nhờ enzyme phân giải protein mà tinh trùng có thể chọc thủng màng trong suốt của noãn và tiếp cận với lớp vỏ bao quanh noãn. Tại đây có các thụ thể cố định màng trƣớc của tinh trùng vào lớp vỏ noãn, màng trƣớc tinh trùng bị tiêu đi, giải phóng enzyme và mở đƣờng xâm nhập vào lòng noãn, màng trong đầu tinh trùng tan ra và vật chất di truyền của đầu tinh trùng xâm nhập vào noãn. Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng (Nguồn: Naokazu et.al., 2005) 21 2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi Quá trình thụ tinh hoàn tất dẫn đến quá trình hình thành phôi ở dạng một tế bào. Sau đó, phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, và 16 tế bào (tế bào nguyên phôi-blastomer). Các blastomer này ngày càng đƣợc phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn và kết hợp lại thành khối rắn chắc đƣợc gọi là phôi dâu (morula), lúc này rất khó nhìn thấy từng tế bào trong phôi, khối tế bào chiếm gần hết không gian của trứng. Sau đó, phôi tiếp tục phát triển hình thành dạng phôi nang (blastocyst) và có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khối cầu rỗng. Tiếp đó, blastocyst qua giai đoạn phôi nang trƣơng nở (expanded blastocyst) và thoát khỏi màng trong suốt ở giai đoạn thoát nang (hatching blastocyst) rồi bắt đầu làm tổ trong tử cung. 22 2.6.4 Vật liệu cho IVF (Phan Kim Ngọc, 2006) 2.6.4.1 Giao tử Trứng (noãn) dùng cho thụ tinh in vitro thƣờng có thể ở 3 dạng: trứng non, trƣởng thành và hậu trƣởng thành. Tùy mức độ phát triển của trứng mà tiến hành các thao tác tiền xử lý khác nhau, thông qua việc nuôi trong khoảng thời gian nhất định trƣớc khi thụ tinh. Các tinh trùng dùng cho thụ tinh in vitro đƣợc chuẩn bị theo một số phƣơng pháp: swim up, tạo vón cục kết hợp swim up, ly tâm, lắng… nhằm làm tăng nồng độ và khả năng hoạt động của tinh trùng. Nồng độ tinh trùng đƣợc quyết định do số lƣợng tinh trùng và dung tích của vi giọt môi trƣờng thụ tinh. Thƣờng thì nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là 105 tinh trùng bình thƣờng/ml, nếu các tinh trùng thiếu các tiêu chuẩn về độ di động và hình thái thì nồng độ thụ tinh phải cao hơn. Nồng độ tinh trùng dƣới 5.104/ml thì kết quả IVF không tốt, tuy nhiên nếu nồng độ tinh trùng quá cao cũng không thuận lợi cho IVF vì sẽ tăng khả năng đa bội, thậm chí sẽ ảnh hƣởng khả năng sống sót của phôi bởi các enzyme trong đầu cực tinh trùng có hại cho trứng và phôi, mẫu tinh trùng chết có thể gây tổn thƣơng cho trứng vì các gốc oxy tự do. 2.6.4.2 Môi trƣờng IVF Thông thƣờng môi trƣờng nuôi trứng còn đƣợc sử dụng cho giai đoạn thụ tinh, thậm chí còn cho cả giai đoạn hình thành và phát triển phôi sau này. Tuy nhiên hiệu quả này không rõ ràng. Trong các môi trƣờng thụ tinh in vitro, có 3 nhóm chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng: muối, cơ chất năng lƣợng (pyruvate, glucose, lactate), và nguồn protein. Ion Ca2+, bicarbonat, tỷ lệ Na+/K+ gần giống trong dịch ống dẫn trứng. Ca2+ cần thiết cho phản ứng cực đầu và thúc đẩy cho các cơ chế sinh học khác tiến triển. Đƣờng glucose, lactate là nguồn năng lƣợng ngoại sinh của tinh trùng. Protein, đặc biệt là albumin thúc đẩy khả năng vận chuyển và tăng cƣờng hoạt hóa. pH của môi trƣờng IVF khoảng 7,4 gần giống với pH máu phù hợp cho thụ tinh 23 và phát triển ban đầu của phôi. Ở môi trƣờng acid phôi phát triển kém. Hệ đệm bicarbonat đƣợc dùng để ổn định pH vì khi ủ kín các tế bào hô hấp sẽ tạo CO2 làm tăng tính acid của môi trƣờng, sự kết hợp giữa hệ đệm này cùng với CO2 trong tủ ấm sẽ giúp ổn định pH cho tế bào. Khi thụ tinh hoặc nuôi phôi in vitro phải phủ lên bề mặt môi trƣờng một lớp dầu khoáng để làm giảm quá trình tạo hạt ngƣng tụ trong môi trƣờng và sự thay đổi nồng độ các chất. Ngoài ra, dầu khoáng còn có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của bụi và vi sinh vật từ ngoài. Tuy nhiên, nó ngăn cản sự khuyếch tán của CO2 vào môi trƣờng nuôi. 2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro (Phan Kim Ngọc, 2006) Có 3 yếu tố quan trọng trong một hệ thống thụ tinh in vitro: dụng cụ thụ tinh, môi trƣờng thụ tinh và các điều kiện khác (khí, nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng…) Thụ tinh trong ống nghiệm 5 ml: Thích hợp nhất là ống ly tâm nhựa 5 ml với nắp mở đƣợc vặn lỏng, giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Thông thƣờng, tỷ lệ thụ tinh tối ƣu là 1 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus oocyte complex-COC)/ ống nghiệm trong 0,5 ml môi trƣờng và 5.104 tinh trùng di động. Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng: Thêm một thể tích huyền phù đã đo trƣớc vào mỗi giếng với nồng độ trung bình là 105 tinh trùng di động/giếng. Sự gắn tinh trùng vào màng trong suốt xảy ra sau 1-3 giờ thụ tinh, do đó sau 3h trứng có thể đƣợc rửa lại để loại bỏ tinh trùng thừa. Thụ tinh trong ống mao quản và cọng rạ: Ƣu điểm là tiết kiệm trứng cũng nhƣ tinh trùng. Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là nuôi cấy trong âm đạo. Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt đƣợc trong các ống mao quản và cọng rạ với thể tích 5-10 µl chứa 2000-4000 tinh trùng di động. Huyền phù trứng/tinh trùng trong cọng rạ đƣợc bảo vệ bằng các khoảng môi trƣờng, ngăn cách xen kẽ với các bóng không khí, đƣợc đặt nằm ngang trong tủ ấm 24 37 oC và 5% CO2. Sau thụ tinh, dùng pipet đẩy hết dung dịch trong ống vào đĩa để kiểm tra. Thụ tinh trong vi giọt: Đây là phƣơng pháp IVF phổ biến nhất. Đƣa các COC vào một vi giọt đã đƣợc chuẩn bị sẵn từ 20-50 µl huyền phù tinh trùng dƣới lớp dầu. Thuận lợi của phƣơng pháp này là kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu bởi thể tích nhỏ và số lƣợng tinh trùng ít, rất phù hợp cho những trƣờng hợp mẫu ít tinh trùng. Trên chó, thể tích vi giọt dùng cho thụ tinh in vitro tùy thuộc vào loại môi trƣờng, nhƣ thể tích 50 µl/giọt đối với môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006), thể tích 100 µl/giọt đối với môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992). 2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh (Phan Kim Ngọc, 2006) Có thể ghi nhận và đánh giá kết quả sau 24 giờ thụ tinh bằng quan sát kính hiển vi và có thể tiến hành phẩu tích phôi, có thể dùng enzyme hay cơ học để tách bỏ lớp tế bào cumulus xung quanh để dễ quan sát và đánh giá. Đánh giá trứng thụ tinh cũng đƣợc dựa vào hai chỉ tiêu cơ bản, đó là sự thay đổi của nhân và tế bào chất. Đạt được các tiền nhân Những trứng thụ tinh tốt là những trứng đƣợc quan sát thấy 2 tiền nhân và 2 thể cực. Trạng thái của tế bào chất Biểu hiện hình dạng đặc thù với màng trong suốt đầy đặn và nguyên sinh chất sạch. Ngoài ra cũng có thể quan sát thêm: nguyên sinh chất của tế bào luôn có ít hạt, có thể biểu hiện từ màu nâu đến đen, hình dạng của trứng có thể biến đổi từ hình cầu đến những hình dạng không đặc trƣng, một vành sáng rõ nguyên sinh chất ngoại vi là một bằng chứng về sự hoạt hóa tốt và sự bắt đầu cho một chu kỳ tiếp theo của quá trình phân bào. Tuy nhiên, không phải tất cả các trứng đều đƣợc thụ tinh trong ngày đầu tiên, các trứng không xuất hiện tiền nhân có thể đƣợc tái thụ tinh. Sự thụ tinh hay phân cắt thƣờng đƣợc xác nhận vào ngày thứ hai, đó có thể là kết quả thụ tinh của lần 25 đầu, hoặc có thể là sự chậm trễ thụ tinh do các khiếm khuyết chức năng tinh trùng hay sự trƣởng thành trễ của trứng. 2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF Sự trƣởng thành của trứng: trứng chỉ đƣợc thụ tinh khi đạt đến MII, do đó sự trƣởng thành của trứng trong IVM là một cơ sở rất quan trọng cho tỷ lệ thành công trong IVF. Đa số các loài động vật, khi rụng trứng đã đạt đến MII nhƣng ở chó trứng rụng khi còn ở giai đoạn GV, do vậy đây là một trở ngại rất lớn làm cho tỷ lệ trứng chín trong IVM và tỷ lệ tạo phôi trong IVF ở chó rất thấp. Năng lực của tinh trùng: hoạt lực của tinh trùng là một yếu tố cực kỳ quan trọng quyết định khả năng xâm nhập của tinh trùng vào màng trong suốt và kết hợp với nhân cái để tạo thành tiền nhân. Nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh: nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là một yếu tố rất cần thiết trong IVF. Tinh trùng sẽ tiết enzyme hyaluronidase để phá hủy mối liên kết giữa các tế bào cumulus bao quanh trứng nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của tinh trùng vào bên trong. Nhƣng để quá trình đó diễn ra thì phải có đủ lƣợng enzyme hyaluronidase, do đó nồng độ tinh trùng là yếu tố cần thiết, nhƣng nồng độ tinh trùng cũng không đƣợc quá cao vì sẽ gây ảnh hƣởng xấu cho sự phát triển của trứng và làm giảm tỷ lệ thụ tinh. Môi trƣờng IVF: có nhiều loại môi trƣờng IVF khác nhau và phù hợp cho từng loài động vật, nhƣ môi trƣờng NCSU 23 dùng cho heo, môi trƣờng TYH và Fert-TALP dùng cho chó. Kỹ thuật của ngƣời thao tác: trong kỹ thuật IVF tất cả mọi quá trình đều có sự tham gia trực tiếp của ngƣời thao tác do đó để góp phần vào tỷ lệ thành công trong IVF thì trƣớc hết ngƣời thao tác phải có kinh nghiệm, sự tỷ mỉ và chính xác trong công việc. Mặc khác, thao tác cũng là một khâu rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm từ các nguồn bên ngoài mà đó là một vấn đề rất khó khăn và phức tạp trong khâu giải quyết, làm giảm đáng kể tỷ lệ thành công. 26 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành Thời gian: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007 Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa khoa Chăn Nuôi Thú Y 3.2 Nội dung nghiên cứu Cải thiện quy trình nuôi chín trứng và nhuộm trứng để xác định các giai đoạn phát triển của trứng So sánh hiệu quả thụ tinh giữa hai môi trƣờng TYH và Fert-TALP. 3.3 Vật liệu 3.3.1 Nguồn mẫu Trứng từ buồng trứng đƣợc lấy ở lò mổ Hình 3.1. Buồng trứng 27 Tinh trùng từ phần đuôi phó tinh hoàn đƣợc lấy ở lò mổ 3.3.2 Hóa chất 3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng a) Môi trƣờng bảo quản buồng trứng Thành phần môi trƣờng phosphate buffered saline (PBS): Nƣớc cất 100 ml NaCl 800 mg KCl 20 mg Na2HPO4.12H2O 290 mg KH2PO4 20 mg Penicillin 7,5 mg Gentamycin 5 mg b) Môi trƣờng cắt trứng Thành phần môi trƣờng HEPES-buffered-Tyrodes (HEPES-TL-PVA): NaCl 129 mM Hepes/KOH 10 mM KH2PO4 0,8 mM MgCl2 0,8 mM D-glucose 5,6 mM NaHCO3 0,8 mM CaCl2 1 mM Hình 3.2. Tinh hoàn Hình 3.3. Phó tinh hoàn Đuôi 28 PVA 0,1 % (w/v) c) Môi trƣờng nuôi trứng Thành phần môi trƣờng North Carolina State University 37 (NCSU 37): NaCl 108,73 mM NaHCO3 25,07 mM KCl 4,78 mM KH2PO4 1,19 mM MgSO4.7H2O 1,19 mM CaCl2.2H2O 1,7 mM Glucose 5,55 mM Penicillin G 0,18 mM Streptomycin sulphate 39 mM D-sorbitol 5,55 mM Bovine serum albumine (BSA) 0,4 % (w/v) Bổ sung: Follicle stimulating hormone (FSH) 1 µg/ml Human gonadotropin (hCG) 10 IU/ml Estradiol 1 µg/ml Fetal bovine serum (FBS) 10 % (v/v) -mercaptoethanol 50 µM d) Hóa chất nhuộm trứng Hyaluronidase 0,1 % Phosphate buffered saline polyvinyl alcohol (PBS-PVA): dung dịch PBS nhƣ trên đƣợc bổ sung 0,1 % (w/v) polyvinyl alcohol (PVA) Aceto-orcein 1 % : Orcein 0,3 g Acid acetic 13,5 ml Nƣớc cất 16,3 ml Dung dịch ethanol:acid acetic với tỷ lệ 3:1 (v/v) 29 Acetone Dung dịch aceto-glycerol: glycerol: acid acetic: nƣớc cất theo tỷ lệ 1:1:3 3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng a) Môi trƣờng bảo quản tinh hoàn Dung dịch NaCl 0,9 % b) Môi trƣờng thu tinh trùng Môi trƣờng Tris-glucose (theo Iguer và Verstegen, 2001): Tris 3,025 g Glucose 1,25 g Citrate Natri 1,7 g Penicillin 100 mg Streptomycin 100 mg Lòng đỏ trứng 20 ml Nƣớc cất 100 ml pH 6,82 Áp suất thẩm thấu 381 mOsm c) Môi trƣờng hoạt hóa tinh trùng Môi trƣờng Sperm-TALP-1 (theo Sirivaiddyapong và et.al., 1999): CaCl2 2 mM KCl 3,1 mM MgCl2 0,4 mM NaCl 100 mM NaHCO3 25 mM Na3PO4 0,3 mM Natri pyruvate 1 mM Natri lactate 21,6 mM BSA 10 g/l Hepes 10 mM 30 Gentamycin S 0,25 g/l pH 7,21 Áp suất thẩm thấu 303 mOsm 3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh Môi trƣờng Fert-TALP (theo Kim et.al., 2006) CaCl2.2H2O 2 mM KCl 3,2 mM MgCl2.6H2O 0,5 mM NaH2PO4.H2O 0,4 mM Lactic acid 11 mM NaCl 114 mM NaHCO3 25 mM Natri pyruvate 0,2 mM BSA 6 mg/ml Gentamycin 50 µg/ml Heparine 2 µg/ml Môi trƣờng TYH (theo Toyoda, 1971) NaCl 119,37 mM KCl 4,78 mM CaCl2 1,71 mM KH2PO4 1,19 mM MgSO4 1,19 mM NaHCO3 25,07 mM Natri pyruvate 1 mM Glucose 5,56 mM BSA 4 g/l Penicillin 75 mg/l Streptomycin sulfate 50 mg/l 31 3.3.3 Dụng cụ - Thiết bị 3.3.3.1 Dụng cụ Bình giữ nhiệt Bộ ổn nhiệt Dao mổ Kéo các loại Khay Becher 500 ml Găng tay Lọ cồn Kẹp Đầu tip các loại Pipette Pasteur vô trùng Micropipette Màng lọc (0,2 µm) Dây truyền nƣớc biển Đĩa petri nhựa (35 x 10 mm) Đĩa petri thủy tinh Lame và lamel Buồng đếm hồng cầu Ống ly tâm Ống falcon (15 ml và 50 ml) Eppendorf 1,5 ml Băng keo parafilm Cá từ 3.3.3.2 Thiết bị Kính hiển vi đảo ngƣợc (Olympus) Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800) Tủ ấm CO2 32 Tủ thao tác vô trùng Nồi hấp Tủ sấy Máy chỉnh pH Máy ly tâm 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng Mục tiêu thí nghiệm: tăng tỷ lệ trứng chín sau khi nuôi để làm nguồn mẫu cho thụ tinh in vitro. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia thành 3 nghiệm thức dựa vào các nồng độ β-mercaptoethanol khác nhau đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng. Nghiệm thức 1: không bổ sung β-mercaptoethanol, đƣợc bố trí trên 10 lô với 249 trứng; nghiệm thức 2: nồng độ β-mercaptoethanol 50 µM, đƣợc bố trí trên 10 lô với 259 trứng; nghiệm thức 3: nồng độ β-mercaptoethanol 100 µM, đƣợc bố trí trên 10 lô với 255 trứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu thống kê: tỷ lệ trứng chín sau 72 giờ nuôi. 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Mục tiêu thí nghiệm: nhuộm trứng là một khâu rất quan trọng để xác định tỷ lệ các giai đoạn phát triển của trứng sau khi nuôi, đặc biệt là tỷ lệ trứng đạt đến metaphase II để làm cơ sở cho việc tiến hành thụ tinh in vitro. Trong đó, nồng độ orcein là một yếu tố quyết định. Cách bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc phân thành 2 nghiệm thức dựa vào nồng độ orcein, nghiệm thức 1: nồng độ orcein 0,75 % đƣợc bố trí trên 23 lô với 437 trứng, nghiệm thức 2: nồng độ orcein 1 % đƣợc bố trí trên 50 lô với 975 trứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu thống kê: tỷ lệ trứng đƣợc quan sát rõ về tình trạng nhân sau 72 giờ nuôi 3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert-TALP Mục tiêu thí nghiệm: tìm ra môi trƣờng thụ tinh thích hợp để tạo hợp tử, từ đó làm cơ sở cho quy trình nuôi phôi trong ống nghiệm. 33 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí thành 2 nghiệm thức dựa vào sự khác nhau của môi trƣờng thụ tinh. Nghiệm thức 1: môi trƣờng thụ tinh là Fert- TALP, đƣợc bố trí trên 15 lô với 252 trứng, nghiệm thức 2: môi trƣờng thụ tinh là TYH, đƣợc bố trí trên 12 lô với 213 trứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu thống kê: tỷ lệ hình thành tiền nhân sau khi thụ tinh 24 giờ. 3.5 Phƣơng pháp tiến hành 3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ Thời điểm lấy buồng trứng tốt nhất là ngay sau khi chó vừa bị đập chết vì chất lƣợng trứng và tỷ lệ trứng phát triển tốt trong IVM cao hơn so với trứng đƣợc lấy ở thời điểm chó đã qua giai đoạn xử lý nhiệt. Giai đoạn sinh sản: theo Martins và cộng sự (2006) trứng từ nhóm chó cái đang động dục đạt tới metaphase II trong IVM với tỷ lệ cao hơn trứng từ nhóm chó cái không động dục. Do đó chó đƣợc chọn để lấy buồng trứng trong thí nghiệm này là những chó đang động dục, những chó này có biểu hiện là âm hộ sƣng lên và có dịch nhờn tiết ra hai bên. Độ tuổi: trung bình độ tuổi bắt đầu động dục của chó là 6-8 tháng, do đó chọn những chó từ 6 tháng tuổi trở lên. Phƣơng pháp xác định tuổi là dựa vào hình dạng của răng.  Công thức răng : - Răng sữa: 2(3/3cửa, 1/1nanh, 3/3 tiền hàm ) = 28 - Răng vĩnh viễn: 2(3/3cửa, 1/1nanh, 4/4 tiền hàm và 2/3hàm) = 42  Hình dáng răng : - 1 ½ năm : đỉnh răng cửa dƣới 1 mòn. - 2 ½ năm: đỉnh răng cửa dƣới 2 mòn. 34 Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó (Nguồn: The Merck Veterinary manual, 2006) Thao tác thu nhận buồng trứng: Đặt chó nằm ngửa, xác định vị trí cần mổ (từ rốn kéo dài xuống về phía đuôi khoảng 5 cm), dùng cồn sát trùng xung quanh vị trí đó. Dùng dao mổ một đƣờng nhỏ để lấy buồng trứng, tuy nhiên buồng trứng rất nhỏ rất khó xác định nên ta phải căn cứ vào vị trí thận, buồng trứng nằm ngay phía dƣới thận, cách thận chừng 2 cm. Răng Thời gian Răng cửa sữa 1 Răng cửa sữa 2 Răng cửa sữa 3 Răng cửa 1 Răng cửa 2 Răng cửa 3 Răng nanh sữa Răng nanh Tiền hàm sữa 2 Tiền hàm sữa 3 Tiền hàm sữa 4 Tiền hàm 1 Tiền hàm 2 Tiền hàm 3 Tiền hàm 4 Răng hàm 1 Răng hàm 2 Răng hàm 3 4 – 5 tuần 4 – 5 tuần 5 – 6 tuần 2 – 5 tháng 2 – 5 tháng 4 – 5 tháng 3 – 4 tuần 5 – 6 tháng 4 – 6 tuần 4 – 6 tuần 6 – 8 tuần 4 – 5 tháng 5 – 6 tháng 5 – 6 tháng 4 – 5 tháng 5 – 6 tháng 6 – 7 tháng 6 – 7 tháng 35 Buồng trứng ngay sau khi cắt ra đƣợc rửa nhanh với dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh (penicillin: 50 µg/ ml, gentamycin: 75 µg/ ml). Sau đó trữ buồng trứng trong ống falcon chứa dung dịch PBS và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (không đƣợc quá 2 giờ), trong thời gian vận chuyển tốt nhất nên giữ buồng trứng ổn định ở nhiệt độ khoảng 37oC. 3.5.2 Xử lý buồng trứng Buồng trứng từ lò mổ mang về phòng thí nghiệm đƣợc sát trùng nhanh bằng cồn, rửa lại với nƣớc cất, dùng kéo đã đƣợc sát trùng cắt bỏ lớp mô mỡ bao quanh buồng trứng, sau đó buồng trứng đƣợc rửa lại với dung dịch PBS và cho vào đĩa petri vô trùng có sẵn PBS rồi đƣa vào tủ thao tác vô trùng. 3.5.3 Tìm và rửa trứng Buồng trứng đƣợc cắt nhỏ ở mặt ngoài để giải phóng trứng trong môi trƣờng HEPES-TL-PVA. Nhìn lƣớt qua thật nhanh trên kính hiển vi soi nổi để xác định những trứng tốt dùng cho IVM. Dùng pipette Pasteur hút và rửa trứng 2-3 lần trong môi trƣờng nuôi trứng cho đến khi không còn mảnh vỡ bao xung quanh trứng. 3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi Chất lƣợng trứng ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng phát triển và tỷ lệ chín của trứng. Do đó trứng đƣợc chọn nuôi là những trứng tốt có nội chất đồng nhất, lớp tế bào cumulus dày. Trứng trƣớc khi nuôi đƣợc phân thành 3 loại: Hình 3.4. Thao tác mổ lấy buồng trứng 36 Loại A có nhiều lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh Loại B có một lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh. Loại C không có hạt tụ bao quanh. 3.5.5 Nuôi trứng Chuyển 10 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus-oocyte complexes- COCs) vào mỗi giọt nuôi (100 µl) với môi trƣờng NCSU 37 đã đƣợc bổ sung các thành phần, mỗi đĩa petri (35×10 mm) 4 giọt đƣợc phủ 3 ml dầu khoáng và đã đƣợc ủ ấm trƣớc 24 giờ. Sau đó đĩa nuôi đƣợc chuyển vào tủ ấm và nuôi trong 72 giờ ở điều kiện 5 % CO2 , 37 o C. 3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi Cho 200 µl hyaluronidase 0,1 % vào mỗi giọt nuôi, để trong 15 phút Hút nhiều lần bằng pipette Pasteur để làm bong lớp tế bào cumulus bao quanh trứng Chuyển trứng qua PBS-PVA rửa 3 lần Đánh giá, phân loại trứng Trứng loại A Trứng loại B Trứng loại C Hình 3.5. Phân loại trứng trƣớc khi nuôi 37 3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi Đánh giá mức độ giãn nở của lớp tế bào cumulus, đây là một tín hiệu kiểu hình giúp ta biết gián tiếp về mức độ trƣởng thành của trứng. Các mức độ phát triển của tế bào cumulus:  Lớp tế bào cumulus không giãn nở  Lớp tế bào cumulus chỉ giãn nở lớp ngoài cùng  Lớp tế bào cumulus giãn nở hơn một nửa số lớp tế bào bao quanh trứng  Lớp tế bào cumulus giãn nở hoàn toàn Đánh giá sự trƣởng thành của nhân (quan sát thể cực) và sự trƣởng thành của tế bào chất: Trứng xấu Trứng tốt Trứng chín -Là những trứng thoái hóa -Tế bào chất không đồng nhất bị co cụm hoặc phân tán. -Không xuất hiện thể cực thứ nhất. -Là những trứng chƣa chín -Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. -Không xuất hiện thể cực thứ nhất. -Là những trứng trƣởng thành -Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. -Xuất hiện thể cực thứ nhất. Trứng xấ u Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi Trứng xấu Trứng tốt Trứng chín 38 Những trứng có lớp tế bào cumulus giãn nở, có sự trƣởng thành về nhân và tế bào chất là những trứng đƣợc chọn cho thụ tinh in vitro. 3.5.7 Nhuộm trứng Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus Đậy lamel với 4 góc đã đƣợc bôi ít silicone lên lame và ép xuống nhẹ nhàng, để khô khoảng 30 phút Ngâm lame trong dung dịch ethanol:acid acetic tỷ lệ 3:1 (v/v) trong 48 giờ Dùng giấy thấm hết dung dịch cũ ra và dùng pipette Pasteur đẩy từ từ acetone vào, để 15 phút Rút acetone ra và thay thế bằng aceto-orcein, để khoảng 30 phút Rút hết aceto-orcein và thay bằng dung dịch aceto-glycerol cho tới khi trứng nhạt màu Cố định bằng keo dán. Quan sát dƣới kính hiển vi Chuyển trứng đã đƣợc làm sạch tế bào cumulus với một ít PBS-PVA lên lame Sơ đồ 3.1. Quy trình nhuộm trứng 39 Lưu ý: trong quá trình nhuộm không đƣợc để cho trứng bị khô vì khi đó trứng rất dễ bị biến dạng và bẳt màu không đẹp. 3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ Thời điểm lấy mẫu: khi chó vừa mới bị đập chết, chƣa qua giai đoạn xử lý nhiệt. Chọn chó đực lấy mẫu: những chó có tinh hoàn lộ rõ ra ngoài, kích thƣớc lớn. Lấy mẫu: dùng dao mổ cắt dọc giữa bìu để lộ tinh hoàn ra ngoài, ta lấy luôn cả tinh hoàn và phó tinh hoàn. Trữ mẫu: trong dung dịch NaCl 0,9 % và mang nhanh về phòng thí nghiệm. 3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng 3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng (phƣơng pháp Swim-up) Ủ ấm sẵn ống falcon có chứa 1,5 ml Sperm-TALP-1 hoặc TYH trong tủ CO2. Cắt phần đuôi phó tinh hoàn trong 2 ml Tris-glucose hoặc TYH để giải phóng tinh trùng Dùng micropipette hút 1 ml dịch tinh trùng cho vào nhẹ nhàng xuống đáy ống falcon đã đƣợc ủ ấm. Phần dịch còn lại đƣợc dùng để đếm hoạt lực và nồng độ. Mở nắp ống falcon và đặt nghiêng 30o trong tủ ấm 5 % CO2, 37oC trong 60 phút. Lấy ống falcon ra, hút 1 ml dịch tinh trùng nằm phía trên cho vào ống khác, trộn đều nhẹ nhàng, đếm hoạt lực, nồng độ và tỷ lệ tinh tinh trùng sống. Nếu các chỉ tiêu đảm bảo thì tiến hành thụ tinh. Nếu nồng độ chƣa đủ thì ly tâm (600 vòng/5 phút). Thu phần đáy và kiểm tra lại các chỉ tiêu. 3.5.9.2 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro a) Xác định hoạt lực tinh trùng Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40. Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37OC khi kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động 40 vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1. b) Xác định nồng độ tinh trùng Tiến hành: xác định nồng độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu với độ pha loãng 200 lần. Nồng độ tinh trùng: C = n * b * 50.000 Trong đó: C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml dịch từ đuôi phó tinh hoàn đƣợc pha loãng với 2 ml môi trƣờng tris – glucose hay TYH n : Số lƣợng tinh trùng đếm đƣợc trong 5 ô lớn b : Hệ số pha loãng Nồng độ tinh trùng tối ƣu cho thụ tinh in vitro trong môi trƣờng Fert-TALP là 2,5.107 tế bào/ml (theo Kim et.al., 2005) và 107 tế bào/ml trong môi trƣờng TYH (theo Yamada et.al., 1992). c) Xác định tỷ lệ tinh trùng sống/chết Tiến hành: Trộn đều 1 giọt tinh dịch với 2 giọt eosin 1 % và để 30 giây. Cho thêm 3 giọt nigrosin 10 % rồi trộn đều và để tiếp 30 giây. Đặt 1 giọt mẫu vừa nhuộm xong lên lame và trải thành lớp mỏng Để mẫu khô tự nhiên Quan sát tinh trùng dƣới kính hiển vi (vật kính 10) Tinh trùng sống: không bắt màu Tinh trùng chết: bắt màu hồng Kiểm tra tổng số 100 tinh trùng, suy ra tỷ lệ % tinh trùng sống. Nếu tỷ lệ tinh trùng sống đạt 80 % trở lên thì mẫu tinh trùng đó tốt. 3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh Những trứng dùng trong thụ tinh là những trứng sau 72 giờ nuôi đƣợc đánh giá tốt (nội chất đồng đều, lớp tế bào cumulus giãn rộng) bằng cách nhìn nhanh trên kính hiển vi, không qua giai đoạn nhuộm. 41 3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006) Chuẩn bị vi giọt môi trƣờng Fert-TALP (44 µl/giọt) trong đĩa petri, phủ dầu khoáng và đƣợc ủ ấm. Hút trứng đã đƣợc nuôi 72 giờ ra khỏi giọt nuôi, rửa 3 lần trong Sperm-TALP. Chuyển trứng vào vi giọt đã đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt. Hút 2 µl tinh trùng đã đƣợc hoạt hóa (nồng độ 2,5.107 tế bào/ml) cho vào mỗi giọt thụ tinh. Tiếp theo cho 2 µl heparin vào từng giọt thụ tinh. Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5%CO2, 37 oC và nuôi trong 24 giờ. Sau 24 giờ Trứng trƣởng thành Rửa trứng 2-3 lần trong môi trƣờng thụ tinh Tạo vi giọt: 10 COCs/giọt, ủ ấm Tinh trùng Hoạt hóa tinh trùng (phƣơng pháp Swim-up) Đánh giá các chỉ tiêu IVF: bơm tinh trùng vào vi giọt Cho đĩa thụ tinh vào ủ ấm: 5 % CO2, 37 o C Nhuộm trứng để đánh giá sự hình thành tiền nhân Sơ đồ 3.2. Quy trình thụ tinh 42 3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992) Chuẩn bị vi giọt môi trƣờng TYH (100 µl/giọt) trong đĩa petri, phủ dầu khoáng và ủ ấm. Hút trứng đã đƣợc nuôi 72 giờ ra khỏi giọt nuôi, rửa 3 lần trong TYH. Chuyển trứng vào vi giọt đã đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt. Hút 10 µl tinh trùng đã đƣợc hoạt hóa (nồng độ 107 tế bào/ml) cho vào mỗi giọt thụ tinh. Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5 % CO2, 37 oC và nuôi trong 24 giờ. 3.6 Xử lý số liệu Xử lý thống kê bằng trắc nghiệm ANOVA sau khi chuyển dạng arcsin ở phần mềm Stagraphic 7.0. Kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng X ± SE. 43 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ chín trứng và phát triển phôi ở một số loài động vật, vì nó có vai trò gián tiếp trong việc tổng hợp glutathione (GSH) - một hợp chất quan trọng bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân oxy hóa. Thí nghiệm bổ sung 3 nồng độ β-mercaptoethanol khác nhau (0 µM, 50 µM và 100 µM) vào môi trƣờng nuôi trứng. Bảng 4.1 Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol Nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) Số lô Số trứng nuôi Tỷ lệ trứng chín (%) P 0 10 249 1,3 ± 0,54a 0,02 50 10 259 4,88 ± 1,37 b 100 10 255 1,65 ± 0,6a 1.3 4.88 1.65 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) tỷ lệ tr ứn g ch ín (% ) Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol 44 Từ kết quả trên cho thấy tỷ lệ trứng chín ở trƣờng hợp đối chứng với trƣờng hợp bổ sung 50 µM và 100 µM có sự khác biệt về mặt thống kê (p<0,05). Khi bổ sung ở nồng độ 50 µM là có sự khác biệt rõ nhất. Trung bình là 1,3% ở mẫu đối chứng, 4,88% trong trƣờng hợp bổ sung 50 µM và 1,65% trong trƣờng hợp bổ sung 100 µM. Tỷ lệ trứng chín ở hai nghiệm thức bổ sung β-mercaptoethanol cao hơn nghiệm thức đối chứng, nên β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ trứng chín mà tốt nhất là ở nồng độ 50 µM. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kim (2004), tác giả đã báo cáo tỷ lệ trứng chín đạt 20% khi bổ sung 50 µM β- mercaptoethanol và đạt tỷ lệ cao hơn so với các nồng độ khác. β-mercaptoethanol đóng vai trò nhƣ một chất đồng xúc tác, giúp tăng cƣờng tổng hợp glutathione (GSH) nội bào, mà GSH có vai trò phân hủy các chất oxy hóa trong môi trƣờng, tăng cƣờng vận chuyển amino acid và đẩy mạnh quá trình tổng hợp DNA, protein trong tế bào,…(Kim et.al., 2004). Do đó, trứng sẽ phát triển tốt và đạt tỷ lệ chín cao hơn đối chứng. Nhƣng nếu nồng độ GSH quá cao cũng sẽ làm mất cân bằng thành phần của các chất trong môi trƣờng nội bào, gây ảnh hƣởng xấu đến sự phát triển của trứng. Do vậy, khi bổ sung β-mercaptoethanol với nồng độ 100 µM đã cho tỷ lệ trứng chín thấp hơn so với 50 µM. Kết quả của chúng tôi thấp hơn của Kim (2004), có thể do ảnh hƣởng của rất nhiều yếu tố trong quá trình nuôi trứng. Trứng đƣợc lấy từ chó cái ở nhiều giai đoạn sinh sản khác nhau, nên chất lƣợng trứng không đồng nhất, và có thể là do sự nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy làm ảnh hƣởng xấu đến sự phát triển của trứng. Nhiễm khuẩn là vấn đề rất khó giải quyết. Trong đề tài này, chúng tôi phải dùng hóa chất tự pha chứ không có nguồn hóa chất tổng hợp nên rất khó kiểm soát. Mặt khác, nguồn mẫu đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ nên nguy cơ nhiễm là rất cao. 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Hiện nay, để xác định các giai đoạn phát triển của nhiễm sắc thể, hầu hết các nhà khoa học đều nhuộm huỳnh quang với Hoechst 33342 cho kết quả rất khả quan. 45 Tuy nhiên, do thực tế chúng tôi không có điều kiện nhuộm huỳnh quang, nên chỉ có thể xác định tỷ lệ trứng chín bằng orcein, và thí nghiệm đã tiến hành thử trên 2 nồng độ orcein khác nhau: 1% và 0,75%. Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein Từ kết quả trên cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê (p>0,05) giữa nồng độ orcein 0,75% và nồng độ 1%. Trung bình là 21,64% ở nồng độ 0,75% và 28,19% ở nồng độ 1%. Nhƣ thế, có thể sử dụng nồng độ nào cũng không ảnh hƣởng nhiều tới khả năng bắt màu nhiễm sắc thể của orcein. Tuy nhiên, điều đáng nói ở đây là tỷ lệ nhìn thấy rõ các giai đoạn nhiễm sắc thể quá thấp, điều này sẽ gây sai lệch trong việc đánh giá tỷ lệ trứng chín để làm cơ sở cho quá trình thụ tinh. Các yếu tố gây ảnh hƣởng có thể là: Nồng độ orcein (%) Số lô Số trứng nhuộm Tỷ lệ trứng nhìn rõ các giai đoạn (%) P 0,75 23 437 21,64 ± 3,28 0,26 1 50 975 28,19 ± 3,45 21.64 28.19 0 5 10 15 20 25 30 0,75 1 nồng độ orcein (%) tỷ lệ tr ứn g nh ìn rõ c ác g ia i đo ạn (% ) Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein 46 Kinh nghiệm của ngƣời thao tác: tất cả các khâu của quá trình nhuộm trứng đều thủ công, do đó kinh nghiệm là một yếu tố rất quan trọng để giữ trứng không bị thất lạc trong quá trình thao tác và ngâm trong dung dịch acetic-ethanol. Orcein để thời gian lâu có thể bị lắng, do đó làm giảm khả năng bắt màu nhiễm sắc thể, hoặc để lâu nên acetic và ethanol có thể bay hơi làm sai lệch nồng độ. Hình 4.2 . Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn GV GVBD MI MII Hình 4.1 . Các giai đoạn phát triển của trứng nhuộm bằng orcein 47 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert- TALP Yamada et. al (1992) đã khảo sát tỷ lệ xuất hiện tiền nhân đực sau 12 giờ thụ tinh là 37% trong môi trƣờng TYH. Kim et.al (2006) đã khảo sát tỷ lệ xuất hiện tiền nhân sau 20 giờ thụ tinh là 28% trong môi trƣờng Fert-TALP. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành thử nghiêm thụ tinh trong cả hai môi trƣờng trên, sau 24 giờ thụ tinh thì tiến hành nhuộm bằng orcein để quan sát sự hình thành tiền nhân. Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP Từ kết quả trên cho thấy tỷ lệ hình thành tiền nhân trong thí nghiệm rất thấp so với kết quả của Yamada et. al (1992) và Kim et. al (2006). Trong môi trƣờng TYH không có kết quả tạo thành tiền nhân, còn khi dùng môi trƣờng Fert-TALP thì chỉ có một tiền nhân duy nhất đƣợc hình thành. Tuy nhiên cũng có thể nói rằng môi trƣờng Fert-TALP dùng trong quy trình này tƣơng đối phù hợp hơn môi trƣờng TYH. Môi trƣờng thụ tinh Số lô Số trứng thụ tinh Số trứng đạt tiền nhân Tỷ lệ (%) Fert-TALP 15 252 1 0,4 TYH 12 213 0 0 Hình 4.3. Tiền nhân sau 24 giờ 48 Một số nguyên nhân có thể làm cho tỷ lệ thụ tinh thấp:  Tỷ lệ trứng chín thấp.  Lớp lipid trong nội chất của trứng chó nhiều do đó rất khó quan sát đƣợc thể cực sau 72 giờ nuôi nên hầu hết trứng sau khi nuôi đƣợc đánh giá theo kinh nghiệm và mang đi thụ tinh.  Thí nghiệm nhuộm trứng bằng orcein vẫn chƣa đạt tỷ lệ cao, do đó việc đánh giá tỷ lệ trứng chín chƣa đƣợc chính xác, điều này gây khó khăn cho việc bổ sung các chất khác (β-mercaptoethanol, EGF…) vào môi trƣờng để tăng hiệu quả chín trứng.  Tinh trùng trong thí nghiệm lấy trực tiếp từ phần đuôi phó tinh hoàn của những chó đực từ lò mổ nên chất lƣợng tinh trùng không ổn định (nồng độ và hoạt lực), có thể là do chó đực bị nhốt một vài ngày trƣớc khi mổ nên dễ bị stress, ngoài ra trong thời gian đó chó còn bị bỏ đói… đã ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sinh tinh và chất lƣợng của tinh trùng. Do đó mà nồng độ và hoạt lực tinh trùng sau khi hoat hóa thƣờng không cao và có khi thấp hơn nồng độ cần cho thụ tinh rất nhiều.  Trong môi trƣờng thụ tinh của chúng tôi thiếu thành phần PHE stock so với môi trƣờng thụ tinh của Kim et.al. (2006), vì trong PHE stock có hypotaurine là yếu tố bảo vệ áp suất thẩm thấu trong môi trƣờng.  Điều kiện thí nghiệm của chúng tôi chƣa đạt điều kiện vô trùng nên rất dễ bị tạp nhiễm trong thao tác. 4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF 4.4.1 Lấy mẫu Đặc tính sinh lý sinh sản của chó rất khác với những loài khác. Do đó, tỷ lệ trứng chín trong IVM và hình thành phôi trong IVF rất thấp. Mặt khác, theo khảo sát của Lâm Thị Ngọc Thanh (2006), tỷ lệ trứng thu đƣợc và tỷ lệ trứng chín cao nhất ở giai đoạn xoang nang, do đó nên chọn những chó trong giai đoạn động dục hoặc trƣớc động dục. Chó đực phải có tinh hoàn lớn nhằm đảm bảo nồng độ và hoạt lực tinh trùng cho thụ tinh. 49 Dung dịch trữ mẫu phải đƣợc bổ sung kháng sinh vào mỗi ngày lấy mẫu để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mẫu sau khi lấy phải đƣợc vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Buồng trứng nên đƣợc trữ ở 37oC trong quá trình bảo quản. Chú ý khâu sát trùng mẫu và dụng cụ vì đây là nguồn mẫu lấy từ ngoài nên khả năng nhiễm là rất cao. 4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm Tinh hoàn nếu nhƣ chƣa đƣa vào tủ cấy làm liền thì phải đƣợc trữ trong tủ lạnh, nhằm hạn chế sự hoạt động của tinh trùng do đó kéo dài thời gian sống của tinh trùng. Tinh hoàn và buồng trứng sau khi mang về phòng thí nghiệm phải đƣợc sát trùng cẩn thận, tiến hành cắt bỏ màng bao ngoài, cho vào đĩa petri và đƣợc dán chặt bằng keo parafilm để hạn chế nhiễm khuẩn. Tủ cấy và dụng cụ thao tác phải đƣợc chiếu tia UV trƣớc mỗi lần làm, tất cả dụng cụ phải đƣợc sát trùng cẩn thận trƣớc khi mang vào phòng cấy và tủ cấy vô trùng. Tinh trùng từ phần đuôi phó tinh hoàn đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ, do đó hoạt lực và nồng độ thƣờng không ổn định nên tốt nhất là tiến hành hoạt hóa tinh trùng liền sau khi mang mẫu về phòng thí nghiệm. Thao tác hoạt hóa và đếm các chỉ tiêu tinh trùng phải tiến hành nhanh và chính xác vì tinh trùng sau khi hoạt hóa rất dễ bị kết dính và thời gian sống không lâu, do đó sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả thụ tinh. 50 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bổ sung β-mercaptoethanol vào môi trƣờng nuôi trứng đã tăng tỷ lệ trứng chín: đạt 1,3% khi không bổ sung, 4,88% khi bổ sung 50 µM, và 1,65% khi bổ sung 100 µM. Nhuộm trứng với nồng độ orcein 0,75% hay 1% không cho kết quả khác biệt về mặt thống kê. Tỷ lệ nhìn thấy rõ các giai đoạn của trứng khi nhuộm với nồng độ 0,75% là 21,64% và với nồng độ 1% là 28,19%. Tỷ lệ trứng thụ tinh còn thấp, trong môi trƣờng Fert-TALP là 0,4% và trong môi trƣờng TYH là 0%. 5.2 Đề nghị Nên bổ sung β-mercaptoethanol với nồng độ 50 µM vào môi trƣờng nuôi trứng. Nghiên cứu bổ sung EGF, huyết thanh chó đang lên giống với nồng độ thích hợp vào môi trƣờng nuôi trứng để tăng tỷ lệ trứng chín. Dùng tinh trùng từ nhiều nguồn để đảm bảo nồng độ và hoạt lực tinh trùng nhằm cải thiện hiệu quả thụ tinh. Bổ sung thành phần PHE stock (2µl/giọt) vào môi trƣờng thụ tinh. Thử nghiệm quy trình tạo phôi chó bằng môi trƣờng TYH, trong đó TYH dùng cho tất cả các giai đoạn nuôi trứng, hoạt hóa tinh trùng, thụ tinh và nuôi phôi. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm. NXB Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 2. Ngô Duy Bình, 2007. Khảo sát ảnh hưởng của EGF (epidermal growth factor) lên sự trưởng thành của trứng bò in vitro. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh 3. Quách Hoa Thiên Cung, 2007. Tạo phôi bò bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF). Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh 4. Trần Thị Dân và Dƣơng Nguyên Khang, 2006. Sinh lý vật nuôi. NXB Nông Nghiệp 5. Phạm Thị Minh Đức, 2001. Sinh lý học, tập 2. NXB Y học Hà Nội 6. Nguyễn Thị Hà, 2007. Thử nghiệm tạo phôi dâu bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trên heo. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh 7. Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005. Khảo sát khả năng khai thác tinh trên chó và khả năng bảo quản của một số môi trường pha chế tinh. Luận văn thạc sĩ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 8. Đỗ Hoàng Khiêm, 2006. Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinht trùng chó. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh hóa tinh 9. Nguyễn Quang Mai và Cù Xuân Dần, 2005. Sinh lý học vật nuôi. NXB Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 10. Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006. Công nghệ sinh học người và động vật. NXB Giáo Dục 11. Nguyễn Đình Nhung và Nguyễn Minh Tâm, 2005. Giáo trình giải phẩu sinh lý vật nuôi. NXB Hà Nội 52 12. Lâm Thị Ngọc Thanh, 2006. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố sinh học lên chất lượng noãn chó trong điều kiện nuôi chín in vitro. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh 13. Nguyễn Bạch Thảo Vy, 2005. Áp dụng quy trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 14. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2005. Công nghệ sinh học, tập 2: Công nghệ sinh học tế bào. NXB Giáo Dục Tài liệu tiếng Anh 15. Ada Rota and Giorgina Cabianca, 2004. In vitro maturation rates of canine oocytes from anestrous bitches in simple media. Reprod. Nutr. Dev. 44: 105-109 16. Berenice de Avila Rodrigues, Lucila Carboneiro Dos Santos and Jose Luiz Rodrigues, 2004. Embryonic development of in vitro matured and in vitro fetilized dog oocytes. Molecular reproduction and development 67: 215-223. 17. Cole H.H. and Cupps, 1959. Reproduction in domestic animals. Academic press, New York and London, pp. 342 – 345, 369 – 374. 18. Dela Pena E.C., Takahashi Y., Katagiri S., Atabay E.C. and Nagano M., 2002. Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral follicles. Reproduction 123: 593-600 19. Downs S.M. and Hudson E.D., 2000. Energy subtrates and the completion of spontaneous meiotic maturation. Zygote, 8: 339 – 351. 20. Masaya Geshi and Naoki Takenouchi, 2000. Effects of sodium pyruvate in nonserum maturation medium on maturation fertilization, and subsequent development of bovine oocytes with or without cumulus cells. Biol. Reprod., 63: 1730 – 1734. 21. Matins L.R., Ponchirolli C.B., Beier S.L., Landim-Alvarenga F.C. and Lopes M.D., 2006. Analysis of nuclear maturation in in vitro matured oocytes from estrous and anestrous bitches. Anim. Reprod., v.3, n.l, p.49-54 22. Kim Kyu Min, Fibrianto Heru Yuda, Oh Ju Hyun, Jang Goo, Kim Jin Hye, Lee Seung Kyu, Kang Keun Sung, Lee Chun Byeong and Hwang Suk Woo, 2005. 53 Effects of estradiol-17β and progesteron supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenology 63 [Abstract]. 23. Kim Kyu Min, Fibrianto Heru Yuda, Oh Ju Hyun, Jang Goo, Kim Jin Hye, Lee Seung Kyu, Kang Keun Sung, Lee Chun Byeong and Hwang Suk Woo, 2004. Effect of β-mercaptoethanol or epidermal growth factor supplementation on in vitro maturation of canine oocytes collected from dogs with different stages of the estrus cycle. J. Vet. Sci 5 (3): 253-258. 24. Otoi T., Fujii M., Tanaka M., Ooka A. and Suzuki T., 1999. Effects of serum on the in vitro maturation of canine oocytes. Reprod. Fertil. Dev., 11:387 – 390. 25. CuiXiang-Shun, Jin Yong-Xun, Shen Xing-Hui, Lee Jae-Yeong, Lee Hyo-Sang, Yin Xi-Jun, Kong Il-Keun and Kim Nam-Hyung, 2006. Epidemal growth factor enhances meiotic resumption of canine oocytes in the presence of BSA. Theriogenology 66: 267-274. 26. Yamada S., Shimazu Y., Kawaji H., Nakazawa M., Naito K. and Toyoda Y., 1992. Maturation, fertilization, and development of dog oocyte in vitro. Biology of reproduction 46: 853-858. 27. Jin Yong-Xun, Lee Hyo-Sang, Yin Xi-Jun, Cui Xiang-Shun, Kong Il-Keun and Kim Nam-Hyung, 2006. Chromatin, microtubule and microfilament configurations in the canine oocyte. Reproduction, fertility and development 18: 849-856. PHỤ LỤC Thí nghiệm1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: MERCAPTO.Ty_le_chin Level codes: MERCAPTO.Nong_do Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .0077643 2 .0038821 4.582 .0193 Within groups .0228754 27 .0008472 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0306396 29 0 missing value(s) have been excluded.  09/05/07 04:53:48 AM Page 1 Table of means for MERCAPTO.Ty_le_chin by MERCAPTO.Nong_do -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 10 .0129910 .0054492 .0092045 -.0003667 .0263487 2 10 .0487369 .0137292 .0092045 .0353792 .0620946 3 10 .0165003 .0059988 .0092045 .0031426 .0298580 -------------------------------------------------------------------------------- Total 30 .0260761 .0053142 .0053142 .0183640 .0337881  09/05/07 04:54:08 AM Page 1 Multiple range analysis for MERCAPTO.Ty_le_chin by MERCAPTO.Nong_do ------------------------------------------------------------------------------- - Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------------- - 1 10 .0129910 X 3 10 .0165003 X 2 10 .0487369 X ------------------------ - contrast difference limits 1 - 2 -0.03575 0.02672 * 1 - 3 -0.00351 0.02672 2 - 3 0.03224 0.02672 * ------------------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 09/05/04 06:08:23 PM Page 1 Table of means for ORCEIN.Ty_le_thay by ORCEIN.Nong_do -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 23 .2147045 .0328294 .0460050 .1498259 .2795831 2 50 .2781867 .0344688 .0312021 .2341839 .3221894 -------------------------------------------------------------------------------- Total 73 .2581854 .0258231 .0258231 .2217685 .2946024  09/05/04 06:08:41 PM Page 1 Multiple range analysis fo ORCEIN.Ty_ e_thay by ORCEIN.Nong_do ----- ------ ------ ------ ---- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ----- ------ ------ ------ ---- 1 23 .21470 5 X 2 50 .2781867 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.06348 0.11086 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: ORCEIN.Ty_le_thay Level codes: ORCEIN.Nong_do Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Betwe n groups .0634861 1 .0634861 1.304 .2573 Within groups 3.4561832 71 .0486786 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3.5196693 72 0 missing value(s) have been excluded.