Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển (avicennia marina) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật rapd

ch theo nồng độ mong muốn. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: - DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. - Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA. 2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly trích. Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260 nm tƣơng ứng với:  50 g/ml DNA sợi đôi.  40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA.  20 g/ml oligonucleotide sợi đơn. ` Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích. Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các acid nucleotide và làm 15 sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm.  Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.  Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel. 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của kỹ thuật điện di: Trong một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: Gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agrose: Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thƣớc 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Bảng 2.1. Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel agarose (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (kb) 0,6  0,8 0,9  1,2 1,2  1,5 1 20 0,5  7 0,5  5 16  Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide. (Lƣu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng. Bảng 2.2. Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel polyacrylamide (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (bp) 4 5 8 11 200  800 80  200 40  100 10  50 Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau: Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gẫy, lẫn tạp… 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác 17 với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là tính đa dạng di truyền [2]. Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Ngƣời ta thƣờng tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra đƣợc sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị.[2]. Có 3 loại chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng: - Chỉ thị hình thái. - Chỉ thị isozyme. - Chỉ thị phân tử. 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ đƣợc liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà ngƣời ta có thể phát hiện đƣợc. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lƣợng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện đƣợc, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. 2.5.1.2 Chỉ thị isozyme Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy ngƣời ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau đƣợc mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, isozyme có thể đƣợc phân tách bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lƣợng chỉ thị có thể phát hiện đƣợc nhiều hơn, tuy nhiên số lƣợng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng [2]. 18 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA. Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Có thể nói rằng kể từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học do số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày ngƣời ta càng tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể đƣợc chia ra làm 2 nhóm:  Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA nào đó trong ống nghiệm, phƣơng pháp này có ba axit nucleic: một DNA dây đôi cần phải khuyếch đại, hai sợi đơn đóng vai trò mồi (primer) với kích thƣớc rất ngắn chạy theo chiều thuận và chiều nghịch trên DNA nền, thêm vào là DNA polymerase, dNTP và một muối Mg2+. 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR Đƣợc miêu tả qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó.  Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 50oC – 56oC. 19  Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở 70oC – 72oC. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTP, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ. Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất: Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR: Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 20  Nồng độ enzyme: Thƣờng sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu nhƣ nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme.  Các dNTP: Hàm lƣợng các dNTP trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTP (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tƣơng đƣơng nhau.  Hàm lƣợng MgCl2: Nồng độ tối ƣu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg + có thể ảnh hƣởng đến: - Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn. - Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn. - Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác. - Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thƣờng hàm lƣợng ion Mg+ cần thiết từ 0,5 – 2,5 mM. Chu trình nhiệt:  Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu nhƣ tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau.  Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trƣớc tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo.  Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp). 21  Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài. Ba bƣớc này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ.  Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC hay –20oC. 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trƣng riêng. Các biện pháp tối ƣu đó liên quan đến những vấn đề.  Trình tự của primer: Trình tự của primer xác định kích thƣớc, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ƣớc lƣợng đƣợc nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thƣờng chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).  Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó: Tm = 2 o C x (A+T) + 4 oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981). Với A, T, G, C là số lƣợng các nucleotide tƣơng ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ƣớc lƣợng.  Nồng độ MgCl2: ảnh hƣởng lớn đến kết quả phản ứng, ngƣời ta thƣờng thay đổi nồng độ của MgCl2 trƣớc tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.  Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thƣờng khoảng 200 μM.  Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).  Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thƣờng là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA. 22  Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dƣ thừa.  Tỉ lệ primer/DNA khuôn: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng dimer – primer sẽ xuất hiện do lƣợng DNA khuôn thấp và lƣợng primer quá cao. Ngƣợc lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản. 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này đƣợc lai với những đoạn dò (probe) đƣợc đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn dò chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [2], [6]. 2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến [2], [6]. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải đƣợc biết rõ trƣớc khi chuẩn bị các primer 23 tƣơng ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991). Hình 2.4: Nguyên lý chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thƣờng primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhƣng số lƣợng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản đƣợc (thƣờng 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ đƣợc nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này đƣợc quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thƣớc ngắn nên dễ tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phƣơng pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá 24 thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tƣơng, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000). Các ƣu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trƣớc trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lƣợng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lƣợng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thƣờng dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bƣớc nhƣ sau:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng cho những mục đích sau:  Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó nhƣ tính trạng chất lƣợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni và ctv., 1996; Winter và ctv., 1995).  Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.  In dấu vân tay (DNA fingerprinting).  Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế nhƣ sau: 25  Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt đƣợc những gen lặn hay cá thể dị hợp tử.  Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thƣờng không thống nhất.  Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.  Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân. 2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu.  Thao tác đơn giản.  Chất lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.  Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.  Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp.  Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [1]. 2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD  Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.  Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.  Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:  Đánh giá đa dạng di truyền: Đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,… 26  Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv., 1999). 27 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện. 3.1.1 Thời gian nghiên cứu. Đề tài đƣợc nghiên cứu từ 20/04/2007 đến 30/08/2007. 3.1.3 Địa điểm thực hiện. Mẫu lá mắm đƣợc thu thập tại khu dự trữ rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và chạy RAPD tại Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm. Mẫu lá mắm thu thập tại 3 tiểu khu 17, tiểu khu 18 và tiểu khu 21 ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Nguyên tắc thu thập mẫu:  Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).  Thu thập lá của cây mắm biển (lá già, lá non, lá bánh tẻ).  Lấy theo đƣờng chéo của từng tiểu khu.  Cách 400 m lấy một mẫu, mỗi mẫu lấy 6 đến 8 lá các loại ( lá non, lá bánh tẻ và lá già ).  Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ, … 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ  Chày và cối (Đức).  Bình và khay đựng Nitơ lỏng. 28  Cân điện tử (Ohaus - Mỹ).  Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh).  Tủ lạnh 4oC và -20oC.  Máy Vortex (IKA - Đức).  Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh).  Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).  Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản).  Lò Viba (Electrolux).  Tủ sấy (Jencons - Anh).  Máy điện di (Biorad).  Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển).  Đầu túyp các loại (Đức).  Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản).  Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ).  Máy PCR (BioRad – Thụy Điển).  Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản).  Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp). b. Hóa chất ly trích. HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp Dung dịch gốc 29 Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc 30 ion hóa trị II nhất là ion Mg ++ khi dùng. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M=157,6 g/mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất Pha 100ml: - 19,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp121oC/20 phút trƣớc khi dùng. NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần 31 EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65 oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100 ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: -10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc 3.3.3 Quy trình ly trích DNA Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 2 quy trình: Quy trình ly trích mẫu tƣơi [Doyle và Doyle (1988)] và quy trình ly trích cải tiến. 32 a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi theo Doyle và Doyle (1988) gồm 12 bƣớc:  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24:1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C.  Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.  Bƣớc 4: Chuyển lấy dịch trong.  Bƣớc 5: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 6: Li tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200 C trong 30 phút.  Bƣớc 9: Li tâm 10 phút 14.000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở 40 C. b. Quy trình 2: Quy trình ly trích của Doyle đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006 gồm 12 bƣớc:  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.  Bƣớc 2: Thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600 - 800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 55oC. 33  Bƣớc 3: Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi.  Bƣớc 4: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi.  Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi.  Bƣớc 6: Thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -20oC trong 90 phút.  Bƣớc 7: Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.  Bƣớc 8: Rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9: Rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 100% và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.  Bƣớc 11: Hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 37oC đến khi kết tủa tan hoàn toàn (có thể ủ qua đêm).  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở -20oC. 3.3.4 Kiểm tra kết quả ly trích DNA a. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế. Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * n Với:  OD260 nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm.  OD280 nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280 nm.  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100). Cách tiến hành: 34  Xây dựng nền: Dùng dung dịch TE 1X để tạo nền.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD. b. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA trong 15 phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.3.5 Thực hiện kỹ thuật RAPD 3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD a) Dụng cụ, thiết bị:  Pipet (0,5 – 10 l, 10 – 100 l).  Đầu túyp (10 l, 100 l).  Eppendorf loại 200 l.  Tủ cấy vô trùng (Anh).  Máy PCR (BioRad – Thụy Điển).  Máy điện di. b) Hóa chất:  Taq polymerase (BioRad – Thụy Điển).  Buffer free Mg++.  MgCl2.  dNTPs 35  Agarose(Pháp)  Loading dye 6X  Ladder 100 bp  Ethidium Bromide.  Nƣớc siêu sạch.  Primer: Sử dụng ba primer: Trình tự của primer 1: 5’ TGCCGAGCTG 3’ và Tm = 40,7 0 C Trình tự của primer RAH8: 5’GAGAGCCAAC 3’ và Tm = 31,9 o C Trình tự của primer OPAC10: 5’ AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 34 0 C 3.3.4.3 Bố trí thí nghiệm Nhằm tìm ra đƣợc chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất tối ƣu cho kỹ thuật RAPD trên cây mắm, chúng tôi đã tiến hành 3 thí nghiệm.  Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8, với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2 Bảng 3.1. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 Hóa chất Nồng độ đầu Lƣợng hút Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 pmol/µl 0,3 l 1,2 pmol/µl Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 18,3 l Tổng thể tích phản ứng 25 l 36 (Nguyễn Thị Lang, 2002) Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 33 94 1 34 1 72 1 1 72 10 Giữ ở 40 C (Nguyễn Thị Lang,2002)  Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1, với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 Hóa chất Nồng độ đầu Lƣợng hút Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/µl Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 17,8 l 37 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 40 1 72 2 1 72 15 Giữ ở 40 C  Thí nghiệm 3: Sử dụng primer OPAC10, với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 Hóa chất Nồng độ đầu Lƣợng hút Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/µl Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 17,8 l 38 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 36 1 72 2 1 72 15 Giử 40 C Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD: Trong thành phần của phản ứng, Taq polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,1 - 0,2 l) và không có pipet nào có thể hút chính xác một thể tích nhỏ nhƣ vậy. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn một lần nhiều phản ứng, sau đó đem chia ra các ống và cho DNA mẫu vào sau cùng. Các thao tác trộn mẫu phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn mẫu, hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt trong quá trình trộn. 39 Taq polymerase phải đƣợc bỏ vào sau cùng. Sau khi đã cho Taq vào trong hỗn hợp, các thao tác tiếp theo phải tiến hành nhanh chóng vì Taq sẽ hoạt động ngay. 3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS Các band thu đƣợc từ kết quả điện di số liệu từ RAPD đƣợc mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa đƣợc lƣu dƣới dạng file excel và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bảng 2.1 để xử lý. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979). Sxy= 2nxy/ (nx + ny ) XY: số băng giữa hai mẫu. X: số băng của mẫu x. Y: Số băng của mẫu y. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y. Dxy= 1 - Sxy Từ kết quả phân nhóm dựa trên kiểu gen và nhận xét mối tƣơng quan dựa trên các đặc điểm hình thái, rút ra kết luận về sự đa dạng di truyền ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng tôi đã tiến hành thu thập 52 mẫu lá mắm ở 3 tiểu khu 17; 18 và 21 với những đặc điểm hình thái khác nhau, sau đó nghiên cứu sự đa dạng di truyền. (A) (B) Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA 4.2.1 Bảo quản mẫu Mẫu lá sau khi thu thập đƣợc đƣa vào trung tâm phân tích bảo quản ở -20 0 C, bảo quản mẫu ở nhiệt độ này thì mẫu vẫn còn tƣơi sau 2 tuần điều này rất thuận lợi cho việc phân tích DNA.Trƣớc khi cho mẫu vào túi nilong thì phải ép cho không khí ra ngoài rồi mới buộc miệng túi lại. Làm nhƣ vậy sẽ giữ cho mẫu không bị hóa nâu trong một thời gian tƣơng đối dài. Việc trữ mẫu đã nghiền trong nitơ lỏng ở điều kiện -70oC có thể trữ đƣợc trong vòng 20 ngày và mẫu nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập…) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Để đạt đƣợc kết quả ly trích tốt nhất nên ủ mẫu với dịch trích EB ngay khi vừa nghiền xong. 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích Ban đầu chúng tôi thực hiện theo quy trình 1 [Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)]. Kết quả chúng tôi không thu đƣợc DNA mẫu hoặc là lƣợng DNA thu đƣợc không tinh sạch bị smear và gẫy vụn rất nhiều. Điều này có thể là do quá trình bảo quản mẫu không tốt làm cho mẫu bị hƣ hỏng. Ngoài ra còn có thể do các thao tác ly trích chƣa đƣợc chuẩn nhƣ vortex quá mạnh, nghiền mẫu quá mạnh làm DNA bị đứt gẫy. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này hoàn toàn không tinh sạch và không đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD. 42 Việc ly trích DNA từ mẫu mắm gặp nhiều khó khăn vì lá mắm có chứa nhiều polysaccharide làm cho dịch trích rất nhớt. Có thể chất nhớt này đã hạn chế sự kết tủa của DNA và làm cho DNA bị trôi đi khi đổ bỏ dịch trong ở bƣớc 6, 9, 10, 11. Đồng thời trong lá mắm còn chứa nhiều chất thứ cấp nên làm hạn chế tác dụng của các hóa chất ly trích. Sau nhiều lần thay đổi một số yếu tố nhƣ thời gian ủ, lƣợng mẫu, tốc độ ly tâm, thử nghiền mẫu trong nitơ lỏng … chúng tôi đã hoàn thiện và quyết định ly trích theo quy trình 2 (Quy trình cải tiến). Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình 2 tốt và đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD. Qua quá trình hoàn thiện quy trình ly trích, chúng tôi rút ra một số kết luận:  Việc sử dụng nitơ lỏng trong giai đoạn nghiền mẫu cho kết quả ly trích tốt hơn so với mẫu nghiền trực tiếp với dịch trích EB. Mẫu lá mắm sau khi nghiền với nitơ lỏng nên ủ ngay với dịch trích EB để cho kết quả tốt hơn.  Tăng thời gian ủ mẫu và giảm nhiệt độ ủ giúp cho lƣợng DNA đƣợc phóng thích tốt hơn.  Giảm tốc độ ly tâm tránh cho DNA bị đứt gẫy.  Việc ly tâm và thu dịch nổi trƣớc khi thêm chloroform có thể đã loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá mắm giúp cho chloroform có tác dụng tốt hơn.  Ly trích DNA từ mẫu lá mắm non sẽ dễ dàng hơn và DNA ly trích đƣợc có độ tinh sạch cao hơn. Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 Từ kết quả ly trích thể hiện ở hình 4.3, chúng tôi thấy rằng lƣợng DNA bị đứt gãy và smear rất nhiều không thể dùng để chạy RAPD. 43 Do đó chúng tôi tiến hành ly trích DNA theo quy trình cải tiến (quy trình 2). Sản phẩm DNA cho kết quả tốt đủ điều kiện để thực hiện RAPD. Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) Tuy nhiên kết quả đo OD cho thấy tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn còn thấp. Điều này là do những mẫu đó đã đƣợc ly trích lâu và trữ ở 4oC làm mất dần lƣợng DNA trong mẫu. Vì vậy chúng tôi quyết định trữ mẫu ở nhiệt độ -20oC. Quy trình ly trích sử dụng -mercaptroethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide... qua đó chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học nhƣ nghiền mẫu, vortex mẫu. Chúng tôi tiến hành ly trích trên 52 mẫu, kết quả thu đƣợc DNA trên 47 mẫu đạt hơn 90%. Những mẫu ly trích không thành công là những mẫu lá đã trƣởng thành. Điều này là do lá trƣởng thành chứa nhiều chất thứ cấp nhƣ phenol, polysaccharide … làm ảnh hƣởng đến hoạt tính của hóa chất ly trích và làm mất một lƣợng lớn DNA trong quá trình loại bỏ tạp chất. Ngoài ra, việc bảo quản mẫu không tốt cũng là nguyên nhân làm cho lƣợng DNA trong mẫu bị mất đi. 4.3 Kết quả chạy RAPD 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1. Qua thí nghiệm 1, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.5. 44 Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 Ở thí nghiệm 1, chúng tôi thực hiện PCR 2 mẫu thử nghiệm. Kết quả điện di thể hiện cho thấy sản phẩm PCR khuyếch đại rất mờ không thể phân biệt rõ các band. Do đó kết quả này chƣa có ý nghĩa trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền trên quần thể mắm biển. Điều này có thể do một số nguyên nhân nhƣ:  Chất lƣợng mẫu chƣa tốt, còn lẫn nhiều tạp chất làm ảnh hƣởng đến phản ứng PCR.  Lƣợng DNA mẫu chƣa đủ.  Lƣợng Taq DNA polymerase sử dụng chƣa đủ hoạt tính.  Lƣợng primer chƣa đủ.  Chu kỳ nhiệt chƣa tốt, thời gian kéo dài chƣa đủ dẫn đến sản phẩm PCR không hoàn thiện. Với những nhận định trên, chúng tôi đã có những thay đổi trong thành phần hóa chất cũng nhƣ chu kỳ nhiệt để có thể tối ƣu hóa phản ứng PCR ở các thí nghiệm sau. 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở bảng 3.3. Qua thí nghiệm 2 chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.6. 45 Ở thí nghiệm 2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR cho 6 mẫu với 6 cây khác nhau đó là đƣng, cóc trắng, đƣớc đôi, mắm đen, mắm biển và mắm trắng, các mẫu này đƣợc chạy cùng 1 chu kỳ và cùng một nồng độ giống nhau. Kết quả điện di cho thấy, 3 mẫu: mắm đen; mắm biển và mắm trắng đều chỉ cho 1 band đồng hình có kích thƣớc khoảng 400 bp. Do chỉ có một band đồng hình nên kết quả ở thí nghiệm 2 không có ý nghĩa trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền. Tuy nhiên có thể band 400 bp này là band đặc trƣng cho họ mắm (Avicenniaceae) và có thể là marker để phân biệt loài mắm với các loài khác. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác nghiên cứu đặc thù cây mắm ở rừng Cần Giờ. 4.3.3 Thí nghiệm 3: Sử dụng primer OPAC10 với chu kỳ nhiệt ở bảng 3.5. Qua thí nghiệm 3, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở hình 4.6. Kết quả điện di PCR tốt, cho độ đa hình cao. Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer OPAC10 trên 5 mẫu kết quả thu đƣợc trung bình 6 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ 46 sự đa hình giữa các mẫu. Chúng tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90 % và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10 % (kích thƣớc cụ thể không xác định), kích cỡ của các band khoảng từ 300 bp – 1200 bp (hình 4.8). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhƣng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống. Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại rừng Cần Giờ Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1. Việc phân tích kết quả PCR trên phần mềm NTSYS cho kết quả nhƣ sau:  Năm mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,40. Nhóm I gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00.  Nhận xét về M1, dựa vào cây phân sinh ở trên chúng tôi thấy rằng M1 có Tiểu khu 21 Tiểu khu 17 Tiểu khu 18 Tiểu khu 18 47 sự khác biệt về mặt di truyền so với 4 cây còn lại. Để giải thích về sự khác biệt này, chúng tôi trở lại nguồn gốc của nó. M1 là giống tái sinh tự nhiên, qua qúa trình hỗn giao và điều kiện môi trƣờng làm cho M1 thay đổi một tính trạng hoặc có thể do sự đột biến. Điểm đặc biệt là giống M1 sống ở bờ biển cho nên có một số thay đổi về mặt di truyền.  Riêng M18 và M40, 2 cây này sinh sống trong một tiểu khu và đƣợc trồng cùng một thời điểm do đó ít thấy sự khác biệt về mặt di truyền. Càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền giữa các cây mắm biển sẽ tăng. Do đó, chúng ta cần trồng xen những giống mắm ở các tiểu khu khác nhau nhằm tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để tái tạo rừng.  Giữa M8, M25 và M40 có hệ số đồng dạng di truyền rất thấp dao động từ 0,9 đến 1,0. Hiện nay rất khó xác định đƣợc nguồn gốc của các cây này, tuy nhiên, xét về mặt vị trí địa lý thì M8 đƣợc trồng ở tiểu khu 18, còn M18 và M40 đƣợc trồng ở tiểu khu 21.  M25 là giống đƣợc tái sinh tự nhiên và sống chung với các quần thể Mắm trắng, Mắm đen, cũng có thể có một số biến đổi về mặt hình thái.  M1, M8, M18, M25, M40 có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,4 đến 1,00. 48 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.2 Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:  Sử dụng lá mắm non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất.  Mẫu lá khi vừa nghiền xong nên ủ ngay với dịch trích EB.  Quy trình ly trích DNA của lá mắm ổn định. Ly trích đƣợc 47 mẫu (trên tổng số 52 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng trong các kỹ thuật sinh học phân tử.  Quá trình bảo quản DNA mẫu rất quan trọng. Một số mẫu DNA đƣợc ly trích đã bị mất dần lƣợng DNA khi bảo quản ở 4oC.  Quy trình RAPD tƣơng đối hoàn thiện.  Sử dụng primer OPAC10 cho số band khuyếch đại cao  Primer OPAC10 dùng trong kỹ thuật RAPD cho 10 band đối với các mẫu thí nghiệm, trong đó có 1 band đồng hình và 9 band đa hình. Primer OPAC10 có tính đa hình đối với quần thể mắm biển (Avicennia marina) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Độ đa hình dạng giữa các mẫu thấp ngoại trừ mẫu M1. 49  Primer 1 dùng trong kỹ thuật RAPD chỉ cho 1 band đồng hình. Primer 1 có thể dùng để làm marker chỉ thị phát hiện giống mắm (Avicenniaceae) với các giống khác ở rừng Cần giờ.  Với việc phân tích RAPD sử dụng primer OPAC10 thì quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,40 – 1,00. 5.3 Đề nghị  Tối ƣu hóa quy trình RAPD trên cây mắm biển.  Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 để đánh giá tính đa dạng di truyền với một lƣợng mẫu lớn hơn đối với quần thể mắm.  Khảo sát thêm các primer khác nhằm có đƣợc kết quả đa dạng di truyền chính xác nhất.  Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể mắm biển (Avicennia marina) nói riêng.  Nghiên cứu thêm về những cây mắm biển có hình thái khác lạ trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: 1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục Tp. HCM. 612 trang 4. Lê Văn Khôi và ctv., 2006. Khôi phục và phát triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành Phố Hồ Chí Minh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 51 7. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 8. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây được đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 9. Richard B. Primack, 1999. Cơ sở sinh học bảo tồn. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. 10. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Viện Công Nghệ Sinh Học Hà Nội. 11. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 139 – 154. 12. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tiến Thắng, 2000. Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Giáo Dục Tp. HCM. 244 trang. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI: 13. Akira Komiyama, 1998. Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R. mucronata) seedlings in the field condition. Forest Ecology and Management, 112: 227 – 231. 14. Brown T. A., 1997. Gene cloning an introduction. Third edition. UMIST, Manchester, UK.. Chapman and Hall. 334 pages. 15. Mukkamala L., 2002. Molecular phylogeny of mangroves IX molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae. Aquatic Botany, 74: 201 – 217. 16. Tanksley S. D., Ahn N., Cause M., Coffman R., Fulton T., McCouch S. R., Sencond G., Tai T., Wang Z., Wu K., Yu Z.. 1991. RFLP mapping of rice genome. Rice genetic, 2: 435 - 449. Intenational Rice Research Institute. TÀI LIỆU TỪ INTERNET: 52 17. g_quan/ 18. 19. 20. 21. 22. 860066e546/ 53 PHỤ LỤC TÊN MẪU TIỂU KHU TỌA ĐỘ PHÚT GIÂY ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI AM1 18 N 100 26’ 47.2’’ E 1060 54’ 20.7’’ Cây mọc tốt, nhiều nhánh AM2 18 N 100 26’ 47.4’’ E 1060 54’ 22.5’’ Cây thấp, bị sâu ăn AM3 18 N 100 26’ 47.4’’ E 1060 54’ 43.0’’ Cây trung bình, gốc bi sạt lỡ AM4 18 N 100 26’ 43.7’’ E 1060 54’ 49.1’’ Cao 4 m, nhiều nhánh AM5 18 N 100 26’ 33.2’’ E 1060 55’ 15.2’’ Cây cao 5 m, thân yếu ớt AM6 18 N 100 26’ 33.5’’ E 1060 55’ 50.0’’ Cây mọc khỏe, nhiều nhánh AM7 18 N 100 28’ 36.5’’ E 1060 55’ 53.4’’ Cao 7 m, nhiều nhánh, lá xanh tốt, có hoa và trái AM8 18 N 100 28’ 30.5’’ E 1060 55’ 31.9’’ Cao 3m, thân yếu ớt,lá bị sâu ăn AM9 18 N 100 28’ 52.7’’ E 1060 54’ 57.4’’ Cao 6m, nhiều nhánh AM10 17 N 100 23’ 45.0’’ E 1060 54’ 48.4’’ Cây mọc yếu, thân bị mối ăn AM11 17 N 100 24’ 11.8’’ E 1060 53’ 59.8’’ Cao 5 m, thân bị mối ăn AM12 17 N 100 25’ 28.1’’ E 1060 53’ 32.7’’ Cao 6m, lá bị sâu ăn AM13 17 N 100 26’ 33.6’’ E 1060 53’ 17.2’’ Cây mọc tốt, nhiều nhánh AM14 17 N 100 24’ 27.9’’ Cao 7m, gốc bị sạt lỡ 54 E 1060 53’ 53.2’’ AM15 21 N 100 25’ 26.5’’ E 1060 53’ 33.2’’ Cây cao, lá xanh tốt, có hoa và trái AM16 21 N 100 26’ 02.7’’ E 1060 53’ 15.2’’ Cây mọc yếu ớt AM17 21 N 100 26’ 45.1’’ E 1060 53’ 17.8’’ Cây phát triển kém, bị cháy lá 55 Thống kê hiện trạng rừng – đất của 24 tiểu khu thuộc Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ Tiểu khu Rừng trồng (ha) Rừng tự nhiên (ha) Đất trống Đất khác Tổng diện tích (ha) 1 890,41 309,14 29,65 1.229,20 2 1.236,41 355,04 34,03 232,16 1.857,64 3 719,09 449,85 81,22 1.250,16 4 1.200,39 369,20 34,14 137,50 1.741,23 5 772,17 252,15 21,21 99,42 1.144,95 6 980,40 397,79 29,45 125,25 1.532,89 7 624,71 230,83 265,68 1.121,22 8 960,49 133,17 157,84 268,72 1.520,22 9 923,34 440,43 86,06 129,97 1.579,80 10 1.236,58 298,89 5,63 62,53 1.603,63 11 667,28 314,47 5,55 249,52 1.236,82 12 775,53 141,59 261,52 1.178,64 13 898,42 243,55 373,61 1.515,58 14 740,17 299,43 486,33 1.525,93 15 1.024,04 539,97 212,09 414,16 2.190,26 16 782,36 325,82 13,80 492,33 1.614,31 17 1.252,85 569,35 172,77 1.994,97 18 746,54 468,82 466,85 1.682,21 19 518,49 354,16 421,15 1.293,80 56 20 762,90 618,33 80,04 448,73 1.910,00 21 722,62 322,85 5,90 778,16 1.829,53 22 300,83 246,09 2,80 229,93 779,65 23 1.434,00 416,86 1.093,18 2.944,04 24 1.257,42 860,28 57,56 212,04 3.387,30 Tổng 21.427,44 8.958,06 746,10 7.532,38 38.663,98 (Nguồn: Ban quản lý Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ) 57 Bảng ma trận tương đồng một số cây mắm biển ỏ rừng Cần Giờ M1 M8 M18 M25 M40 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 58 Bảng mã hóa chỉ số di truyền các mẫu chạy RAPD trên primer OPAC10. M1 M8 M18 M25 M40 M1 1,00 M8 0,30 1,00 M18 0,40 0,90 1,00 M25 0,50 0,60 0,70 1,00 M40 0,40 0,90 1,00 0,70 1,00 Mẫu OD260nm OD280nm OD260nm/OD280nm Nồng độ DNA 59 AM1 0.091194 0.052121 1.749659 385.9747 AM2 0.021316 0.012636 1.686926 88.58804 AM3 0.071687 0.042125 1.701769 299.2612 AM4 0.033725 0.022381 1.506858 131.5587 AM5 0.04484 0.019294 2.324039 212.5852 AM6 0.03186 0.015387 2.070579 145.0062 AM7 0.0408 0.020084 2.031463 184.329 AM8 0.0846 0.043811 1.931022 374.4144 AM9 0.099372 0.055977 1.775229 423.5327 AM10 0.087193 0.048581 1.794796 373.5524 AM11 0.080778 0.041681 1.938005 358.042 AM12 0.054111 0.028858 1.875078 236.4694 AM13 0.060632 0.043957 1.379348 223.1301 AM14 0.028961 0.017237 1.680165 120.1115 AM15 0.032535 0.022489 1.446707 123.6848 AM16 0.032067 0.019065 1.681983 133.0674 AM17 0.054854 0.038525 1.423855 206.3417 AM18 0.036523 0.024599 1.484735 141.1733 AM19 0.037981 0.022475 1.689922 157.9905 AM20 0.024727 0.013502 1.831358 106.9256 AM21 0.048591 0.025885 1.877188 212.4514 AM25 0.09906 0.055315 1.790834 423.9534 AM26 0.030023 0.014881 2.017539 135.2731 AM27 0.02886 0.015387 1.875609 126.1362 AM40 0.022709 0.011084 2.048809 102.9372 AM52 0.024727 0.013502 1.831358 106.9256