Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen (Avicennia officinalis) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa.  Tủa trong Isopropanol, điểm khác biệt so với phƣơng pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích Isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có phân tử trọng lƣợng nhỏ không bị tủa. Do đó, có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong Isopropanol. Trong hai phƣơng pháp trên có thể thu acid nucleic bằng ly tâm. Sau đó cặn tủa rửa trong Ethanol 70% để loại các muối hoặc Isopropanol còn dính lại trên mẫu. [5] Một số vấn đề gặp phải khi ly trích DNA:  Có lẫn tạp RNA trong mẫu.  Lẫn tạp chất Polysaccharide trong mẫu DNA.  DNA bị đứt gẫy. 2.4.3. Đánh giá chất lƣợng DNA 2.4.3.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Phƣơng pháp này cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi ly trích đƣợc. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: Optical density) ở bƣớc sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: 1 đơn vị OD260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 µg/ml cho dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD280nm. Tại bƣớc sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhƣng các protein cũng hấp thu bƣớc sóng ở 260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ tinh sạch của DNA. [5] Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1,8 đối với DNA tinh khiết. Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết. 12 2.4.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của các phân tử này đƣợc phân tích trên bảng gel, nó phụ thuộc vào hai yếu tố: Khối lƣợng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel. Việc lựa chọn các loại gel cũng nhƣ nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thƣớc trung bình của các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách.  Gel agarose: Là loại gel thông dụng nhất, dùng để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc từ 0,5 – 200 kb. Dùng điện di phƣơng ngang.  Gel polyacrylamide: Đƣợc dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc nhỏ, dƣới 1000 bp. Dùng điện di phƣơng thẳng đứng. 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng PCR do K. B. Mullis (Nobel hóa học, 1993) phát minh ra năm 1985. Đây là phƣơng pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một khối lƣợng mẫu ban đầu rất nhỏ. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích pháp y. 2.5.1. Nguyên tắc Tất cả Taq DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung đầu 3’ của khuôn. Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành sợi mới. Hiện tƣợng trên chính là cơ sở của phản ứng PCR. Nếu đƣợc cung cấp hai mồi (mồi xuôi và mồi ngƣợc) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một trình tự DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai mồi này. 13 Hình 2.4. Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm 3 bƣớc: Bƣớc 1: Biến tính. Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới. Bƣớc 2: Bắt cặp. Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer bắt cặp với các mạch của DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 700C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai. Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer. Nhiệt độ đƣợc tăng lên 720C giúp cho Taq DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả sau cùng ta có thể thu nhận số lƣợng lớn bản sao trình tự DNA. Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR đƣợc tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m * 2n m: Số bản sao ban đầu của DNA mẫu. 14 n: Số chu kỳ. 2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR  DNA bản mẫu (DNA template).  Mồi xuôi (primer forward) và mồi ngƣợc (primer reverse).  dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).  Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (PCR buffer).  MgCl2.  Taq DNA polymerase.  Nƣớc cất 2 lần, khử ion. 2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR  Tỷ lệ lí tƣởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% GC để nhiệt độ bắt cặp của mồi là không quá thấp.  Các đoạn mồi không nên chứa hơn ba nucleotid giống nhau xếp liên tiếp.  Tránh sử dụng các đoạn mồi nhân các đoạn gen phụ.  Hai đoạn mồi không có trình tự bổ sung lẫn nhau.  Độ dài của đoạn mồi là 17 - 25 nucleotide (cho PCR bình thƣờng). 2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm  Ƣu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, đặc hiệu, chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ có thể thực hiện.  Nhƣợc điểm: Có thể cho phản ứng dƣơng tính dã, không phân biệt đƣợc sinh vật sống hay chết. 2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học 2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Trong số các chỉ thị phân tử, chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ gen của con ngƣời (Botstein và ctv, 1980), sau đó đƣợc cải biên để ứng dụng cho việc lập bản đồ (mapping) ở cây trồng. RFLP là thể đa hình đáng tin cậy nhất, có thể đƣợc dùng cho những phân tích chính xác về kiểu gen. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. 15 Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ). Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra các phân đoạn cắt khác nhau. Hình 2.5. Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP Chỉ thị RFLP có khả năng sử dụng rất phong phú, vì là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Ƣu điểm khi dùng RFLP:  Thích hợp cho phân tích đa dạng di truyền đối với DNA có kích thƣớc nhỏ.  Chi phí áp dụng thấp.  Kỹ thuật này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu dịch tễ học. Nhƣợc điểm khi dùng RFLP:  Dùng một lƣợng mẫu DNA lớn.  Môi trƣờng đệm đặc biệt quan trọng đối với hiệu quả hoạt động của enzyme cắt khi mà phối hợp giữa các enzyme cắt với nhau.  Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định. Ứng dụng:  Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể.  Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Lập bản đồ di truyền phục vụ công tác chọn giống. Vị trí cắt Điện di Lai Đột biến = một vị trí cắt mới Thấm tách 16 2.6.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn chỉ khoảng 10 nucleotid, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu là bƣớc đầu đánh giá các tính trạng của sinh vật. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình phản ứng PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Hình 2.6. Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD Ƣu điểm của phƣơng pháp RAPD:  Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít.  Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản.  Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. Điện di sản phẩm PCR Vị trí bắt cặp primer Sản phẩm khuếch đại Nhiễm sắc thể 17  Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao. Nhƣợc điểm:  Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định.  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp. Ứng dụng:  Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể.  Đánh giá sự tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Chọn giống. 2.6.3. Chỉ thị AFLP Phƣơng pháp AFLP đƣợc xây dựng bởi công ty KeyGene và là phƣơng pháp kết hợp giữa RFLP và RAPD. Phƣơng pháp AFLP bao gồm các giai đoạn.  Tách chiết DNA.  Cắt DNA bằng enzyme giới hạn.  Nối trình tự các đoạn DNA đƣợc cắt với các adapter.  Khuếch đại các đoạn cắt giới hạn.  Chạy điện di các đoạn khuếch đại trên gel polyarylamide hay gel agarose. Ở phƣơng pháp này mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adapter và đƣợc gắn thêm 1 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’, gọi là primer+1: Là primer tiền chọn lọc. Adapter gắn 2 - 3 nucleotide thì gọi là primer chọn lọc. Một nucleotide chọn lọc có thể là A, C, G, T. Hai nucleotide chọn lọc là những tổ hợp của A, C, T, G nhƣ là: AA, AG, AT,…. Ba nucleotide có thể là: AAA, ATG, ACC,…. DNA mẫu đƣợc khuếch đại hai giai đoạn:  Giai đoạn 1: Giai đoạn khuếch đại tiền chọn lọc với primer+1.  Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại chọn lọc với primer+2(3). Sự chọn lọc ở đây có ý nghĩa:  Chỉ những trình tự DNA nào gắn với adapter mới đƣợc khuếch đại.  Sự khuếch đại tiền chọn lọc giúp chọn lọc bƣớc đầu các trình tự DNA cần đƣợc khuếch đại. 18  Sự khuếch đại chọn lọc giúp chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần đƣợc khuếch đại. Trong phƣơng pháp AFLP việc ly trích thành phần DNA là khâu hết sức quan trọng, để mà có đƣợc DNA tinh khiết ít bị tạp nhiễm. Cùng với đó những thành phần làm dung dịch đệm cho enzyme cắt và enzyme gắn cũng quyết định sự thành công của kỹ thuật này. Sự thiết kế mồi dựa trên các adapter, mồi đƣợc thiết kế phải phù hợp sao cho có sự cân đối giữa các thành phần theo tỷ lệ: %G + C = 60%, kích thƣớc 17 – 28 base = L Tm = 59,9 + 0,41*(%G,C) – 600/L. Tanneal = Tm-primer - 4 0 C. Tm-product – Tanneal >= 30 0 C. Tm: Nhiệt độ nóng chảy. Tanneal: Nhiệt độ bắt cặp. Tm-primer: Nhiệt độ nóng chảy của mồi. Tm- product : Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm. Ƣu điểm:  Lƣợng DNA cần dùng ít.  Tạo nhiều band khuếch đại khả năng đa hình cao.  Kết quả có độ tin cậy cao, có khả năng lặp lại.  Không cần biết trƣớc trình tự genome. Nhƣợc điểm:  Chi phí cao.  Không kiểm soát hết sự bắt cặp của các adapter.  Enzyme cắt và gắn có thể hoạt động không tốt.  Cần chất lƣợng DNA mẫu cao. Ứng dụng của phƣơng pháp này:  Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể.  Đánh giá sự tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Lập bản đồ di truyền, chọn giống. 19 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Nội dung đề tài Đề tài đƣợc thực hiện với hai nội dung sau:  Thu thập mẫu cây mắm đen tại rừng ngập mặn Cần Giờ.  Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen bằng kỹ thuật RAPD. 3.2. Thời gian thực hiện đề tài Thời gian bắt đầu thực hiện đề tài từ ngày 1 tháng 5 năm 2007 đến ngày 1 tháng 9 năm 2007 tại rừng ngập mặn Cần Giờ và phòng CNSH thực vật của Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Mẫu mắm đen Mẫu mắm đen (Avicennia officinalis) đƣợc lấy ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Cách thức lấy mẫu:  Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).  Thu thập lá của cây mắm đen nhiều hình dạng nhƣ: Lá già, lá non, lá bánh tẻ, lá bị thủng lổ, lá bị sâu bọ ăn, lá nhỏ, lá to.  Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: Thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng, lá khác lạ v/v.  Chọn mẫu lá từ trên những cây mắm đen có năm tuổi khác nhau (cây có gốc lớn, cây có gốc lớn sống cằn cỗi, cây có gốc nhỏ có sức sống tốt, cây có gốc nhỏ sống cằn cỗi). 20  Mỗi cây lấy khoảng 5 - 10 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu.  Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó, nên chuyển ngay về phòng thí nghiệm cho vào tủ lạnh -200C. 3.3.2. Hóa chất thí nghiệm 3.3.2.1. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA  Chloroform:Isoamyl alcohol = 24:1.  Polyvinyl pyrrolidone (PVP).  Sodium acetat 3 M.  Ethanol 100%.  Isopropanol.  Ethanol 70%.  Dịch trích DNA (EB). Bảng 3.1. Thành phần dung dịch ly trích DNA (EB). Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 100ml) CTAB (hexade- cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M β - mercaptroethanol NaCl 5 M Tris – HCl 1 M Nƣớc 2 g. 4 ml. 1 ml. 28 ml. 10 ml. Thêm cho đến 100 ml. 21  TE 1X (Tris-HCl, EDTA). Bảng 3.2. Thành phần dung dịch TE 1X. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 250 ml) Tris – HCl 1 M EDTA 0,5 M 1 ml. 0,2 ml 3.3.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA  Nƣớc cất 2 lần khử ion (đã hấp khử trùng).  TE 1X. 3.3.2.3. Hóa chất dùng trong định tính DNA  Agarose.  Ethidium bromide.  TAE. 3.3.2.4. Hóa chất dùng để cho phản ứng RAPD-PCR  PCR buffer.  dNTP.  Taq DNA polymerase (promega)  MgCl2.  Primer OPA5, primer OPA10, primer OPD18, primer l, primer OPAC10.  DNA mẫu.  Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV. 3.3.3. Trang thiết bị - Chén sứ và chày giã (Đức) - Máy Vortex (IKA - Đức) - Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) - Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) - Tủ sấy (Jencons-Anh) - Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) - Máy điện di (Biorad) - Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) - Lò Viba (Electrolux) - Máy chụp ảnh DNA (Biorad-Thụy Điển) - Đầu típ các loại (Đức) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) - Máy PCR (PTC 100 - MJ) - Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) - Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) 22 - Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản) 3.4. Phƣơng pháp 3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là DNA đƣợc ly trích từ mẫu lá của cây mắm đen. 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp RAPD-PCR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen. 3.4.3. Cách bố trí thí nghiệm  Giai đoạn1 : Tách triết DNA từ các mẫu mắm đen đƣợc thu thập. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di và định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ.  Giai đoạn 2 : Khảo sát các thành phần tối ƣu hóa phƣơng pháp RAPD-PCR trong phân tích đa dạng di truyền của các mẫu mắm đen đƣợc thu thập. Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ mồi và nồng độ muối đến phản ứng RAPD-PCR.  Giai đoạn 3 : Khảo sát tính đa dạng di truyền của các mẫu mắm đen thu đƣợc và phát hiện ra chỉ thị phân tử.  Giai đoạn 4 : Đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc. 3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA 3.4.4.1.Quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle và Doyle (1988)  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch ly trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ, ủ ở 650C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol, khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C.  Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.  Bƣớc 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 µl RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ.  Bƣớc 5: Thêm vào 250 µl dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 6: Ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 7: Cho vào 300 µl TE 1X, ủ ở 370C trong 1 giờ. 23  Bƣớc 8: Thêm 20 µl muối Sodium acetate 3 M và 640 µl Ethanol 100%, trộn đều và để –200C trong 30 phút.  Bƣớc 9: Ly tâm 10 phút 14000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 µl TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở 40C. 3.4.4.2. Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng  Bƣớc1 : Nghiền 0,3 g lá trong nitơ lỏng và cho vào eppendort 1,5 ml.  Bƣớc 2 : Cho 1,3 ml dịch EB đã đƣợc ủ nóng ở 650C vào eppendort rồi vortex thật kỹ.  Bƣớc 3 : Mẫu đƣợc ủ trong 1 giờ ở 650C và sau đó ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.  Bƣớc 4 : Sau đó cho 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều.  Bƣớc 5 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.  Bƣớc 6 : Cho tiếp 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.  Bƣớc 7 : Cho 300 µl Isopropanol lạnh và ủ 1 giờ ở -200C (nên để qua đêm).  Bƣớc 8 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9 : Cho 300 µl TE 1X ủ 370C trong 1 giờ, sau đó cho tiếp 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100% để tủa 30 phút ở -200C.  Bƣơc 10 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11 : Rửa tủa với 400 µl Ethanol 70%, ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, lập lại 1 lần nữa. Phơi mẫu 370C sau đó cho 100 µl TE 1X vào ủ 37 0C trong 30 phút.  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu 40C. 24 3.4.4.3. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Để định tính DNA, điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose. Trong điện trƣờng, DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dƣơng, vì DNA mang điện âm (do tính chất của nhóm phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của gel agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh. Do đó, DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy, có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose dựa vào kích thƣớc phân tử. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Mà có thể quan sát DNA bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với Ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV. Cách tiến hành:  Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.  Đổ gel và chờ agarose đông.  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 µl loading dye và 4 µl DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.  Nhuộm Ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. 3.4.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Trên nguyên tắc sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các base nitơ của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, có thể xác định hàm lƣợng của DNA trong dung dịch. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch DNA thƣờng đo giá trị OD280nm. Do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bƣớc sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm gây nên sự sai lệch khi tính nồng độ của acid nucleic. Khi giá trị OD260/OD280 = 1,8 – 2,2 thì dịch trích DNA đƣợc coi là tinh sạch. Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/µl) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Cách tiến hành: 25  Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 5 µl dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD. DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lƣợng sẽ đƣợc bảo quản ở -20 0 C để dùng cho việc thực hiện phản ứng RAPD. 3.4.5. Thực hiện phản ứng RAPD-PCR 3.4.5.1. Primer sử dụng Những primer đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. Bảng 3.3. Danh sách những primer dùng trong nghiên cứu Tên primer Trình tự Tm OPA10 GTGATCGCAG 30,7 OPA5 AGGGGTCTTG 30,2 OPD18 GAGAGCCAAC 31,9 Primer 1 TGCCGAGCTG 40,7 OPAC10 AGCAGCGAGG 34 3.4.5.2. Bố trí thí nghiệm Chọn những mẫu có độ tinh sạch cao để thực hiện phản ứng RAPD-PCR. Thí nghiệm 1:  Mục đích: Chúng tôi khảo sát mồi, xem xét những mồi nào thích hợp cho phản ứng RAPD-PCR.  Phƣơng pháp tiến hành: Theo qui trình sau. 26 Bàng 3.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 Hóa chất Dung dịch gốc L hút Nđ cuối PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X MgCl2 25 mM 3 µl 3 mM Primer 100 pM/µl 0,3 µl 1,2 pM/µl dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl Nƣớc 17,8 µl Bảng 3.5. Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 0,5 Ta 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002)  Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di. Thí nghiệm 2:  Mục đích: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ primer đến qui trình RAPD-PCR.  Phƣơng pháp tiến hành: Theo quy trình sau. 27 Bảng 3.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 2 Thành phần hóa chất Dung dịch gốc Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 L hút Nđ cuối L hút Nđ cuối L hút Nđ cuối PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X 2,5 µl 1X 2,5 µl 1 X MgCl2 25 mM 3 µl 3 mM 3 µl 3mM 3 µl 3 mM Primer 100 pM/µl 0,25 µl 1 pM/µl 0,2 µl 0,8 pM/µl 0,15 µl 0,6 pM/µl dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM 0,2 µl 0,2 mM 0,2 µl 0,2 mM Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U 0,2 µl 1 U 0,2 µl 1 U DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl Nƣớc 17,85 µl 18,1 µl 17,95 µl Bảng 3.7: Chƣơng trình nhiệt của phản ứng RAPD–PCR cho thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002)  Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di. 28 Thí nghiệm 3:  Mục đích: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ MgCl2 và primer đến phản ứng RAPD - PCR.  Phƣơng pháp tiến hành: Theo quy trình sau. Bảng 3.8: Bảng hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc L hút Nđ cuối Nghiệm thức 1 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2,5 µl 0,2 µl 2,5 mM 0,8 pM/µl Nghiệm thức 2 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2 µl 0,2 µl 2 mM 0,8 pM/µl Nghiệm thức 3 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2,5 µl 0,15 µl 2,5 mM 0,6 pM/µl Nghiệm thức 4 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2 µl 0,15 µl 2 mM 0,6 pM/µl Bảng 3.9: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002)  Chỉ tiêu đánh giá: Số lƣợng và chất lƣợng các band DNA trên gel điện di. 29 Thí nghiệm 4  Mục đích: Dùng RAPD-PCR để nghiên cứu sự đa dạng cây mắm đen.  Phƣơng pháp tiến hành: Theo qui trình sau. Bảng 3.10. Thành phần hóa chất cho RAPD-PCR của thí nghiệm 4 Hóa chất Dung dịch gốc L hút N đ cuối PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X MgCl2 25 mM 2,5 µl 2,5 mM Primer 100 pM/µl 0,15 µl 0,6 pM/µl dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl Nƣớc 17,8 µl Bảng 3.11. Chu trình nhiệt cho RAPD-PCR của thí nghiệm 4 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002)  Chỉ tiêu đánh giá: Số lƣợng các band DNA trên gel điện di. Sau khi đã tối ƣu cho qui trình RAPD-PCR chúng tôi tiến hành chọn 11 mẫu để nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm đen. 3.4.6. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc Các band thu đƣợc từ kết quả điện di của phản ứng RAPD-PCR sẽ đƣợc mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa đƣợc lƣu dƣới dạng file Excel và chuyển sang phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1 để xử lý. 30 Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979). Sxy = 2 xy/(x + y) với xy: Số band giữa hai mẫu. x: Số band của mẫu x. y: Số band của mẫu y. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y. Dxy = 1 - Sxy Từ kết quả phân nhóm dựa trên kiểu gen và nhận xét mối tƣơng quan dựa trên các đặc điểm hình thái, rút ra kết luận về sự đa dạng di truyền ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thu thập mẫu tại các tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ Chúng tôi tiến hành thu thập 50 mẫu lá cây mắm đen, tại các tiểu khu của rừng ngập mặn Cần Giờ. Quá trình thu thập mẫu đƣợc tiến hành theo đƣờng chéo của khu rừng khoảng cách lấy mẫu là vào khoảng 500 m, có máy định vị GPS. Tiến trình lấy mẫu chủ yếu theo đƣờng bộ hai bên đƣờng đi hay theo đƣờng thủy dọc hai bên mé sông và kênh rạch. Vị trí lấy mẫu đƣợc thể hiện trên bản đồ sau. Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ Quá trình lấy mẫu đƣợc chia làm 2 đợt. Đợt 1 lấy 20 mẫu lá mắm đen từ mẫu A1 đến A20 theo đƣờng bộ bằng phƣơng tiện xe máy, đƣợc biểu thị trên bản đồ là những chấm đen. Đợt 2 lấy 30 mẫu lá mắm đen từ mẫu A21 đến A50 theo đƣờng thủy bằng phƣơng tiện ghe máy, đƣợc biểu thị bằng chấm đỏ trên bản đồ. 32 Hạn chế của việc lấy mẫu là không đi vào bên trong của khu rừng, vì đƣờng đi rất khó, nƣớc ngập, sình lầy và bùn lún. Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu là dựa vào những đặc điểm của cây nhƣ: Chiều cao cây, thân hình cây, hoa, trái, lá cây. Đặc điểm của cây lấy mẫu đƣợc ghi nhận ở phần phụ lục 4.1. 4.2. Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền 4.2.1. Bảo quản Mẫu lá mắm đen không thể bảo quản lâu ở 40C. Cách bảo quản tốt nhất cho mẫu lá mắm đen là nên cho vào bịch nilong, ép hết không khí ra ngoài và trữ ở -200C. Đối với lá trƣởng thành có thể bảo quản trên 4 tuần. Còn đối với lá non thì việc bảo quản lâu không tốt, lá thƣờng hay bị hóa nâu đen. Vì có thể vách tế bào của lá non còn mềm nên khi bỏ vào tủ -200C thì tế bào dễ bị co rút và dễ bị vỡ cho nên các hợp chất thứ cấp trong tế bào lá non ra ngoài và làm cho lá bị hóa nâu, cùng với đó trong thời kì này lá non phát triển mạnh nên có nhiều hợp chất thứ cấp đƣợc hình thành nhƣ Phenol làm lá hóa nâu. Điều này có thể đã làm cho DNA bị đứt gẫy hay bị phân hủy trƣớc khi ly trích DNA tổng số. Cách tốt nhất là, lá non khi lấy mẫu về thì nên dùng trong 2 - 3 ngày. 4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền Chúng tôi khảo sát trên hai qui trình ly trích và nhận thấy một số điểm đáng lƣu ý sau.  Đối với qui trình ly trích Doyle và Doyle (1988). Khi chúng tôi thực hiện theo qui trình của Doyle và Doyle (1988) thì kết quả thu đƣợc hàm lƣợng DNA không cao. 33 Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA theo qui trình Doyle (1988) Điều này rất có thể là do quá trình ly tâm ở tốc độ quá cao đã làm cho DNA bị đứt gẫy. Tại bƣớc 2 và 3 khi vortex quá mạnh, kỹ và đề thời gian tƣơng đối dài với Chloroform:Isoamyl alcohol đã làm cho DNA bị biến tính và đứt gẫy cho nên hàm lƣợng DNA thu đƣợc không cao. Do vậy, chúng tôi đã có một số lƣu ý ở những bƣớc này và thu đƣợc kết quả. Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA theo qui trình Doyle có cải tiến Sản phẩm điện di cho thấy DNA tổng số cho band tƣơng đối tốt, band sáng và rõ, tạp phía dƣới tách biệt với band DNA tổng số, sản phẩm cho ít bị đứt gẫy. Chúng tôi tiến hành đo OD của những mẫu này thì thu đƣợc kết quả sau. 34 Bảng 4.1 : Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến Mẫu OD260nm OD280nm OD260/OD280 Lƣợng DNA (ng/µl) 5A 0,026761 0,015763 1,69771 177,7886 4Ag 0,033635 0,021825 1,541123 199,2029 4An 0,03761 0,022284 1,66709 153,5203 3A 0,070867 0,041934 1,689965 294,791 2A 0,09279 0,054756 1,694609 386,5275 1A 0,023907 0,013311 1,796033 102,4554 Kết quả đo OD khá tốt đủ tiêu chuẩn dùng trong sinh học phân tử. Tuy nhiên, việc ly trích bằng dịch EB sẽ mất nhiều thời gian và công sức. Nghiền trong dung dịch EB thì phụ thuộc rất nhiều vào thao tác nghiền. Do vậy, kết quả thƣờng không ổn định. Một số lƣu ý khi nghiền trong dịch EB.  Nên chọn những lá trƣởng thành, dịch EB nên ủ ở 650C trƣớc khi dùng và khi dùng mới bỏ β-mercaptroethanol vào dịch EB vì nhƣ thế β - mercaptroethanol sẽ bảo vệ DNA tốt hơn và phá hủy màng tế bào đƣợc tốt hơn.  Khi nghiền mẫu không nên nghiền mạnh tay, vortex tại bƣớc 1 vào khoảng 1000 - 1200 vòng/phút.  Tại bƣớc 2 và 3 không nên vortex và không để thời gian lâu vì nhƣ thế sẽ làm cho DNA dễ bị đứt gẫy hơn và dễ bị biến tính hơn. Nên đảo nhẹ tay trong 5 phút và ly tâm 11000 vòng/phút trong 10 phút.  Ở bƣớc 4 nên hút khoảng 250 – 300 ml dịch trong và không để đầu típ chạm vào giữa 2 pha, vì nhƣ thế sẽ làm cho protein sẽ đi theo và làm cho chất lƣợng DNA thu đƣợc không tốt.  Tại bƣớc 5 nên cho Isopropanol : mẫu theo tỉ lệ 1:1 và nên ủ qua đêm thì hiệu quả cho kết tủa của DNA tốt hơn.  Tại bƣớc 6 nên ly tâm ở 11000 vòng/phút trong 15 phút.  Bƣớc 7 khi cho TE 1X vào sẽ làm cho DNA hòa tan, nếu thấy DNA chƣa hòa tan hết thì nên kéo dài thời gian ủ.  Bƣớc 9 nên ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút. 35  Bƣớc 10 và 11 nên ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Nên phơi mẫu thật khô vì nếu không Ethanol còn lại sẽ làm cho DNA bị phá hủy, thƣờng thì chúng tôi phơi trong khoảng 2 - 3 giờ ở 370C. Nên bảo quản DNA ở -200C.  Qui trình ly trích bằng nitơ lỏng. Chúng tôi nhận thấy khi nghiền trong dịch EB sẽ mất nhiều thời gian và công sức cùng với đó chất lƣợng DNA cho không cao còn tạp nhiều, tạp lắng không tốt sản phẩm hay bị smear. Do vậy, chúng tôi thử nghiệm qui trình ly trích bằng nitơ lỏng và thu đƣợc kết quả sau. Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA bằng nitơ lỏng Chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt hơn tạp ít hơn, tạp lắng tốt và DNA ít bị đứt gẫy. Qui trình này cho DNA tổng số khá ổn định. Mẫu 6 và 11 ta thấy tạp nhiều và hàm lƣợng DNA tổng số nhiều là do thao tác nghiền mẫu lúc cho mẫu vào eppendort quá nhiều làm cho hàm lƣợng DNA nhiều, cùng với đó mẫu lá quá non nên tế bào và màng nhân dễ vỡ nên giải phóng hàm lƣợng DNA nhiều. Mặt khác, giai đoạn này lá non đang phát triển mạnh nên tổng hợp nhiều hợp chất thứ cấp nhiều protien nên trong quá trình ly trích lá non tạp nhiều. Chúng tôi tiến hành đo OD của 30 mẫu thì thu đƣợc kết quả theo phụ lục 4.2. Nhận thấy rằng mẫu OD đạt từ 1,4 trở lên trong đó tỷ lệ OD đạt từ 1,7 trở lên chiếm 67,7%, mẫu OD đạt từ 1,5 – 1,7 chiếm 22,58% và nồng độ DNA đạt từ 80 ng/µl đến 417 ng/µl. Qua đó chúng tôi thấy chất lƣợng DNA cho khá tốt, có thể dùng đƣợc trong nghiên cứu sinh học phân tử. Những mẫu có OD đạt từ 1,5 trở lên ta có thể dùng cho phản ứng RAPD-PCR. Chất lƣợng mẫu có tỷ lệ OD đạt từ 1,5 trở lên chiếm trên 90%. Điều này là quá tốt trong nghiên cứu sinh học phân tử. Trong quá trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng chúng tôi có một số lƣu ý sau. 36  Cần dùng lá không quá non (là những lá trên đọt ngọn), trƣớc khi nghiền cần nên lau lá thật khô nƣớc.  Trong quá trình nghiền không để cho mẫu chảy nƣớc (mẫu hết lạnh) vì nhƣ thế các hợp chất thứ cấp trong tế bào sẽ hòa tan ra ngoài và phá hủy DNA.  Khi nào dùng dịch EB thì mới bỏ β-mercaptroethanol vì nhƣ thế thì hiệu quả bảo vệ DNA sẽ tốt hơn và cần để dịch EB ở 650C. Trong dịch EB lúc này cần bổ sung thêm Polyvinyl pyrrolidone 2 g trong 100 ml dịch EB, thì hiệu quả sẽ tốt hơn. Vì Polyvinyl pyrrolidone có tác dụng làm biến tính các Polyssacharid.  Khi cho dịch EB vào thì nên vortex ngay để dịch EB trộn đều và bảo vệ DNA đƣợc tốt, nên vortex 1400 vòng/phút.  Bƣớc 4 nên ủ Isopropanol qua đêm.  Giai đoạn phơi mẫu thì cần nên phơi mẫu thật khô thƣờng thì 2 - 3 giờ trong tủ hút. Trong hai qui trình ly trích trên chúng tôi nhận thấy nên ly trích theo qui trình nghiền trong nitơ lỏng. Vì hiệu quả cho sản phẩm DNA tổng số khá tốt tạp ít, tạp lắng tốt, DNA ít bị đứt gẫy. Thời gian nghiền mẫu nhanh, nghiền đƣợc số lƣợng mẫu lớn. 4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR  Thí nghiệm 1 : Chúng tôi tiến hành khảo sát các mồi.  Đối với primer OPA10 và OPA5, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 34 0 C và thu đƣợc kết quả sau. 37 Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và OPA5 Kết quả điện di không thấy band. Điều này có thể là do nguyên nhân. - Trình tự mồi không bắt cặp với DNA của bộ gen hay không có vị trí tƣơng đồng trên bộ gen. - Lƣợng MgCl2 cho vào quá cao đã làm ức chế hoạt động của Taq DNA polymerase. - Lƣợng mồi quá nhiều cũng gây ảnh hƣởng đến quá trình bắt cặp và kéo dài. - Taq DNA polymerase chƣa đủ hoạt tính. - Chu kỳ nhiệt chƣa thích hợp. Qua hai mồi OPA10 và OPA5 chúng tôi không thu đƣợc kết quả. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát những mồi tiếp theo.  Đối với OPD18, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 34 0 C và kết quả thu đƣợc nhƣ sau. 38 Sản phẩm RAPD-PCR Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA18 Hình điện di cho ta thấy có sản phẩm RAPD-PCR nhƣng band cho không tách rõ ràng, band còn mờ. Điều này có thể là do nguyên nhân. - Chu kì nhiệt chƣa tốt. - Lƣợng mồi còn quá cao. - Hàm lƣợng MgCl2 còn cao nên đã có phần gây ức chế hoạt động của Taq DNA polymerase. - Taq DNA polymerase chƣa đủ hoạt tính để kéo dài sản phẩm. Nên cần phải điều chỉnh thêm trong quá trình cần nghiên cứu tiếp.  Đối với primer 1, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 38 0 C. Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm trên ba loại cây mắm (mắm đen, mắm biển và mắm trắng) thì chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau. Mắm biển Mắm đen Mắm trắng Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1 Kết quả điện di chỉ cho một band đồng hình duy nhất sáng và rõ, nên không có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho cây mắm. Tuy nhiên, ở đây có thể 39 band này là đặc trƣng cho cây mắm và có thể là marker để chỉ thị cho cây mắm với những cây khác. 400bp Hình 4.8. Kích thƣớc band phản ứng RAPD-PCR của primer 1 Chúng tôi xác định kích thƣớc band này là vào khoảng 400pb (hình 4.8). Cần nên giải trình tự band này nhằm mục đích phục vụ cho công tác chọn giống và nghiên cứu đặc thù cây mắm ở rừng ngập mặn Cần Giờ.  Đối với OPAC10, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 36 0 C. Chúng tôi tiến hành khảo sát mồi này và thu đƣợc kết quả nhƣ sau. Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 Kết quả thu đƣợc cho thấy rằng có thể sử dụng mồi này dùng làm trong nghiên cứu tiếp theo. Kết quả điện di cho hai band đồng hình rất rõ và sáng kích thƣớc khá gần nhau. Những band có kích thƣớc lớn hơn hay nhỏ hơn thì mờ, điều này có thể là do nguyên nhân. - Trên bộ gen có nhiều đoạn gen có kích thƣớc gần với hai band đồng hình này. - Vị trí bắt cặp giữa mồi và DNA này dễ xảy ra, cùng với hàm lƣợng mồi cao và nồng độ DNA mẫu cao nên đã có sự bắt cặp nhiều giữa DNA và mồi đã 40 làm cho Taq DNA polymerase hoạt động gần hết. Do vậy, mà những vị trí khác lƣợng Taq DNA polymerase không đủ hoạt tính. - Chu trình nhiệt chƣa phù hợp. - Nồng độ MgCl2 còn cao đã làm hạn chế hoạt động của Taq DNA polymerase. Do vậy, cần có những điều chỉnh tiếp theo để cho kết quả phù hợp dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền.  Thí nghiệm 2 : Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer OPAC10 lên kết quả RAPD-PCR. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau : Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2 Nghiệm thức 2 và 3 ta thu đƣợc 4 - 6 band, band phân tách rõ và độ sáng band đều. Điều này cho thấy, ở nồng độ primer 0,8 pM/µl và 0,6 pM/µl cho kết quả phản ứng RAPD-PCR tốt hơn. Tuy nhiên, có một số band chƣa có phân tách rõ và một số band còn mờ. Điều này có thể là do hàm lƣợng MgCl2 chƣa thật tối ƣu để cho Taq DNA polymerase hoạt động tốt. Do vậy, cần phải điều chỉnh nồng độ MgCl2.  Thí nghiệm 3: Sử dụng primer OPAC10 làm thí nghiệm tối ƣu. Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ MgCl2 trên hai nồng độ mồi và thu đƣợc kết quả sau. 41 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3 Kết quả điện di cho thấy ở nghiệm thức 3 và 4 cho sản phẩm RAPD-PCR khá ổn định. Số band đạt từ 5 band/mẫu, độ sáng band tƣơng đối đều. Do vậy, ta có thể làm ở những nồng độ này trong nghiên cứu tiếp theo.  Thí nghiệm 4 : Sử dụng primer OPAC10 làm thí nghiệm cho nghiên cứu sự đa dạng di truyền. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: đa hình đồng hình Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ƣu Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR tƣơng đối tốt band sáng và rõ, tuy nhiên độ đa hình không cao. Chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR trên primer OPAC10 của 11 mẫu kết quả điện di thu đƣợc 5,4 band/mẫu. Trong đó band đồng hình 5 band chiếm tỷ lệ 62,5% band đa hình có 3 band chiếm tỷ lệ 37,5%. Kích thƣớc band sản phẩm 150bp – 1000bp, kích thƣớc band đồng hình luôn xuất hiện 150bp, 250bp, 350bp 550bp và 650bp. Kích thƣớc band đa hình 400bp, 750bp và 1000bp. Tuy nhiên lƣợng mẫu 42 nghiên cứu không lớn chỉ 11 mẫu chƣa thấy đƣợc hết sự đa dạng di truyền của cây mắm đen. Từ kết quả điện di chúng tôi mã hóa số liệu theo dạng nhị phân 0 và 1 những mẫu có band là 1 không có band là 0 theo phụ lục 4.3. Kết quả xử lý đƣợc phân tích trên phần mềm NTSYTpc phiên bản 2.1 chúng tôi thu đƣợc kết quả sau. a b Hình 4.13. Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen Từ cây phân nhóm di truyền cho thấy hệ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,54 đến 1 và cây phân nhóm di truyền đƣợc chia làm hai nhóm phân biệt nhóm I và nhóm II. Trong nhóm I gồm có nhóm a, nhóm b và mẫu cây mắm đen A4. Nhóm II chỉ có một mẫu cây mắm đen A19. Từ bảng ma trận tƣơng đồng ở phụ lục 4.4 ta thấy hệ số đồng dạng di truyền giữa nhóm a và nhóm b là khá cao 0,875 điều này có thể là do các cây có cùng một nguồn gốc giống bố mẹ từ tự nhiên. Xem xét vị trí lấy mẫu thì nhận thấy rằng các mẫu này lấy cùng đợt 1 trên cùng một đƣờng đi. Điều này có thể là nguyên nhân thuận lợi để cho gió và côn trùng giúp cho sự giao phấn chéo giữa các cây cận huyết hay là sự phát tán các cây có cùng một nguồn gốc bồ mẹ, mà ta thấy rõ nhất các mẫu cây A1, A7, A8, A10, A12 của nhóm a chủ yếu thuộc tiểu khu 17 và 21 hay A15, A17, A18, A20 của nhóm b chủ yếu là thuộc tiểu khu 10 và 5B có vị trí lấy mẫu khá gần nhau và hệ đồng dạng di truyền của nhóm a hay nhóm b là 100%. Trong tƣơng lai gần nếu không du nhập giống mới từ những địa phƣơng khác vào thì nguy cơ Nhóm I Nhóm II 43 cây giữa nhóm a và nhóm b sẽ đạt hệ số đồng dạng di truyền tăng dần. Điều này sẽ không tốt, và gây nguy hại cho quần thể cây này có thể chết hàng loạt khi cây nhiễm bệnh. Trong nhóm II chỉ có một mẫu cây A19 có hệ số đồng dạng di truyền so với nhóm I là 0,54. Xem xét vị trí lấy mẫu thì cây A19 thuộc tiểu khu 5B , mẫu lấy gần nhóm b nên hệ số đồng dạng di truyền so với nhóm này là 0,625. Còn nhóm a thì tƣơng đối xa do vậy hệ số đồng dạng di truyền có sự khác biệt 0,5. Điều này cũng là tất yếu, vì khoảng cách có sự khác biệt nên quá trình thụ phấn chéo cũng bị ảnh hƣởng. Nhìn chung cây A19 có sự khác biệt với những cây trong nhóm I. Điều này có thể là do nguyên nhân bị ảnh hƣởng của môi trƣờng làm cây bị biến đổi những cặp alen trong quá trình giao phấn với cây khác. Tuy nhiên, trong một thời gian nữa nếu không có sự du nhập giống mới từ những địa phƣơng khác vào thì những cây này sẽ có hệ số tƣơng đồng di truyền cao làm cho nguồn gene cây mắm đen ở khu vực này ngày càng nghèo nàn. Do vậy, cần phải có một chính sách quản lý phù hợp cho những khu vực này. Nên đƣa giống mới từ những địa phƣơng khác vào, trồng xen kẽ trong các tiểu khu nhằm mục đích làm giảm hệ số đồng dạng di truyền cho quần thể cây này. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc, có thể đƣa một số kết luận sau.  Bảo quản mẫu Mẫu bảo quản ở -200C, đối với lá trƣởng thành thì bảo quản trên 4 tuần. Còn lá non thì việc bảo quản lâu sẽ không tốt, lá thƣờng hay bị hóa nâu do hợp chất Phenol.  Về quy trình ly trích DNA Quy trình ly trích DNA nghiền trong nitơ lỏng cho kết quả tốt hơn quy trình ly trích DNA nghiền trong dịch EB. DNA thu đƣợc từ quy trình nghiền trong nitơ lỏng cho ít bị smear, tạp lắng tốt hơn và hàm lƣợng DNA thu đƣợc khá cao.  Về phản ứng RAPD-PCR Chỉ có 3 primer RAH8, primer 1 và OPAC10 cho sản phẩm phản ứng RAPD- PCR. Trong đó primer 1 cho sản phẩm phản ứng RAPD-PCR một band đồng hình duy nhất trên 3 loại cây mắm và kích thƣớc 400pb. Primer OPAC10 thích hợp ở nồng độ 0.6 pM/µl và nồng độ MgCl2 là 2 mM hay 2.5 mM.  Về cây phân nhóm di truyền Các mẫu mắm đen khảo sát có hệ số đồng dạng di truyền cao biến thiên từ 0,54 đến 1. Các mẫu mắm đen đều bắt nguồn từ tự nhiên không có sự du nhập giống mới vào. 5.2. Đề nghị - Cần tối ƣu qui trình RAPD-PCR cho primer OPD18 - Cần phân tích nhiều mẫu khi dùng primer OPAC10. - Cần khảo nghiệm nhiều primer để thấy mức độ đa dạng di truyền cây mắm đen. - Cần giải trình tự band 400bp khi dùng primer 1để nghiên cứu sâu hơn về cây mắm. 45 - Cần có chính sách bảo vệ và phát triển giống mới bằng cách cho lai tạo với những cây ở địa phƣơng khác. - Cần nghiên cứu nhiều cây có những đặc điểm hình dạng khác nhau. Do quá trình lấy mẫu chỉ tập trung 2 bên đƣờng bộ và sông chƣa đi sâu vào bên trong. Do vậy, không khảo sát đƣợc những cây ở bên trong khu rừng. 46 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Quỳnh Anh, 2005. Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP, luận văn tốt nghiệp Kĩ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 2. Lê Huy Bá, 1998. Môi trường. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh. 3. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L) hiện được trồng tại tĩnh ninh thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Luận văn tốt nghiệp Kĩ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh 4. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử, những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp 5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2003. Sinh học phân tử ( khái niệm- phương pháp- ứng dụng). Nhà xuất bản Giáo dục. 6. Lê Văn Khôi và cs, 2005 . Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000). Giải thƣởng Hồ Chí Minh về Khoa học và Công nghệ năm 2005. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh. 9. Lƣu Phúc Lợi, 2005. Bài giảng : Học phần sinh tin học ứng dụng. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Phƣớc Nhuận và cs, 2003. Giáo trình sinh hóa học( phần 1 sinh hóa học tĩnh). Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. 47 11. 6860066E546/$FILE/Mamldong.htm 12. 13. 14. quan/xa_hoi/dia_ly_thu_muc/ba_he_sinh_thai_rung/mldocument_view 15. Phục lục 4.1. Toạ độ và đặc điểm cây mắm lấy mẫu Tên mẫu Đặc điểm Tiều khu GPS 48P: UTM: A1 Cây cao khoảng 5 m, nhiều nhánh, có vết bệnh đốm trắng trên lá, không có trái 17 0707448 1150623 A2 Cây cao khoảng 2,3 m, có vết bệnh đốm trắng, không có trái 17 0707448 1152105 A3 Cây cao khoảng 3,5 m, mất ngọn, nhiều nhánh, không có trái 21 0706752 1154072 A4 Cây cao lớn 17 O706799 1154233 A5 Cây cao khoảng 10 m, đƣờng kính 35 cm, có nhiều nhánh, 17 0706898 1156443 A6 Cây cao khoảng 5 m, lá có nhiều vết đốm trắng, không có trái 21 0706380 1157741 A7 Cây cao khoảng 10 m, đƣờng kính gốc 15 cm, cây chết phần ngọn 6 m, nhánh nhỏ ít, không trái 11 0705765 1158774 A8 Cao khoảng 2,5 m, đƣờng kính gốc khoảng 3,5 cm, là tốt, không trái 11 0705441 1159250 A9 Cây bụi cao khoàng 2 m, không có vết bệnh, có trái ít 11 0705161 1159715 AO10 Cây bụi cao khoảng 3,5 m không sâu bệnh, trái ít 11 0704086 1161940 A11 Cây cao khoảng 4,5 m, lá non tốt, ngọn gẫy mọc nhiều nhánh nhỏ trên gốc, có bông 10 0703881 1162362 A12 Cây cao khoảng 1,6 m không trái, lá tốt 10 0703258 1162362 A13 Cây cao khoảng 4 m, có vết bệnh đốm trắng 10 0702913 lá ít, có bông, trái nhiều 1163559 A14 Cây cao khoảng 6 m, đƣờng kính 8 cm, không sâu bệnh, không hoa trái 10 0702489 1164263 A15 Cây cao khoảng 3 m, lá tốt, không hoa trái 10 0702486 1164263 AO16 Cây cao koảng 10 m, đƣờng kính gốc 30 cm, nhánh to lớn, có nhánh to lớn, có nhiều trái 10 0700452 1165786 A17 Cây cao khoảng 2,5 m, không hoa trái, cây tốt 5B 0700650 1166971 A18 Cây cao khoảng 5 m, có vài trái, lá bị đốm trắng 5B 0700167 1167848 A19 Cây cao 8-9 m, không trái, lá bị đốm trắng 5B 0699673 1169619 A20 Cây cao 7-8 m, không trái, lá bị đốm trắng 5B 0699710 1169129 A21 Lá nhỏ, không trái 10B 0704645 1161886 A22 Lá bị đốm trắng 10A 0704353 1132004 A23 Cây thấp, chết nửa ngọn 10A 0704558 1162782 A24 Lá nhỏ, lá tốt 6B 0705498 1163894 A25 Lá tốt, cây nhỏ 6B 0706049 1163668 A26 Cây to, lá tốt 6B 0706393 1163652 A27 Cây nhỏ, lá tốt 6B 0706852 1163693 A28 Cây cao nhỏ, lá nhỏ 6B 0707424 1163700 A29 Lá bị thủng có đốm trắng 6B 0707851 1163576 A30 Cây cao, lá nhỏ bị thủng nhiều, 6B 0708594 1163382 A31 Cây nhỏ, lá tốt 6B 0708849 1163504 A32 Lá tốt 13 0709814 1164396 A33 Lá tốt, cây nhỏ 7 0710845 1165053 A34 Lá tốt, có trái 7 0711177 1165656 A35 Lá nhỏ, lá tốt 7 0711394 1166150 A36 Cây nhỏ, lá tốt 7 0711567 1166759 A37 Lá bị thủng nhiều lổ, lá không tốt 7 0711726 1166759 A38 Lá tốt, cây nhỏ, trái nhiều 2B 0711903 1167160 A39 Cây bị chết phần ngọn, lá bình thƣờng 7 0712166 1167219 A40 Cây to, nhiều nhánh, lá tốt 2B 0742166 1167411 A41 Cây nhỏ, lá tốt 7 0712901 1167384 A42 Cây nhỏ, lá bị thủng lổ 7 0713150 1167524 A43 Lá có vệt đóm trắng, thủng lổ 2B 0713389 1168187 A44 Cây mọc thành bụi lá tốt 7 0714263 1168125 A45 Cây nhỏ, lá to tốt 2B 0714899 1168188 A46 Cây nhỏ, lá tốt 2B 0715333 1168845 A47 Cây to, lá bình thƣờng, có nhiều trái 2B 0714707 1169317 A48 Cây cao, lá nhỏ 2B 0713958 1169946 A49 Cây cao, thân nhỏ, lá nhỏ 2B 0712242 1172242 A50 Lá bị đốm màu trắng, lá to 2B 0711195 1170319 Phục lục 4.2. Kết quả đo OD của 30 mẫu ly trích bằng nitơ lỏng Thứ tự Mẫu OD260nm OD280nm OD260/OD280 lƣợng DNA 1 A1 0,039025 0,018796 2,07629 177,8028 2 A2 0,019541 0,011348 1,722053 82,06189 3 A3 0,069912 0,040837 1,711998 292,7351 4 A4 0,03195 0,021093 1,514756 125,0325 5 A5 0,085824 0,050984 1,683352 356,2906 6 A6 0,129195 0,084802 1,523499 507,3512 7 A7 0,089419 0,050833 1,759091 379,4485 8 A8 0,082825 0,042523 1,947792 367,8883 9 A9 0,079003 0,040393 1,955883 351,5159 10 A10 0,130555 0,068373 1,909467 575,05 11 A11 0,066317 0,040988 1,617961 269,5771 12 A12 0.02657 0.012482 1.654943 84.99733 13 A15 0,161185 0,082766 1,94749 715,8979 14 A17 0,097597 0,054689 1,784598 417,0065 15 A18 0,085418 0,047293 1,806164 367,0262 16 A19 0,019357 0,012365 1,565467 77,24153 17 A20 0,052336 0,02757 1,89833 229,9432 18 A21 0,082312 0,046935 1,753763 348,7783 19 A22 0,027186 0,015949 1,704612 113,5853 20 A23 0,03076 0,021201 1,450909 117,1586 21 A24 0,030292 0,017777 1,704047 126,5413 22 A25 0,053079 0,037237 1,425456 199,8155 23 A26 0,034748 0,023311 1,490659 134,6471 24 A27 0,036206 0,021187 1,708918 151,4643 25 A28 0,022952 0,012214 1,879232 100,3995 26 A29 0,046816 0,024597 1,90336 205,9252 27 A30 0,016743 0,007573 2,210881 78,05067 28 A31 0,022952 0,012214 1,879232 100,3995 29 A32 0,036206 0,021187 1,708918 151,4643 30 A33 0,028186 0,015949 1,767314 119,8753 Phụ lục 4.3. Bảng mã hóa kết quả điện di ở thí nghiệm 4 Kích thƣớc A1 A4 A7 A8 A10 A12 A15 A17 A18 A19 A20 1000bp 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 750bp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 650bp 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 550bp 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 400bp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 350bp 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 250bp 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 150bp 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Phục lục.4.4. Bảng ma trận tƣơng đồng của 11 mẫu mắm đen