Khóa luận Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống

tley) Thạch mật asculin-nitrua Thạch sunphit triptoza Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường King’s B Thạch dinh dưỡng Canh thang acetamide Thạch Mueller-Hinton 22 Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí 23 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Áp dụng theo TCVN 5992-1995 (ISO 5669-2:1991) [11]  Nguồn gốc mẫu thí nghiệm: Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nước uống xử lý: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống bệnh viện, nước uống gia đình.  Quá trình lấy mẫu: Sát trùng bên ngoài vòi nước, mở vòi cho nước chảy một lúc rồi hứng vào các chai đựng. Dụng cụ chứa nước là các chai thủy tinh có thể tích 1,25 ml được vô trùng trước khi lấy mẫu. Lấy mẫu xong phải đậy kín bình chứa rồi nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm và lọc ngay trong ngày. Nếu để sang ngày hôm sau phải được trữ trong tủ mát ở nhiệt độ 40C. 3.4.2. Xử lý số liệu Từ các kết quả phân lập vi khuẩn của nước uống đóng chai và nước uống xử lý, chúng tôi xử lý số liệu theo thống kê mô tả. Tiếp theo các kết quả về tỉ lệ phần trăm khác biệt được phân tích về mặt ý nghĩa thống kê với P < 0,05 bằng phép kiểm 2 test. Tính đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa cũng được phân tích sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê theo nhóm (nước uống đóng chai hoặc nước uống xử lý). Trong trường hợp mẫu nhỏ, phép kiểm sẽ được xử lý hiệu chỉnh Yates. 24 3.4.3. Đánh giá kết quả Chỉ tiêu vi sinh vật kiểm tra áp dụng theo TCVN 6096:2004 [1] + Đọc kết quả: Trong một chỉ tiêu, nếu số vi khuẩn hiện diện ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai. Nếu số vi khuẩn ≥ 2 thì coi như chỉ tiêu đó không đạt tiêu chuẩn. + Biện giải kết quả: Nếu một mẫu bị vi phạm bất cứ chỉ tiêu nào trong các chỉ tiêu trên thì đều không đạt tiêu chuẩn vi sinh. Kiểm tra lần đầu Giới hạn Coliforms tổng số 1x250 ml Không được phát hiện trong bất kỳ mẫu nào Nếu ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai Nếu ≥ 2 thì loại bỏ Coliform fecal hoặc E. coli 1x250 ml Streptococcus fecalis 1x250 ml Pseudomonas aeruginosa 1x250 ml Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphite 1x50 ml 25 3.4.4. Phƣơng pháp thử nghiệm vi sinh vật 3.4.4.1. Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và Escherichia coli giả định Áp dụng theo TCVN 6187-1:1996; ISO 7899-2:1990(E) [12].  Nguyên tắc Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc trên môi trường nuôi cấy thạch lactoza chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hòa bằng môi trường lỏng chọn lọc chứa lactoza. Nuôi cấy màng lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ 350C hoặc 370C để phát hiện vi khuẩn Coliform, hoặc ở 440C để phát hiện Coliform fecal. Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy chuyển các khuẩn lạc đặc trưng để thử nghiệm xác định khả năng sinh khí và sinh indol. Tính toán số vi khuẩn Coliform, Coliform fecal và E. coli giả định có trong 250 ml mẫu.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Môi trường khẳng định: Môi trường để kiểm tra sự sinh khí: Nước pepton lactoza Môi trường để kiểm tra sự sinh indol: Nước trypton Môi trường ống đơn để kiểm tra sự sinh khí và indol: Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan Thuốc thử: Thuốc thử Kovac’s để thử indol Thuốc thử oxidase dùng cho phép thử oxidase 26  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E. coli giả định Lactose TTC + Tergitol 7 - Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-) Lactose TTC + Tergitol 7 Ủ (37 ± 0,5)0C/18-24 giờ - Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Nước trypton (sinh indol) Ủ 370C/ 48 giờ Ủ 440C/ 24 giờ - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-) Coliforms tổng số - Thử indol (+) E.coli giả định Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (vàng, da cam hoặc đỏ gạch) Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định Coliforms Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (vàng, da cam hoặc đỏ gạch) Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định Coliform fecal và E.coli Ủ(44 ± 0,25)0C/18-24 giờ Coliform fecal 27 3.4.4.2. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân (Streptococcus fecalis) Áp dụng theo TCVN 6189-2:1996; ISO 7899-2:1984(E) [13].  Nguyên tắc Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5- triphenyltetrazoli chlorua liên cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan màu đỏ. Sau khi nuôi cấy, tất cả khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng toàn bộ khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, toàn bộ các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định. Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 440C. Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7-dihydroxycourmarin sẽ kết hợp với ion Fe3+ cho hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuếch tán vào môi trường. Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalase đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường khẳng định. Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và catalase âm tính thì có thể xem là liên cầu phân.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Môi trường khẳng định: Thạch mật asculin-nitrua Thuốc thử catalase: Hydropeoxit dung dịch 30g/l 28  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis Ủ 370C/ 24h SLANTZ & BARTLEY Ủ (37 ± 1)0C/ (44 ± 4)h Đếm các khuẩn lạc màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc và cấy chuyển các khuẩn lạc điển hình sang môi trường Thạch dinh dưỡng Thạch mật asculin – nitrua (BEA) Ủ(44 ± 0,5) 0 C / 48h Thử catalaza (-) Xuất hiện khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hoặc đen Liên cầu phân 29 3.4.4.3. Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clostridium) Áp dụng theo TCVN 6191-2:1996; ISO 6461-2:1986(E) [14].  Nguyên tắc Lựa chọn các bào tử Chọn lọc các bào tử có trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian (80 0C trong 10 phút) đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡng. Lọc qua màng và nuôi cấy Lọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 m) được giữ lại trên màng lọc. Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 370C ± 10C trong 20 ± 4 giờ và 44 ± 4 giờ và đếm các khuẩn lạc có màu đen.  Môi trường nuôi cấy Thạch sunphit triptoza  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (50 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,2 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium) Thạch - sunphit - tryptoza Ủ (37 ± 1)0C/(20 ± 4)h và (44 ± 4)h (Ủ trong điều kiện kỵ khí) Đếm các khuẩn lạc màu đen Bào tử vi khuẩn kỵ khí sunphit (Clostridium) 30 3.4.4.4. Phát hiện và đếm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Áp dụng theo ISO 16266:2006(E) [15].  Nguyên tắc Lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt trên môi trường chọn lọc và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp. Sau khi ủ đếm các khuẩn lạc P. aeruginosa giả định trên màng lọc. Các khuẩn lạc tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời hoặc màu xanh lá cây được khẳng định là P. aeruginosa, nhưng các khuẩn lạc khác không tạo màu xanh mà lại phát huỳnh quang dưới đèn UV hoặc có màu nâu đỏ cũng yêu cầu khẳng định. Cấy chuyển các khuẩn lạc cần khẳng định trên màng lọc sang môi trường thạch dinh dưỡng. Sau khi ủ, các khuẩn lạc ban đầu không phát huỳnh quang được thử phản ứng oxidase và các khuẩn lạc có oxidase dương tính được thử khả năng tạo sắc tố và tạo amoniac từ acetamide, các khuẩn lạc ban đầu phát huỳnh quang được thử khả năng tạo amoniac từ acetamide.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường khẳng định: Môi trường King’s B Canh thang acetamide Thạch dinh dưỡng Thuốc thử: Thuốc thử oxidase Thuốc thử Nessler 31  Cách tiến hành Lọc một lượng xác định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler (mt chuyển màu vàng  đỏ gạch) Khuẩn lạc tạo màu xanh da trời/ xanh lá cây (pyocyanin) Đếm tất cả Thạch CN Khuẩn lạc không tạo màu xanh Kiểm tra dưới đèn UV Khuẩn lạc màu nâu đỏ, không phát huỳnh quang Khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocianin, phát huỳnh quang - Thạch dinh dưỡng - Canh thang acetamide - King’ B Canh thang acetamide Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h - Oxidase (+) - Sinh amoniac - Phát huỳnh quang dưới UV Sinh amoniac P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa 32 3.4.5. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ Trong nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng, phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch được sử dụng để kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn. Kết quả kháng sinh đồ giúp cho việc điều trị được chính xác và hạn chế việc sử dụng kháng sinh bừa bãi [17][33] [28]. 3.4.5.1. Các kháng sinh thử nghiệm Chọn lựa các kháng sinh thích hợp nhất để thử nghiệm và phúc trình kết quả là một quyết định hay nhất của phòng thí nghiệm lâm sàng để có thể tham vấn được việc trị liệu kháng sinh. Tuy nhiên phòng thí nghiệm có thể tuỳ điều kiện thực tế có thể thêm hay bớt một hay một số kháng sinh. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn P. aeruginosa với 16 loại kháng sinh theo tiêu chuẩn NCCLS-2007 (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) và CA-SFM-2004 (Hội đồng kháng sinh – Hiệp hội vi sinh của Pháp). Bảo quản kháng sinh: Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện không hút ẩm và được giữ ở nhiệt độ 80C hoặc thấp hơn. Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh 1 đến 2 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp. Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn. Hình 3.4: Các kháng sinh thử nghiệm 33 Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ (*) National Committee for Clinical Laboratory Standards (2007), Performance standards for anmicrobial susceptibility testing, Seventeenth informational supplement. (**)Société Française de microbiologie, COMITÉ DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE, Communiqué 2004. Họ kháng sinh Tên kháng sinh Viết tắt Hàm lƣợng Kháng Trung gian Nhạy Beta- lactamin Penicillin Piperacillin PIP** 75µg ≤17 - ≥18 Ticarcillin/a.clavulanic TCC* 75/10µg ≤14 - ≥15 Cephalosporin Cephem Cefoperazone CFP* 75µg ≤15 16-20 ≥21 Cefsulodin CFS** 30 µg ≤14 15-21 ≥22 Ceftazidime CAZ* 30µg ≤14 15-17 ≥18 Cefepime FEP* 30µg ≤14 15-17 ≥18 Carbapenem Imipenem IPM* 10µg ≤13 14-15 ≥16 Mono-lactamin Aztreonam ATM* 30µg ≤15 16-21 ≥22 Aminoglycosid Gentamicin GM* 10µg ≤12 13-14 ≥15 Tobramycin TM* 10µg ≤12 13-14 ≥15 Amikacin AN* 30µg ≤14 15-16 ≥17 Polypeptide Colistin CS* 10µg ≤10 - ≥11 Fluoroquinolon Ofloxacin OFX* 5µg ≤12 13-15 ≥16 Ciprofloxacin CIP* 5µg ≤15 16-20 ≥21 Sulfamid Sulfamides SSS** 200µg ≤12 13-16 ≥17 Fosfomycin Fosfomycin FOS** 50µg ≤14 - ≥14 34 3.4.5.2. Vi khuẩn thử nghiệm Để chuẩn hóa độ đục của vi khuẩn thử nghiệm, dùng huyền dịch BaSO4 tương đương độ đục chuẩn 0,5 McFarland. Pha độ đục chuẩn BaSO4 0,5 McFarland như sau: Lấy 0,5 ml dung dịch BaCl2 0,048 M cho vào 99,5 ml H2SO4 0,18 M, vừa cho vào vừa khuấy đều. Đậm độ chính xác của độ đục chuẩn nên được xác định bằng quang phổ kế đo độ hấp thu với ống đo 1 cm. Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải có độ hấp thu ở bước sóng 625 nm đạt 0,08 đến 0,1. 3.4.5.3. Qui trình thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ  Chuẩn bị vi khuẩn Chọn một khuẩn lạc riêng rẽ trên mặt thạch phân lập cấy truyền vào môi trường BHI. Ủ canh khuẩn ở 370C trong 24 giờ, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch dinh dưỡng ủ ở 370C trong 24 giờ. Lấy một vài khuẩn lạc trên mặt thạch hòa vào nước muối sinh l ý và điều chỉnh độ đục đến khi đạt độ đục chuẩn 0,5 McFarland.  Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: Thạch Mueller Hinton  Trải vi khuẩn lên mặt thạch Đặt đĩa thạch vào tủ ấm 15 phút cho khô mặt thạch. Dùng pipette vô trùng hút khoảng 1 ml (106 vi khuẩn/ml) dịch khuẩn vừa mới pha láng đều trên mặt thạch. Để 3 đến 5 phút hút bỏ dịch vi khuẩn thừa và để khoảng 15 phút cho khô mặt thạch.  Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn Dùng kẹp vô trùng gắp các đĩa kháng sinh và ép nhẹ lên mặt thạch để đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Số lượng các đĩa kháng sinh không quá 7 đĩa trên hộp thạch có đường kính 90 mm. Các kháng sinh sẽ khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy không nên dời chỗ các đĩa kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch. 35 Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa kháng sinh phải ủ sấp hộp thạch (đáy trên nắp dưới) trong tủ ấm 370C.  Đọc và biện luận kết quả: Đo vòng khuyếch tán trên đĩa thạch Sau khi ủ 18 đến 24 giờ đọc kết quả các hộp thạch. Nếu mặt thạch được trải vi khuẩn đúng cách và mầm cấy đúng độ đục chuẩn, vi khuẩn sẽ mọc thành một lớp mịn và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất. Đo đường kính vòng vô khuẩn là một vòng, kể cả đường kính đĩa kháng sinh, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc thấy được bằng mắt thường. Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẽ hay thước dành riêng cho mục đích này, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp. Khi đọc kết quả tốt nhất là dung ánh sáng xuyên (tức là giữ hộp thạch trên một nguồn sáng). Biện luận đường kính vòng vô khuẩn dựa theo biện luận đường kính và ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy hay trung gian hay kháng đối với kháng sinh thử nghiệm. 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn của các loại nƣớc uống 4.1.1. So sánh giữa 2 nhóm nƣớc uống (đóng chai và xử lý) Bảng 4-1: So sánh tỉ lệ không đạt về chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nƣớc Nước uống đóng chai (nhóm 1) Nước uống xử lý (nhóm 2) Số mẫu % Số mẫu % Đạt 40 80 265 75,7 Không đạt 10 20 85 24,3 Tổng số mẫu 50 350 80 75,7 20 24,3 0 20 40 60 80 100 1 2 Nhóm % Đạt Không đạt Biểu đồ 4.1: So sánh sự nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nƣớc Nhận xét: Nhìn chung mức độ nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nước là như nhau, không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P = 0,4 > 0,05; xem them chi tiết ở phụ lục A1) 37 Bảng 4-2: Tỉ lệ không đạt theo từng chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nƣớc Nhóm 1 Nhóm 2 Số mẫu không đạt % Số mẫu không đạt % Tổng số mẫu 50 350 Coliform 5 10 48 13,7 Coliform fecal 4 8 37 10,6 Streptococcus fecalis 1 2 11 3,1 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 18 5,1 P. aeruginosa 8 16 51 14,6 13,7 10,6 3,1 5,1 14,6 0 5 10 15 20 CLs C.F S.F KK P.A % Nhóm 1 Nhóm 2 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nƣớc CLs: Coliforms C.F: Coliform fecal S.F: Streptococcus fecalis KK: vi khuẩn kỵ khí sinh H2S P.A: P. aeruginosa Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nƣớc Nhận xét: Nếu xét theo từng chỉ tiêu vi sinh thì nhóm nước uống đóng chai (nhóm 1) bị nhiễm ít hơn nhóm nước uống xử lý (nhóm 2) ngoại trừ chỉ tiêu về P. aeruginosa, tuy nhiên giữa 2 nhóm nước sự khác biệt chưa có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05; xem thêm chi tiết ở phụ lục A2). 38 4.1.2. Giữa các chỉ tiêu trong từng nhóm nƣớc 4.1.2.1. Nƣớc uống đóng chai Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 40 mẫu, 80% Số mẫu không đạt: 10 mẫu, 20% Bảng 4-3: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống đóng chai theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 5 10 Coliform fecal 4 8 Streptococcus fecalis 1 2 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 P. aeruginosa 8 16 Nhận xét: Các mẫu nước uống đóng chai đa phần bị nhiễm P. aeruginosa tiếp đến là chỉ tiêu Coliform. Streptococcus fecalis và vi khuẩn kỵ khí khử sunphit tìm thấy không đáng kể. 4.1.2.2. Nƣớc uống công ty Số mẫu khảo sát: 200 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 144 mẫu , 72% Số mẫu không đạt: 56 mẫu, 28% Bảng 4-4: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống công ty theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 32 16 Coliform fecal 25 12,5 Streptococcus fecalis 5 2,5 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 10 5 P. aeruginosa 32 16 Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm Coliform và P. aeruginosa cao nhất trong các chỉ tiêu, kế đến là Coliform fecal . Cũng giống như nước uống đóng chai Streptococcus fecalis và vi khuẩn kỵ khí khử sunphit chiếm tỷ lệ thấp hơn trong các mẫu thử. 4.1.2.3. Nƣớc uống gia đình Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 24 mẫu , 48% Số mẫu không đạt: 26 mẫu, 52% 39 Bảng 4-5: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống gia đình theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 13 26 Coliform fecal 11 22 Streptococcus fecalis 4 8 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 6 12 P. aeruginosa 18 36 Nhận xét: Nhìn chung nước uống gia đình bị nhiễm khuẩn nặng hơn các loại nước khác, số mẫu không đạt các chỉ tiêu vi sinh chiếm tới 52%. Trong đó chiếm tỉ lệ cao nhất là P. aeruginosa, kế đến là Coliform và Coliform fecal. 4.1.2.4. Nƣớc uống trƣờng học Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 47 mẫu , 94% Số mẫu không đạt: 3 mẫu, 6% Bảng 4-6: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống trƣờng học theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 3 6 Coliform fecal 1 2 Streptococcus fecalis 2 4 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 P. aeruginosa 1 2 Nhận xét: Nước uống trường học có tỉ lệ không đạt thấp nhất, trong đó cao nhất vẫn là Coliform. 4.1.2.5. Nƣớc uống bệnh viện Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 50 mẫu , 100% Số mẫu không đạt: 0 mẫu, 0% 40 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nƣớc uống Bảng 4-7: Tỉ lệ nhiễm P.aeruginosa giữa các loại nƣớc uống Loại nước uống Tổng số mẫu Số mẫu nhiễm P. aeruginosa % nhiễm P. aeruginosa NUĐC 50 8 16 NUCT 200 32 16 NUGĐ 50 18 36 NUTH 50 1 2 NUBV 50 0 0 16 16 36 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 NUĐC NUCT NUGĐ NUTH NUBV % Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nƣớc uống NUĐC: nước uống đóng chai NUCT: nước uống công ty NUGĐ: nước uống gia đình NUTH: nước uống trường học NUBV: nước uống bệnh viện Nhận xét: Nước uống gia đình bị nhiễm P. aeruginosa cao nhất trong các loại nước, tiếp đến là nước uống đóng chai và nước uống công ty. Nước uống bệnh viện không tìm thấy loại vi khuẩn này. 41 4.2. Tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nƣớc uống Tổng số P. aeruginosa: 59 chủng Trong đó: Nước uống đóng chai: 8 chủng Nước uống công ty: 32 chủng Nước uống gia đình: 18 chủng Nước uống trường học: 1 chủng Nước uống bệnh viện: 0 chủng Bảng 4-8: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P . aeruginosa trong các loại nƣớc uống Tỉ lệ % Kháng sinh NUĐC NUCT NUGĐ S I R S I R S I R Piperacillin 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ticarcillin/a.clavulanic 100 0 0 97 0 3 100 0 0 Cefoperazone 100 0 0 93,8 6,3 0 100 0 0 Cefsulodin 75 12,5 12,5 87,5 9,4 3 83 17 0 Ceftazidime 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Cefepime 100 0 0 97 3 0 100 0 0 Imipenem 100 0 0 94 0 6 100 0 0 Aztreonam 62,5 12,5 25 97 0 3 100 0 0 Gentamicin 100 0 0 97 3 0 89 11 0 Tobramycin 87,5 0 12,5 100 0 0 94,4 5,6 0 Amikacin 87,5 0 12,5 97 3 0 100 0 0 Colistin 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ofloxacin 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ciprofloxacin 87,5 12,5 0 100 0 0 100 0 0 Sulfamides 100 0 0 94 3 3 89 11 0 Fosfomycin 50 0 50 56 0 44 67 0 33 Nước uống trường học chỉ có 1 mẫu tìm thấy P. aeruginosa và kết quả kháng sinh đồ cho thấy chủng này nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nghiệm. Nước uống bệnh viện không tìm thấy P. aeruginosa trong các mẫu khảo sát. 42 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% PIP TC C CF P CF S CA Z FE P IPM AT M GM TM AN C S OF X CI P SS S FO S Kháng sinh % R I S Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống đóng chai Nhận xét: Đa số vi khuẩn nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Tuy nhiên, một số kháng sinh bị đề kháng với tỉ lệ thấp (cefsulodin, tobramycin, amikacin, aztreonam), riêng fosfomycin tỉ lệ đề kháng lên đến 50%. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60 70% 80% 90 100 PIP TC C CF P CF S CA Z FE P IPM AT M GM TM AN C S OF X CI P SS S FO S Kháng sinh % R I S Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống công ty Nhận xét: Vi khuẩn phân lập từ nước uống công ty nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Nhưng vẫn có một số kháng sinh bị đề kháng với tỉ lệ thấp (ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, sulfamides, aztreonam, imipenem), riêng fosfomycin bị đề kháng đến 44%. 43 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% PIP TC C CF P CF S CA Z FE P IPM AT M GM TM AN C S OF X CI P SS S FO S Kháng sinh % R I S Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống gia đình Nhận xét: Ngoại trừ fosfomycine bị đề kháng với tỉ lệ khá cao đến 33%, các vi khuẩn còn lại trong nước uống gia đình đều nhạy cảm với kháng sinh thử nghiệm. Trong nước uống trường học, tỉ lệ nhiễm không cao, chỉ có 1 trường hợp bị nhiễm P. aeruginosa. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn này nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nghiệm. 44 4.3. Một số hình ảnh các vi sinh vật trong quá trình thử nghiệm Hình 4.1: Khuẩn lạc coliform trên môi trƣờng lactose TTC tergitol 7 (khuẩn lạc đặc trưng có màu vàng, da cam hoặc đỏ gạch). Hình 4.2: Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng lactose của coliform, faecal coliform 45 Hình 4.3: Khuẩn lạc Streptococcus fecalis trên môi trƣờng Slanetz và Bartley (Các khuẩn lạc đặc trưng có màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc) Hình 4.4: Khuẩn lạc Steptococcus fecalis trên thạch mật asculin-nitrua (khuẩn lạc có màu nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hoặc đen) 46 Hình 4.5: Khuẩn lạc các bào tử Clostridium trên thạch sunphit triptoza Hình 4.6: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trƣờng thạch CN A. P. aeruginosa trên môi trường thạch CN. B. P. aeruginosa phát huỳnh quang dưới tia UV. A B 47 Hình 4.7: P. aeruginosa trên môi trƣờng King’s B Hình 4.8: Thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn P. aeruginosa (Đường kính vòng vô khuẩn nhỏ và nằm trong giới hạn đề kháng theo Bảng 3-1 các kháng sinh thử nghiệm thì vi khuẩn được kết luận là đề kháng với kháng sinh đó – trong hình này dấu mũi tên chỉ vi khuẩn đề kháng với fosfomycin) 48 4.3.1. Tình hình nhiễm khuẩn nƣớc uống  So sánh tỉ lệ không đạt chỉ tiêu vi sinh giữa các nhóm và loại nƣớc Mức độ nhiễm các chỉ tiêu vi sinh giữa nhóm nước uống đóng chai và nước uống xử lý khảo sát là như nhau, không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,4 > 0,05). Nhưng giữa các loại nước thì lại có sự khác biệt rõ rệt. Trong nhóm nước uống xử lý, nước uống bệnh viện (NUBV) hầu hết đạt chỉ tiêu vi sinh và nước uống trường học (NUTH) tỉ lệ nhiễm khuẩn thấp. Nhìn chung trong các loại nước uống, nước uống gia đình (NUGĐ) dẫn đầu mức độ ô nhiễm với tất cả 5 chỉ tiêu vi sinh. Theo Tamagnini L.M. và González R.D. (1997), nước uống đóng chai được vô trùng trong các chai nhựa tái sử dụng hay sử dụng một lần đều không bị nhiễm Coliforms và Coliform fecal nhưng lại tìm thấy P. aeruginosa trong các chai nhựa tái sử dụng [40]. Theo Vess et al. (1993), P. aeruginosa có khả năng sống sót trên bề mặt PVC [41]. Theo chúng tôi, NUGĐ vi phạm cao có thể là do việc không chú ý đến vệ sinh các chai đựng và dụng cụ chứa nước. Việc tái sử dụng các chai nhựa chứa nước, đun nấu nước uống chưa kỹ hay bảo quản không tốt là những nguyên nhân làm cho tiến trình nhiễm khuẩn trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Trái lại, NUBV là loại nước uống ở trong môi trường có nguy cơ lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh rất cao nhưng trong các mẫu khảo sát lại không tìm thấy bất cứ một vi khuẩn nào trong tiêu chuẩn. Theo chúng tôi điều này có thể là nước uống trong bệnh viện được xử lý thêm để hạn chế sự lây nhiễm. Đây là một thông tin đáng mừng cho thấy vấn đề vệ sinh môi trường cũng như vệ sinh nước uống trong các bệnh viện được kiểm soát tốt. NUTH chỉ có 6% không đạt tiêu chuẩn vi sinh, chứng tỏ vấn đề vệ sinh nước uống trong các trường học cũng rất được quan tâm. Điều này làm an lòng các bậc phụ huynh vì đa số các mẫu khảo sát đều lấy từ các trường mầm non và tiểu học. Theo kết quả nghiên cứu của Benoit Lévesque (1994) so sánh chất lượng vi sinh nước máy và nước từ máy làm lạnh nước uống tại khu dân cư và khu văn phòng cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn của nước máy thấp hơn rất nhiều so với nước lấy từ các máy làm lạnh nước uống. Điều này theo tác giả các bình làm lạnh nước uống không 49 được vệ sinh sạch sẽ là nơi ẩn trú cho vi sinh vật gây bệnh. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự nhiễm khuẩn không phải từ các bình lọc nước uống mà bắt nguồn từ nhà sản xuất (Baumgartner A., 2006). Nước uống đóng chai rất dễ bị nhiễm khuẩn nếu như quy trình súc rửa, đóng bình, vô trùng không đạt tiêu chuẩn. Và uống nguồn nước bị nhiễm khuẩn như vậy là không an toàn cho sức khỏe, nhất là những đối tượng có hệ miễn dịch kém như là người bệnh, người già và trẻ em.  So sánh giữa các chỉ tiêu vi phạm giữa các nhóm và loại nƣớc Nhìn chung, trong tất cả các chỉ tiêu vi phạm, P . aeruginosa (chiếm 62% trong 95 mẫu không đạt tiêu chuẩn) là chỉ tiêu bị vi phạm nhiều nhất. Tiếp đến là Coliform (56%) và fecal Coliform (43%). Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S và streptococcus fecalis là chỉ tiêu ít bị vi phạm nhất trong các loại nước uống khảo sát (chỉ chiếm 21% và 13%). P. aeruginosa Đây là chỉ tiêu bị nhiễm nhiều nhất trong tất cả các loại nước uống. Giữa 2 nhóm nước tỉ lệ nhiễm khuẩn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P = 0,8 > 0,05). Giữa các loại nước uống, tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa trong NUGĐ là 36% rất cao so với NUBV là 0% và NUTH chỉ chiếm 2%. Sự chênh lệch quá lớn giữa NUGĐ và NUBV, NUTH dẫn đến những khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P= 10-7 >0,001; xem thêm chi tiết ở phụ lục A3). So sánh 3 loại nước uống có tỉ lệ nhiễm cao là NUĐC, NUCT và NUGĐ vẫn có sự khác biệt có ý nghĩa (P= 0,048 < 0,05). Điều này cho thấy NUGĐ có tỉ lệ nhiễm cao hơn rõ rệt so với các loại nước uống còn lại. Coliform Giữa 2 nhóm nước tỉ lệ nhiễm Coliform vẫn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P= 0,468 > 0,05). Giữa các loại nước uống thì tỉ lệ này lại có khác biệt rất có ý nghĩa (P = 0,0009 < 0,01). Trong đó, NUGĐ tỉ lệ nhiễm cao nhất (26%), theo sau là NUCT (16%) và NUĐC (10%), NUBV và NUTH có tỉ lệ nhiễm thấp nhất lần lượt là 0% và 6%. Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học thì không có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm Coliform giữa 3 loại nước uống còn lại (P = 0,09 > 0,05), chứng tỏ nước uống bệnh viện và trường học tỷ lệ nhiễm Coliform không đáng kể. 50 Coliform fecal Giữa 2 nhóm nước tỉ lệ nhiễm fecal Coliform vẫn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P= 0,57 > 0,05). Giữa các loại nước uống thì tỉ lệ này lại có sự khác biệt rất có ý nghĩa (P = 0,001 < 0,05). Trong đó, NUGĐ có tỉ lệ nhiễm cao nhất (22%), theo sau là NUCT (13%) và NUĐC (8%), NUBV và NUTH có tỉ lệ nhiễm thấp nhất lần lượt là 0% và 2%. Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và trường học thì vẫn có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm giữa 3 loại nước uống còn lại (P = 0,001 < 0,05). Yếu tố còn lại ảnh hưởng đến sự khác biệt đó là nước uống gia đình bị nhiễm khuẩn cao hơn rất nhiều so với các loại nước uống còn lại. Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S và Streptococcus fecalis Đây là 2 chỉ tiêu ít bị nhiễm nhất trong 5 chỉ tiêu khảo sát. So sánh các tỉ lệ nhiễm của từng chỉ tiêu giữa các nhóm và loại nước uống không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. 4.3.2. Tính đề kháng kháng sinh của P . aeruginosa Nhìn chung, với số mẫu xét nghiệm còn hạn chế (400 mẫu) và số vi khuẩn P . aeruginosa tìm được còn ít (59 mẫu). Các vi khuẩn tìm được còn khá nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Tuy nhiên, fosfomycin là kháng sinh bị đề kháng nhiều nhất chiếm từ 33% đến 50% (24 mẫu). Theo một số tác giả nước ngoài thì P. aeruginosa trong nước uống vẫn còn khá nhạy cảm với các kháng sinh sử dụng. Thật vậy, nghiên cứu của Papapetropoulou M (1994) cho thấy P. aeruginosa trong nước máy và nước đóng chai không gas, các chủng đều nhạy cảm với tất cả beta-lactams, amynoglycosides, cephalosporins thế hệ III và quinolones [36]. Một nghiên cứu khác của Papandreous S và cộng sự về tính đề kháng đa kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm trong nước uống ở Greece (2000), cho thấy các vi khuẩn Gram âm trong đó có Pseudomonas (145/239 vi khuẩn Gram âm) tất cả đều nhạy cảm 100% với quinolones, amynoglycoside, imipenem, aztreonam, cefoperazon [35]. Theo Pilar Arca và cộng sự (1997), tính đề kháng đối với fosfomycin của vi khuẩn được mã hóa bởi gen fosA và fosB trên plasmid của vi khuẩn [37]. Plasmid này 51 có thể truyền từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác thông qua hiện tượng biến nạp, tải nạp, tiếp hợp…. Một nghiên cứu khác cho thấy, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc giúp tăng trưởng nhanh, phòng và trị bệnh tuy nhiên hậu quả là tỉ lệ các vi khuẩn kháng thuốc ngày càng cao [23]. Trong lâm sàng, fosfomycin rất hữu hiệu và tác dụng hợp lực khi được phối hợp với các kháng sinh khác để điều trị P. aeruginosa đã đề kháng các kháng sinh thông dụng [31], [32]. Như vậy có khả năng sự đề kháng fosfomycin này là kết quả nhận gen đề kháng từ các vi khuẩn khác trong tự nhiên sau quá trình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Tuy nhiên để có cơ sở kết luận thì cần có những nghiên cứu sâu hơn, cụ thể hơn. Đối với loại NUĐC, có 3 kháng sinh đều bị đề kháng với tỉ lệ 12,5% (cefsulodin, tobramycin, amikacin). Đối với NUCT, có 4 kháng sinh bị đề kháng với tỉ lệ 3,1% (ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, sulfamides, aztreonam), riêng imipenem là 6,3%. Đối với NUGĐ ngoài fosfomycin thì các chủng tìm thấy đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Mặt khác, kết quả kháng sinh đồ cho thấy các vi khuẩn thử nghiệm chưa có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh. Nếu không có biện pháp kiểm soát thường quy tính nhạy cảm kháng sinh của các vi sinh vật trong chỉ tiêu nước uống tại Việt Nam, chúng tôi nghĩ tính đề kháng kháng sinh của các vi sinh vật trong nước uống sẽ gia tăng đáng kể và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. 52 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đề tài chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu đề ra: xác định tỉ lệ nhiễm khuẩn nước uống theo TCVN 6096:2004 và làm kháng sinh đồ đối với P. aeruginosa theo tiêu chuẩn NCCLS và CA-SFM thu được kết quả như sau: Nước uống gia đình không đạt chỉ tiêu vi sinh nhiều nhất trong tất cả các loại nước uống khảo sát chiếm 52% mẫu kiểm tra. Tiếp theo là nước uống công ty với tỉ lệ 28%, nước uống đóng chai 20%, nước uống trường học 6% và hầu hết nước uống bệnh viện đều đạt chỉ tiêu vi sinh. Trong các chỉ tiêu vi sinh, P. aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm nhiều nhất chiếm đến 62% trong 95 mẫu không đạt tiêu chuẩn, kế đến là chỉ tiêu Coliform 56% và Coliform fecal 43%. Hai chỉ tiêu còn lại là vi khuẩn kỵ khí sinh H2S và Streptococcus fecalis chiếm tỉ lệ thấp lần lượt là 21% và 13%. Hầu hết các chủng P. aeruginosa phân lập được từ các loại nước uống này đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Ngoại trừ, fosfomycin bị kháng khá nhiều (từ 33% đến 50% các chủng thu được, 24 chủng đề kháng trong 59 chủng thử nghiệm). Một số kháng sinh khác như ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin cũng bị kháng nhưng tỉ lệ tương đối thấp (≤ 5%). Ngoài ra, các chủng vi khuẩn tìm thấy không có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh. Kết quả này tuy chỉ đánh giá riêng về chỉ tiêu vi sinh chưa tính đến các chỉ tiêu Lý-Hóa nhưng đã góp phần phản ánh tình hình nhiễm khuẩn trong một số loại nước uống nhất định đến mức báo động. Qua đó mọi người có cái nhìn ý thức hơn trong việc sử dụng cũng như trong kinh doanh các loại nước uống đóng chai nhằm đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng. Cần có nhiều biện pháp tăng cường kiểm soát chất lượng không những riêng cho nước mà còn cho các thực phẩm nói chung. 53 5.2. Đề nghị Tìm gen kháng fosfomycin trong các chủng P. aeruginosa trong mẫu nước thử nghiệm. Mở rộng thu thập thêm các mẫu nước uống bệnh viện để tìm hiểu về tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa trong nước uống bệnh viện. Nghiên cứu so sánh cụ thể hơn về mối liên quan tính kháng kháng sinh của vi khuẩn trong bệnh phẩm và thực phẩm để có cái nhìn toàn diện hơn về chiến lược sử dụng kháng sinh cũng như các hậu quả do việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong chăn nuôi, bảo quản thủy sản mà công luận đang lên tiếng. Khảo sát tính đề kháng kháng sinh với các vi khuẩn còn lại trong chỉ tiêu. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt [1]. Nguyễn Thị Kim Chi. Tình hình nhiễm khuẩn các nguồn nước dùng tại TP. Hồ Chí Minh. Luận án Thạc sĩ khoa học Y Dược, 1997. [2]. Harison. Các nguyên lý y học nội khoa – Tập II. Nhà xuất bản Y học, 1999, tr 313-323. [3]. Dược lực học lâm sàng. Kháng sinh. Nhà xuất bản Y học, 2001. [4]. Hồ Việt Mỹ và cộng sự. Nghiên cứu tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện; đề xuất, áp dụng và đánh giá các biện pháp phòng chống tại bệnh viện đa khoa tỉnh và BVĐK khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004. Sở y tế Bình Định. [5]. Lê Bảo Huy, Lê Đức Thắng. Khảo sát tác nhân gây viêm phổi bệnh viện và tình hình kháng kháng sinh tại khoa ICU bệnh viện Thống Nhất 2004-2005. Tập thể khoa hồi sức cấp cứu – Khoa vi sinh bệnh viện Thống Nhất. Tài liệu hội thảo khoa học. [6]. Hướng dẫn sử dụng kháng sinh. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Nhà xuất bản Y Học, 2001, tr 21-30. [7]. ISO 16266:2006 (E). Water quality – Detection and enumaration of Pseudomonas aeruginosa – Method by membrane filtration. International Satndard Organization, 2006. [8]. Võ Thị Chi Mai. Nhận xét về tính kháng thuốc in vitro ở bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997. Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược – Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy, 1997. Tài liệu hội thảo khoa học. [9]. Trần Thị Mai và cs. Điều kiện vệ sinh cơ sở sản xuất và chất lượng vệ sinh an toàn nước uống đóng chai tại thành phố Buôn Ma Thuột năm 2005. Trung tâm Y tế dự phòng Dak Lak 2005. [10]. TCVN 6096:2004. Nước uống đóng chai. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 2005. [11]. TCVN 2652-78. Nước uống-Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1978. [12]. TCVN 6187-1:1996 (ISO 9308-1:1990(E)). Chất lượng nước - Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt và Escherichia coli giả định. Phần 1: Phương pháp màng lọc. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996. [13]. TCVN 6189-2:1996 (ISO 7899-2:1984(E)). Chất lượng nước. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân. Phần 2: Phương pháp màng lọc. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996. [14]. TCVN 6191-2:1996 (ISO 6461-2:1986(E)). Chất lượng nước - Phát hiện và đếm số bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphit (Clostridia). Phần 2: Phương pháp màng lọc. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996. 55 [15]. Trần linh Thước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục, 2006. [16]. Hoàng Nǎng Trọng, Hoàng Thị Phúc, Hoàng Minh Châu. Bệnh viêm loét giác mạc do vi khuẩn tại khoa Mắt hột - Giác mạc Viện Mắt nǎm 1996. Kỷ yếu hội nghị KHKT ngành mắt, Viện Mắt, 1997. [17]. Phạm Hùng Vân. Cẩm nang các kỹ thuật vi sinh lâm sàng, 1999. [18]. Vi sinh vật y học. Nhà xuất bản Y Học, 2007, tr 218-221. Phần tiếng Anh: [19]. Aulicino F.A., Pastoni F. Microorganisms surviving in drinking water systems and related problems. Ann Ig. , 2004 Jan-Apr;16(1-2):265-72. [20]. Baumgartner A, Grand M. Bacteriological quality of drinking water from dispensers (coolers) and possible control measures. J Food Prot., 2006, Dec; 69(12):3043-6. [21]. Benoit Lévesque. Comparision of the Microbological Quality of Water Coolers and That of Municipal Water Systems. Applíed and Environmental Microbiology, Apr 1994, p. 1174- 1178. [22]. Bharath J, Mosodeen M, Motilal S, Sandy S, Sharma S, Tessaro T, Thomas K, Umamaheswaran M, Simeon D, Adesiyun AA. Microbial quality of domestic and imported brands of bottled water in Trinidad. School of Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of the West Indies, St. Augustine, Trinidad and Tobago. Int J Food Microbiol., 2003 Feb 25;81(1):53-62. [23]. Deanna, L., Kiska, Peter, H., Gilligan. Pseudomonas aeruginosa. In Manual of clinical microbiology. Patrick R. Murray (Ed.), ASM Press, Washington D.C., 2003. [24]. Gales, A. C., 1 R. N. Jones,1 J. Turnidge,2 R. Rennie,3 and R. Ramphal Characterization of Pseudomonas aeruginosa Isolates: Occurrence rates, antimicrobial susceptibility patterns, and molecular typing in the global SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997–1999. Clinical Infectious Diseases, 2001, 32(Suppl 2): S146–55. [25]. Hunter, P.R. The microbiology of bottled natural mineral waters. Journal of Applied Bacteriology, 1993, 74: 345-352. [26]. Lateef A∗, Oloke J. K., Gueguimkana E. B. The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria. Environmental Monitoring and Assessment, 2005, 100: 59–69. [27]. Liang J.L., Dziuban E.J., Craun G.F., Hill V., Moore M.R., Gelting R.J., Calderon R.L., Beach M.J., Roy S.L. Surveillance for waterborne disease and outbreaks associated with drinking water and water not intended for drinking-- United States, 2003-2004. MMWR Surveill Summ., 2006 Dec 22;55(12):31-65. 56 [28]. Lucia Martins Teixeira, Richard R. Facklan. Enterococcus. In Manual of clinical microbiology. Patrick R. Murray (Ed.), ASM Press, Washington D.C., 2003. [29]. Martha Oliveira Cardoso, Aldemir Reginato Ribeiro, Luciana Ruschel dos Santos*, Fernando Pilotto. Antibiotic resistance in samonella enteritidis isolated from broiler carcasses. Brazilian Journal of Microbiology, 2006, 37:368-371 [30]. Maschemeyer, G., and I. Braveny. Review of the incidence of prognosis of Pseudomonas aeruginosa infections in cancer patients in the 1990s. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2000.19:915-925. [31]. Mirakhur A., Gallagher M.J., Ledson M.J., Hart C.A., Walshaw M.J.. Fosfomycin therapy for multiresistant Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. J. Cyst. Fibros., 2003 Mar, 2(1):19-24. [32]. Monden K., Ando E., Iida M., Kumon H. Role of fosfomycin in a synergistic combination with ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm. J Infect Chemother., 2002 Sep, 8(3):218-26. [33]. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Performance standards for anmicrobial susceptibility testing, Seventeenth informational supplement, 2007. [34]. Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2, Occurrence of Pseudomonas aeruginosa in post-operative wound infection, Pak J Med Sci July-September 2004, Vol. 20 No. 3: 187-191. [35]. Papandreou S, Pagonopoulou O, Vantarakis A, Papapetropoulou M. Multiantibiotic resistance of gram-negative bacteria isolated from drinking water samples in southwest Greece. J Chemother, 2000 Aug;12(4):267-73. [36]. Papapetropoulou M, Iliopoulou J, Rodopoulou G, Detorakis J, Paniara. OOccurrence and antibiotic-resistance of Pseudomonas species isolated from drinking water in southern Greece. J Chemother., 1994, Apr; 6(2):111-6. [37]. Pilar Arca, Gemma Reguera, Carols Hardisson*. Plasmid-encoded fosfomycin resistance in bacteria isolated from the urinary tract in a multicentre survey. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1997, 40, 393–399. [38]. Rusin PA, Rose JB, Haas CN, Gerba CP. Risk assessment of opportunistic bacterial pathogens in drinking water. Rev Environ Contam Toxicol., 1997, 152:57-83. [39]. Société Française de microbiologie- Comité de l’antibiogramme de la societe francaise de microbiologie, Communiqué 2004. [40]. Tamagnini, L.M., Gonzalez, R.D. Bacteriological stability and growth kinetics of Pseudomonas aeruginosa in bottled watter. Journal of Applied Microbiology 1997, 83: 91-94. [41]. Vess, R. W., Anderson, R.L., Carr, J.H., Bond, W. W. and Favero, M.S. The colonization of solid PVC surfaces and the acquisition of risistance to 57 germicides by water microorganisms. Journal of Applied Bacteriology, 1993, 74: 215-221. Internet: [42]. www.moi.gov.vn [43]. [44]. - Báo động! Nước ăn uống ở các trường học. Báo Sài Gòn Giải Phóng . Số ra ngày 06/03/07 Phụ lục A: Xử lý số liệu thống kê A1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn giữa nƣớc uống đóng chai và xử lý nhóm 1 nhóm 2 Tổng Actual Số mẫu đạt 40 265 305 Số mẫu không đạt 10 85 95 50 350 400 Expected 38,13 266,88 11,88 83,13 P = 0,5 > 0,05 Khác biệt không có ý nghĩa thống kê A2. Tỉ lệ nhiễm khuẩn giữa các loại nƣớc uống Actual Đạt Không đạt Tổng số mẫu NUĐC 40 10 50 NUCT 144 56 200 NUGĐ 24 26 50 NUTH 47 3 50 NUBV 50 0 50 305 95 400 Expected NUĐC 304,9 11,9 NUCT 304,5 47,5 NUGĐ 304,9 11,9 NUTH 304,9 11,9 NUBV 304,9 11,9 P = 3,1E-224 < 0,01 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Đạt Không đạt Tổng số mẫu NUĐC 40 10 50 NUCT 144 56 200 NUGĐ 24 26 50 208 92 300 Expected NUĐC 34,7 15,3 NUCT 138,7 61,3 NUGĐ 34,7 15,3 P = 0,0009 < 0,05 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống gia đình Actual Đạt Không đạt Tổng số mẫu NUĐC 40 10 50 NUCT 144 56 200 184 66 250 Expected NUĐC 36,8 13,2 NUCT 147,2 52,8 P = 0,25 > 0,05 Khác biệt không có ý nghĩa thống kê A.3. So sánh các chỉ tiêu vi phạm giữa các nhóm và loại nƣớc  P. aeruginosa: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 8 42 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 18 32 50 NUTH 1 49 50 NUBV 0 50 50 59 341 400 Expected NUĐC 7,4 42,6 NUCY 29,5 170,5 NUGĐ 7,4 42,6 NUTH 7,4 42,6 NUBV 7,4 42,6 P = 0,0 < 0,001 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê học Loại trừ ảnh hưởng của nước uống nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 8 42 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 18 32 50 58 242 300 Expected NUĐC 9,7 40,3 NUCY 38,7 161,3 NUGĐ 9,7 40,3 P = 0,0048 < 0,05 Khác biệt có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống gia đình Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 8 42 50 NUCY 32 168 200 40 210 250 Expected NUĐC 8 42 NUCT 32 168 P = 1 > 0,05  Coliforms: So sánh giữa 2 nhóm nước: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Nhóm 1 5 45 50 Nhóm 2 48 302 350 53 347 400 Expected Nhóm 1 6,6 43,4 Nhóm 2 46,4 303,6 P = 0,47 > 0,05 Không khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh giữa các loại nước uống: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 5 45 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 13 37 50 NUTH 3 47 50 NUBV 0 50 50 53 347 400 Expected NUĐC 6,6 43,4 NUCY 26,5 173,5 NUGĐ 6,6 43,4 NUTH 6,6 43,4 NUBV 6,6 43,4 P = 0,00087 < 0,05 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 5 45 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 13 37 50 50 250 300 Expected NUĐC 8,3 41,7 NUCY 33,3 166,7 NUGĐ 8,3 41,7 P = 0,09 > 0,05 Không có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm Coliforms giữa 3 loại nước uống  Coliform fecal: So sánh giữa 2 nhóm nước: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Nhóm 1 4 46 50 Nhóm 2 37 313 350 41 359 400 Expected Nhóm 1 5,125 44,875 Nhóm 2 35,875 314,125 P = 0,57 > 0,05 Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh giữa các loại nước với nhau: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 4 46 50 NUCY 25 175 200 NUGĐ 11 39 50 NUTH 1 49 50 NUBV 0 50 50 41 359 400 Expected NUĐC 5,1 44,9 NUCY 20,5 179,5 NUGĐ 5,1 44,9 NUTH 5,1 44,9 NUBV 5,1 44,9 P = 0,0 < 0,05 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 4 46 50 NUCY 25 175 200 NUGĐ 11 39 50 40 260 250 Expected NUĐC 8 52 NUCT 32 208 NUGĐ 8 52 P = 0,001 < 0,05 Khác biệt có ý nghĩa thống kê  Streptococcus fecalis: So sánh giữa 2 nhóm nước: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Nhóm 1 1 49 50 Nhóm 2 11 339 350 12 388 400 Expected Nhóm 1 2 49 Nhóm 2 12 339,5 P = 0,5 > 0,05 Không có khác biệt có ý nghĩa So sánh giữa các loại nước với nhau: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 1 49 50 NUCY 5 195 200 NUGĐ 4 46 50 NUTH 2 48 50 NUBV 0 50 50 12 388 400 Expected NUĐC 1,5 48,5 NUCY 6 194 NUGĐ 1,5 48,5 NUTH 1,5 48,5 NUBV 1,5 48,5 P = 0,17 > 0,05 Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê  Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S: So sánh giữa 2 nhóm nước: Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Actual Nhóm 1 2 48 50 Nhóm 2 18 332 350 20 380 400 Expected Nhóm 1 2,5 47,5 Nhóm 2 17,5 332,5 P = 0,73 > 0,05 Không khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh giữa các loại nước với nhau: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 2 48 50 NUCY 10 190 200 NUGĐ 6 44 50 NUTH 2 48 50 NUBV 0 50 50 20 380 400 Expected NUĐC 2,5 47,5 NUCY 10 190 NUGĐ 2,5 47,5 NUTH 2,5 47,5 NUBV 2,5 47,5 P = 0,092 > 0,05 Không khác biệt có ý nghĩa thống kê Phụ lục B: Thành phần môi trƣờng 1. Thạch lactoza TTC với Tergitol 7 Môi trường cơ bản Lactoza 20 g Pepton 10 g Cao men 6 g Canh thịt 5 g Bromothymol xanh 0.05 g Thạch 16 – 25 g Nước cất 1000 ml Dung dịch TTC 2, 3, 5 – Tryphenol-tertrazo clorua (TTC) 0.05 g Nước cất 100 ml Dung dịch Tergitol 7 Tergitol 7 0.2 g Nước cất 100 ml Môi trường hoàn chỉnh Môi trường cơ bản 100 ml Dung dịch TTC 5 ml Dung dich Tergitol 7 5 ml 2. Nƣớc pepton lactoza: Pepton 10 g Natri clorua 5 g Lactoza 10 g Phenol đỏ 2.5 ml ( hoặc chỉ thị Andrad) (10 ml) Nước cất 1000 ml 3. Nƣớc trypton (để thử phản ứng sinh indol) Trypton 20 g Natri clorua 5 g Nước cất 1000 ml 4. Thuốc thử Kovac’s để thử indol: ρ – dimetylaminbenzandehyt 5 g amyl alcol ( không chứa các gốc hữu cơ) 75 g axit clohydric (ρ = 1,18 g/ml) 25 ml 5. Thuốc thử oxidase: Tertrametyl-ρ-phenylenediamin hydro clorua 0.1 g Nước cất 10 ml 6. Thạch dinh dƣỡng: Cao thịt 1 g Pepton 1 g Natri clorua 5 g Thạch 15 g 7. Thạch Slanetz và Bartley: Môi trường cơ bản Tryptoza 20 g Cao men 5 g Glucoza 2 g Dikali hydrophotphat (K2HPO4) 4 g Natri nitrua (NaN3) 0.4 g Thạch 15 g Nước 1000 ml Dung dịch TTC 2, 3, 5 – Tryphenol-tertrazo clorua (TTC) 0.05 g Nước cất 100 ml Môi trường hoàn chỉnh Môi trường cơ bản 1000 ml Dung dịch TTC 10 8. Thạch mật asculin nitrua Trypton 17 g Pepton 3 g Cao men 5 g Mật bò khô 10 g Natri clorua 5 g Asculin 1 g Amoni-sắt (III) citrate 0.5 g Natri nitrua (NaN3) 0.15 g Thạch 12-20 g Nước 1000 ml 9. Hydro peroxit, dung dịch 30 g/l. 10. Thạch sunphit trytoza Trytoza 15 g Soyton 5 g Cao men 5 g Natri metabisunphit 1 g Amoni sắt (III) citrate 1 g Nước 1000 ml 11. Thạch CN Môi trường cơ bản Gelatin pepton 16 g Casein hydrolysate 10 g Kali sunphat (K2SO4) 10 g Magie clorua (MgCl2) 1.4 g Glycerol 10 ml Thạch 11-18 g Nước 1000 ml Thành phần CN Hexadecyltrimethyl ammonium bromide (cetrimide) 0.2 g Nalidixic acid 0.015 g 12. Môi trƣờng King’s B Pepton 20 G Glycerol 10 ml Kaki hydro photphat (K2HPO4) 1.5 g Magie sunphat (MgSO4.7H2O) 1.5 g Thạch 15 g Nước 1000 ml 13. Môi trƣờng canh Acetamide Dung dịch A Kali dihydrophotphat (KH2PO4) 1 g magie sunphat (MgSO4) 0.2 g Acetamide 2 g Natri clorua (NaCl) 0.2 g Nước 900 ml Dung dịch B Na2MoO4.2H2O 0.5 g FeSO4.7H2O 0.05 g Nước 100 ml Môi trường hoàn chỉnh Dung dịch A 900 ml Dung dịch B 1 ml Nước 99 ml 14. Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng: Pepton 5 g Nước chiết thịt 1 g Nước chiết nấm men 2 g Natri clorua (NaCl) 5 g Thạch 15 g Nước 1000 ml 15. Thuốc thử Nessler HgCl2 10 g KI 7 g NaOH 16 g Nước cất thêm đến 100 ml