Khóa luận Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum esculentum L.) phục vụ chuyển gen

Më §Çu §Æt vÊn ®Ò Cµ chua lµ nguån thùc phÈm quan träng trong ®êi sèng th­êng ngµy cña con ng­êi. §©y lµ lo¹i c©y trång cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao, dÔ trång, vèn chi phÝ ban ®Çu thÊp, cã thÓ më réng s¶n xuÊt ë hÇu kh¾p c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau. Nhu cÇu tiªu thô cµ chua ë n­íc ta rÊt lín vµ nhu cÇu nµy ngµy cµng t¨ng v× cµ chua lµ lo¹i rau ¨n qu¶ cã gi¸ trÞ dinh d­ìng cao, trong cµ chua cã chøa nhiÒu lo¹i vitamin nh­ A, B, C, B2, PP, K,…vµ c¸c chÊt kho¸ng nh­ Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg vµ ®­êng. MÆt kh¸c, cµ chua lµ lo¹i thùc phÈm dÔ chÕ biÕn vµ sö dông, cã thÓ dïng ¨n t­¬i, nÊu, chÕ biÕn thµnh cµ chua kh«, cµ chua bét, t­¬ng cµ chua,…Bªn c¹nh ®ã, cµ chua cßn lµ mÆt hµng xuÊt khÈu cã nhiÒu triÓn väng v× s¶n phÈm cµ chua ë n­íc ta được thu hoạch vµo ®óng thêi ®iÓm nhiÒu n­íc kh«ng trång ®­îc trong mïa ®«ng l¹nh [15]. Tuy nhiªn, n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng cµ chua phô thuéc vµo rÊt nhiÒu yÕu tè. Bëi cµ chua lµ lo¹i c©y rÊt dÔ bÞ s©u bÖnh ph¸ h¹i, ®Æc biÖt lµ nh÷ng bÖnh do nÊm, vi khuÈn, virus. Chóng g©y h¹i tõ giai ®o¹n c©y con trong v­ên ­¬m, giai ®o¹n trång ngoµi s¶n xuÊt cho ®Õn khi thu ho¹ch [16]. Do ®ã lµm gi¶m n¨ng suÊt ®ång thêi ng­êi trång ph¶i sö dông rÊt nhiÒu lo¹i thuèc phßng trõ s©u bÖnh víi liÒu l­îng cao h¬n khuyÕn c¸o rÊt nhiÒu lÇn, v× thÕ chóng th­êng g©y ®éc cho ng­êi tiªu dïng do d­ l­îng trong s¶n phÈm. Bªn c¹nh ®ã, víi n¨ng suÊt trung b×nh 14 tÊn/1 ha, s¶n l­îng hµng n¨m trªn c¶ n­íc lµ 100 ngµn tÊn míi chØ ®¶m b¶o cho b×nh qu©n ®Çu ng­êi trªn c¶ n­íc h¬n 1 kg s¶n phÈm mét n¨m. MÆt kh¸c, do vïng trång cµ chua vµ thêi gian thu ho¹ch th­êng tËp trung nªn s¶n phÈm cã n¬i cã lóc thõa, gi¸ b¸n qu¸ rÎ, dËp n¸t vµ h­ háng khi vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n,... [15]. V× vËy, viÖc t¹o ra nh÷ng gièng cµ chua cã kh¶ n¨ng kh¸ng s©u bÖnh, n©ng cao n¨ng suÊt, chÊt l­îng lµ rÊt cÇn thiÕt. Tr­íc ®©y, muèn t¹o ra ®­îc mét gièng c©y míi, ng­êi ta ®· ph¶i mÊt rÊt nhiÒu n¨m b»ng c¸ch lai t¹o, chän läc qua nhiÒu thÕ hÖ, tuy nhiªn kh«ng ph¶i lóc nµo còng t¹o ra ®­îc gièng c©y mang ®­îc c¸c ®Æc tÝnh nh­ mong muèn. Nh­ng ngµy nay, c«ng nghÖ gen ®· gióp cho viÖc chuyÓn gen ­u viÖt vµo viÖc lai t¹o gièng míi trong n«ng nghiÖp ®­îc tiÕn hµnh mét c¸ch nhanh chãng vµ dÔ dµng h¬n [13]. Tuy nhiªn, mét trong nh÷ng yÕu tè quan träng hµng ®Çu dÉn tíi sù thµnh c«ng cña c«ng t¸c chän t¹o gièng c©y trång nãi chung vµ chuyÓn gen vµo thùc vËt nãi riªng lµ viÖc x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh cã hiÖu qu¶ cao [14]. ChÝnh v× vËy chóng t«i quyÕt ®Þnh tiÕn hµnh"Nghiªn cøu hÖ thèng t¸i sinh c©y cµ chua (Lycopersicum esculentum L.) phôc vô chuyÓn gen" nh»m kh¶o s¸t kh¶ n¨ng t¸i sinh in vitro c©y cµ chua từ th©n mÇm ®Ó phôc vô cho viÖc chuyÓn gen sau nµy. 2. Néi dung nghiªn cøu. - T×m hiÓu ¶nh h­ëng cu¶ mét sè chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t. - T×m hiÓu kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y tõ th©n mÇm. §Ò tµi ®­îc thùc hiÖn t¹i phßng thÝ nghiÖm thuéc Bé m«n Sinh häc - Khoa KHTN & XH - §HTN. Ch­¬ng 1. Tæng Quan Tµi LiÖu 1.1. Giíi thiÖu chung vÒ c©y cµ chua 1.1.1. Nguån gèc, ph©n lo¹i Cµ chua cã nguån gèc ë Peru, Bolivia, Ecuado. Tr­íc khi t×m ra ch©u Mü th× cµ chua ®· ®­îc trång ë Peru vµ Mehico. Nh÷ng loµi cµ chua hoang d¹i gÇn gòi víi loµi cµ chua trång ngµy nay vÉn t×m thÊy ë däc theo d·y nói Andes (Peru), ®¶o Galapagos (Ecuado) vµ Bolivia. C¸c nhµ v­ên ®· trång, thuÇn d­ìng nh÷ng gièng cµ chua qu¶ nhá vµ d¹ng hoang d¹i. Nh÷ng gièng vµ loµi hoang d¹i nµy ®­îc mang từ n¬i xuÊt xø ®Õn Trung Mü, råi ®Õn Mehico [2]. §Õn ®Çu thÕ kû XVIII, c¸c gièng cµ chua ®· trë nªn phong phó vµ ®a d¹ng, nhiÒu vïng ®· trång cµ chua lµm thùc phÈm. Vµo thÕ kû XIX (1830) qu¶ cµ chua ®· trë thµnh lo¹i thùc phÈm kh«ng thÓ thiÕu trong b÷a ¨n th­êng ngµy. Cuèi thÕ kû XIX, trªn 200 dßng, gièng cµ chua ®­îc giíi thiÖu mét c¸ch réng r·i trªn thÕ giíi [2]. Cµ chua thuéc hä cµ (Solanaceae), bé cµ (Solanales), ph©n líp bạc hà (Lamiidae), líp ngäc lan (Magnoliopsida), cã tªn khoa häc lµ Lycopersicum esculentum L., cµ chua cßn cã nhiÒu tªn gäi kh¸c nhau nh­ Lycopersicum esculentum Mill, L. lycopersicum, S. lycopersicon, L. kort...[15]. Tõ l©u cã nhiÒu t¸c gi¶ nghiªn cøu vÒ ph©n lo¹i cµ chua vµ lËp thµnh hÖ thèng ph©n lo¹i theo quan ®iÓm riªng cña m×nh. Theo H.J.Muller (1940) th× loµi cµ chua trång hiÖn nay thuéc chi phô Eulycopersion C.H.Muller. T¸c gi¶ ph©n lo¹i chi phô nµy thµnh 7 loµi, loµi cµ chua trång hiÖn nay (Lycopersicon esculentum L.) thuéc loµi thø nhÊt [2]. Theo L.B.Lihner Nonnecke (1989) th× L.esculentum lµ loµi cµ chua trång cã 4 biÕn chñng sau. + L. esculentum var. Commune lµ gièng cµ chua th«ng th­êng. HÇu hÕt nh÷ng gièng cµ chua trång ®Òu thuéc biÕn chñng nµy. §Æc ®iÓm lµ th©n, l¸ rËm r¹p, sum suª, qu¶ cã khèi l­îng trung b×nh lín. + L. esculentum var. Grandifolium. L¸ cña biÕn chñng nµy to, gièng l¸ khoai t©y, mÆt l¸ réng vµ l¸ng bãng, sè l¸ trªn c©y Ýt. + L. esculentum var. Validum. Cµ chua anh ®µo, c©y ®øng, mËp. + L. esculentum var. Pyriforme. Cµ chua h×nh qu¶ lª. TÊt c¶ c¸c loµi cµ chua ®Òu cã sè nhiÔm s¾c thÓ 2n = 24. 1.1.2. §Æc ®iÓm sinh häc Cµ chua lµ lo¹i th©n th¶o, sèng theo mïa, ­a khÝ hËu Êm ¸p vµ ¸nh s¸ng ®Çy ®ñ. Cã ¸nh s¸ng c©y míi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn tèt. Cµ chua sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn thÝch hîp trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é trung b×nh tõ 22oC -26oC. NÕu nhiÖt ®é trªn 35oC c©y cµ chua ngõng sinh tr­ëng, khi nhiÖt ®é xuèng d­íi 10oC cµ chua kh«ng ra hoa. MÆc dï ®­îc xÕp vµo nhãm c©y t­¬ng ®èi chÞu h¹n song cµ chua còng lµ c©y ­a n­íc, cµ chua cÇn mét l­îng n­íc lín cho suèt qu¸ tr×nh sinh tr­ëng, ph¸t triÓn nªn cµ chua cÇn ph¶i ®­îc t­íi nhiÒu n­íc, nÕu ®Ó ruéng trång cµ chua lóc thõa lóc thiÕu n­íc sÏ lµm cho qu¶ dÔ bÞ nøt. Vµo thêi gian ra hoa nÕu thiÕu n­íc sÏ lµm cho hoa ®­îc h×nh thµnh Ýt, dÔ bÞ rông qu¶ [12]. Cµ chua cã th©n trßn, ph©n nh¸nh nhiÒu, cao 0.6 - 1m, toµn th©n cã l«ng mÒm vµ l«ng tuyÕn, ®Æc tÝnh cña c©y cµ chua lµ bß lan ra xung quanh hoÆc mäc thµnh bôi. L¸ kÐp l«ng chim ph©n thuú, sè l­îng thuú kh«ng cè ®Þnh. L¸ chÐt h×nh trøng thu«n dµi 7-12cm, réng 2-5 cm, ®Çu nhän hoÆc tï, gèc lÖch, mÐp khÝa, r¨ng th«, cuèng dµi 2-3cm [6]. Hoa mµu vµng, mäc thµnh chïm ë kÏ l¸, mçi chïm 5-8 hoa hoÆc nhiÒu h¬n. Khi gÆp nh÷ng ®iÒu kiÖn bÊt lîi nh­ qu¸ l¹nh, qu¸ nãng, qu¸ kh« h¹n, qu¸ Èm ­ít hoÆc thiÕu dinh d­ìng, s©u bÖnh g©y h¹i,...th× sÏ lµm cho hoa vµ qu¶ dÔ bÞ rông. Th­êng ng­êi ta sö dông chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng 2,4D ®Ó ng¨n c¶n hiÖn t­îng nµy [3]. Qu¶ cµ chua cã h×nh trßn hoÆc h¬i dÑt, còng cã gièng qu¶ h×nh trøng, h×nh qu¶ lª,... Khi qu¶ chÝn, tuú thuéc vµo ®Æc ®iÓm cña gièng mµ cã mµu s¾c kh¸c nhau nh­ mµu ®á, mµu vµng, mµu vµng hång,... ChÊt mµu chñ yÕu cña cµ chua lµ carotinoit, chlorophyll, theo møc ®é chÝn, l­îng chlorophyll gi¶m, l­îng carotinoit t¨ng. Trong qu¶ cµ chua cã chøa thÞt qu¶, chÊt dÞch chua ngät vµ nhiÒu h¹t dÑt h×nh thËn [6]. Líp thÞt cµng dµy, buång ®ùng h¹t cµng bÐ, chÊt l­îng qu¶ cµng cao. ë ®é chÝn hoµn toµn, l­îng vitamin C vµ carotinoit ®¹t tû lÖ cao nhÊt, l­îng acid gi¶m, l­îng ®­êng t¨ng, thÞt qu¶ cã vÞ ngät h¬n lóc cßn xanh. L­îng protopectin gi¶m lµm cho vá dÔ t¸ch ra vµ qu¶ bÞ mÒm. Dùa vµo ®Æc ®iÓm h×nh th¸i cña qu¶ mµ ng­êi ta ph©n lo¹i cµ chua thµnh c¸c nhãm kh¸c nhau. ë n­íc ta, c¸c gièng cµ chua ®ang ®­îc trång chñ yÕu thuéc ba nhãm chÝnh lµ nhãm cµ chua mói, nhãm cµ chua hång vµ nhãm cµ chua bi (hay cßn gäi lµ cµ chua ta hoÆc cµ chua kiu) [15]. - Cµ chua mói: Qu¶ to, nhiÒu ng¨n t¹o thµnh mói. Qu¶ cã vÞ chua, nhiÒu h¹t, ¨n kh«ng ngon, nh­ng c©y mäc khoÎ, sai qu¶, chèng chÞu s©u bÖnh tèt. Gièng ®iÓn h×nh lµ cµ chua mói H¶i Phßng. - Cµ chua hång: Lµ lo¹i cµ chua ®­îc trång phæ biÕn hiÖn nay. Qu¶ cã h×nh d¹ng nh­ qu¶ hång, kh«ng cã mói hoÆc mói kh«ng râ. ChÊt l­îng ¨n t­¬i còng nh­ lóc chÕ biÕn vµ nÊu ¨n cao do thÞt qu¶ ®Æc, nhiÒu bét, l­îng ®­êng cao. PhÇn lín trong nhãm nµy lµ c¸c gièng ®­îc lai t¹o, chän läc trong n­íc vµ mét sè gièng nhËp néi. Mét sè gièng th­êng ®­îc trång lµ PT18, HT7, HT14, VT3, HP1, MV1,... - Cµ chua bi: Lµ gièng ®Þa ph­ong, gÆp r¶i r¸c ë c¸c vïng nói cao vµ ven biÓn miÒn trung, chóng cã l­îng acid cao, h¹t nhiÒu, n¨ng suÊt thÊp do qu¶ bÐ nh­ng kh¶ n¨ng chèng chÞu tèt nªn ®­îc sö dông lµm vËt liÖu t¹o gièng. GÇn ®©y, nhiÒu vïng trong n­íc ®· trång c¸c gièng cµ chua qu¶ nhá nhËp néi. Nh÷ng gièng nµy cho n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng tèt, ®­îc sö dông chñ yÕu nh­ mét lo¹i qu¶ sau b÷a ¨n. C¸c gièng cã mµu s¾c vµ h×nh d¸ng rÊt ®a d¹ng [23]. 1.1.3. Gi¸ trÞ kinh tÕ vµ gi¸ trÞ sö dông Cµ chua lµ c©y rau cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao, ®­îc trång réng r·i trªn thÕ giíi. Cµ chua cã thÓ cho n¨ng suÊt cao, sinh tr­ëng nhanh, b¶o qu¶n ®­îc t­¬ng ®èi dµi h¬n so víi c¸c lo¹i rau kh¸c, qu¶ cã kh¶ n¨ng vËn chuyÓn ®­îc thuËn lîi vµ ®i xa [3]. V× vËy trång cµ chua ®· thùc sù mang lai hiÖu qu¶ kinh tÕ cao. Theo FAO (1999), hiÖn cã tíi 158 n­íc trång cµ chua. DiÖn tÝch cµ chua trªn thÕ giíi lµ 3 254 000 ha, n¨ng suÊt lµ 27.77 tÊn/ha, s¶n l­îng 90.36 triÖu tÊn. Mét sè n­íc cã n¨ng suÊt cµ chua cao trªn 100 tÊn/ha nh­ Hµ Lan (425 tÊn/ha), Thôy SÜ (383 tÊn/ha), Thôy §iÓn (327 tÊn/ha), Na Uy (291 tÊn/ha), Ailen (201 tÊn/ha),...[2]. Cµ chua lµ lo¹i rau cho hiÖu qu¶ kinh tÕ cao vµ lµ mÆt hµng xuÊt khÈu quan träng cña nhiÒu n­íc. ë Mü (1997) tæng gi¸ trÞ xuÊt khÈu mét hecta cµ chua cao h¬n 4 lÇn so víi lóa n­íc, 20 lÇn so víi lóa mú [2]. ë ViÖt Nam, lÞch sö trång cµ chua míi chØ h¬n 100 n¨m nay. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y ë n­íc ta diÖn tÝch trång cµ chua ®ang ngµy mét t¨ng. §iÒu kiÖn thiªn nhiªn, khÝ hËu vµ ®Êt ®ai n­íc ta rÊt thÝch hîp cho cµ chua sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn. V× vËy trªn kh¾p n­íc ta tõ b¾c tíi nam hÇu hÕt ®©u còng trång ®uîc cµ chua [3]. DiÖn tÝch trång cµ chua hµng n¨m kho¶ng 10 000 ha [15]. Cµ chua lµ c©y rau quan träng cña nhiÒu vïng chuyªn canh, lµ c©y trång sau lóa mïa sím cho hiÖu qu¶ kinh tÕ cao. Cµ chua ®­îc trång chñ yÕu ë vïng ®ång b»ng s«ng hång vµ trung du b¾c bé. ë MiÒn Nam cã §µ L¹t (L©m §ång) lµ n¬i s¶n xuÊt cµ chua cho n¨ng suÊt cao. Song trong c¶ n­íc ch­a cã vïng s¶n xuÊt lín, cµ chua ®ang ®­îc trång r¶i r¸c ë nhiÒu n¬i. §©y còng lµ khã kh¨n trong viÖc quy hoÆch vïng s¶n xuÊt cµ chua cho môc ®Ých xuÊt khÈu vµ chÕ biÕn. Qu¶ cµ chua cã gi¸ trÞ dinh d­ìng rÊt cao, thµnh phÇn dinh d­ìng gåm glucid, protein, P, Ca, caroten, Fe, c¸c vitamin B1, B2, PP, C [6]. Vitamin C trong qu¶ cµ chua khi nÊu chÝn vÉn gi÷ ®­îc phÇn lín khèi l­îng, chØ bÞ bay h¬i t­¬ng ®èi Ýt v× trong qu¶ cµ chua cã c¸c acid xitric vµ acid t¸o lµ nh÷ng lo¹i acid võa cã t¸c dông b¶o vÖ vitamin C võa cã t¸c dông tiªu ®­îc c¸c chÊt bÐo [3]. Cµ chua chÝn c©y cã chÊt l­îng tèt h¬n so víi cµ chua chÝn trong thêi gian b¶o qu¶n. §Æc biÖt, quả cà chua có chứa hàm lượng lycopen khá cao. Lycopen hoạt động như chất chống oxy hóa cực mạnh trong cơ thể, chống lại tác hại của các gốc tự do, khôi phục những tế bào bị tổn hại, tiêu diệt những phân tử thoái hóa, kiềm chế quá trình oxy hóa của DNA do đó cà chua có tác dụng tốt đối với nhiều bệnh như: ung thư, tim mạch, chống lão hóa,… Do cã thµnh phÇn dinh d­ìng phong phó nªn cµ chua ®· trë thµnh mãn ¨n th«ng dông cña nhiÒu n­íc trªn 150 n¨m nay vµ lµ c©y rau ¨n qu¶ ®­îc trång réng r·i kh¾p c¸c ch©u lôc [2]. Cµ chua còng lµ lo¹i rau cã nhiÒu c¸ch sö dông. Cã thÓ dïng qu¶ t­¬i, trén salat, n­íc gi¶i kh¸t, xµo nÊu,...hoÆc ®­îc chÕ biÕn thµnh nhiÒu lo¹i s¶n phÈm kh¸c nhau nh­: cµ chua c« ®Æc, n­íc qu¶, n­íc sèt, t­¬ng, cµ chua ®ãng hép,...[19]. Cµ chua lµ lo¹i rau ¨n qu¶ cã gi¸ trÞ dinh d­ìng vµ kinh tÕ cao nh­ng ë mét sè vïng ë n­íc ta nã cßn gi÷ gi¸ trÞ thÊp trong c¬ cÊu c©y trång. HiÖn nay, c¸c nghiªn cøu trªn ®èi t­îng nµy chØ dõng l¹i ë viÖc sö dông hÖ thèng c©y trång hoµn chØnh [13]. Sö dông nh÷ng tiÕn bé trong lÜnh vùc nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ®· thiÕt lËp mét c«ng cô h÷u Ých cho viÖc nghiªn cøu vµ t¹o thµnh c«ng c©y cµ chua chuyÓn gen nh»m n©ng cao n¨ng suất, chÊt l­îng cña cµ chua. 1.2. C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt trong c¶i t¹o gièng c©y trång 1.2.1. HÖ thèng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt HÖ thèng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®­îc hoµn thiÖn vµ ph¸t triÓn m¹nh tõ nh÷ng n¨m 60 cña thÕ kû XX khi t×m ra m«i tr­êng nu«i cÊy chuÈn vµ ®Æc biÖt sö dông c¸c chÊt hormone sinh tr­ëng nh­ auxin, gibberillin, cytokinin,...®Ó kÝch thÝch sù ph©n bµo vµ t¨ng tr­ëng tÕ bµo còng nh­ t¹o thµnh c¸c m« vµ t¸i sinh c©y toµn vÑn tõ tÕ bµo ®­îc nu«i cÊy[1]. Ngµy nay ng­êi ta cã thÓ nu«i cÊy bÊt kú c¬ quan nµo cña c©y (chåi, l¸, th©n, rÔ, hoa,...) ®Ó t¹o thµnh m« sÑo vµ tõ ®ã ®iÒu khiÓn cho tÕ bµo biÖt ho¸ thµnh c¸c m« kh¸c nhau (rÔ, th©n, l¸,...) vµ t¸i sinh thµnh c©y tr­ëng thµnh. Trong kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo th× m«i tr­êng dinh d­ìng ®Ó duy tr× sù sèng cho tÕ bµo lµ rÊt quan träng. M«i tr­êng bao gåm c¸c thµnh phÇn ®a l­îng nh­: NH4, NO3, SO4, Ca, Cl, K, Na,...C¸c chÊt vi l­îng nh­: Fe, Mg, Mn, Zn, I, Bo, Mo, Cu, ... Ngoµi ra cßn ph¶i bæ sung ®­êng vµo m«i tr­êng nu«i cÊy v× c©y nu«i cÊy kh«ng hoµn toµn tù d­ìng [27]. §­êng ®­îc sö dông lµm nguån cacbon chñ yÕu cung cÊp n¨ng l­îng trong nu«i cÊy, ®ång thêi ®ãng vai trß duy tr× ¸p suÊt thÈm thÊu cho m«i tr­êng nu«i cÊy [25]. C¸c ®­êng th­êng dïng trong nu«i cÊy lµ ®­êng glucose, hoÆc sucrose. Cho ®Õn nay, cã rÊt nhiÒu m«i tr­êng dinh d­ìng kho¸ng ®­îc t×m ra nh­ m«i tr­êng MS (1962), m«i tr­êng Knop (1974), m«i tr­êng Linsmainer vµ Skoog (1963), m«i tr­êng Gamborg (1968), m«i tr­êng VW (Vacine Went),... Trong ®ã m«i tr­êng MS lµ phï hîp nhÊt ®èi víi ®a sè c¸c loµi thùc vËt [24]. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i loµi nµo còng phï hîp víi m«i tr­êng MS nh­ cÈm ch­íng (Dianthus spp), h­¬ng nhu (Ocmum gratissmum) chØ sinh tr­ëng ®­îc khi l­îng kho¸ng gi¶m mét nöa [26]. Ngoµi chÊt dinh d­ìng th× c¸c hormone sinh tr­ëng còng ®ãng vai trß hÕt søc quan träng trong ®Þnh h­íng cho qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« nu«i cÊy [4]. Bªn c¹nh ®ã ph¶i kÓ ®Õn vai trß cña c¸c yÕu tè ngo¹i c¶nh nh­ thêi gian, ®é chiÕu s¸ng, nhiÖt ®é, ®é pH, ...Chóng g©y ¶nh h­ëng lªn sù sinh tr­ëng vµ t¸i sinh cña tÕ bµo, m« sÑo vµ c©y con [1]. 1.2.1.1. C¬ së cña kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt Kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt dùa trªn c¬ së khoa häc lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo do Haberlandt ®Ò xuÊt n¨m 1902: “Mçi mét tÕ bµo bÊt kú lÊy tõ c¬ thÓ thùc vËt ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó ph¸t triÓn thµnh mét c¸ thÓ hoµn chØnh”. Kh¶ n¨ng ®ã gäi lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt [4]. Theo quan ®iÓm cña sinh häc hiÖn ®¹i th× mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· ph©n ho¸ ®Òu mang toµn bé th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ. ChÝnh v× vËy, khi gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp, mçi mét tÕ bµo ®Òu cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh. §Ó thùc hiÖn ®­îc ®iÒu nµy tÕ bµo thùc vËt ph¶i tr¶i qua hai qu¸ tr×nh lµ ph¶n biÖt ho¸ vµ t¸i biÖt ho¸ [11]. - Ph¶n biÖt ho¸ lµ giai ®o¹n ®­a tÕ bµo tõ tr¹ng th¸i ®· biÖt ho¸ trë l¹i tr¹ng th¸i ch­a biÖt ho¸. Qu¸ tr×nh nµy biÕn tÕ bµo ®· biÖt ho¸ thµnh nh÷ng tÕ bµo cã h×nh thøc gièng nh­ nh÷ng tÕ bµo ë ®Ønh sinh tr­ëng (tÕ bµo mÇm ph«i). Chóng cã ®Æc ®iÓm lµ tÕ bµo chÊt ®Ëm ®Æc, kh«ng bµo nhá li ti hoÆc kh«ng cã, nh©n to, kÝch th­íc tÕ bµo lín. Nh÷ng tÕ bµo nh­ vËy coi nh­ ®· ®ược ph¶n biÖt ho¸ xong vµ trong nh÷ng ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nhÊt ®Þnh chóng sÏ ph¸t triÓn thµnh c¬ thÓ míi. - T¸i biÖt ho¸ lµ giai ®o¹n ®­a tÕ bµo ®· ph¶n biÖt ho¸ ph¸t triÓn thµnh c©y hoµn chØnh. Trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy, c¸c tÕ bµo ®· biÖt ho¸ tham gia h×nh thµnh nªn c¸c tÕ bµo ph«i vµ hai lo¹i tÕ bµo kh¸c lµ tÕ bµo trung gian vµ tÕ bµo khæng lå cã kh«ng bµo rÊt lín. Trong ®ã, chØ cã tÕ bµo ph«i vµ tÕ bµo trung gian lµ ph©n chia cßn c¸c tÕ bµo khæng lå th× chÕt dÇn. Kh¶ n¨ng t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh chØ cã ë trong c¸c tÕ bµo ph«i, nh­ng nÕu trong quÇn thÓ kh«ng cã c¸c tÕ bµo khæng lå th× c¸c tÕ bµo ph«i kh«ng thÓ ph¸t sinh thµnh c¬ thÓ míi ®­îc mµ chØ nh÷ng quÇn thÓ nu«i cÊy cã ®ñ c¸c lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau míi cã kh¶ n¨ng t¸i sinh [11]. Sù t¸i biÖt ho¸ vµ ph¶n biÖt ho¸ lµ qu¸ tr×nh ho¹t ho¸ vµ øc chÕ ho¹t ®éng cña c¸c gen. Trong mét giai ®o¹n nhÊt ®Þnh cña c©y, mét sè gen nµo ®ã ®ang ë trong tr¹ng th¸i øc chÕ kh«ng ho¹t ®éng ®­îc ho¹t ho¸ ®Ó cho ra mét tÝnh tr¹ng biÓu hiÖn míi. Ng­îc l¹i, mét sè gen l¹i bÞ øc chÕ ®×nh chØ ho¹t ®éng. Qu¸ tr×nh ho¹t ho¸, øc chÕ diÔn ra theo mét ch­¬ng tr×nh ®· ®­îc lËp s½n trong cÊu tróc hÖ gen cña tÕ bµo, gióp cho sù sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña c¬ thÓ thùc vËt ®­îc hµi hoµ. Sù ho¹t ®éng hµi hoµ cña cña c¸c tÕ bµo vµ m« c¬ quan cßn phô thuéc vµo tÕ bµo n»m trong khèi m«, c¬ quan cña c¬ thÓ. Khi t¸ch riªng tõng tÕ bµo hoÆc lµm gi¶m kÝch th­íc khèi m« sÏ t¹o ®iÒu kiÖn cho viÖc ho¹t ho¸ c¸c gen cña tÕ bµo [4]. 1.2.1.2. Mét sè yÕu tè ¶nh h­ëng lªn qu¸ tr×nh nu«i cÊy m« tÕ bµo + ¶nh h­ëng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng lµ thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong m«i tr­êng nu«i cÊy. Chóng cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i thùc vËt in vitro. HiÖu qu¶ t¸c ®éng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng phô thuéc vµo: Nång ®é sö dông, ho¹t tÝnh vèn cã cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng, lo¹i mÉu nu«i cÊy,...[20]. C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng bao gåm hai nhãm chÝnh lµ auxin vµ cytokinin. TØ lÖ, hµm l­îng hai nhãm chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng nµy trong m«i tr­êng nu«i cÊy kh¸c nhau sÏ ®Þnh h­íng cho sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« nu«i cÊy kh¸c nhau[5]. - Nhãm auxin: §­îc ®­a vµo m«i tr­êng nu«i cÊy nh»m thóc ®Èy sù sinh tr­ëng vµ gi·n në cña tÕ bµo, t¨ng c­êng c¸c qu¸ tr×nh sinh tæng hîp vµ trao ®æi chÊt, kÝch thÝch sù h×nh thµnh rÔ vµ tham gia vµo c¶m øng ph¸t sinh ph«i v« tÝnh. Mét sè lo¹i auxin th­êng dïng trong nu«i cÊy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid) ; α-NAA (α-Naphthalene acetic acid). C¸c auxin ®Òu cã hiÖu qu¶ sinh lý ë nång ®é thÊp, ph¹m vi sö dông tõ 0.1 - 1mg tuú theo môc ®Ých vµ vËt liÖu nu«i cÊy. Auxin ®­îc thªm vµo sÏ kÕt hîp víi c¸c auxin néi sinh ®Ó ®iÒu khiÓn chiÒu h­íng vµ c­êng ®é c¸c qu¸ tr×nh sinh tr­ëng [18] .Tuú theo lo¹i auxin, hµm l­îng sö dông vµ ®èi t­îng nu«i cÊy... mµ t¸c ®éng sinh lý cña auxin lµ kÝch thÝch sinh tr­ëng cña m«, ho¹t ho¸ sù h×nh thµnh rÔ hay thóc ®Èy sù ph©n chia m¹nh mÏ cña tÕ bµo dÉn ®Õn h×nh thµnh m« sÑo [20]. - Nhãm cytokinin: KÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo, sù h×nh thµnh vµ sinh tr­ëng cña chåi in vitro. C¸c cytokinin cã biÓu hiÖn øc chÕ sù t¹o rÔ vµ sinh tr­ëng cña m« sÑo nh­ng cã ¶nh h­ëng d­¬ng tÝnh râ rÖt ®Õn ph¸t sinh ph«i v« tÝnh cña mÉu nu«i cÊy. V× thÕ, trong giai ®o¹n ®Çu cña ph¸t sinh ph«i soma, sù cã mÆt auxin lµ cÇn thiÕt nh­ng trong giai ®o¹n sau cña ph«i ph¶i ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng cã cytokinin ®Ó biÖt ho¸ chåi [21]. Mét sè lo¹i cytokinin th­êng dïng trong nu«i cÊy: zeatin; kinetin; BAP,…Hµm l­îng sö dông c¸c lo¹i cytokinin dao ®éng tõ 0.1-2.0mg/l. ë nh÷ng nång ®é cao h¬n, cytokinin cã t¸c dông kÝch thÝch râ rÖt ®Õn sù h×nh thµnh chåi bÊt ®Þnh, ®ång thêi øc chÕ m¹nh sù t¹o rÔ cña chåi nu«i cÊy. Ng­îc l¹i, ë nång ®é thÊp h¬n, cytokinin biÓu hiÖn hiÖu qu¶ kÝch thÝch kÐm, dÉn ®Õn sù t¹o chåi vµ sinh tr­ëng cña chåi gi¶m. Trong nu«i cÊy cã lo¹i mÉu chØ cÇn auxin hoÆc cytokinin, hoÆc kh«ng cÇn c¶ hai. Cßn ®a sè c¸c tr­êng hîp ph¶i sö dông phèi hîp c¶ auxin vµ cytokinin ë nh÷ng tæ hîp tØ lÖ kh¸c nhau [20]. Theo Bhojwani(1980) ë mét sè loµi, m«i tr­êng nu«i cÊy chØ cã mét lo¹i cytokinin còng cho hÖ sè t¹o chåi cùc ®¹i. Víi c¸c c©y ngò cèc sù phèi hîp cña hai hay nhiÒu lo¹i cytokinin cho kÕt qu¶ tèt h¬n khi sö dông cytokinin riªng rÏ. Tuy nhiªn, muèn cã t­¬ng quan sinh tr­ëng tèi ­u th× ph¶i cã c©n b»ng hormone thÝch hîp. Sù biÖt ho¸ c¬ quan thùc vËt in vitro lµ kÕt qu¶ t¸c ®éng qua l¹i gi÷a hai nhãm auxin vµ cytokinin. Tû lÖ auxin/cytokinin cao sÏ kÝch thÝch sù t¹o thµnh rÔ, ng­îc l¹i sÏ ®Èy m¹nh sù biÖt ho¸ chåi, cßn nÕu tû lÖ ®ã lµ trung b×nh th× m« sÑo ®­îc h×nh thµnh. §ã lµ nguyªn t¾c chung, cßn ph¶n øng cña c¸c lo¹i m« lµ kh«ng gièng nhau [25]. V× thÕ mçi lo¹i m« ë tõng giai ®o¹n sinh tr­ëng kh¸c nhau th× tæ hîp nång ®é gi÷a auxin vµ cytokinin lµ rÊt quan träng. Ngoµi hai nhãm chÝnh lµ auxin vµ cytokinin, trong nu«i cÊy ng­êi ta cßn sö dông thªm c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng kh¸c nh­ GA (th«ng dông nhÊt lµ GA3), ABA, etylen,…Sù cã mÆt cña GA3 trong m«i tr­êng nu«i cÊy sÏ t¨ng c­êng qu¸ tr×nh v­¬n th©n cña chåi vµ t¹o c©y hoµn chØnh ë mét sè loµi thùc vËt. Tuy nhiªn ®èi víi mét sè ®èi t­îng th× viÖc bæ sung GA3 lµ kh«ng cÇn thiÕt v× nã ¶nh h­ëng xÊu ®Õn sù h×nh thµnh chåi bÊt ®Þnh, sù t¹o rÔ vµ ph¸t sinh ph«i. ABA chØ ®­îc sö dông trong nu«i cÊy nh»m k×m h·m sù sinh tr­ëng cña chåi, tham gia b¶o qu¶n l­¬ng thùc vµ quü gen in vitro. ë mét sè tr­êng hîp ABA cã t¸c dông thóc ®Èy sù t¹o rÔ nh­ trong nu«i cÊy khoai lang, cµ chua, ®Ëu t­¬ng,…Trong nu«i cÊy ph«i, viÖc bæ sung ABA vµo m«i tr­êng nu«i cÊy lµ cÇn thiÕt v× ABA gióp ph«i chèng l¹i sù kh« ho¸ [25]. + ¶nh h­ëng cña mÉu nu«i cÊy lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y MÉu dïng cho nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt cã thÓ lµ hÇu hÕt c¸c c¬ quan bé phËn cña c©y: Chåi ngän, chåi bªn, phiÕn l¸, cuèng l¸,…C¸c cÊu tróc cña ph«i (l¸ mÇm, trô l¸ mÇm,…); C¸c c¬ quan dù tr÷ (cñ, c¨n hµnh,…). Tuú theo sù tiÕp xóc víi m«i tr­êng mµ c¸c mÉu thùc vËt cã chøa Ýt hay nhiÒu mÇm bÖnh (vi khuÈn, nÊm). C¸c cÊu tróc thùc vËt ®­îc bao kÝn (l¸ mÇm, ph«i, m« thÞt trong qu¶,…) th­êng kh«ng chøa hoÆc cã Ýt vi sinh vËt. Ng­îc l¹i c¸c m« vµ c¬ quan thùc vËt tiÕp xóc trùc tiÕp víi ®Êt, n­íc nh­ rÔ, th©n ngÇm, cñ th­êng cã l­îng vi sinh vËt rÊt cao vµ rÊt khã lo¹i bá hoµn toµn chóng khái nguån mÉu. C¸c loµi c©y kh¸c nhau cã hiÖu qu¶ nu«i cÊy kh¸c nhau. Th«ng th­êng thùc vËt hai l¸ mÇm cã kh¶ n¨ng t¸i sinh cao h¬n thùc vËt mét l¸ mÇm. ThËm chÝ tuy mang cïng mét l­îng th«ng tin di truyÒn nh­ nhau nh­ng c¸c cÊu tróc m« kh¸c nhau trªn mét c©y cã thÓ cho c¸c kÕt qu¶ ph¸t sinh h×nh th¸i kh¸c nhau, víi kh¶ n¨ng t¹o chåi, rÔ hay m« sÑo,…[24]. V× vËy, ®Ó chän mÉu cÊy cho phï hîp, ph¶i c¨n cø vµo tr¹ng th¸i sinh lý hay tuæi cña mÉu. MÉu non trÎ cã sù ph¶n øng víi c¸c ®iÒu kiÖn vµ m«i tr­êng nu«i cÊy nhanh, dÔ t¸i sinh, ®Æc biÖt lµ trong nu«i cÊy m« sÑo, ph«i. Ngoµi ra m« non trÎ míi ®­îc h×nh thµnh, sinh tr­ëng m¹nh, møc ®é nhiÔm mÇm bÖnh Ýt h¬n [20]. §Ó ®¹t ®­îc hiÖu qu¶ t¸i sinh cao, khi lÊy mÉu ph¶i chän ®óng lo¹i m«, ®óng giai ®o¹n ph¸t triÓn cÇn thiÕt. Th«ng th­êng ng­êi ta lÊy mÉu m« ë ®Ønh chåi ngän, ®Ønh chåi n¸ch råi ®Õn ®Ønh chåi hoa vµ cã thÓ lµ ®o¹n th©n non, hoÆc m¶nh l¸ non. §Ønh chåi ngän, ®Ønh chåi n¸ch dïng ®Ó nh©n nhanh nhiÒu lo¹i c©y trång nh­: døa, khoai t©y, thuèc l¸, cµ chua, hoa cóc, hoa hång,…§Ønh chåi hoa ®Ó nh©n nhanh supl¬. M¶nh l¸ mÇm ®Ó nhanh hä bÇu bÝ,…Sö dông chåi non cña h¹t n¶y mÇm còng dÔ dµng nh©n nhanh nhiÒu lo¹i c©y trång [5]. Bªn c¹nh ®ã, chÊt l­îng cña mÉu cÊy phô thuéc vµo chÊt l­îng cña c©y cho mÉu, th­êng ng­êi ta lÊy mÉu tõ nh÷ng c©y cã nh÷ng ®Æc ®iÓm ­u viÖt cÇn quan t©m: Sinh tr­ëng, ph¸t triÓn m¹nh, chèng chÞu tèt víi c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi (h¹n, l¹nh, mÆn,…) hoÆc s©u bÖnh, cho s¶n l­îng vµ chÊt l­îng ngon cña qu¶, h¹t,… Tuú thuéc vµo môc ®Ých vµ kh¶ n¨ng nu«i cÊy mµ ng­êi ta chän mÉu cho phï hîp: §Ó phôc vô cho nh©n gièng v« tÝnh th­êng chän chåi ngän, chåi bªn (chåi muén). Nu«i cÊy m« sÑo, nu«i cÊy ph«i cã thÓ sö dông l¸ mÇm, trô mÇm, th©n, l¸, ph«i,…§Ó thu c©y ®¬n béi phôc vô cho lai t¹o gièng: Dïng bao phÊn vµ h¹t phÊn cho nu«i cÊy. Bªn c¹nh ®ã, nguån gèc, tuæi sinh lý cña mÉu cÊy còng ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh cña m«. C¸c m¶nh nu«i cÊy cµng nhá th× tØ lÖ sèng cµng thÊp vµ c¸c m« cã nguån gèc tõ chåi ®Ønh cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng tèt h¬n c¸c m« cã nguån gèc tõ chåi n¸ch [25]. Tuy vËy, nguyªn t¾c c¨n b¶n lµ mÉu cÊy ph¶i chøa c¸c tÕ bµo sèng tõ c¸c m« non cã c¸c tÕ bµo ®ang ph©n chia m¹nh chiÕm tû lÖ lín, nhÊt lµ dÔ t¹o m« sÑo. MÉu cÊy ph¶i ®­îc khö trïng tr­íc khi ®­a vµo m«i tr­êng nu«i cÊy. NÕu mÉu lÊy tõ h¹t, cÇn ph¶i khö trïng bÒ mÆt vµ gieo h¹t vµo ®iÒu kiÖn v« trïng ®Ó mäc thµnh c©y vµ lÊy mÉu. NÕu mÉu lÊy trùc tiÕp tõ c©y t­¬i, cÇn ph¶i ®­îc xö lý ®Ó thu ®­îc mÉu s¹ch bÖnh. Nång ®é vµ thêi gian xö lý tuú theo lo¹i mÉu. 1.2.1.3. øng dông cña kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ c«ng cô cÇn thiÕt trong nhiÒu lÜnh vùc nghiªn cøu c¬ b¶n vµ øng dông cña ngµnh sinh häc. Nhê ¸p dông c¸c kü thuËt nu«i cÊy m« ph©n sinh, m« sÑo,… con ng­êi ®· thóc ®Èy thùc vËt sinh s¶n nhanh h¬n gÊp nhiÒu lÇn tèc ®é vèn cã trong tù nhiªn. Do ®ã sÏ t¹o ra hµng lo¹t c¸c c¸ thÓ ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn tõ mét c¸ thÓ ban ®Çu víi hÖ sè nh©n gièng cao ë quy m« c«ng nghiÖp, chÝnh v× vËy nã ®­îc øng dông ®Ó nh©n nhanh c¸c gièng c©y trång cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao hoÆc khã nh©n gièng b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p th«ng thuêng kh¸c. H¬n n÷a dùa vµo kü thuËt nu«i cÊy ®Ó duy tr× vµ b¶o qu¶n ®­îc nhiÒu gièng c©y trång quý hiÕm hoÆc cã thÓ lo¹i bá c¸c mÇm bÖnh (phôc chÕ gièng) [21]. HiÖn nay hµng lo¹t c©y gièng nh­ c©y l­¬ng thùc, c©y thùc phÈm, c©y d­îc liÖu, c©y hoa, c©y ¨n tr¸i, c©y rõng,… ®ang ®­îc s¶n xuÊt trªn quy m« c«ng nghiÖp b»ng c«ng nghÖ vi nh©n gièng. C«ng nghÖ vi nh©n gièng cã ý nghÜa kinh tÕ cao, nhÊt lµ ®èi víi c¸c c©y sinh s¶n chËm (c©y rõng, c©y gç, c©y ¨n tr¸i, c©y d­îc liÖu) hoÆc ®èi víi c©y cÇn cung cÊp sè l­îng c©y gièng nhiÒu trong thêi gian ng¾n nh­ c¸c c©y hoa (hoa hång, phong lan,…). H¬n n÷a, chØ th«ng qua kü thuËt vi nh©n gièng míi cã thÓ t¹o ®­îc c¸c gièng c©y thuÇn, c©y lai, c©y chuyÓn gen ®ång ®Òu vÒ chÊt l­îng, vÒ tÝnh chÞu bÖnh,…hoÆc mang c¸c ®Æc tÝnh ®¸p øng nhu cÇu cña ng­êi tiªu dïng [8]. MÆt kh¸c, sö dông c¸c kü thuËt nu«i cÊy vµ dung hîp tÕ bµo trÇn (protoplast) ®Ó chuyÓn c¸c gen mong muèn vµo c©y trång t¹o ra nh÷ng tÕ bµo lai kh¸c loµi mang ®Æc tÝnh di truyÒn cña c¶ bè vµ mÑ, ®©y lµ ph­¬ng ph¸p hiÖu qu¶ nhÊt ®Ó t¹o ra c©y lai xoma, cho phÐp thu ®­îc tæ hîp lai mong muèn, ph­¬ng ph¸p nµy ®· kh¾c phôc ®­îc nh÷ng h¹n chÕ cè h÷u mµ ph­¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh kh«ng thùc hiÖn ®­îc. Bªn c¹nh ®ã c¸c nhµ nghiªn cøu cßn thu nhËn c¸c chÊt trao ®æi thø cÊp tõ tÕ bµo nu«i cÊy dÉn ®Õn mét sù æn ®Þnh vµ ®éc lËp h¬n, Ýt lÖ thuéc vµo s¶n xuÊt cña thùc vËt ngoµi tù nhiªn [21]. §ång thêi nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ mét ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu hiÖu qu¶ nhÊt qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i ë nhiÒu loµi thùc vËt. Ph­¬ng ph¸p nµy gióp më ra nh÷ng h­íng míi trong nghiªn cøu sinh lý vµ di truyÒn thùc vËt nh­: C¬ chÕ sinh tæng hîp c¸c chÊt, sinh lý ph©n tö - ®ét biÕn, sinh lý dinh d­ìng ë tÕ bµo thùc vËt,…[21]. §Æc biÖt nu«i c©y m« tÕ bµo thùc vËt cßn ®­îc xem lµ b­íc kh«ng thÓ thiÕu trong kü thuËt t¹o c©y trång chuyÓn gen. Mét hÖ thèng t¸i sinh tèi ­u sÏ cho phÐp t¹o ra c¸c c©y chuyÓn gen cã kh¶ n¨ng sinh s¶n b×nh th­êng vµ duy tr× tÝnh tr¹ng ®­îc chuyÓn n¹p cho thÕ hÖ sau mét c¸ch hiÖu qu¶. 1.2.2. T¹o gièng c©y trång míi b»ng ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen So víi c¸c ph­¬ng ph¸p lai t¹o vµ chän gièng cæ ®iÓn, kü thuËt chuyÓn gen cã mét sè ­u thÕ: Nã cho phÐp ®­a vµo thùc vËt mét gen l¹ thËm chÝ kh«ng hÒ cã nguån gèc thùc vËt, nã cßn cho phÐp s¶n xuÊt víi hµm l­îng cao mét protein chñ yÕu cña tÕ bµo cã cÊu tróc vµ ®Æc tÝnh hoµn toµn thay ®æi, ®iÒu kh«ng bao giê x¶y ra trong tù nhiªn [4]. ­u ®iÓm cña hÖ thèng chuyÓn gen thùc vËt lµ kh«ng nh÷ng toµn bé c¸c tÕ bµo cña c©y t¸i sinh ®Òu mang gen t¸i tæ hîp mµ kÓ c¶ nh÷ng h¹t sinh ra tõ c©y nµy. H¬n n÷a, viÖc bæ sung c¸c tÝnh tr¹ng quan träng b»ng kü thuËt gen kh«ng lµm ¶nh h­ëng tíi kiÓu h×nh cña c©y, trong khi lai t¹o truyÒn thèng th­êng ph¶i chuyÓn toµn bé genome cña c©y cho vµo c©y nhËn nªn rÊt khã t¸ch riªng c¸c gen cã lîi khái c¸c gen kh«ng cÇn thiÕt, nhÊt lµ khi chóng liªn kÕt víi nhau dÉn ®Õn viÖc t¹o ra kiÓu h×nh kh«ng mong ®îi [14]. ChuyÓn gen ®­îc hiÓu lµ qu¸ tr×nh g¾n mét hay nhiÒu ®o¹n DNA m· ho¸ cho mét th«ng tin di truyÒn nhÊt ®Þnh vµo mét c¬ thÓ sinh vËt míi. §o¹n DNA l¹ nµy cã thÓ ®­îc t¸ch tõ thùc vËt, vi khuÈn, ®éng vËt hoÆc ®­îc tæng hîp b»ng c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö. Trong tÕ bµo chñ, gen l¹ ho¹t ®éng tæng hîp nªn c¸c protein ®Æc tr­ng, tõ ®ã xuÊt hiÖn ®Æc tÝnh míi cña c¬ thÓ mang gen chuyÓn. Muèn chuyÓn gen l¹ vµo tÕ bµo chñ ph¶i g¾n gen mong muèn chuyÓn vµo vector. C¸c vector chuyÓn gen cµng nhá cµng tèt v× chóng dÔ x©m nhËp vµo tÕ bµo. Vector ph¶i cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp nhê ®ã gen l¹ còng ®­îc sao chÐp cïng víi DNA vector. §ång thêi, vector ph¶i ®­îc g¾n gen chØ thÞ chän läc. VÝ dô: Gen kh¸ng kh¸ng sinh, gen chØ thÞ mµu,...vµ ph¶i cã vÞ trÝ nhËn biÕt cña enzyme giíi h¹n. C¸c vector th­êng dïng ®Ó chuyÓn gen ë thùc vËt gåm cã c¸c plasmid cña vi khuÈn hoÆc mét sè lo¹i virus thùc vËt. Qu¸ tr×nh nµy ph¶i tr¶i qua mét sè giai ®o¹n nhÊt ®Þnh ®ã lµ lång ghÐp, kÕt g¾n, t¹o biÓu hiÖn vµ di truyÒn ®o¹n gen míi ®ã cho c¸c thÕ hÖ sau [18]. HiÖn nay, cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p ®­îc sö dông ®Ó chuyÓn gen vµo c©y trång. C¨n cø vµo c¸ch thøc ®­a gen vµo tÕ bµo thùc vËt mµ ng­êi ta chia ra hai ph­¬ng ph¸p lµ: chuyÓn gen trùc tiÕp vµ chuyÓn gen gi¸n tiÕp. ChuyÓn gen trùc tiÕp lµ viÖc sö dông c¸c biÖn ph¸p c¬ häc, vËt lý hoÆc ho¸ häc ®Ó chuyÓn trùc tiÕp c¸c gen vµo tÕ bµo thùc vËt. §ã lµ ph­¬ng ph¸p vi tiªm, ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen b»ng sóng b¾n gen, b»ng xung ®iÖn, qua èng phÊn, chuyÓn gen b»ng siªu ©m, chuyÓn gen b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc. ChuyÓn gen gi¸n tiÕp lµ ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen th«ng qua c¸c vi sinh vËt trung gian nh­ virus, vi khuÈn (tiªu biÓu lµ vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens). §©y lµ ph­¬ng ph¸p hiÖu qu¶ vµ phæ biÕn nhÊt hiÖn nay nhê vµo kh¶ n¨ng g¾n gen ngo¹i lai vµo hÖ gen thùc vËt mét c¸ch chÝnh x¸c vµ æn ®Þnh [5]. Cho dï lùa chän ph­¬ng ph¸p nµo th× ®Ó chuyÓn gen vµo thùc vËt còng cÇn ph¶i tr¶i qua c¸c b­íc c¬ b¶n lµ: Chän läc vµ ph©n lËp gen; chuyÓn gen vµo tÕ bµo thùc vËt; nu«i tÕ bµo thùc vËt ®Ó t¹o c©y hoµn chØnh. Nh­ vËy, nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ kh©u quan träng kh«ng thÓ thiÕu trong quy tr×nh t¹o thùc vËt chuyÓn gen. V× thÕ mét hÖ thèng t¸i sinh c©y in vitro hoµn chØnh víi tÇn sè t¸i sinh cao gi÷ vai trß quan träng trong nghiªn cøu chuyÓn n¹p gen vµ hÖ thèng t¸i sinh nµy cÇn thùc hiÖn tr­íc khi tiÕn hµnh qu¸ tr×nh chuyÓn gen. KÓ tõ khi nh÷ng thÝ nghÖm chuyÓn gen ®Çu tiªn ®­îc tiÕn hµnh ®Õn nay ®· cã h¬n 50 lo¹i gen ®­îc chuyÓn vµo c©y trång vµ Ýt nhÊt kho¶ng 400 loµi ®· ®­îc kiÓm tra ngoµi ®ång ruéng [1]. Trong ®ã cã mét sè c©y quan träng nh­ ng«, cµ chua, ®Ëu t­¬ng, khoai t©y, b«ng, lóa, thuèc l¸,...vµ mét sè loµi hoa. Theo thèng kª cña ISAAA n¨m 2006, diÖn tÝch trång c©y chuyÓn gen trªn toµn cÇu ®· lªn tíi 102 triÖu ha mµ ®øng ®Çu lµ hoa kú víi 54,6 triÖu ha (chiÕm 53%). Trong sè c¸c c©y trång chuyÓn gen ®­îc th­¬ng m¹i ho¸ th× ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen lµ lo¹i c©y trång cã diÖn tÝch gieo trång lín nhÊt 58,6 triÖu ha (chiÕm 57% diÖn tÝch trång c©y chuyÓn gen trªn toµn cÇu), tiÕp theo lµ ng« víi 25,2 triÖu ha (chiÕm 25%), b«ng 13,4 triÖu ha (chiÕm 13%) vµ c¶i dÇu canola 4,8 triÖu ha (chiÕm 5%) [10]. 1.2.3. Mét sè thµnh tùu chuyÓn gen ë cµ chua Ngµy nay nhê thµnh qu¶ cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m«, kÕt hîp víi nhiÒu ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen tiªn tiÕn cã hiÖu qu¶, chóng ta ®· t¹o ra ®­îc trªn 45 loµi c©y t¸i tæ hîp kh¸c nhau nh­ lóa m×, lóa, ng«, khoai t©y, b«ng, cµ chua, c¶i dÇu, ®Ëu t­¬ng,…[18]. Víi nhiÒu tÝnh tr¹ng ®­îc chuyÓn gen ë thùc vËt. §a phÇn c¸c thùc vËt chuyÓn gen nhËn ®­îc c¸c gen ®Ò kh¸ng thuèc diÖt cá (56%), kh¸ng virus (15%), kh¸ng c«n trïng (10%),…[11]. Riªng ®èi víi cµ chua, kÓ tõ n¨m 1994 khi cµ chua trë thµnh s¶n phÈm chuyÓn gen ®Çu tiªn ®­îc th­¬ng m¹i ho¸ [5] cho ®Õn nay ng­êi ta ®· t¹o ra ®­îc nhiÒu gièng cµ chua míi mang c¸c ®Æc tÝnh mong muèn nh­ kh¸ng s©u, kh¸ng virus, cho qu¶ chÝn chËm, chèng chÞu ®iÒu kiÖn bÊt lîi,… Cµ chua lµ lo¹i c©y dÔ trång, kh«ng yªu cÇu cao vÒ kü thuËt ch¨m sãc. Tuy nhiªn n¨ng suÊt cµ chua th­êng bÞ gi¶m ®¸ng kÓ do cµ chua lµ lo¹i c©y dÔ bÞ s©u bÖnh ph¸ h¹i. §Ó kh¾c phôc ®iÒu nµy, ng­êi ta ®· t¹o ra ®­îc gièng cµ chua cã kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc qu¶ rÊt hiệu quả b»ng c¸ch chuyÓn gen Cry vµo cµ chua. Gen Cry lµ gen tæng hîp protein néi ®éc tè cña vi khuÈn Bacillus (Bt) ®· c¾t ng¾n phÇn phô (gen Cry). Gen Cry ®· c¾t ng¾n nµy ®­îc chuyÓn vµo cµ chua t¹o ra gièng cµ chua cã kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc qu¶ rÊt hiệu quả §Ó kh¸ng l¹i virus kh¶m thuèc l¸, ng­êi ta ®· chuyÓn gen CP-TMV vµo cµ chua t¹o ra c©y cµ chua chuyÓn gen cã kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i virus kh¶m thuèc l¸. Cµ chua sau thu ho¹ch th­êng chÝn nhanh vµ dÔ bÞ thèi háng do ®ã lµm ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n. §Ó kh¾c phôc nh­îc ®iÓm nµy ng­êi ta ®· chuyÓn mét gen vµo c©y cµ chua, gen nµy lµm cho cµ chua s¶n xuÊt ra mét lo¹i enzyme lµm tho¸i ho¸ thµnh phÇn tiÒn chÊt h×nh thµnh ethylen vµ nh­ vËy sÏ lµm cho cµ chua chËm chÝn vµ Ýt bÞ h­ h¹i. Ngµy nay, ®Ó b¶o qu¶n cho cµ chua khái bÞ thèi háng, ng­êi ta ®· chuyÓn vµo cµ chua mét gen của vi khuÈn, gen nµy s¶n sinh ra mét chÊt gäi lµ chitinase tiªu diÖt c¸c tÕ bµo nÊm. Do ®ã cã thÓ b¶o qu¶n ®­îc cµ chua l©u h¬n sau khi thu ho¹ch [16]. Tõ n¨m 1994, gièng cµ chua chÝn chËm chuyÓn gen ®· ®­îc th­¬ng m¹i ho¸ réng r·i trªn thÞ tr­êng ë Mü. Gièng nµy cã ­u ®iÓm lµ qu¶ kh«ng bÞ dËp khi vËn chuyÓn[9]. Nh­ vËy, tõ khi cµ chua chÝnh thøc ®­îc trång lµm rau mµu cho ®Õn nay. Qu¸ tr×nh c¶i tiÕn gièng ®­îc c¸c nhµ chän t¹o gièng cµ chua thùc hiÖn liªn tôc. Do ®ã, n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng cµ chua kh«ng ngõng ®­îc c¶i thiÖn nh»m ®¸p øng nhu cÇu ngµy cµng cao cña ng­êi tiªu dïng. Bªn c¹nh c¸c h­íng nghiªn cøu n©ng cao n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng cµ chua b»ng viÖc chuyÓn c¸c gen kh¸ng s©u bÖnh, kh¸ng thuèc diÖt cá, chÝn chậm,…Ngµy nay, mét h­íng nghiªn cøu míi ®­îc øng dông ®èi víi cµ chua lµ t¹o c©y cµ chua víi môc ®Ých lµm thùc phÈm chøc n¨ng. Tuy ch­a ®­îc th­¬ng m¹i ho¸ nh­ng ®©y lµ h­íng nghiªn cøu cã nhiÒu triÓn väng vµ b­íc ®Çu thu ®­îc thµnh c«ng ë mét sè n­íc. ë Ên ®é c¸c nhµ khoa häc thuéc viÖn nghiªn cøu thùc vËt quèc gia ®· ph¸t triÓn dßng cµ chua chuyÓn gen cã chøc n¨ng antitrypsin cña ng­êi. Cµ chua chuyÓn gen cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt ra lo¹i protein chøc n¨ng “ human alpha - 1- antitrypsin” (AAT). Protein AAT lµ chÊt øc chÕ phæ biÕn nhÊt víi enzyme “ serine protease” trong huyÕt t­¬ng ng­êi. ThiÕu AAT sÏ dÉn tíi bÖnh ung th­ gan, viªm khÝ qu¶n, viªm khíp vµ viªm da. Ng­êi ta nhËn thÊy protein AAT cña cµ chua chuyÓn gen thÓ hiÖn ho¹t tÝnh rÊt cao. Trung b×nh 1kg l¸ cµ chua cã thÓ cho 195mg AAT [28]. Ch­¬ng2. VËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. VËt liÖu Trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i sö dông h¹t gièng cña gièng cµ chua bi (hay cßn gäi lµ cµ chua ta hay cµ chua kiu) (Lycopersicum esculentum Mill var . Cerasiforme Alef) [15]. Cµ chua bi cã l¸ máng, qu¶ h×nh cÇu bÐ, mäc thµnh chïm, mçi chïm 3 - 5 qu¶ hoÆc h¬n. Lóc chÝn cã mµu ®á, vÞ chua h¬n so víi c¸c gièng cµ chua kh¸c . H×nh 2.1. C©y cµ chua dïng trong thÝ nghiÖm 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.2.1. Thu vµ xö lý mÉu - Chän nh÷ng qu¶ cµ chua chÝn ®á, kh«ng bÞ s©u bÖnh. Läc lÊy h¹t, lo¹i bá nh÷ng h¹t næi, ph¬i kh«. - Tr­íc khi cÊy h¹t vµo m«i tr­êng chóng t«i tiÕn hµnh khö trïng h¹t nh­ sau: TiÕn hµnh khö trïng b»ng cån 700 trong mét phót, röa b»ng n­íc cÊt. TiÕp tục khö trïng b»ng javen 60 % trong 20 phót, sau ®ã röa s¹ch b»ng n­íc cÊt v« trïng. - CÊy h¹t vµo m«i tr­êng n¶y mÇm, mËt ®é 15 h¹t / 1 b×nh m«i tr­êng. - T¸i sinh tõ th©n mÇm: Khi h¹t n¶y mÇm ®­îc 10 ngµy tuæi ch­a xuÊt hiÖn l¸ ®Çu tiªn, th©n mÇm ®­îc c¾t vµ chØ sö dông hai ®o¹n liªn tiÕp d­íi l¸ mÇm dµi kho¶ng 1 cm. Sau ®ã cÊy th©n mÇm vµo m«i tr­êng t¸i sinh, mËt ®é là 6 mÉu/1 b×nh m«i tr­êng. C¸c thao t¸c ®­îc tiÕn hµnh trong Box cÊy v« trïng. 2.2.2. M«i tr­êng nu«i cÊy - M«i tr­êng chóng t«i sö dông trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy lµ m«i tr­êng MS ( Murashige and Skoog 1962 ) (xem b¶ng phô lôc 1) cã bæ sung: §­êng sucrose: 15 g / l ®èi víi m«i tr­êng n¶y mÇm 30 g / l ®èi víi m«i tr­êng t¸i sinh c©y Agar: 9 g / l Nång ®é của c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng thay ®æi tuú môc ®Ých thÝ nghiÖm - §Ó nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t vµ kh¶ n¨ng t¸i sinh cña th©n mÇm, chóng t«i tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm sau. * ThÝ nghiÖm 1: ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t. Bæ sung BAP víi c¸c nång ®é: 0 mg / l; 1 mg / l; 2 mg / l; 3 mg / l; 4 mg/ l; 5 mg/ l * ThÝ nghiÖm 2: ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ kinetin lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t. Bæ sung BAP 0.2 mg/ l vµ kinetin víi c¸c nång ®é: 0 mg/l; 0.5 mg/l; 1 mg/l; 1.5 mg/l; 2 mg/l; 2.5 mg/l; 3 mg/l * ThÝ nghiÖm 3: ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ α-NAA lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t. Bæ sung α-NAA 0.2 mg/l vµ BAP víi c¸c nång ®é: 1 mg/l; 2 mg/l; 3 mg/l; 4 mg/l; 5 mg/l * ThÝ nghiÖm 4: ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh tõ th©n mÇm. Bæ sung BAP v¬Ý c¸c nång ®é: 0 mg/l; 0.25 mg/l; 0.5 mg/l; 0.75 mg/l; 1 mg/l M«i tr­êng nu«i cÊy ®­îc ®iÒu chØnh pH ë 5.6 - 5.8 b»ng HCl 0.1N hoÆc NaOH 0.1N. 2.2.3. §iÒu kiÖn thÝ nghiÖm Qu¸ tr×nh nu«i cÊy ®­îc tiÕn hµnh trong ®iÒu kiÖn cã chiÕu s¸ng 10h/ngµy, nhiÖt ®é nu«i cÊy kho¶ng 25 - 30 0C. 2.2.4. ChØ tiªu ®¸nh gi¸ Tæng sè h¹t n¶y mÇm Tû lÖ n¶y mÇm = * 100% Tæng sè h¹t cÊy vµo m«i tr­êng Tæng sè mÉu t¹o chåi Tû lÖ t¹o chåi = * 100% Tæng sè mÉu cÊy vµo m«i tr­êng Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. ¶nh h­ëng cña mét sè chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t 3.1.1. ¶nh h­ëng cña BAP §Ó tiÕn hµnh theo dâi ¶nh h­ëng cña BAP lªn qu¸ tr×nh n¶y mÇm cña h¹t, chóng t«i tiÕn hµnh cÊy h¹t trªn m«i tr­êng MS cã bæ sung ®­êng sucrose 15 g/l; agar 9g/l vµ BAP víi nång ®é thay ®æi: 0; 1; 2; 3; 4; 5mg/l. C¸c mÉu ®­îc nu«i trong ®iÒu kiÖn cã chiÕu s¸ng 10h/ngµy, nhiÖt ®é tõ 25 - 300C. Sau 10 ngµy quan s¸t ¶nh h­ëng cña BAP lªn tØ lÖ n¶y mÇm cña h¹t chóng t«i thÊy ë tÊt c¶ c¸c m«i tr­êng ®Òu cã h¹t n¶y mÇm víi tØ lÖ kh¸ cao. Trong ®ã ë m«i tr­êng cã bæ sung 3 mg/l BAP (C1-3) cã tØ lÖ h¹t n¶y mÇm cao nhÊt (77.8%). Tuy nhiªn, trªn m«i tr­êng kh«ng bæ sung BAP (C1-0) mÆc dï tØ lÖ n¶y mÇm chØ ®øng thø hai (60%) nh­ng c©y mäc trªn m«i tr­êng nµy cã ®é ®ång ®Òu cao vµ ph¸t triÓn tèt nhÊt. ChiÒu dµi c©y mÇm ®¹t tõ 5 - 6 cm, l¸ mÇm c©n ®èi, th©n mËp. Trong khi ë c¸c m«i tr­êng kh¸c chiÒu dµi c©y mÇm chØ kho¶ng 2- 4 cm, l¸ mÇm bÐ, th©n m¶nh. Nh­ vËy, nång ®é BAP ë møc võa ph¶i (3mg/l) cã thÓ thóc ®Èy kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t vµ cho tû lÖ n¶y mÇm cao nhÊt. Tuy nhiªn, ®Ó t¹o nguyªn liÖu cho nu«i cÊy sau nµy chóng t«i lùa chän m«i tr­êng C1-0 (m«i tr­êng kh«ng bæ sung BAP) v× khi cÊy h¹t ë m«i tr­êng nµy cho c©y mÇm cã c¸c ®Æc ®iÓm thÝch hîp cho viÖc nu«i cÊy sau nµy. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.1 vµ biÓu ®å 3.1 B¶ng 3.1. ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t KÝ hiÖu Nång ®é BAP (mg/l) Sè h¹t cÊy vµo Sè h¹t n¶y mÇm tØ lÖ(%) C1-0 0 45 27 60 C1-1 1 45 26 57.8 C1-2 2 45 23 51.1 C1-3 3 45 35 77.8 C1-4 4 45 24 53.3 C1-5 5 45 26 57.8 BiÓu ®å 3.1. ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t H×nh 3.1. H¹t n¶y mÇm ë m«i tr­êng C1-0 3.1.2. ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ kinetin §Ó tiÕn hµnh theo dâi ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ kinetin lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t chóng t«i tiÕn hµnh t­¬ng tù thÝ nghiÖm 1 cã bæ sung BAP 0.2 mg/l vµ kinetin víi c¸c nång ®é: 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 mg/l. Sau 10 ngµy quan s¸t thÊy ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ kinetin lªn tØ lÖ n¶y mÇm cña h¹t nh­ sau: ë tÊt c¶ c¸c m«i tr­êng cã tØ lÖ n¶y mÇm kh¸ ®ång ®Òu, sù chªnh lÖch tØ lÖ n¶y mÇm gi÷a c¸c m«i tr­êng kh«ng cao. TØ lÖ n¶y mÇm cao nhÊt lµ 64.4% ë m«i tr­êng cã bæ sung BAP 0.2 mg/l vµ kinetin 1 mg/l (C2-2). Tõ ®ã rót ra kÕt luËn: Sù phèi hîp cña BAP vµ kinetin cã t¸c ®éng kh¸ tèt lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t. Cã thÓ sö dông m«i tr­êng C2-2 (m«i tr­êng cã bæ sung 0.2mg/l BAP vµ 1mg/l kinetin) vµo viÖc t¹o nguån nguyªn liÖu tõ h¹t cho nu«i cÊy sau nµy. KÕt qu¶ thu ®­îc ë b¶ng 3.2 vµ biÓu ®å 3.2 B¶ng 3.2. ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ kinetin lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t KÝ hÖu Nång ®é BAP(mg/l) Nång ®é kinetin(mg/l) Sè h¹t cÊy vµo Sè h¹t n¶y mÇm TØ lÖ (%) C2-0 0.2 0 45 25 55.6 C2-1 0.2 0.5 45 26 57.8 C2-2 0.2 1 45 29 64.4 C2-3 0.2 1.5 45 23 51.1 C2-4 0.2 2 45 24 53.3 C2-5 0.2 2.5 45 24 53.3 C2-6 0.2 3 45 17 37.8 BiÓu ®å 3.2. ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ kinetin lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t H×nh3.2. H¹t n¶y mÇm ë c¸c m«i tr­êng C2 3.1.3. ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ α-NAA §Ó tiÕn hµnh theo dâi ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ α-Naa lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t chóng t«i bæ sung α-NAA 0,2mg/l vµ BAP víi nång ®é thay ®æi: 0mg/l; 1mg/l; 2mg/l; 3mg/l; 4mg/l; 5mg/l. Sau 10 ngµy quan s¸t chóng t«i thÊy ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ α-NAA lªn tû lÖ n¶y mÇm cña h¹t nh­ sau: Tû lÖ n¶y mÇm ë c¸c m«i tr­êng t­¬ng ®èi ®ång ®Òu, tû lÖ n¶y mÇm ®¹t cao nhÊt trªn m«i tr­êng cã bæ sung 0,2 mg/l α-NAA vµ 2mg/l BAP (57,8%). Cßn ë c¸c m«i tr­êng kh«ng bæ sung BAP (C3-0) hoÆc cã bæ sung BAP ë nång ®é cao 5mg/l (C3-5) chóng t«i ®Òu thÊy tû lÖ n¶y mÇm thÊp chØ ®¹t 37.8%. MÆt kh¸c, chóng t«i nhËn thÊy ë tÊt c¶ c¸c m«i tr­êng C3, c©y con thu ®­îc ®Òu cã th©n ng¾n, l¸ nhá, rÔ kh«ng ph¸t triÓn. Do ®ã, kh«ng thÝch hîp ®Ó sö dông lµm nguyªn liÖu cho viÖc t¸i sinh sau nµy. Nh­ vËy, sù phèi hîp cña BAP vµ α-NAA cã t¸c ®éng râ rÖt lªn sù n¶y mÇm cña h¹t. Vµ m«i tr­êng C3 kh«ng thÝch hîp cho viÖc t¹o nguyªn liÖu t¸i sinh tõ h¹t cµ chua. B¶ng 3.3. ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ α-NAA lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t Ký hiÖu Nång ®é α- NAA (mg/l) Nång ®é BAP (mg/l) Sè h¹t cÊy vµo Sè h¹t n¶y mÇm Tû lÖ(%) C3-0 0.2 0 45 17 37.8 C3-1 0.2 1 45 23 51.1 C3-2 0.2 2 45 26 57.8 C3-3 0.2 3 45 24 53.3 C3-4 0.2 4 45 21 46.7 C3-5 0.2 5 45 17 37.8 BiÓu ®å 3.3. ¶nh h­ëng phèi hîp cña BAP vµ α-NAA lªn kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña h¹t H×nh 3.3. H¹t n¶y mÇm ë c¸c m«i tr­êng C3 3.2. ¶nh h­ëng cña kÝch thÝch sinh tr­ëng lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y §Ó tiÕn hµnh nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y, chóng t«i c¾t nh÷ng ®o¹n th©n d­íi l¸ mÇm thµnh nh÷ng mÈu ng¾n kho¶ng 1cm sau ®ã cÊy mÉu th©n mÇm trªn m«i tr­êng MS cã bæ sung sucrose 30g/l; agar 9g/l vµ BAP víi c¸c nång ®é thay ®æi 0 mg/l; 0.25 mg/l; 0.5 mg/l; 0.75 mg/l; 1 mg/l. Qua ®ã, chóng t«i muèn t×m hiÓu ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y tõ th©n mÇm. Sau ba tuÇn nu«i cÊy chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ (®­îc thÓ hiÖn ë b¶ng 3.4 vµ biÓu ®å 3.4) nh­ sau: Tû lÖ t¹o chåi vµ sè chåi ®­îc t¹o thµnh ë c¸c m«i tr­êng cã sù sai kh¸c ®¸ng kÓ. Trong ®ã, tû lÖ mÉu t¹o chåi ®¹t gi¸ trÞ cao nhÊt ë m«i tr­êng MS cã bæ sung 0.5mg/l BAP( 86.6%) vµ thÊp nhÊt ë m«i tr­êng MS cã bæ sung 1mg/l BAP . Tõ kÕt qu¶, ®ã chóng t«i kÕt luËn m«i tr­êng thÝch hîp nhÊt ®Ó t¸i sinh chåi tõ th©n mÇm lµ m«i tr­êng R3 ( m«i tr­êng cã bæ sung 0.5mg/l BAP). B¶ng 3.4. ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y KÝ hiÖu Nång ®é BAP (mg/l) Tû lÖ mÉu t¹o chåi (%) Sè chåi ®­îc t¹o thµnh R1 0 80,0 19 R2 0,25 55,5 15 R3 0,5 86,6 18 R4 0,75 80,0 27 R5 1 50,0 15 BiÓu ®å 3.4. ¶nh h­ëng cña BAP lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y H×nh 3.4. C¸c mÉu t¸i sinh tõ m«i tr­êng R3 KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ KÕt luËn Dùa vµo sè liÖu thu ®­îc vµ kÕt qu¶ ph©n tÝch ë trªn, chóng t«i rót ra nh÷ng kÕt luËn sau: C¸c nång ®é BAP kh¸c nhau trong m«i tr­êng nu«i cÊy cã ¶nh h­ëng kh¸c nhau lªn tû lÖ n¶y mÇm cña h¹t cµ chua. Trong ®ã, ë nång ®é 3mg/l BAP trong m«i tr­êng MS cho tû lÖ n¶y mÇm cao nhÊt (77.8%). Sù phèi hîp cña BAP vµ kinetin ë c¸c nång ®é kh¸c nhau cã ¶nh h­ëng râ rÖt lªn tû lÖ n¶y mÇm cña h¹t. Trong ®ã ë nång ®é phèi hîp 0.2 mg/l BAP vµ 1mg/l kinetin trong m«i tr­êng MS cho tû lÖ n¶y mÇm cao nhÊt (64.4%). Sù phèi hîp cña BAP vµ α -NAA ë nång ®é 0.2 mg/l α -NAA vµ 2 mg/l BAP trong m«i tr­êng MS cho tû lÖ n¶y mÇm cao nhÊt (57.8%). M«i tr­êng R3 ( MS + 0.5mg/l BAP) lµ m«i tr­êng thÝch hîp cho t¸i sinh chåi tõ th©n mÇm cµ chua. §Ò nghÞ Do cßn h¹n chÕ vÒ thêi gian vµ ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm, chóng t«i ®­a ra mét sè kiÕn nghÞ sau: + Kh¶o s¸t kh¶ n¨ng t¸i sinh tõ l¸ mÇm. + T×m hiÓu ¶nh h­ëng cña tuæi th©n mÇm vµ l¸ mÇm lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh. + TiÕp tôc nghiªn cøu vµ hoµn thiÖn quy tr×nh t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh ®Ó phôc vô cho viÖc chuyÓn gen th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumfaciens sau nµy. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu tiÕng ViÖt 1. Lª TrÇn B×nh, Hå H÷u NhÞ, Lª ThÞ Muéi, C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¶i tiÕn gièng c©y trång, NXB N«ng nghiÖp, 1997. 2. T¹ Thu Cóc, Kü thuËt trång cµ chua, NXB N«ng nghiÖp, 2002. 3. §­êng Hång DËt, Sæ tay ng­êi trång rau, NXB Hµ Néi, 2002. 4. Hå Huúnh Thuú D­¬ng, Sinh häc ph©n tö, NXB Gi¸o dôc, 2005. 5. TrÞnh §×nh §¹t, C«ng nghÖ sinh häc, tËp 4, c«ng nghÖ di truyÒn , NXB Gi¸o dôc 2006. 6. Lª TrÇn §øc, C©y thuèc ViÖt Nam, NXB N«ng nghiÖp, 1997. 7. Ph¹m ThÞ H¹nh, Lª TÊn §øc, NguyÔn H÷u Hå, NguyÔn V¨n UyÓn, Kh¶o s¸t kh¶ n¨ng t¸i sinh in vitro c©y c¶i ngät (Brassica integrifolia) tõ l¸ mÇm vµ trô mÇm phôc vô cho nghiªn cøu chuyÓn gen, Nh÷ng vÊn ®Ò nghiªn cøu c¬ b¶n trong khoa häc sù sèng, NXB Khoa häc vµ Kü thuËt, 2005, trang 498 - 500. 8. NguyÔn Nh­ HiÒn, C«ng nghÖ sinh häc, tËp 1, Sinh häc ph©n tö vµ tÕ bµo- c¬ së khoa häc cña c«ng nghÖ sinh häc, NXB Gi¸o dôc, 2007. 9. Ph¹m Thµnh Hæ, Di truyÒn häc, NXB Gi¸o dôc, 2006. 10. James Clive (2006), Tãm t¾t b¸o c¸o ®¸nh gi¸ vÒ t×nh tr¹ng c©y trång c«ng nghÖ sinh häc, c©y trång chuyÓn gen ®­îc ®­a vµo canh t¸c víi môc ®Ých th­¬ng m¹i trªn thÕ giíi trong n¨m 2006, C¬ quan dÞch vô quèc tÕ vÒ tiÕp thu c¸c øng dông c«ng nghÖ sinh häc trong n«ng nghiÖp ISAAA. 11. NguyÔn Träng L¹ng, Chu Hoµng MËu, NguyÔn ThÞ T©m, Sinh häc tÕ bµo, NXB N«ng nghiÖp, 2005. 12. Hoµng Minh, Kü thuËt trång vµ ch¨m sãc d­a hÊu, bÝ ngåi, cµ chua, ng«, NXB Lao ®éng X· héi, 2005. 13. Tr­¬ng ThÞ BÝch Ph­îng, Hå ThÞ Kim Kh¸nh, NguyÔn H÷u §æng, ¶nh h­ëng cña Mannitol ®Õn tÝch luü prolin vµ glucose liªn quan ®Õn kh¶ n¨ng ®iÒu chØnh thÈm thÊu trong nu«i cÊy callus cµ chua, T¹p chÝ di truyÒn häc vµ øng dông, sè 1 , 2003. 14. NguyÔn §øc Thµnh, ChuyÓn gen ë thùc vËt, NXB Khoa häc vµ Kü thuËt, 2003. 15. TrÇn Kh¾c Thi, Kü thuËt trång rau s¹ch - Rau an toµn vµ chÕ biÕn rau xuÊt khÈu, NXB Thanh Ho¸, 2005. 16. Chu ThÞ Th¬m, Phan ThÞ Lµi, NguyÔn V¨n Tã, øng dông c«ng nghÖ sinh häc trong s¶n xuÊt vµ ®êi sèng , NXB Lao ®éng, 2006. 17. Ph¹m ThÞ Lý Thu, Lª Huy Hµ, Ph¹m Minh Th¬i, §ç N¨ng VÞnh, Nghiªn cøu x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh sö dông cho biÕn n¹p gen ë ng«, Héi nghÞ c«ng nghÖ sinh häc toµn quèc, NXB Khoa häc vµ Kü thuËt, 2003, trang 820- 824. 18. Phan H÷u T«n, Gi¸o tr×nh c«ng nghÖ sinh häc trong chän t¹o gièng c©y trång, Tr­êng §H N«ng nghiÖp I, 2005. 19. NguyÔn V¨n Viªn, §ç TÊn Dòng, BÖnh h¹i cµ chua do nÊm, vi khÈn vµ biÖn ph¸p phßng chèng, NXB N«ng nghiÖp, 2004. 20. Vò V¨n Vô, NguyÔn Méng Hïng, Lª Hång §iÖp, C«ng nghÖ sinh häc, tËp 2, C«ng nghÖ sinh häc tÕ bµo, NXB Gi¸o dôc, 2006. 21. Vò V¨n Vô, Vò Thanh T©m, Hoµng Minh TÊn, Sinh lý häc thùc vËt, NXB Gi¸o dôc,2007. 22. NguyÔn Thị H¶i YÕn, Nghiªn cøu hoµn thiÖn hÖ thèng chuyÓn gen ë lóa, LuËn v¨n th¹c sÜ Khoa häc Sinh häc, 2004. 23. Sæ tay kü thuËt th©m canh rau ë ViÖt Nam, NXB V¨n ho¸ D©n téc, 2005. Tµi liÖu tiÕng Anh vµ Internet 24. Haiyan Yu, Reserch on ABT and GGR International Application and Cooperation, China Forestry Publishing House Beijing, 2002. 25. Naroyanaswamys, Plant cell and tissue culture, Tataca Mc. Graw Hill. Publishing company limited, New Delhi, 1994. 26. Pierick R.L.M, In vitro Culture of highter plant, 1998. 27. Smith R.H, Plant tissue culture. Departmen of soil and Crop Science, 1992. 28. http:// www.springerlink.com/content/053336v077647j05