Khóa luận Xác định gene liên quan đến tính kháng virus PMWaV - Pineapple mealybug wilt associated virus - gây bệnh héo đỏ đầu lá trên giống dứa Cayenne bằng phương pháp PCR thoái hoá (degenerated PCR)

hân hủy bởi các tác nhân cơ hay hóa học. Một quy trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bƣớc cơ bản: Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein, polysaccharide. 32 Bƣớc 3: Tủa DNA. Thông thƣờng, cần phải tiến hành nhiều quy trình với nhiều thí nghiệm để có đƣợc quy trình ly trích nucleic acid ổn định, đáp ứng đƣợc về lƣợng và độ tinh sạch phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu. 2.6. Định lƣợng DNA Sau khi tinh sạch, để kiểm tra số lƣợng và chất lƣợng mẫu li trích ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp nhƣ: đo mật độ quang, siêu ly tâm, sắc kí, điện di… Trong đó, định lƣợng DNA bằng phân tử Mass dựa trên kỹ thuật điện di là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện nhất, có thể đáp ứng đƣợc việc phân tích mẫu cho các thí nghiệm kế tiếp một cách tƣơng đối. Phƣơng pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lƣợng so với band của phân tử Mass. Mẫu định lƣợng cần phải đƣợc pha loãng một lần, hai lần, ba lần, …, n lần. Sau đó, các mẫu pha loãng đƣợc kiểm tra bằng điện di và đƣợc so sánh với phân tử Mass. Khi xác định đƣợc sự tƣơng quan về kích thƣớc và độ sáng giữa các band, từ đó, xác định đƣợc nồng độ của mẫu pha loãng. Với hệ số pha loãng có thể dễ dàng tính đƣợc nồng độ mẫu gốc. Những hiểu biết về định lƣợng DNA bằng phân tử Mass sẽ là cơ sở cho việc định lƣợng, pha loãng mẫu sử dụng cho các phân tích tiếp theo trong nghiên cứu. 2.7. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phƣơng pháp PCR là phƣơng pháp khuếch đại nhanh, nhiều các bản sao của đoạn DNA mục tiêu mà không cần phải qua tạo dòng. Phƣơng pháp này đƣợc K. Mullis đƣa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phƣơng pháp đƣợc thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA. 2.7.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp PCR chủ yếu dựa trên khả năng nhân đôi, biến tính, và hồi tính theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại đƣợc thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại cùng với sự hoạt động của DNA polymerase. 33 Phản ứng PCR gồm có nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1 (biến tính - denaturation): nhiệt độ đƣợc nâng lên 92 - 100oC. Ở nhiệt độ này, các mạch xoắn kép của DNA tách ra. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn 2 (bắt cặp - hybridization): nhiệt độ đƣợc hạ nhanh xuống khoảng từ 50 – 60oC, phụ thuộc vào Tm của primer. Ở nhiệt độ này hai primer sẽ bắt cặp bổ sung với hai sợi DNA cùng theo hƣớng 5’ – 3’. Giai đoạn này cũng kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn 3 (kéo dài - extension): nhiệt độ đƣợc nâng lên 68 - 72oC. Ở nhiệt độ này DNA - polymerase hoạt động để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 primer đƣợc tổng hợp. Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 đoạn khuôn mẫu sẽ tạo ra đƣợc 2 đoạn DNA mới. Và cứ thế, sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lƣợng DNA mẫu của lần trƣớc. Hình 2.13. Quá trình của phản ứng PCR. Chú thích: (1): biến tính; (2): bắt cặp; (3): kéo dài; (4): hoàn thành một chu kỳ; (P): DNA - polymerase. 34 2.7.2. Thành phần và các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 2.7.2.1. DNA khuôn DNA khuôn chứa trình tự cần khuếch đại có vai trò rất quan trọng, ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng PCR diễn ra tối ƣu với các DNA khuôn hoàn toàn tinh sạch. 2.7.2.2. Dung dịch đệm (buffer) Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase đƣợc dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, gelatin và Tris - HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng). 2.7.2.3. MgCl2 Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Cụ thể, Mg2+ làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thƣờng biến thiên trong khoảng từ 0,5 - 5 mM. Nồng độ MgCl2 từ 1,5 – 2 mM thƣờng đƣợc xem là tối ƣu. 2.7.2.4. Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTP gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 – 200 µM mỗi nucleotide. Điều quan trọng là phải giữ cho nồng độ của cả 4 loại dNTP bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. 2.7.2.5. Primer Primer là một oligonucleotide thƣờng có chiều dài từ 20 – 30 nucleotide. Đây là yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu quả cũng nhƣ độ chuyên biệt của phản ứng PCR. 2.7.2.6. Taq – polymerase Là một DNA polymerase chịu nhiệt, đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ƣu ở 68 - 72oC. 35 Nồng độ enzyme Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0,5 - 5 unit/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lƣợng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn 2.7.2.7. Nhiệt độ bắt cặp Phản ứng PCR rất nhạy cảm với nhiệt độ, đặc biệt là với nhiệt độ bắt cặp của mồi. Vì thế bất cứ sự thay đổi nào của yếu tố này cũng có thể ảnh hƣớng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt. Thông thƣờng, số base của primer càng ít, nhiệt độ này càng thấp và ngƣợc lại. 2.7.2.8. Số chu kỳ của phản ứng PCR Số chu kỳ cho một phản ứng tùy thuộc vào số lƣợng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lƣợng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lƣợng bản mẫu là 102 – 103 thì số lƣợng chu kỳ là 35 – 40. 2.8. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong cùng một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền. Do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là tính đa dạng di truyền. Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Ngƣời ta thƣờng tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra đƣợc sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị. Có 3 loại chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng: Chỉ thị hình thái. Chỉ thị isozyme. Chỉ thị phân tử. 36 2.9. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.9.1. Enzyme cắt giới hạn Trong phân tích genome, restriction endonuclease (RE) là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng. Đó là nhóm của DNase, ghi nhận và cắt DNA tại tại vị trí chuyên biệt gọi là điểm giới hạn theo hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le. Hiện nay, đã có rất nhiều enzyme cắt giới hạn đƣợc phát hiện và đƣợc chia làm 3 loại: Loại I: gồm các enzyme giới hạn nhận biết đƣợc trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn), di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide cắt tại đó và giải phóng khoảng vài chục nucleotide. Loại II: gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Đây là loại thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp. Loại III: gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trƣớc. Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lƣợng và kích thƣớc đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số lƣợng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn. Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. 2.9.2. Nguyên tắc của phƣơng pháp RFLP Phƣơng pháp RFLP – đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn (restriction enzyme), là phƣơng pháp tạo nên các đoạn cắt khác nhau, phân biệt đƣợc bằng kỹ thuật điện di. Các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các fingerprinting đặc trƣng cho từng phân tử DNA. Xử lý các mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn, các gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lƣợng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, còn những gen có cấu trúc hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. 37 RFLP thƣờng đƣợc sử dụng để nghiên cứu genome và cơ chất thƣờng là DNA tổng số. Tuy nhiên, với mục đích phân biệt chỉ trên một vùng gene nào đó, ngƣời ta kết hợp cả hai phƣơng pháp RFLP và PCR bằng cách phân cắt enzyme trực tiếp trên sản phẩm PCR trên vùng gene đó. Quy trình phƣơng pháp RFLP dựa trên PCR (phƣơng pháp RFLP-PCR): Tách chiết DNA tổng số. Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã đƣợc cắt. 38 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Nội dung Khoá luận đƣợc thực hiện với 3 nội dung sau: Nội dung 1: Lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne. Nội dung 2: Phân lập vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập. Nội dung 3: Phân tích RFLP vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập. 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 01/2007 đến tháng 09/2007 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng và Trại thực nghiệm bảo vệ thực vật, khoa Nông học Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Vật liệu chủng bệnh 3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm Nguồn dứa nuôi cấy mô sạch bệnh đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ sinh học, 4 tháng tuổi, cao 15 cm, có 9 lá. Nguồn dứa ngoài đồng đƣợc thu thập là những cây có và không có biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá trên cả 3 giống Lâm Đồng, Thái Lan, Trung Quốc tại nông trƣờng Phạm Văn Hai, xã Phạm Văn Hai, huyện Bình Chánh, Tp. Hồ Chí Minh. 3.2.1.2. Dụng cụ chủng bệnh Rệp sáp đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa nông học. Bí đỏ, mỗi trái nặng khoảng 2 kg. Thùng giấy. Đèn 5 W. Kéo. Cọ vẽ. Kính lúp. 39 Cân phân tích 2 số. 3.2.2. Hoá chất và vật liệu dùng trong li trích DNA tổng số và PCR 3.2.2.1. Hoá chất Hoá chất li trích DNA tổng số Nitơ lỏng. Dung dịch EB (extraction buffer): CTAB 2% w/v. NaCl 1,4 M. Tris – HCl 100 mM pH 8.0. EDTA 20 mM. PVP 2%. β – mercaptoethanol 0,1 % v/v. Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Isopropanol. Ethanol 70%. Dung dịch TE: Tris – HCl pH 8,0 10 mM. EDTA 1 mM. Hoá chất PCR Taq polymerase (Promega). Taq buffer (Promega). MgCl2 (Promega). dNTP mix (Promega). Nƣớc cất 2 lần, hấp khử trùng và chiếu UV. Primer (IDT, Invitrogen). 40 Hoá chất điện di Agarose (Bio-rad). Dung dịch TAE 0,5X. DNA ladder 100 – 3000 bp (Bio-rad). Loading dye 6X. Ethidium bromide. 3.2.2.2. Dụng cụ Chén sứ và chày giã (Đức, Trung Quốc). Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ, Italia). Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ). Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh). Pipette các loại (Bio-Rad, Biohit). Đầu típ các loại (Đức, Italia). Máy siêu ly tâm (Hettich –Đức). Máy luân nhiệt (Biorad, Eppendoft). Bộ dụng cụ điện di (bồn điện di, khay, lƣợc đổ gel) (Bio-Rad). Máy chụp Geldoc (Bio-rad). Lò Viba (Electrolux). Máy định ôn (MemMert –Đức). Tủ lạnh các loại (Sanyo –Nhật). Máy votex (Đức). Găng tay (Malaysia). Nồi hấp autoclave (Nhật) Tủ sấy. 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 1: Lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne. Tiến hành lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá từ những cây đã biểu hiện triệu chứng bệnh rõ ràng sang cây dứa Cayenne sạch bệnh thông qua tác nhân lây truyền là rệp 41 sáp. Những cây có và không biểu hiện bệnh trên nguồn dứa đƣợc chủng và nguồn dứa ngoài đồng ở cả ba giống Lâm Đồng, Thái Lan, Trung Quốc đƣợc thu thập để tiến hành các thí nghiệm ở Nội dung 2. 3.3.1.1. Nuôi rệp Bí mua về rửa sạch, để khô. Lựa chọn những con rệp sáp trƣởng thành, cấy từ 30 - 50 con/quả, cân trọng lƣợng của rệp trƣớc khi cấy. Đặt những quả bí đã cấy rệp vào thùng kín đã chuẩn bị (có lót giấy để hút nhƣạ chảy ra từ quả bí). Rệp sáp phát triển mạnh trong điều kiện ánh sáng yếu hoặc tối, ẩm độ từ 65 - 70%, nhiệt độ từ 25 - 28 o C. Sử dụng máy điều hoà nhiệt độ để điều khiển ẩm độ và nhiệt độ nhƣ mong muốn, quạt thông gió để hạn chế sự xếp tầng của không khí và giúp không khí lƣu thông dễ dàng. Hình 3.1. Chuyển rệp lên bí Tiến hành cân trọng lƣợng của rệp sáp đã phát triển trên quả bí định kỳ. Khối lƣợng rệp đƣợc định lƣợng một cách tƣơng đối trên bí bằng cách cân số rệp đƣợc quét từ 3 vị trí khác nhau trên quả bí. Lấy trung bình của 3 trọng lƣợng này nhân với tỷ số giữa diện tích của quả bí và trung bình diện tích của 3 vị trí quét rệp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại trên 3 quả bí. 42 3.3.1.2. Lây nhiễm bệnh Chuyển rệp lên dứa bệnh Chọn những cây dứa có biểu hiện triệu chứng bệnh nhƣng vẫn còn tƣơi đủ để hấp dẫn rệp. Rệp đƣợc chuyển lên dứa bệnh bằng hai cách: - Chuyển rệp bằng đèn Dùng ánh sáng từ đèn 5 W để dẫn dụ rệp tự di chuyển sang cây dứa bệnh. Cây dứa đã cắt bớt lá đƣợc đặt trong thùng giấy, phía dƣới đèn. Bí đã có rệp phát triển đƣợc đặt xung quanh cây dứa. Thùng phải kín để đảm bảo ánh sáng phát ra từ đèn là duy nhất. Hình 3.2. Chuyển rệp bằng đèn - Chuyển rệp trực tiếp Rệp đƣợc chuyển bằng cách quét trực tiếp lên dứa bệnh bằng cọ mềm. Quan sát định kỳ để theo dõi mức độ di chuyển và phát triển của rệp trong một tuần. Chuyển rệp lên dứa sạch bệnh. - Trồng và chăm sóc dứa Các cây đƣợc trồng thành luống, giống nhau về điều kiện sinh trƣởng, trồng theo kiểu nanh sấu, cách nhau 0,4 m trên luống 12 m x 1,5 m x 0,2 m. Chăm sóc theo hƣớng dẫn của Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải. - Chuyển rệp từ dứa bệnh lên dứa sạch bệnh 43 Dứa bệnh đã có rệp phát triển đƣợc cắt thành nhiều mảnh nhỏ (có rệp ở trên). Đặt các mảnh này lên cây dứa sạch bệnh ở vị trí gốc lá gần sát mặt đất. Sau khi thả rệp, định kỳ kiểm tra sự hiện diện và đếm số rệp trên dứa 2 tuần/lần. 3.3.1.3. Thu thập mẫu Chọn những cây dứa biểu hiện bệnh và không biểu hiện bệnh wilt trên cả hai nguồn dứa Cayenne, cây cấy mô chủng bệnh và ngoài đồng (trên cả 3 giống). Sau khi đã chọn mẫu, tiến hành lấy mẫu lá. Lấy khoảng 7 - 9 lá còn non hay 3 lá đã trƣởng thành, không lấy lá đã già, cắt bỏ phần ngọn, lau sạch rồi cho vào túi nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và giữ mát trong thùng đá. Sau đó, mẫu đƣợc đem giữ ở tủ -20oC tại Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng thuộc Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.3.2. Nội dung 2: Phân lập vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập. Những mẫu dứa thu thập trong Nội dung 1 sẽ đƣợc phân tích tại Phòng Công nghệ sinh học thực vật, Viện Nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trƣờng, ĐH Nông Lâm qua các kỹ thuật ly trích DNA tổng số và PCR thoái hoá. 3.3.2.1. Ly trích DNA tổng số Lá dứa Cayenne từ các mẫu thu thập đƣợc cắt ra thành từng mảnh nhỏ. Phần lá đƣợc dùng để ly trích DNA không quá non cũng không quá già (phần cách gốc lá khoảng 3 cm). Quy trình ly trích DNA đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Doyle (1990) nhƣ sau: Bƣớc 1: Nghiền 0,5 g lá đã rửa sạch trong nitơ lỏng thành bột mịn. Bƣớc 2: Thêm vào 1 ml dung dịch CTAB đã đun nóng ở 65oC, votex đều và đem ủ ở 65oC trong 1h. Bƣớc 3: Ly tâm 10 phút (5000 vòng/phút, 4oC), hút lấy dịch trong. Bƣớc 4: Thêm 500 μl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), lắc đều, li tâm 15 phút (11.000 vòng/phút 4oC), hút lấy dịch trong. Bƣớc 5: Thêm vào dung dịch isopropanol lạnh một lƣợng tƣơng đƣơng 2/3 thể tích dịch trong. Để tủa ở -20oC trong khoảng 1 h (nên để qua đêm). Bƣớc 6: Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, 4oC). 44 Bƣớc 7: Đổ bỏ dịch trong, thêm vào 400 μl ethanol 70% lạnh. Bƣớc 7: Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, 4oC). Bƣớc 8: Đổ bỏ dịch, làm khô tự nhiên trong 1 h. Bƣớc 9: Cho vào 30 μl TE 1X, ủ ở 37oC trong 1 h. Bảo quản ở -20oC. Mẫu DNA sau khi đƣợc ly trích đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose. Cách thức tiến hành nhƣ sau: Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò viba ở bƣớc sóng 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 60oC. Đổ gel vào khuôn đã cắm lƣợc tạo giếng, chờ gel đông. Cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5 X. Bơm mẫu vào các giếng với tỷ lệ 1 l loading dye : 2 l DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml khoảng 15 phút, vớt ra, rửa lại nhiều lần với nƣớc. Chụp ảnh kết quả điện di bằng máy Gel doc thông qua phần mềm Quantity One. 3.3.2.2. Pha loãng mẫu DNA tổng số Sản phẩm ly trích DNA đƣợc định lƣợng sơ bộ bằng phƣơng pháp định lƣợng theo phân tử Mass. Tuy nhiên, do không có phân tử Mass nên chúng tôi sử dụng DNA ladder với nồng độ 400 ng mỗi band nếu sử dụng 2 μl cho mỗi giếng trên gel điện di theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Bio-rad). Để định lƣợng, chúng tôi tiến hành điện di tất cả các mẫu li trích (tỷ lệ mẫu : loading dye là 1 : 2) và DNA ladder (tỷ lệ ladder : loading dye là 2 : 2). Dựa vào quan sát và đánh giá, tiến hành pha loãng mẫu về hàm lƣợng phù hợp với phƣơng pháp PCR thoái hoá. 3.3.2.3. Tối ƣu phƣơng pháp PCR thoái hoá Theo khảo sát, phƣơng pháp PCR chƣa từng đƣợc áp dụng trên đối tƣợng là cây dứa, đặc biệt là dứa Cayenne. Vì vậy, một giải pháp đƣợc cho là có tính khả thi là sử dụng những cặp primer thoái hoá đã đƣợc thiết kế và chứng minh là cho hiệu quả 45 khuếch đại cao trên nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhƣ đậu nành (Kanazin, 1996), chuối (Georgio), cây có múi (Z. Deng, 2000), khoai tây (Linden)...Chi tiết về các primer đƣợc chọn thể hiện qua Bảng 3.1. Bảng 3.1. Các primer thoái hoá sử dụng trong nghiên cứu Tên primer Trình tự Motif Ta ( o C) Độ thoái hoá Sản phẩm ( bp) Tác giả LM638 5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’ P-loop 50 0 500 Kanazin LM637 5'-ARIGCTARIGGIARICC-3’ GLPL 50 8 F11 5´-GGDGTDGGNAARACWAC- 3’ P-loop 50 144 500 Z. Deng R11 5´-AGI GCHAGNGGNAGNCC-3’ GLPL 50 192 R16 5´-AGNGCHAGNGGYAANCC-3’ GLPL 50 384 TIR1 5’- GGTATGGGTGGTGTTGGTAAR ACNACN-3’ TIR 66 32 300 Xitao Wei TIR2 5’- GGTATGGGTGGTGTTGGTAAR ACNACN-3’ TIR 67 32 (I - inosine - một purine, xuất hiện trong cấu trúc tự nhiên của tRNA, có thể bắt cặp với cytidine, thymidine adenosine). Tạo thành các cặp primer: (LM638, LM637), (F11, R11), (F11, R16), (TIR1,TIR2). Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện ban đầu cho phản ứng PCR Thí nghiệm này đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu xác định thành phần phản ứng và chu trình nhiệt để PCR thoái hoá cho sản phẩm trên gel điện di. Cách tiến hành : Thực hiện theo quy trình của Z. Deng và cs (2000), thành phần hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt độ của Thí nghiệm 1 đƣợc trình bày trong Bảng 3.2. Thực hiện PCR với 4 cặp primer: (LM638, LM637); (F11, R11); (F11, R16); (TIR1, TIR2) trên mẫu cho kết quả li trích tốt nhất. Kết quả PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 2%, chạy điện di với tỉ lệ mẫu:loading dye là 5:2 ở điều kiện 50 V, 250 mA trong 70 phút. Chỉ tiêu theo dõi: sự xuất hiện band điện di với kích thƣớc khoảng 500 bp 46 Bảng 3.2. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR theo Z. Deng và cs (2000). Thành phần (25μl/ống) Chu trình nhiệt Taq buffer 1X MgCl2 2 mM dNTPs 800 µM Primer 25 µM mỗi loại DNA mẫu 150 ng Taq polymerase 1 unit Nƣớc vừa đủ 25 μl. 92 o C – 2 phút. Lặp lại 42 chu kỳ: 92 o C – 1 phút; 50 o C – 1 phút 72 o C – 2 phút. 72 o C – 5 phút. Giữ 4oC. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR Do kết quả PCR chịu ảnh hƣởng của rất nhiều yếu tố nên chúng tôi thực hiện việc tối ƣu dựa trên nhiều chỉ tiêu và thông số để tìm kết quả tốt nhất. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên mẫu li trích tốt nhất. Chỉ tiêu theo dõi là độ sáng và rõ của band kháng chính (khoảng 500 bp). Nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm trƣớc đƣợc áp dụng cho thí nghiệm sau. Chi tiết các phản ứng tối ƣu PCR thoái hoá đƣợc trình bày trong Bảng 3.3. Bảng 3.3. Một số chỉ tiêu và các mức tiến hành tối ƣu phản ứng PCR thoái hoá Tên thí nghiệm Chỉ tiêu tối ƣu Các mức tiến hành TN 2.1 Loại primer (LM637, LM638), (F11, R11), (F11, R16), (TIR1, TIR2) TN 2.2 Nồng độ primer 1, 2, 3 pm/μl TN 2.3 Nồng độ dNTP 150, 200, 300 μM TN 2.4 Nồng độ Mg2+ 1; 1,5; 2 mM TN 2.5 Nồng độ Taq polymerase 0,5; 1; 1,5 unit/25μl TN 2.6 Nhiệt độ bắt cặp 47, 50, 53oC TN 2.7 Số chu kỳ 37, 40, 45 Chú thích: TN - Thí Nghiệm 47 3.3.2.4. Reampify sản phẩm PCR Mục đích của thí nghiệm nhằm làm sạch hơn (giảm độ smear) sản phẩm PCR lần thứ nhất để sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Cách tiến hành: Sử dụng dung dịch sản phẩm PCR lần thứ nhất (2 μl) với vai trò làm DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR thoái hoá theo quy trình đã tối ƣu. Chỉ tiêu theo dõi: độ sáng và rõ của band kháng chính trên gel điện di. 3.3.2.5. PCR thoái hoá trên các mô khác nhau Mục đích của thí nghiệm là khảo sát khả năng nhân bản của phƣơng pháp PCR thoái hoá vùng gene NBS trên các loại mô khác nhau. Phƣơng pháp tiến hành: ly trích và thực hiện phản ứng PCR trên 3 loại mô: rễ, thân và lá của cây dứa Cayenne không có biểu hiện của triệu chứng bệnh. Phƣơng pháp ly trích và PCR đƣợc tiến hành theo quy trình đã tối ƣu. Chỉ tiêu theo dõi: độ sáng rõ của các band ở cả 3 mẫu: lá, thân và rễ. 3.3.2.6. PCR thoái hoá phân lập vùng NBS trên các mẫu dứa thu thập Thực hiện phản ứng PCR thoái hoá trên 9 mẫu dứa Cayenne thu thập theo quy trình đã tối ƣu. Chỉ tiêu khảo sát: sự hiện diện của band kháng chính trên gel điện di của từng mẫu. 3.3.2.7. Giải trình tự sản phẩm PCR thoái hoá Mục đích: phân tích tính nhạy cảm và không nhạy cảm với bệnh wilt của cây dứa Cayenne dựa vào sự khác biệt về trình tự DNA của vùng gene NBS. Cách tiến hành: Lựa chọn 2 mẫu có biểu hiện triệu chứng nhiễm rõ đối với bệnh héo đỏ đầu lá và 2 mẫu không biểu hiện bệnh (dự tuyển cho tính kháng). Thực hiện li trích, PCR thoái hoá và reamplify theo quy trình đã tối ƣu. Kiểm tra độ sạch của sản phẩm reamplify bằng điện di và gửi mẫu giải trình tự tại Viện Pasteur, TP. Hồ Chí Minh. 48 3.3.3. Nội dung 3: Phân tích RFLP vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập. Nội dung đƣợc tiến hành với mục đích khảo sát sự đa hình của sản phẩm PCR thoái hoá từ các mẫu dứa Cayenne thu thập. Kết quả của thí nghiệm sẽ là cơ sở cho việc xác định marker định vị trên vùng gene NBS. Sản phẩm PCR thoái hoá đƣợc phân cắt bởi enzyme Hind III. Phản ứng cắt đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Ủ khoảng 1 g DNA đã đƣợc khuếch đại với 1 unit enzyme cắt theo điều kiện nhà sản xuất (Roche) hƣớng dẫn. Thành phần của phản ứng thể hiện trong Bảng 3.5. - Những đoạn DNA đã cắt đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose 0,8%, 140V trong 60 phút. Sau đó, gel đƣợc nhuộm ethidium bromide. Đọc kết quả và chụp hình dƣới tia UV. Bảng 3.4. Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích Buffer DNA Restriction enzyme Nƣớc cất vô trùng 10X 100 – 150 ng 10 UI 2,5 l 6 – 10 l 0,1 l Vừa đủ thể tích 25 l 49 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nội dung 1: Lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne. 4.1.1. Nuôi rệp Kết quả nuôi rệp thể hiện qua Bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả nuôi rệp Chú thích: KL – khối lƣợng Sự phát triển của rệp theo thời gian đƣợc thể hiện qua Biểu đồ 4.1 và Hình 4.1. sự phát triển của rệp 0 10 20 30 bd 30 45 55 thời gian (ngày) kh ối lư ợ ng r ệp (g ) bí đỏ 1 bí đỏ 2 bí đỏ 3 Biểu đồ 4.1. Sự phát triển của rệp theo thời gian STT KL bắt đầu cấy KL rệp sau 30 ngày KL rệp sau 45 ngày KL rệp sau 55 ngày KL Bí KL Rệp 1 506g 0,15g 12,2g 18,6g 6,7g 2 512g 0.15g 13,2g 18,2g 6,5g 3 612g 0.15g 14g 19,3g 8,2g 50 Hình 4.1. Sự phát triển của rệp trên bí đỏ sau 45 ngày. Số lƣợng rệp có sự gia tăng đáng kể bắt đầu kể từ 2 tuần sau khi cấy. Số lƣợng rệp tăng mạnh nhất sau 6 tuần nuôi và bắt đầu suy giảm sau đó. Nguyên nhân vì bí nuôi rệp hƣ hoại dần do mức độ chích hút của rệp tăng lên cũng nhƣ nhiệt độ và độ ẩm cao (do sự hô hấp của bí) làm xuất hiện hiện tƣợng thối trái và nấm. Rệp tự điều chỉnh bằng cách phát triển dần lên cao, tránh xa phần dƣới của quả bí đã bị ẩm, hƣ hoại. Nhƣ vậy phƣơng pháp nuôi rệp cho kết quả khá tốt và ổn định với hệ số nhân sau 6 tuần nuôi từ 124 – 129 lần, có thể ứng dụng để nhân sinh khối rệp phục vụ cho việc chủng bệnh. 4.1.2. Lây nhiễm bệnh 4.1.2.1. Chuyển rệp lên dứa bệnh Chuyển rệp bằng đèn Sau một tuần, chỉ có một số ít rệp di chuyển lên dứa, chủ yếu là rệp con, đa số rệp già không di chuyển. Ngoài ra có một số rệp tập trung trên đèn và chết. Nguyên nhân có thể do rệp không có khả năng di chuyển xa hoặc bí vẫn còn dinh dƣỡng nên rệp không muốn di chuyển. Chuyển rệp trực tiếp Sau 7 ngày, rệp vẫn sống trên dứa tuy số lƣợng có giảm nhiều so với lúc ban đầu. Điều này có thể là do trong quá trình quét rệp bằng cọ, rệp bị tác động cơ học nên bị thƣơng và chết. So với phƣơng pháp chuyển rệp bằng đèn thì phƣơng pháp 51 quét trực tiếp tuy lƣợng rệp hao hụt trong quá trình quét có nhiều nhƣng phƣơng pháp này nhanh hơn và rệp đƣợc chuyển qua dứa nhiều hơn. Hình 4.2. Rệp phát triển trên dứa sau 7 ngày 4.1.2.2. Chuyển rệp lên dứa sạch bệnh. Trồng và chăm sóc dứa Sau khi đem ra vƣờn trồng, nhìn chung, đa số các cây dứa đều thích nghi và sinh trƣởng tốt ngoại trừ một số cây còn yếu không thích nghi đƣợc (sinh trƣởng kém, chết) chiếm khoảng 8%. Chuyển rệp từ dứa bệnh lên dứa sạch bệnh Sau 1 tuần sống trên dứa bệnh, rệp hấp thu virus và đƣợc chuyển lên dứa sạch bệnh (xem Hình 4.3). (a) 52 (b) (c) Hình 4.3. Chuyển rệp lên dứa sạch bệnh. (a) mảnh lá dứa có rệp, (b) và (c) chuyển rệp. Sau khi thả rệp, định kỳ kiểm tra sự hiện diện và đếm số rệp trên dứa sau mỗi 2 tuần. Số lƣợng rệp giảm đi so với lúc chủng sau 2 tuần đầu tiên nhƣng bắt đầu tăng lên từ tuần tứ 4. Có lẽ trong 2 tuần đầu rệp chƣa thích nghi nên chết nhiều. Sau đó, rệp thích nghi dần và bắt đầu phát triển số lƣợng. Hình 4.4. Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng. a: 2 tuần; b: 4 tuần; c: 6 tuần; d: 8 tuần Do cây dứa 4 tháng tuổi chƣa có biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá rõ rệt nên chúng tôi tiến hành chủng bệnh lần hai để đảm bảo sự truyền virus. 53 Sau khi chủng rệp 8 tháng (tính từ lần chủng rệp thứ nhất), cây biểu hiện triệu chứng nhƣ lá đỏ dần lên, kém trƣơng nƣớc, rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất. Loại trừ các trƣờng hợp cây biểu hiện triệu chứng tƣơng tự nhƣng không phải do bệnh, ƣớc tính số cây biểu hiện bệnh là 107 cây chiếm tỷ lệ là 35,66%. Hình 4.5. Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá sau khi chủng bệnh. Nhƣ vậy sau khi tiến hành chủng virus PMWaV thông qua trung gian truyền bệnh là rệp sáp, chúng tôi đi đến kết luận: quá trình chủng rệp đã thành công với 35,66% cây dứa biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, vẫn còn 64,34% số dứa không biểu hiện bệnh. Điều này có thể do dứa có khả năng chống chịu bệnh tốt hoặc do lƣợng rệp và virus chƣa đủ để làm biểu hiện bệnh. Mặc khác, quá trình chủng bệnh đƣợc tiến hành cận mùa mƣa. Do đó có thể bệnh biểu hiện nhƣng không đủ mạnh để ghi nhận. Song song với việc theo dõi sự tăng sinh của rệp, chúng tôi còn quan sát số lƣợng của kiến hiện diện trong vƣờn dứa. Kết quả nhận thấy rằng, những cây có biểu hiện triệu chứng bệnh thƣờng xuất hiện thành từng cụm. Ở những cụm này, mức độ hiện diện và hoạt động của kiến (khoảng 30 con/cây) là cao so với các cụm khác. Mặt khác, do điều kiện mƣa, không thuận lợi cho sự phát triển nên kiến không phân bố một cách đồng đều mà chỉ tập trung ở dƣới những cây dứa có lá tƣơng đối lớn. 4.1.3. Thu thập mẫu Các cây có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ nhất và các cây không biểu hiện triệu chứng đƣợc chọn ra để tiến hành các phân tích kế tiếp. Chi tiết về các mẫu thu thập thể hiện qua Bảng 4.2. 54 Bảng 4.2. Danh sách các mẫu thu thập Nguồn dứa Bệnh Số lƣợng Kí hiệu mẫu Lâm Đồng - 1 LĐK + 1 LĐB Thái Lan - 1 TLK + 1 TLB Trung Quốc - 1 TQK + 1 TQB Cây cấy mô - 2 CMK1, CMK2 + 1 CMB Tổng 9 Chú thích: (+): có biểu hiện bệnh wilt, (-): không biểu hiện bệnh wilt. Hình 4.6. Một số mẫu dứa Cayenne thu thập. 55 4.2. Nội dung 2: Phân lập vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập 4.2.1. Kết quả ly trích DNA tổng số Ban đầu, quy trình li trích đƣợc hiện theo Doyle (1996). Kết quả điện di DNA tổng số của dứa Cayenne theo quy trình này không đƣợc tốt do có nhiều smear và tạp (protein và RNA). Do đó, phƣơng pháp đƣợc cải tiến cho phù hợp hơn với đối tƣợng là cây dứa bằng cách tăng thêm một lần tủa protein bằng hỗn hợp PCI. Kết quả li trích theo quy trình cải tiến thể hiện trên gel qua Hình 4.7. Hình 4.7. Kết quả điện di DNA tổng số theo quy trình cải tiến. Chú thích: Từ 1 – 9 là các mầu CMK1, CMK2, CMB, LĐK, LĐB, TLK, TLB, TQK, TQB (1 μl). L là DNA ladder với nồng độ mỗi band là 400 ng (2 μl) Kết quả điện di cho thấy DNA genome đều xuất hiện ở tất cả các mẫu li trích nhƣng với hàm lƣợng không đồng đều. Một số mẫu có nhiều tạp. Tuy nhiên, smear từ band DNA tổng số là không có hoặc không đáng kể. Do đó, những mẫu này có thể tiến hành pha loãng, định lƣợng để sử dụng cho phản ứng PCR. 4.2.2. Kết quả pha loãng mẫu DNA tổng số Trên gel điện di sản phẩm li trích DNA tổng số (Hình 4.7), bố trí chạy DNA ladder (2 μl) với nồng độ mỗi band là 400 ng để thuận lợi cho việc quan sát và định các hệ số pha loãng cho các mẫu tƣơng ứng. Kết quả pha loãng thể hiện trên gel điện di qua Hình 4.8. DNA tổng số 56 Hình 4.8. Kết quả pha loãng DNA. Chú thích: Từ 1 – 9 là các mầu CMK1, CMK2, CMB, LĐK, LĐB, TLK, TLB, TQK, TQB (3μl). C là đối chứng (mẫu DNA lan li trích), S là mẫu DNA hiệu chuẩn với nồng độ là 50 ng/μl (2μl). Kết quả pha loãng cho thấy sự đồng đều giữa các mẫu về hàm lƣợng DNA. Đối chiếu với mẫu hiệu chuẩn, chúng tôi nhận thấy có thể sử dụng DNA pha loãng này cho phản ứng PCR (2 – 3 μl khoảng 120 – 180 ng/phản ứng) theo yêu cầu của phƣơng pháp (150 ng/phản ứng). 4.2.3. Tối ƣu phƣơng pháp PCR thoái hoá Trong phần đầu của quá trình tối ƣu phản ứng PCR thoái hoá, chúng tôi thực hiện theo quy trình của Z. Deng và cs (2000). Nhƣng có lẽ do sự không tƣơng hợp với mẫu DNA, các hoá chất PCR hay điều kiện máy móc của phòng thí nghiệm nên kết quả không có band trên gel điện di. Do đó, tham khảo một số quy trình khác, chúng tôi đã tiến hành chạy phản ứng PCR với nhiệt độ bắt cặp 43oC và nồng độ primer là 1,5 pm/μl thấp hơn so với quy trình của Z. Deng và cs. Đồng thời, tăng nhiệt độ biến tính lên 94oC và thời gian biến tính ban đầu lên 5 phút đảm bảo DNA biến tính hoàn toàn. Do bản chất của Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2.1 gần nhƣ giống nhau nên chúng tôi tiến hành và theo dõi chung. Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2.1: Kết quả tối ƣu các cặp primer trong việc khuếch đại gene kháng chính 57 Sử dụng qui trình của Z. Deng và cs (2000) có cải tiến, lần lƣợt chạy với 4 cặp primer (LM637, LM638), (F11, R11), (F11, R16), (TIR1, TIR2) trên cùng một mẫu (TLK) theo Bảng 4.3 Bảng 4.3. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR thoái hoá cải tiến Thành phần (25 μl/ống) Nồng độ gốc Nồng độ cuối Lƣợng dùng (μl) Chu trình nhiệt PCR buffer 5 X 1 X 5 94 o C – 5 phút MgCl2 25 mM 2 mM 2 Lặp lại 42 chu kỳ: Primers xuôi 100 pm/μl 1,5 pm/μl 0,4 94oC – 1 phút Primers ngƣợc 100 pm/μl 1,5 pm/μl 0,4 43oC – 1 phút dNTP 10 mM 200 µM 0,5 72oC – 2 phút Taq polymerase 5 unit/μl 1 unit/25μl 0,2 72oC – 5 phút DNA mẫu 60 ng/μl 150 ng/25μl 2,5 Giữ 4oC Nƣớc 14 Tổng 25 Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện qua Hình 4.10. Hình 4.9. Kết quả PCR tối ƣu 4 cặp primer theo quy trình của Z. Deng và cs có cải tiến Chú thích: Từ trái qua phải các giếng 1, 2, 3, 4 lần lƣợt là phản ứng PCR với các cặp primer (LM637, LM638), (F11, R16), (TIR1, TIR2), (F11, R11); Giếng 5 - DNA ladder (2 μl). 100 bp 500 bp 1000 bp Khoảng 510 bp 58 Kết quả trên cho thấy quy trình PCR cải tiến có khả năng khuếch đại vùng gene kháng chính trên cây dứa. Trong số các cặp primer sử dụng, cặp primer (TIR1, TIR2) không cho sản phẩm. Nguyên nhân là do không thích hợp với nhiệt độ bắt cặp của phản ứng (Tm của cặp primer TIR là 66oC – theo tính toán của nhà sản xuất IDT). Ngoài ra, một nguyên nhân khác có thể có là trên cây dứa không có vùng mã hoá cho cấu trúc Tol. Ba cặp còn lại là (LM637, LM638), (F11, R11), (F11, R16) đều cho sản phẩm. Tuy nhiên, chỉ có cặp (F11, R11) có sản phẩm khuếch đại gần với mong muốn nhất (khoảng 510 bp). Đánh giá tổng thể, phản ứng PCR vẫn chƣa đạt do còn quá nhiều sản phẩm phụ (smear) và band chính mờ. Do đó, cần phải tiếp tục tối ƣu các yếu tố khác với cặp primer (F11, R11). Thí nghiệm 2.2. Tối ƣu nồng độ primer Kết quả PCR trên gel điện di (Hình 4.11) Hình 4.10. Kết quả PCR tối ƣu nồng độ primer Chú thích: Từ trái qua phải các giếng 1, 2 ,3 là sản phẩm PCR với nồng độ primer sử dụng lần lƣợt là 1, 2, 3 pm/μl. Sản phẩm điện di tuy có nhƣng khá mờ, chƣa tạo thành vạch rõ. Trong đó, nồng độ 1 pm/μl không cho sản phẩm, nồng độ 2 pm/μl tạo ra band điện di mỏng và có phần rõ hơn so với nồng độ 3 pm/μl. Do đó nồng độ primer 2 pm/μl đƣợc sử dụng cho những nghiệm thức tối ƣu kế tiếp. Kết quả PCR tối ƣu nồng độ primer có vẻ mâu thuẫn với việc hạ nồng độ ở giai đoạn đầu. Lí giải cho việc này chúng tôi đƣa ra nguyên nhân nhƣ sau. Primer thoái Band chính 59 hoá là một hỗn hợp gồm rất nhiều primer khác nhau và cùng tham gia vào phản ứng PCR với vai trò nhƣ nhau. Khi nồng độ primer quá cao, khả năng xảy ra hiện tƣợng bắt cặp giữa các primer là rất lớn. Hơn nữa, các primer có trình tự thích hợp cho phản ứng sẽ chịu sự cạnh tranh nhiều hơn từ các primer có trình tự gần giống nhƣng không có khả năng hay khuếch đại không đúng vùng mong muốn. Do đó, phản ứng sẽ rất khó thành công ở nồng độ primer cao. Khi nồng độ primer thấp hơn, sự cạnh tranh và bắt cặp diễn ra không gay gắt làm cho lƣợng sản phẩm và lƣợng primer quay về mối quan hệ tỉ lệ thuận. Mặt khác, khi so với nồng độ primer sử dụng trong các phản ứng PCR thông thƣờng (single PCR, RAPD, SSR…) thì nồng độ primer sử dụng trong phản ứng PCR thoái hoá cao hơn nhiều. Điều này cũng có thể giải thích bằng bản chất của primer thoái hoá là hỗn hợp nhiều trình tự primer. Do đó, số primer có trình tự thích hợp để bắt cặp và có khả năng khuếch đại DNA khuôn mẫu chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ trong hỗn hợp sử dụng. Tỉ lệ này phụ thuộc vào độ thoái hoá của primer. Vì vậy, phải tăng nồng độ của cả hỗn hợp để tăng số primer có khả năng khuếch đại đảm bảo cho sản phẩm đạt yêu cầu về số lƣợng. Thí nghiệm 2.3. Tối ƣu nồng độ dNTP Kết quả PCR thể hiện trên gel agarose (xem Hình 4.12). Hình 4.11. Kết quả PCR tối ƣu nồng độ dNTP Chú thích: 1, 2, 3 lần lƣợt là kết quả của phản ứng PCR ở nồng độ 300, 200, 100 μM. Band chính 60 Kết quả điện di cho thấy độ sáng của band kháng chính giảm dần theo nồng độ dNTP. Ở mức nồng độ 300 μM band kháng chính lại khá nhoè. Do đó, nồng độ dNTP đƣợc giữ nguyên so với thí nghiệm của Z. Deng và cs (2000) và đƣợc áp dụng cho các thí nghiệm sau là 200 µM. Thí nghiệm 2.4. Tối ƣu nồng độ Mg2+ Kết quả PCR thể hiện qua Hình 4.13. Hình 4.12. Kết quả PCR tối ƣu nồng độ Mg2+ Chú thích: Giếng 1, 2, 3 tƣơng ứng với nồng độ Mg2+ lần lƣợc là 1, 2, 3 mM Trong 3 nghiệm thức, chỉ có phản ứng với nồng độ Mg2+ ở 1 mM không cho sản phẩm. Hai nghiệm thức còn lại có sự hiện diện của band chính. Riêng nghiệm thức 2 (1,5 mM) cho kết quả khá tốt, độ tạp thấp. Điều này có thể giải thích vì Mg2+ là cofactor của Taq polymerase nên việc tăng hay giảm nồng của yếu tố này ảnh hƣởng rất lớn đến sản phẩm PCR. Do đó nồng độ Mg2+ là 1,5 mM đƣợc cho là tối ƣu và áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 2.5. Tối ƣu nồng độ Taq polymerase Kết quả PCR tối ƣu nồng độ Taq polymerase thể hiện qua Hình 4.14. Band chính 61 Hình 4.13. Kết quả PCR tối ƣu nồng độ Taq polymerase Chú thích: Giếng 1 – 1 unit/25μl; giếng 2 - 1,25 unit/25μl; giếng 3 - 1,5 unit/25μl. Kết quả PCR thể hiện trên gel điện di cho khá nhiều tạp, xung quanh band kháng chính có nhiều smear, không có khác biệt lớn giữa các nghiệm thức khi sử dụng các nồng độ Taq khác nhau. Do đó nồng độ Taq polymerase tối ƣu là 1 unit/25μl. Thí nghiệm 2.6. Tối ƣu nhiệt độ bắt cặp Kết quả tối ƣu nhiệt độ bắt cặp thể hiện qua Hình 4.15. Hình 4.14. Kết quả tối ƣu nhiệt độ bắt cặp Chú thích: Từ trái qua phải các giếng 1, 2, 3 tƣơng ứng với nhiệt độ bắt cặp 47, 50, 53oC Theo dõi độ sáng và độ rõ của band, nhiệt độ 47oC so với hai mức nhiệt còn lại cho hiệu quả khuếch đại kém nhất đối với band chính (band chính không hiện rõ, Band chính Band chính 62 nhiều smear). Ở nhiệt độ 50oC và 53oC không có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, để giảm bớt lƣợng tạp cho các phản ứng kế tiếp, chúng tôi chọn 53oC là mức nhiệt độ tối ƣu. Thí nghiệm 2.7. Tối ƣu số chu kỳ nhiệt Kết quả PCR đƣợc ghi nhận qua Hình 4.16. Hình 4.15. Kết quả PCR tối ƣu số chu kỳ Chú thích: Giếng 1 – 3 lần lƣợt là số chu kỳ của các phản ứng: 45, 40, 37. Theo kết quả điện di, độ đậm của band kháng chính tỷ lệ thuận với việc tăng số chu kỳ của chu trình nhiệt. Ở 45 chu kỳ, phản ứng cho band rõ nhƣng tạp khá nhiều. Nhƣ vậy, có thể giữ nguyên số chu kỳ theo thí nghiệm của Z. Deng và cs (2000) là 42. Tổng kết qua các thí nghiệm, có thể kết luận rằng gene kháng bệnh tồn tại trong genome của cây dứa và đƣợc phân lập bằng phƣơng pháp PCR thoái hoá. Tuy nhiên sản phẩm PCR thể hiện trên gel điện di chƣa đƣợc rõ, mức độ tạo tạp và sản phẩm phụ còn cao. Có thể tạm lý giải điều này nhƣ sau: Primer sử dụng là một hỗn hợp primer khác nhau, do đó trong quá trình xảy ra phản ứng không thể tránh khỏi sự cạnh tranh giữa các primer trong việc bắt cặp với DNA mẫu. Lƣợng primer dƣ có thể tạo dimer làm xuất hiện tạp. Mặc khác, do độ thoái hoá cao so với vùng gene kháng chính nên một số primer có thể bắt cặp với các vùng gene khác tạo nên các band phụ. Band chính 63 Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng 53oC chƣa đủ lớn để có thể loại trừ hiện tƣợng bắt cặp không chuyên biệt. Dung hoà các yếu tố, có thể đi đến qui trình cho phản ứng PCR thoái hoá phân lập gene kháng ở cây dứa Cayenne (xem Bảng 4.1.) Bảng 4.4. Quy trình PCR thoái hoá tối ƣu cho cây dứa Cayenne Thành phần (25 μl/ống) Nồng độ cuối Chu trình nhiệt PCR buffer 1 X 94 o C – 5 phút MgCl2 2 mM Lặp lại 42 chu kỳ: Primers xuôi 1,5 pm/μl 94oC – 1 phút Primers ngƣợc 1,5 pm/μl 53oC – 1 phút dNTP 200 µM 72oC – 2 phút Taq polymerase 1 unit/25μl 72oC – 5 phút DNA mẫu 150 ng/25μl Giữ 4oC Nƣớc cất Vừa đủ 25 μl 4.2.4. Reamplify sản phẩm PCR Để tăng tăng hàm lƣợng cũng nhƣ độ sạch của sản phẩm PCR cho các phân tích tiếp theo, chúng tôi tiến hành khuếch đại lại (reamplify) sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR trực tiếp trên genome (PCR lần thứ nhất) đƣợc sử dụng làm mẫu (2 μl) cho phản ứng khuếch đại lại (PCR lần thứ hai). Ngoài ra, các yếu tố nhƣ nồng độ các chất và chu kỳ nhiệt đều giữ nguyên nhƣ đã tối ƣu. Kết quả PCR biểu hiện trên gel điện di qua Hình: 64 Hình 4.16. Kết quả khuếch đại lại sản phẩm PCR lần 1 của một số mẫu dứa Chú thích: Từ trái qua phải, các giếng L, 1, 2, 3 lần lƣợt là DNA ladder, CMK1, CMK2, CMB. Sau khi khuếch đại lần thứ 2, sản phẩm PCR cho ra band rõ và đẹp hơn so với PCR lần thứ nhất. Điều này có thể lý giải do mẫu của phản ứng PCR lần thứ hai là những đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ nên không có hiện tƣợng bắt cặp nhầm vào các trình tự khác của genome. Do đó sản phẩm sẽ chuyên biệt hơn. Sản phẩm PCR biểu hiện trên gel cho thấy hàm lƣợng của PCR đủ lớn để các thể tiến hành các phân tích tiếp theo nhƣ phân cắt enzyme. 4.2.5. PCR trên các loại mô khác nhau Thực hiện phản ứng PCR với quy trình đã đƣợc tối ƣu ở trên đối với mẫu lá, thân và rễ của cùng một cây. Kết quả điện di sản phẩm thể hiện qua Hình 4.18. 65 Hình 4.17. Sản phẩm PCR với quy trình đã tối ƣu trên các loại mô khác nhau Chú thích: Từ trái qua phải, các giếng 1, 2, 3 lần lƣợt là sản phẩm PCR của mô lá, thân, rễ Band kháng chính đều xuất hiện ở cả ba loại mô. Tuy nhiên, độ sáng rõ của band tăng dần tƣơng ứng với mô rễ, thân và lá. Nguyên nhân khác có thể là do quy trình ly trích mẫu chỉ phù hợp với lá. Do đó, với các loại mô khác nhƣ rễ và thân, quy trình không cho phép loại bỏ các tạp chất trong các mô này. Vì vậy, những chất này có thể cản trở phản ứng xảy ra một cách tối ƣu. Nhƣ vây lá là loại mô thích hợp nhất cho việc li trích DNA mẫu dùng cho phản ứng PCR thoái hoá. 4.2.6. PCR thoái hoá clone vùng NBS trên các mẫu dứa Cayenne Thực hiện quy trình PCR thoái hoá tối ƣu trên 9 mẫu DNA li trích, kết quả thể hiện trên gel điện di nhƣ sau: Band chính 66 Hình 4.18. Kết quả PCR thoái hoá trên 9 mẫu dứa Cayenne Chú thích. Sản phẩm PCR thoái hoá: từ 1 – 9 các mẫu CMK1, CMK2, CMB, LĐK, LĐB, TLK, TLB, TQK, TQB; D: mẫu lan Dendrobium; L: DNA ladder; S: sản phẩm PCR thoái hoá đƣợc tinh sạch với kích thƣớc khoảng 510 bp. Hầu hết các mẫu dứa đều tạo sản phẩm PCR thoái hoá với rất nhiều band. Trong đó chỉ có hai band sáng và rõ nhất (khoảng 510 bp, khoảng 700 bp), band có kích thƣớc lớn hơn 1000 bp (khoảng 1400) mỏng và không đồng đều giữa các mẫu, các band còn lại khá mờ. Band khoảng 700 bp có phần sáng hơn so với band khoảng 510 bp. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR không có sự khác biệt lớn giữa các mẫu dứa (ngoại trừ mẫu 8 - TQK không cho sản phẩm – có thể do sai sót trong pha loãng hay ly trích cho nhiều tạp). Điều này cho thấy các mẫu biểu hiện và không biểu hiện triệu chứng của bệnh héo đỏ đầu lá không có sự khác biệt khi kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR thoái hoá và điện di. Mẫu lan Dendrobium cũng cho kết quả clone vùng gene NBS khá tốt (band sáng rõ, kích thƣớc khoảng 510 bp). So sánh kết quả PCR thoái hoá giữa mẫu lan Dendrobium và dứa Cayenne cho thấy chỉ có sự giống nhau ở band khoảng 510 bp (vùng gene mã hoá cho cấu trúc NBS). Các band còn lại rất khác biệt nhau (mẫu lan không có band khoảng 700 bp, các band mờ có kích thƣớc nhỏ hơn cũng không có sự tƣơng đồng). Điều này chỉ ra rằng vùng gene mã hoá cho cấu trúc NBS có độ bảo tồn rất cao trên các loài cách xa nhau về phân loại. 4.2.7. Giải trình tự sản phẩm PCR thoái hoá Việc có đƣợc trình tự của những thành viên họ gene NBS cho phép phân tích sâu hơn về tính kháng trên cây dứa Cayenne. Tuy nhiên, cố gắng giải trình tự trực 67 tiếp sản phẩm PCR thoái hoá đã không thành công. Nguyên nhân là do mồi sử dụng là mồi thoái hoá thay vì mồi chuyên biệt nhƣ thông thƣờng. Do đó hiện tƣợng nhiễu xảy ra gây khó khăn cho việc đọc trình tự. Mặt khác, sản phẩm PCR thoái hoá thƣờng là một hỗn hợp đa trình tự. Vì vậy, mẫu sau khi đã tinh sạch để đƣa vào máy đọc vẫn có thể là một hỗn hợp nhiều gene. Và điều này cũng là một nguyên nhân gây nhiễu. 4.3. Nội dung 3: Phân tích RFLP vùng gene NBS các mẫu dứa thu thập. Kết quả phân cắt bằng các mẫu PCR thoái hoá thể hiện nhƣ sau: Hình 4.19. Kết quả phân cắt enzyme Hind III sản phẩm PCR thoái hoá Chú thích. Các giếng 1-8: CMK1, CMK2, CMB, LĐK, LĐB, TLK, TLB, TQB; D: mẫu lan Dendrobium; S: sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch với kích thƣớc khoảng 510 bp; L: DNA ladder Theo kết quả điện di, những khác biệt so với sản phẩm PCR ban đầu mà việc xử lí enzyme tạo ra là: Trên mẫu lan Dendrobium, band sản phẩm PCR (510 bp) vẫn không có sự thay đổi. Chứng tỏ trên trình tự sản phẩm khuếch đại của cây lan Dendrobium không có sự hiện diện của site cắt phù hợp với enzyme Hind III. Trên mẫu dứa, các band sáng rõ ban đầu (510 bp, 700 bp, 1400 bp) biến mất hay hiện diện rất mờ. Thay vào đó là sự xuất hiện của các band mới (< 100 bp, 300 bp, 430 bp, 600 bp, 900 bp). Tuy nhiên, sản phẩm phân cắt lại không cho thấy sự đa hình giữa các mẫu dứa. Do đó, có thể nói vẫn chƣa xác định đƣợc marker liên kết với tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá. 68 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua những nội dung đã thực hiện trong khoá luận, chúng tôi đƣa những kết luận sau: Nội dung 1: Đã nuôi rệp và lây nhiễm bệnh thành công với tỉ lệ biểu hiện là 35,66%. Nội dung 2: Có thể sử dụng quy trình li trích của Doyle có cải tiến để li trích DNA tƣơng đối tinh sạch sử dụng cho phản ứng PCR thoái hoá khuếch đại vùng gene mã hoá cho cấu trúc NBS trên cây dứa Cayenne. Đã cải tiến đƣợc chu trình nhiệt và nồng độ các thành phần tham gia phản ứng PCR thoái hoá cho phép khuếch đại thành công vùng NBS trên cây dứa Cayenne. Đây sẽ là cơ sở cho việc ứng dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử cho phép phân tích chính xác hơn để tìm ra vùng gene liên quan đến tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne. Nội dung 3: Không có sự đa hình cho phép xác định marker liên quan đến tính kháng virus PMWaV khi phân cắt sản phẩm PCR thoái hoá với enzyme HindIII. 5.2. Đề nghị Tuyển lựa và thành lập những giống dứa Cayenne kháng với bệnh héo đỏ đầu lá, tạo điều kiện thuận lợi để có thể thu thập mẫu một cách chính xác, phân biệt giữa giống kháng và giống nhiễm. Tiếp tục phân tích RFLP trên vùng gene NBS với nhiều enzyme cắt hơn để tìm ra marker liên kết với tính kháng virus PMWaV. Thực hiện clone, giải trình tự sản phẩm PCR thoái hoá để có thể phân tích sâu hơn các RGA, nhằm xác định và lập bản đồ các marker liên kết với tính kháng. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, 2002. Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 272 trang. 2. Nguyễn Phú Dũng, 2005. Xây dựng quy trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá (Mealybug Wilt) trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục. 300 trang. 4. Võ Thị Mỹ Hân, 2004. Điều tra tình hình bệnh hại trên cây dứa (Ananas comosus) ở huyện Tân Phước, Tiền Giang. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Võ Thị Thúy Huệ, 2003. Điều tra tình hình bệnh hại trên cây dứa (Ananas comosus) ở huyện Bến Lức, Long An và huyện Bình Chánh, Tp. Hồ Chí Minh. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Phạm Văn Khánh, 2003. Điều tra bệnh trên dứa ở Đức Trọng – Lâm Đồng và nông trường Thọ Vực – Xuân Lộc – Đồng Nai. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 240 trang. 8. Tôn Bảo Linh, 2005. Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus). Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 9. Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 1996. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 10. Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2000. Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 70 TIẾNG NƢỚC NGOÀI 11. Deng Z., Huang S., Ling P., Chen C., Yu C., Weber C. A., Moore G. A and Gmitter F. G., 2000. Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance - gene candidate sequences in citrus. Theor Appl Genet 101: p. 814 – 822. Springer – Verlag. 12. Kanazin V., Marek L. F and Shoemaker R. C., 1996. Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: p. 11746 - 11750. Genetics. 13. Kenneth G. Rohrbach, John W. Beardsley, Thomas L. German, Neal J. Reimer, and Wallace G. Sanford, 1988. Mealybug wilt, Mealybugs and Ants on Pineapple. Plant Dis. 72 (7). 14. Leister D., 1998. Rapid reorganization of resistance gene homologues in cereal genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: p. 370 - 375. 15. Melzer, M. J., Karasev, A. V., Sether, D. M., and Hu, J. S., 2001. Nucleotide sequence, genome organization and phylogenetic analysis of pineapple mealybug wilt-associated virus-2. Journal of General Virology 82: 1-7. 16. Pamela C. Ronald., 1997. The molecular basis of disease resistance in rice. Plant Molecular Biology 35: p. 179–186. Kluwer Academic Publishers. 17. Sambrook J., and Russell D. W., 2001. Molecular cloning, vol. 2. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. 18. Sether D. M., Karasev A. V., Okumura C., Arakawa C., Zee F., Kislan M. M., Busto J. L and Hu J. S., 2001. Differentiation, distribution, and elimination of two different pineappple mealybug wilt-associated viruses found in pineapple. Plant Disease 85: p. 856-864. 19. Sether D. M., Ulman D. E., and Hu J. S., 1998. Transmission of pineapple mealybug wilt-associated virus by two species of mealbug (Dysmicoccus spp.). Phytopathology 88: p. 1224-1230. 20. Yu Y. G., Buss G. R., Maroof S., 1996. Isolation of a superfamily of candidate disease-resistance genes in soybean based on a conserved nucleotide-binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: p. 11751–11756. Genetics.