Khóa luận Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông Cửu Long

trong gan, thận và lách bị teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 23: nghiệm thức 108 lô A có một cá chết với biểu hiện nhƣ ngày thứ 22; nghiệm thức 109 lô A có một cá chết bên ngoài biểu hiện nhƣ trên bên trong đã xuất hiện đốm trắng nhẹ. Ngày thứ 24 – 38: cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 22, cho đến thời điểm này cá ở các nghiệm thức đối chứng không chết. Ngày thứ 38: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm. 32 Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng Ở thí nghiệm 1, trƣớc khi tiêm vacxin cá khỏe và biểu hiện bình thƣờng. Nhƣng sau khi tiêm vacxin trong khoảng thời gian từ ngày thứ 6 – 10 các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết do ký sinh trùng ngoài biểu hiện bệnh tích của ký sinh, cá còn có những biểu hiện khác nhƣ bên ngoài lở loét vùng bụng; bên trong xoang bụng có chứa đầy dịch trắng, trong khi các nghiệm thức đối chứng thì cá hoạt động bình thƣờng. Trong thí nghiệm này điều kiện môi trƣờng, nguồn nƣớc là nhƣ nhau ở tất cả các nghiệm thức, cá đối chứng hoạt động bình thƣờng, chỉ ở các nghiệm thức tiêm vacxin có cá chết với những triệu chứng nhƣ trên. Điều này chứng tỏ chất bổ trợ nhũ dầu làm vacxin đã gây tác dụng phụ, tạo cơ hội cho ký sinh trùng phát triển. Sau đó chúng tôi xử lí formol cho tất cả các nghiệm thức sau một ngày thì cá không còn dấu hiệu của ký sinh trùng và cá hoạt động bình thƣờng từ ngày thứ 10 – 13. 33 Vào ngày thứ 14 chúng tôi tiêm nhắc lại vacxin, sau một ngày cá có những triệu chứng bất thƣờng, cá chết rải rác ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện bên ngoài cá gầy yếu, bỏ ăn, lở loét ngay vùng bụng; bên trong thận, gan và lách teo, thận sƣng mất màu, gan thâm đen, xoang bụng chứa đầy dịch trắng và cá tiếp tục chết ở các ngày sau đó với những triệu chứng đã nêu, một điều cần chú ý là tất cả các cá chết khi giải phẫu bên trong xoang bụng đều chứa dịch trắng; trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng hoạt động bình thƣờng và không có con nào chết. Nhƣ vậy trong điều kiện thí nghiệm nhƣ nhau đối với các nghiệm thức có sự khác biệt lớn giữa nghiệm thức tiêm vacxin và đối chứng: nghiệm thức đối chứng cá hoạt động bình thƣờng, nghiệm thức tiêm vacxin cá chết sau khi tiêm vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu, nhƣ thế có thể nói vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu đã tác động không tốt tới hoạt động sống bình thƣờng của cá. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn tiến hành công vi khuẩn sống cho cá đối chứng và cá tiêm vacxin để đánh giá thêm tác động của chất bổ trợ nhũ dầu lên tính mẫn cảm của cá đối với Ed. ictaluri. Khi công vi khuẩn sống cho tất cả các nghiệm thức vào ngày thứ 21, sau đó một ngày đã có cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ lúc đầu và tiếp tục có cá chết vào những ngày tiếp theo với những bệnh tích tƣơng tự nhƣng thêm vào đó là những dấu hiệu của bệnh đốm trắng nhẹ; một điều cần lƣu ý là tới lúc này, cá ở các nghiệm thức đối chứng vẫn hoạt động bình thƣờng. Trong khi ở các nghiệm thức tiêm vacxin lại tiếp tục có cá chết, nhƣ thế ta có thể thấy rõ là vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG ngoài việc gây chết cá khi nuôi bình thƣờng trong điều kiện thí nghiệm còn gây chết cá nhiều hơn (Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1) khi có sự xuất hiện của Ed. ictaluri. Nhƣng sau khi công cƣờng độc vi khuẩn, cá đối chứng vẫn không chết nên chúng tôi nghi ngờ về độc lực của vi khuẩn hoặc nồng độ vi khuẩn chƣa đạt mức cho cá chết nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 để khẳng định lại vấn đề này. 34 Tỉ lệ cá chết thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu 38,1 7,14 21,43 2,38 33,33 4,762,38 2,38 0 000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A B C Loại vacxin Tỉ lệ (% ) 10^8 10^9 3x10^9 ĐC Biểu đồ 4. 1. Tỉ lệ cá chết của thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Nhƣ vậy, bằng thực nghiệm ta có thể khẳng định chất bổ trợ nhũ dầu dùng trong thí nghiệm này không có độ an toàn, đem lại tác dụng không tốt cho cá mà theo hai tác giả Tyler và Klesius (1994), chất bổ trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri. Kết luận đƣợc rút ra từ thí nghiệm 1 là:  Chất bổ trợ nhũ dầu Montanide 70M-PG của Seppic không hoạt động, không an toàn.  Có thể độc lực của các chủng vi khuẩn có vấn đề: một là vi khuẩn đã hoàn toàn mất độc lực, hai là trong quá trình bảo quản làm vi khuẩn yếu độc lực. 35 4.2 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Bảng 4. 3. Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) A 2,5 x10 6 (110 LD50) 18 con 10 8 55,6 B 2 x10 6 (90 LD50) 18 con 9 9 50 C 5,6 x10 5 (25 LD50) 18 con 4 14 22,2 Ghi chú: A (Ei-23), B (Ei-151), C (Ei-338); LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá Bảng 4. 4. Kết quả theo dõi biểu hiện của cá thí nghiệm 2 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1 - 8 Ngày thứ 1: công vi khuẩn sống với liều lƣợng, nồng độ, cách thức đƣợc nêu trên, cá sau khi công biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2 – 3: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 4: cá bắt đầu có triệu chứng của bệnh và cá chết rải rác ở các nghiệm thức, cá chết ở các nghiệm thức có biểu hiện giống nhau với các triệu chứng nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây, mắt đỏ; bên trong gan, thận, lách đều có đốm trắng. Từ ngày thứ 4 trở đi: cá ở các nghiệm thức chết rất nhiều và có những dấu hiệu bệnh tích điển hình của bệnh đốm trắng. Ngày thứ 8: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm. Thí nghiệm 2 cho kết quả chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 gây ra tỉ lệ cá chết trên 50% trừ chủng vi khuẩn Ei-338 do công với liều thấp (25LD50) nên tỉ lệ chết chỉ chiếm 22,2% (Bảng 4.3). Cá chết đều có những dấu hiệu bệnh tích điển hình của bệnh đốm trắng (Bảng 4.4). Tất cả điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn trên vẫn 36 còn độc độc lực và có khả năng gây chết cá. Nhƣ vậy, nghi vấn về vi khuẩn đã mất độc lực bị bác bỏ, nguyên nhân còn lại chúng tôi nghi ngờ là trong quá trình chuẩn bị vi khuẩn để công cƣờng độc, có thể nồng độ quá thấp nên cá đối chứng không chết hoặc quá trình bảo quản vi khuẩn sống trƣớc khi công đã làm vi khuẩn chết bớt trƣớc khi tiêm vào cá. Điều này đƣợc chúng tôi khắc phục ở thí nghiệm tiếp theo. 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua Bảng 4. 5. Kết quả thí nghiệm 3 - Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Nồng độ vi khuẩn công (ngày 21) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số cá chết qua các ngày Số cá còn Tỉ lệ cá chết (%) 1-14 14-21 21-28 B1 10 8 1,43 x 10 7 tbvk/cá (635 LD50) 42 0 0 41 1 95 10 9 42 0 0 39 3 93 3 x10 9 42 0 0 31 11 74 B2 10 8 42 0 0 42 0 100 10 9 42 0 0 42 0 100 3 x10 9 42 0 0 38 4 90 Đối chứng 42 0 0 42 0 100 A1 10 8 0,95 x 10 7 tbvk/cá (420 LD50) 42 0 0 40 2 95 10 9 42 0 0 30 12 71 3 x10 9 42 0 0 19 23 46 Đối chứng 42 0 0 42 0 100 Ghi chú: B1(có chất bổ trợ), B2 (không chất bổ trợ) (Ei-151); A1 (Ei-23): có chất bổ trợ; LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá 4.3.1 Kết quả theo dõi bệnh tích lâm sàng của cá Bảng 4. 6. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 3 37 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1 – 21 Trƣớc khi công vi khuẩn, cá khỏe biểu hiện bình thƣờng. Ngày 21 - 28 Ngày thứ 1: Công vi khuẩn, sau khi công cá biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2: sau khi công vi khuẩn, các nghiệm thức đối chứng cá có biểu hiện xuất huyết vây ngực và vây đuôi nhẹ. Ngày thứ 3: các nghiệm thức đối chứng A, B có cá chết đầu tiên với những biểu hiện bên ngoài mắt đỏ, hậu môn xuất huyết nhẹ, xuất huyết hàm, các vây xuất huyết nhẹ; bên trong gan, thận, lách sƣng nhũn, gan và thận xuất huyết nhẹ; ở nghiệm thức 108 lô B1 cá chết biểu hiện bên ngoài mắt đỏ, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong thận sƣng, gan xuất huyết; ở nghiệm thức 10 9 lô B1 cá chết biểu hiện tƣơng tự; các nghiệm thức tiêm vacxin còn lại cá chết rải rác có những biểu hiện tƣơng tự, bên trong chƣa có xuất hiện đốm trắng; lúc 17h - 22h nghiệm thức 108 lô B1 có một cá chết biểu hiện bên ngoài xuất huyết các vây, hậu môn nặng (Hình 4.3); bên trong thận, gan, lách sƣng, xuất huyết xoang bụng (Hình 4.4) và bắt đầu xuất hiện đốm trắng; các nghiệm thức còn lại của các lô vacxin và lô đối chứng cá chết rải rác và có những biểu hiện tƣơng tự. Ngày thứ 4: lúc này ở các nghiệm thức của từng lô thí nghiệm (cả lô đối chứng và lô vacxin) cá chết có những dấu hiệu của bệnh đốm trắng nhƣ bên ngoài các vây và gốc vây xuất huyết, xuất huyết hậu môn, hốc mắt, vồm miệng; bên trong thận, gan và lách sƣng nhũn, có đốm trắng nặng (Hình 4.5). Ngày thứ 5 – 8: cá chết ở các nghiệm thức và có những biểu hiện bệnh tích tƣơng tự, cá đạt tỉ lệ chết 100% ở các nghiệm thức lô đối chứng và ngay cả một số nghiệm thức ở lô vacxin; thí nghiệm kết thúc vào ngày thứ 8. 38 Hình 4. 3. Cá có biểu hiện xuất huyết bên ngoài Hình 4. 4. Cá có dấu hiệu xuất huyết xoang bụng Hình 4. 5. Cá có nhiều đốm trắng trên thận 39 Thí nghiệm 3 sử dụng vacxin với chất bổ trợ phèn chua đã đƣợc dùng phổ biến làm vacxin trong thú y. Sau khi tiêm vacxin lần nhất và tiêm nhắc lại, cá ở các nghiệm thức hoạt động bình thƣờng, nhƣ vậy so sánh với thí nghiệm 1, vacxin với chất bổ trợ phèn chua có độ an toàn hơn. Sau khi công vi khuẩn vào ngày thứ 21 của thí nghiệm, sau hai ngày cá ở một số nghiệm thức đều có những biểu hiện bệnh nhƣ cá bỏ ăn, lờ đờ, xuất huyết ở các vây và cá chết vào ngày hôm sau có những biểu hiện nhƣ bên ngoài với những triệu chứng vừa nêu còn xuất huyết hậu môn, hốc mắt, vòm miệng, mắt đỏ nhƣng bên trong chƣa có biểu hiện của bệnh đốm trắng. Những ngày tiếp theo, cá chết có những biểu hiện của bệnh đốm trắng rất rõ rệt (Bảng 4.6). Sau khi kết thúc thí nghiệm, ở các nghiệm thức đối chứng tỉ lệ cá chết đạt 100%. Tuy nhiên, một điều đáng nói là, các nghiệm thức tiêm vacxin tỉ lệ cá chết cũng khá cao (> 46%), có nghiệm thức chiếm 100%. Trong đó, các nghiệm thức tiêm vacxin của chủng vi khuẩn B có tỉ lệ cá chết cao nhất (Bảng 4.5). Theo kết quả quan sát thực nghiệm, cá chết với số lƣợng nhiều và chiếm tỉ lệ cao ở tất cả các nghiệm thức. Nhƣ vậy, nguyên nhân có thể do nồng độ công vi khuẩn cao, 420 LD50 (A) và 635 LD50 (B). Điều này sẽ đƣợc chúng tôi bàn luận tiếp khi trình bày về hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ cá chết. Qua phân tích trên, chúng tôi có thể rút ra một số kết luận:  Chất bổ trợ phèn chua dùng làm vacxin trong thí nghiệm này bƣớc đầu có độ an toàn, và có hiệu quả hơn chất bổ trợ nhũ dầu dùng ở thí nghiệm 1.  Tỉ lệ cá chết của các nghiệm thức vacxin và đối chứng cao có thể do nguyên nhân nồng độ vi khuẩn công quá cao. 40 4.3.2 Kết quả phản ứng vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể Bảng 4. 7. Kết quả giá trị hiệu giá kháng thể trung bình thí nghiệm 3 Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Trƣớc khi tiêm vacxin (ngày 1) Trƣớc khi công vi khuẩn (ngày 21) Sau khi công vi khuẩn (ngày 28) TTB n TTB n TTB n B1 (Có chất bổ trợ) 10 8 0 5 1200 4 x 10 9 1740 4 6240 2 3x10 9 2660 4 5414 3 B2(Không có chất bổ trợ) 10 8 1440 4 x 10 9 2380 4 x 3x10 9 3480 4 6240 4 ĐC 13 4 x A1(Có chất bổ trợ) 10 8 4080 4 6240 2 10 9 4680 4 6240 10 3x10 9 4540 4 6240 13 ĐC 403 4 x Ghi chú: B1(có chất bổ trợ), B2 (không chất bổ trợ) (Ei-151); A1 (Ei-23): có chất bổ trợ; TTB: giá trị hiệu giá kháng thể trung bình; n: số mẫu cá kiểm tra huyết thanh; x: không có mẫu (do sau khi công vi khuẩn cá đã chết hết); ĐC: mẫu đối chứng (cá thí nghiệm chỉ tiêm nƣớc muối sinh lí). Kết quả từ Bảng 4.7 cho thấy: trƣớc khi tiêm vacxin ngày thứ nhất, giá trị hiệu giá kháng thể trung bình (TTB) bằng 0. Ngày thứ 21 trƣớc khi công vi khuẩn, đối với 3 loại vacxin kết quả cho thấy nồng độ vacxin tiêm tăng dần (108, 109, 3 x10 9 ) thì TTB cũng tăng dần. So với hai nghiệm thức đối chứng A và B, các nghiệm thức vacxin có giá trị hiệu giá kháng thể trung bình cao hơn đáng kể, gấp khoảng 100 lần ở chủng vi khuẩn B (p < 0,05) và khoảng 10 lần ở chủng vi khuẩn A (p < 0,01). Trong đó vacxin B1 với nồng độ 3x109 có TTB cao gấp khoảng 2 lần vacxin với nồng độ 108 và 200 lần so với đối chứng (p < 0,05), vacxin A1 ở từng nồng độ đều có TTB cao và có sự khác biệt với đối chứng (p < 0,01) (Phụ lục 5.1 và 5.2). Nhƣ vậy, ta có thể kết luận rằng, các vacxin đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều 41 cho đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể. Các giá trị TTB của loại vacxin có chất bổ trợ của chủng Ei-23 (A1) cao gấp khoảng hai lần vacxin B1 (p < 0,01). Cụ thể ở từng nồng độ 3x109, 109, 108 vacxin A1 cao gấp vacxin B1 lần lƣợt là 1,7; 2,9; 3,4 (p < 0,01) (Phụ lục 5.3). Ta kết luận vacxin A1 có hiệu giá kháng thể trung bình cao hơn nhiều lần so với vacxin B1, nhƣ thế khả năng tạo đáp ứng miễn của vacxin A1 cao hơn vacxin B1. Đối với chủng vi khuẩn Ei-151, loại vacxin có chất bổ trợ (B1) có các giá trị TTB thấp hơn so với loại vacxin không có chất bổ trợ (B2), tuy nhiên giá trị này không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê và ngay cả khi so sánh ở từng nồng độ của hai loại vacxin này cũng không thấy sự khác biệt (p > 0,05) (Phụ lục 5.4). Cuối cùng, khi kết thúc thí nghiệm TTB của cá ở các nghiệm thức sử dụng vacxin còn sống là rất cao từ 5414 đến 6240. Tiếp tục so sánh hai loại vacxin B1 và B2, ta thấy ở nồng độ 109 vacxin B1 cá vẫn còn sống và có TTB = 6240, trong khi vacxin B2 cá chết hết. Còn ở nồng độ vacxin 3x109, TTB của cả hai loại vacxin đều cao và chúng không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê (p > 0,05) (Phụ lục 5.5). Nhƣ vậy vacxin có và không có chất bổ trợ phèn chua đều cho đáp ứng miễn dịch nhƣ nhau, tuy nhiên qua kết quả phân tích nêu trên ta có thể thấy vacxin với chất bổ trợ phèn chua có xu hƣớng tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn thể hiện qua tỉ lệ cá chết sau thí nghiệm, mà chúng tôi sẽ bình luận tiếp theo. Tỉ lệ cá chết của các nghiệm thức 95 100 9593 100 7174 90 46 100 100 100 0 20 40 60 80 100 120 B1 B2 A1 Loại vacxin Tỉ lệ (% ) 10^8 10^9 3x10^9 ĐC Biểu đồ 4. 2. Thể hiện tỉ lệ cá chết các nghiệm thức của thí nghiệm 3 42 Khi so sánh tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin B1 và A1 với đối chứng, ta thấy ở các nghiệm thức tiêm vacxin tuy cho tỉ lệ cá chết thấp so với đối chứng (100%) nhƣng đều ở mức cao (> 46%). Nghiệm thức ở nồng độ 3x109 của vacxin B1 cho tỉ lệ cá chết thấp so với đối chứng và với hai nghiệm thức còn lại (p < 0,01) (Phụ lục 4.2). Đối với vacxin A1, các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết cũng với tỉ lệ cao, tuy nhiên nghiệm thức ở nồng độ vacxin 3x109 tỉ lệ cá chết thấp hơn so với đối chứng và với cả hai nghiệm thức ở nồng độ 108, 109 (p < 0,01) (Phụ lục 4.2). Nhƣ vậy, khi so sánh tỉ lệ cá chết giữa các nghiệm thức vacxin cho ta thấy vacxin với nồng độ 3x109 CFU/cá có tỉ lệ cá chết thấp hơn so với cá đối chứng và cá ở nồng độ vacxin 108 và 109. Điều này, chúng ta có thể xác định rằng nồng độ vacxin 3x10 9 CFU/cá là nồng độ vacxin thích hợp nhất để chọn tiêm cho cá tra. Tuy nhiên, một vacxin đƣợc xem là hiệu quả khi tỉ lệ chết của cá ở nghiệm thức vacxin dƣới 24% (hay tỉ lệ bảo hộ trên 76%) trong điều kiện cá đối chứng chết trong khoảng 60 - 80% (Nordmo, 1997). Nhƣng cá ở tất cả các nghiệm thức vaxcin và đối chứng trong thí nghiệm này đều không đạt đƣợc yêu cầu trên (tỉ lệ cá chết khá cao). Một điều cần chú ý là cá ở các nghiệm thức tiêm vacxin đều tạo ra đáp ứng miễn dịch thể hiện qua giá trị hiệu giá kháng thể trung bình cao so với cá ở các nghiệm thức đối chứng. Nhƣ vậy, nguyên nhân dẫn tới kết quả tỉ lệ cá chết cao là do nồng độ vi khuẩn công quá cao khiến cá không có khả năng chống chịu nổi, nhất là đối với chủng vi khuẩn B. So sánh hai loại vacxin B1 có chất bổ trợ phèn chua và B2 không có chất bổ trợ về khả năng gia tăng sức đề kháng của cá tra đối với Ed. ictaluri, ta thấy khi công vi khuẩn sống với cùng liều lƣợng thì tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức sử dụng chất bổ trợ phèn chua thấp hơn so với các nghiệm thức không dùng chất bổ trợ, và ở từng nồng độ đều có sự khác biệt, trong đó nồng độ 3x109 của vacxin B1 cho tỉ lệ cá chết thấp hơn của vacxin B2 (p < 0,05) (Phụ lục 4.3 ). Hơn nữa, do nồng độ vi khuẩn chủng Ei-151 công cho cá quá cao nên chúng tôi không thể đánh giá hay so sánh hiệu quả bảo hộ của hai loại vacxin (có và không có chất bổ trợ) ở các nồng độ vacxin tiêm so với nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên, ta cũng có thể kết luận bƣớc 43 đầu, vacxin sử dụng chất bổ trợ phèn chua có khả năng gia tăng sức đề kháng của cá tra tốt hơn vacxin không dùng chất bổ trợ, nhƣng điều này cần phải đƣợc nghiên cứu thêm ở những thí nghiệm kế tiếp. Tóm lại ở thí nghiệm này ta có thể khẳng định những điều sau:  Vacxin có hoặc không có chất bổ trợ phèn chua có tỉ lệ bảo hộ thấp mặc dù khả năng gây đáp ứng miễn dịch của chúng là tốt điều này liên quan tới nồng độ vi khuẩn công cƣờng độc là chƣa hợp lý (nồng độ vi khuẩn công cƣờng độc cho cá cao khiến tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức cao).  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua và vacxin không có chất bổ trợ phèn chua về khả năng gia tăng sức đề kháng là có sự khác biệt theo so sánh thống kê, và vacxin có chất bổ trợ phèn chua có xu hƣớng đáp ứng miễn dịch tốt hơn. Nhƣ thế chúng ta cần có sự nghiên cứu thêm về vai trò của chất bổ trợ phèn chua đồng thời với các chất bổ trợ khác nhằm tăng hiệu lực của vacxin.  Nồng độ vacxin 3x109 CFU/cá là nồng độ vacxin thích hợp nhất để chọn tiêm cho cá tra. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG không hiệu quả, không có tính an toàn.  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua bƣớc đầu thử nghiệm có độ an toàn, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trên cá tra đối với vi khuẩn Ed. ictaluri.  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua mặc dù tạo ra đáp ứng miễn dịch tốt thể hiện qua hiệu giá kháng thể cao, tuy nhiên tỉ lệ bảo hộ thấp là do có liên quan mật thiết đến nồng độ vi khuẩn công cƣờng độc cao.  Nồng độ vacxin 3x109 CFU/cá là thích hợp nhất cho vacxin có chất bổ trợ phèn chua. 5.2 Đề nghị  Xác định thêm LD50 cho từng chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập từ cá tra ở các thời điểm khác nhau ứng với các loại cá thí nghiệm có kích cở khác nhau để có liều công cƣờng độc chính xác hơn.  Tiếp tục thử nghiệm vacxin với chất bổ trợ phèn chua dùng nồng độ vacxin là 3 x109 CFU/0,2ml và công cƣờng độc vi khuẩn với các nồng độ khác nhau (nồng độ công cƣờng độc thấp hơn) để chọn nồng độ vi khuẩn thích hợp.  Dùng kỹ thuật ELISA gián tiếp để xác đinh hiệu giá kháng thể nhằm đem lại kết quả xác định hiệu giá kháng thể chính xác hơn.  Thử nghiệm vacxin nghiên cứu ngoài thực địa (ao/bè nuôi) để xác định khả năng sử dụng của loại vacxin này. 45  Tiếp tục nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh đốm trắng trên cá tra nói chung và bệnh nhiễm khuẩn trên các đối tƣợng cá nuôi công cƣờng độc nghiệp khác. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt 1. Từ Thanh Dung, 1994. Phòng và trị bệnh cá nước ngọt. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. 32 trang. 2. Từ Thanh Dung, M Crumlish, H W Ferguson, N T N Ngọc, N Q Thịnh và D T M Thy, 2003. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. Tuyển tập báo cáo khoa học về nuôi thủy sản, tr 411 – 415. 3. Lê Minh Hải và ctv., 2004. Thử nghiệm vaxcine Norvax VIB trong nuôi tôm sú. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 1984 – 2004. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III, trang 463 - 475. 4. Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004. Bệnh học thuỷ sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM, tr 125 – 164. 5. Lê Văn Hùng, 2002. Miễn dịch học thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. HCM. 192 trang. 6. Phạm Văn Khánh, 1997. Sinh sản nhân tạo cá tra. Báo cáo khoa học - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 8 trang. 7. Phạm Văn Khánh, 2000. Kỹ thuật nuôi cá tra và basa trong bè. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh. 40 trang. 8. Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005. Kỹ thuật nuôi một số loài cá kinh tế nước ngọt và phòng trị bệnh cá. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. 102 trang. 9. Nguyễn Ngọc Lanh và ctv., 1997. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 342 trang. 10. Nguyễn Ngọc Nhiên và ctv., 1992. Miễn dịch đại cương. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 56 – 66. 11. Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003. Nghiên cứu tác nhân hoại tử trên cơ quan nội tạng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tuyển tập nghề cá đồng bằng sông Cửu Long 2003, tr 315 - 321. 47 12. Bùi Quang Tề và ctv., 1994. Những bệnh thường gặp của tôm cá nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. 40 trang. 13. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 110 trang. 14. Trần Thanh Xuân, 1996. Một số đặc điểm sinh học và sinh sản nhân tạo cá tra (Pangasius hypophthalmus). Các báo cáo khoa học đã được trình bày tại hội thảo quốc tế. Bộ Thủy Sản - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, tr 80 - 82. 15. Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994. Kỹ thuật nuôi cá nước ngọt. Sở Khoa học Công Nghệ và Môi Trƣờng An Giang. 230 trang. 2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 16. Anderson D. P., 1997. Adjuvants and immunostimulants for enhancing vaccine potency in fish. Fish vaccinology 90: 257 – 265. 17. Evelyn T. P. T., 1997. A historical review of fish vaccinology. Fish vaccinology 90: 3 – 12. 18. Ferguson H. W., Turnbull J. F., Shinn A., Thompson K., Dung T. T. and Crumlish M., 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 24: 509 – 513. 19. Gudding R., Lillehaug A., Evensen Q., 1999. Recent development in fish vaccinology. Veterinary Imumunology and Immunopathology 72: 203 – 212. 20. Hawke J. P., 1979. A beterium asociated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of Fisheries Research Board of Cannada 36: 1508 – 1512. 21. Muiswinkel W. B., Wiegertjes G. F., 1997. Immune responses after injection vaccination of fish. Fish vaccinology 90: 55 – 57. 22. Nakanishi T., Ototake M., 1997. Antigen uptake and immune responses after immersion vaccination. Fish vaccinology 90: 59 – 68. 23. Nordmo R., 1997. Strengths and weaknesses of different challenge methods. Fish vaccinology 90: 303 – 309. 48 24. Quentel C., Vigneulle M., 1997. Antigen uptake and immune responses after oral vaccination. Fish vaccinology 90: 69 – 78. 25. Tyler J. W., Klesius P. H., 1994. Decreased resistance to Ed. ictaluri infection in Channel Catfish intraperitoneally administered an oil adjuvant. Journal of Aquatic Animal Health 6: 275 – 278. 3. Tài liệu từ internet 1. www.fistenet.com.vn 2. www.vietlinh.com.vn 3. www.taxonomy.nl/Taxonomicon/TaxonTree.aspx.id=153008 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các số đo của cá thí nghiệm 1 STT p (g/con) L (mm) Lo (mm) H (mm) 1 51,52 20,3 18,1 3,5 2 39,3 18,4 16,1 3,2 3 50,18 20,7 18,2 3,6 4 57,97 21,5 18,5 3,6 5 41,42 18,5 16,7 3,1 6 41,92 19,2 16,5 2,8 7 39,56 18,2 16,1 3,1 8 32,74 17,5 14,5 2,6 9 50,17 20,2 17,5 3,1 10 32,45 17,7 15,2 2,6 11 48,8 20,1 17,1 3,6 12 35,69 17,8 15,6 2,8 13 46,96 19,5 17,2 3,2 14 44,84 19,5 16,8 3,2 15 44,44 19,2 16,5 3,2 16 60,16 20,7 18,5 3,5 17 40,17 19,1 16,2 2,8 18 34,14 17,8 15,2 2,8 19 41,78 17,5 15,1 3,1 20 37,67 18,7 16,5 3,1 21 43,73 18,5 16,3 3,3 22 52,81 19,1 17,1 3,4 23 47,79 20,1 17,1 3,4 24 39,62 18,2 16,1 3,1 25 39,84 18,2 16,1 3,1 26 38,77 18,5 16,1 2,7 27 36,44 19,1 15,1 2,8 28 49,33 19,1 16,5 3,4 29 41,2 18,2 16,1 3,4 30 40,15 17,2 16,1 2,8 TB 43,39 18,94 16,49 3,13 max 60,16 21,5 18,5 3,6 min 32,45 17,2 14,5 2,6 Ghi chú: P (g): Trọng lƣợng của cá tra thí nghiệm; L (mm): Chiều dài tổng; Lo (mm): Chiều dài chuẩn; H (mm): Chiều cao thân; TB (g): giá trị trung bình; max: giá trị lớn nhất; min: giá trị nhỏ nhất. Phụ lục 2: Các số đo của cá thí nghiệm 2: STT p (g/con) L (mm) Lo (mm) H (mm) 1 55,46 19 17,2 3,7 2 69,49 22,7 19,5 3,8 3 52,43 19,2 16,5 3,4 4 43,09 16,8 14,8 3,4 5 73,74 22 18,5 4 6 61,87 20 18 3,6 7 57,35 19,3 15,8 3,1 8 71,77 22,5 19 4 9 68,17 20,5 17,5 3,7 10 57,76 19 16,7 3,6 11 51,52 19,2 16,2 3,5 12 74,43 22 19,5 4 13 74,3 22,5 19 4 14 50,68 19 16 3,2 15 46,87 18,5 16 3,3 16 54,63 20,5 17,5 3,4 17 73,95 21,4 18 4,3 18 71,65 21,5 18,5 3,5 19 66,52 21 17,5 3,8 20 49,83 19,5 16,8 3,4 21 55,43 20,5 18 3,5 22 50,54 20 17 3,6 23 47,87 19,5 16,2 3,2 24 70,39 22,3 18,2 3,9 25 60,95 20,4 17,5 3,6 26 71,75 19 16,5 3,5 27 52,21 21,5 19 3,8 28 74,98 21,5 19 3,6 29 53,55 20,5 17,3 3,6 30 66,25 20,7 18,5 3,8 TB 60,98 20,4 17,52 3,63 max 74,98 22,7 19,5 4,3 min 43,09 16,8 14,8 3,1 Ghi chú: P (g): Trọng lƣợng của cá tra thí nghiệm; L (mm): Chiều dài tổng; Lo (mm): Chiều dài chuẩn; H (mm): Chiều cao thân; TB (g): giá trị trung bình; max: giá trị lớn nhất; min: giá trị nhỏ nhất. Phụ lục 3: Các số đo của cá thí nghiệm 3: STT p (g/con) L (mm) Lo (mm) H (mm) 1 80,42 23,5 19 4,2 2 75,12 20,2 17,2 3,8 3 77,8 19,9 16,9 3,5 4 98,52 19,5 16,8 3,7 5 53,9 18,8 15,8 3,6 6 76,45 21 17,9 3,9 7 57,35 19,3 15,8 3,1 8 71,77 22,5 19,2 4,2 9 56,54 18,5 15,6 3,5 10 50,25 18,4 15,6 3,5 11 53,89 19,6 16,9 3,7 12 66,12 20,3 17,2 4,1 13 80,4 22,6 19,5 4,5 14 72,24 21,2 18,1 4,2 15 74,21 21,9 18,6 3,9 16 50,07 19,9 16,5 3,8 17 52,97 19,2 16,4 3,6 18 53,13 19,8 16,8 3,8 19 58,83 19,5 16,6 3,4 20 50,41 19,8 16,6 3,8 21 54,91 19,8 16,1 3,7 22 51,61 18,5 18,9 3,4 23 76,17 22,6 18,8 4,2 24 70,39 22,3 18,2 3,9 25 71,53 20,9 16,3 3,2 26 42,71 18,6 16,3 3,2 27 52,21 19,4 16,4 3,8 28 80,4 22,6 19,5 4,5 29 50,41 19,8 16,6 3,8 30 50,07 19,9 16,5 3,8 TB 63,69 20,33 17,22 3,78 max 98,52 23,5 19,5 4,5 min 42,71 18,4 15,6 3,1 Ghi chú: P (g): Trọng lƣợng của cá tra thí nghiệm; L (mm): Chiều dài tổng; Lo (mm): Chiều dài chuẩn; H (mm): Chiều cao thân; TB (g): giá trị trung bình; max: giá trị lớn nhất; min: giá trị nhỏ nhất. Phụ lục 4: Bảng ANOVA về mối quan hệ giữa tỉ lệ cá chết của các loại vacxin với nhau và với đối chứng 4.1. So sánh vacxin B1 và đối chứng One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 778.00000 3 259.33333 172.889 .0001 Within groups 6.00000 4 1.50000 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 784.00000 7 Table of means for B1DC1.Tlcachet by B1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ------- ĐC 2 100.000000 .0000000 .8660254 98.299179 101.7008 b1-108 2 95.000000 1.0000000 .8660254 93.299179 96.7008 b1-109 2 93.000000 1.0000000 .8660254 91.299179 94.7008 b1-3x109 2 74.000000 1.0000000 .8660254 72.299179 75.7008 ------------------------------------------------------------------------- ------- Total 8 90.500000 .4330127 .4330127 89.649589 91.35041 Multiple range analysis for B1DC1.Tlcachet by B1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1-3x109 2 74.000000 X b1-109 2 93.000000 X b1-108 2 95.000000 X ĐC 2 100.000000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - b1-108 5.00000 3.40164 * ĐC - b1-109 7.00000 3.40164 * ĐC - b1-3x109 26.0000 3.40164 * b1-108 - b1-109 2.00000 3.40164 b1-108 - b1-3x109 21.0000 3.40164 * b1-109 - b1-3x109 19.0000 3.40164 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.2. So sánh vacxin A1 và đối chứng One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------ Source of var Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 3692.0000 3 1230.6667 820.444 .0000 Within groups 6.0000 4 1.5000 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3698.0000 7 Table of means for A1DC1.Tlcachet by A1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 100.000000 .0000000 .8660254 98.299179 101.70082 a1-108 2 95.000000 1.0000000 .8660254 93.299179 96.70082 a1-109 2 71.000000 1.0000000 .8660254 69.299179 72.70082 a1-3x109 2 46.000000 1.0000000 .8660254 44.299179 47.70082 ------------------------------------------------------------------------- Total 8 78.000000 .4330127 .4330127 77.149589 Multiple range analysis for A1DC1.Tlcachet by A1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- a1-3x109 2 46.000000 X a1-109 2 71.000000 X a1-108 2 95.000000 X ĐC 2 100.000000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - a1-108 5.00000 3.40164 * ĐC - a1-109 29.0000 3.40164 * ĐC - a1-3x109 54.0000 3.40164 * a1-108 - a1-109 24.0000 3.40164 * a1-108 - a1-3x109 49.0000 3.40164 * a1-109 - a1-3x109 25.0000 3.40164 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.3. So sánh vacxin B1 và B2 Analysis of Variance for B1B211.Tlcachet - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:B1B211.vacxin 261.33333 1 261.33333 28.000 .0007 B:B1B211.nongdo 602.00000 2 301.00000 32.250 .0001 RESIDUAL 74.666667 8 9.3333333 ------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 938.00000 11 Multiple range analysis for B1B211.Tlcachet by B1B211.vacxin ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1 6 87.333333 X b2 6 96.666667 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits b1 - b2 -9.33333 4.06855 * ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1B211.Tlcachet by B1B211.nongdo ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 3x109 4 82.000000 X 109 4 96.500000 X 108 4 97.500000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 108 - 109 1.00000 4.98293 108 - 3x109 15.5000 4.98293 * 109 - 3x109 14.5000 4.98293 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 932.00000 5 186.40000 186.400 .0000 Within groups 6.00000 6 1.00000 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 938.00000 11 Table of means for B1B211.Tlcachet by B1B211.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- B1-108 2 95.000000 1.0000000 .7071068 93.776173 96.22383 B1-109 2 93.000000 1.0000000 .7071068 91.776173 94.22383 B1-3x109 2 74.000000 1.0000000 .7071068 72.776173 75.22383 B2-108 2 100.000000 .0000000 .7071068 98.776173 101.22383 B2-109 2 100.000000 .0000000 .7071068 98.776173 101.22383 B2-3x109 2 90.000000 .0000000 .7071068 88.776173 91.22383 ------------------------------------------------------------------------- Total 12 92.000000 .2886751 .2886751 91.500375 92.49963 Multiple range analysis for B1B211.Tlcachet by B1B211.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- B1-3x109 2 74.000000 X B2-3x109 2 90.000000 X B1-109 2 93.000000 X B1-108 2 95.000000 X B2-108 2 100.000000 X B2-109 2 100.000000 X contrast difference limits B1-108 - B1-109 2.00000 2.44765 B1-108 - B1-3x109 21.0000 2.44765 * B1-108 - B2-108 -5.00000 2.44765 * B1-108 - B2-109 -5.00000 2.44765 * B1-108 - B2-3x109 5.00000 2.44765 * B1-109 - B1-3x109 19.0000 2.44765 * B1-109 - B2-108 -7.00000 2.44765 * B1-109 - B2-109 -7.00000 2.44765 * B1-109 - B2-3x109 3.00000 2.44765 * B1-3x109 - B2-108 -26.0000 2.44765 * B1-3x109 - B2-109 -26.0000 2.44765 * B1-3x109 - B2-3x109 -16.0000 2.44765 * B2-108 - B2-109 0.00000 2.44765 B2-108 - B2-3x109 10.0000 2.44765 * B2-109 - B2-3x109 10.0000 2.44765 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 5: Bảng ANOVA về mối quan hệ giá trị hiệu giá kháng thể trung bình của các loại vacxin với nhau và với đối chứng 5.1. So sánh vacxin B1 và đối chứng: Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 7336634.4 3 2445544.8 12.501 .0168 Within groups 782512.5 4 195628.1 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 8119146.9 7 Table of means for B1DC.hieugia by B1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 12.5000 7.50000 312.75240 -601.7268 626.7268 b1-108 2 1200.0000 400.00000 312.75240 585.7732 1814.2268 b1-109 2 1740.0000 140.00000 312.75240 1125.7732 2354.2268 b1-3x109 2 2660.0000 460.00000 312.75240 2045.7732 3274.2268 ------------------------------------------------------------------------- Total 8 1403.1250 156.37620 156.37620 1096.0116 1710.2384 Multiple range analysis for B1DC.hieugia by B1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 12.5000 X b1-108 2 1200.0000 XX b1-109 2 1740.0000 XX b1-3x109 2 2660.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - b1-108 -1187.50 1228.45 ĐC - b1-109 -1727.50 1228.45 * ĐC - b1-3x109 -2647.50 1228.45 * b1-108 - b1-109 -540.000 1228.45 b1-108 - b1-3x109 -1460.00 1228.45 * b1-109 - b1-3x109 -920.000 1228.45 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 5.2. So sánh vacxin A1 và đối chứng: Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 24765559 3 8255186.5 91.315 .0004 Within groups 361613 4 90403.1 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 25127172 7 Table of means for A1DC.hieugia by A1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 402.5000 242.50000 212.60659 -15.0465 820.0465 a1-108 2 4080.0000 320.00000 212.60659 3662.4535 4497.5465 a1-109 2 4680.0000 .00000 212.60659 4262.4535 5097.5465 a1-3x109 2 4540.0000 140.00000 212.60659 4122.4535 4957.5465 ------------------------------------------------------------------------- Total 8 3425.6250 106.30330 106.30330 3216.8518 3634.3982 Multiple range analysis for A1DC.hieugia by A1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 402.5000 X a1-108 2 4080.0000 X a1-3x109 2 4540.0000 X a1-109 2 4680.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - a1-108 -3677.50 835.093 * ĐC - a1-109 -4277.50 835.093 * ĐC - a1-3x109 -4137.50 835.093 * a1-108 - a1-109 -600.000 835.093 a1-108 - a1-3x109 -460.000 835.093 a1-109 - a1-3x109 140.000 835.093 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 5.3. So sánh vacxin B1 và A1: Analysis of Variance for B1A1.hieugia - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:B1A1.vacxin 19763333 1 19763333 115.530 .0000 B:B1A1.nongdo 1864800 2 932400 5.451 .0447 INTERACTIONS AB 709066.67 2 354533.33 2.072 .2069 RESIDUAL 1026400.0 6 171066.67 ------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 23363600 11 ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1A1.hieugia by B1A1.vacxin ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1 6 1866.6667 X a1 6 4433.3333 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits b1 - a1 -2566.67 584.483 * ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1A1.hieugia by B1A1.nongdo ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 108 4 2640.0000 X 109 4 3210.0000 XX 3x109 4 3600.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 108 - 109 -570.000 759.678 108 - 3x109 -960.000 759.678 * 109 - 3x109 -390.000 759.678 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference ------------------------------------------------------------------------- Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 22337200 5 4467440.0 26.115 .0005 Within groups 1026400 6 171066.7 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 23363600 11 Table of means for B1A1.hieugia by B1A1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- B1-108 2 1200.0000 400.00000 292.46082 693.8227 1706.1773 B1-109 2 1740.0000 140.00000 292.46082 1233.8227 2246.1773 B1-3x109 2 2660.0000 460.00000 292.46082 2153.8227 3166.1773 A1-108 2 4080.0000 320.00000 292.46082 3573.8227 4586.1773 A1-109 2 4680.0000 .00000 292.46082 4173.8227 5186.1773 A1-3x109 2 4540.0000 140.00000 292.46082 4033.8227 5046.1773 ------------------------------------------------------------------------- Total 12 3150.0000 119.39663 119.39663 2943.3540 3356.6460 ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1A1.hieugia by B1A1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- B1-108 2 1200.0000 X B1-109 2 1740.0000 XX B1-3x109 2 2660.0000 X A1-108 2 4080.0000 X A1-3x109 2 4540.0000 X A1-109 2 4680.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits B1-108 - B1-109 -540.000 1012.35 B1-108 - B1-3x109 -1460.00 1012.35 * B1-108 - A1-108 -2880.00 1012.35 * B1-108 - A1-109 -3480.00 1012.35 * B1-108 - A1-3x109 -3340.00 1012.35 * B1-109 - B1-3x109 -920.000 1012.35 B1-109 - A1-108 -2340.00 1012.35 * B1-109 - A1-109 -2940.00 1012.35 * B1-109 - A1-3x109 -2800.00 1012.35 * B1-3x109 - A1-108 -1420.00 1012.35 * B1-3x109 - A1-109 -2020.00 1012.35 * B1-3x109 - A1-3x109 -1880.00 1012.35 * A1-108 - A1-109 -600.000 1012.35 A1-108 - A1-3x109 -460.000 1012.35 A1-109 - A1-3x109 140.000 1012.35 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 5.4. So sánh vacxin B1 (Có chất bổ trợ) và B2 (Không chất bổ trợ): Analysis of Variance for B1B2.hieugia - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean squa F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:B1B21.vacxin 963333.3 1 963333.3 2.231 .1859 B:B1B21.nongdo 6173600.0 2 3086800.0 7.148 .0258 INTERACTIONS AB 176266.67 2 88133.333 .204 .8208 RESIDUAL 2591200.0 6 431866.67 ------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 9904400.0 11 ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1B2.hieugia by B1B2.vacxin ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1 6 1866.6667 X b2 6 2433.3333 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits b1 - b2 -566.667 928.676 ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1B21.hieugia by B1B21.nongdo ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 108 4 1320.0000 X 109 4 2060.0000 XX 3x109 4 3070.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 108 - 109 -740.000 1137.39 108 - 3x109 -1750.00 1137.39 * 109 - 3x109 -1010.00 1137.39 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 7313200.0 5 1462640.0 3.387 .0848 Within groups 2591200.0 6 431866.7 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 9904400.0 11 ----------------------------------------------------------------------- Table of means for B1B21.hieugia by B1B21.nt ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- B1-108 2 1200.0000 400.00000 464.68627 395.7431 2004.2569 B1-109 2 1740.0000 140.00000 464.68627 935.7431 2544.2569 B1-3x109 2 2660.0000 460.00000 464.68627 1855.7431 3464.2569 B2-108 2 1440.0000 160.00000 464.68627 635.7431 2244.2569 B2-109 2 2380.0000 180.00000 464.68627 1575.7431 3184.2569 B2-3x109 2 3480.0000 920.00000 464.68627 2675.7431 4284.2569 ------------------------------------------------------------------------- Total 12 2150.0000 189.70738 189.70738 1821.6635 2478.3365 ---------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1B21.hieugia by B1B21.nt ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- B1-108 2 1200.0000 X B2-108 2 1440.0000 X B1-109 2 1740.0000 X B2-109 2 2380.0000 XX B1-3x109 2 2660.0000 XX B2-3x109 2 3480.0000 X ------------------------------------------------------------------------ contrast difference limits B1-108 - B1-109 -540.000 1608.51 B1-108 - B1-3x109 -1460.00 1608.51 B1-108 - B2-108 -240.000 1608.51 B1-108 - B2-109 -1180.00 1608.51 B1-108 - B2-3x109 -2280.00 1608.51 * B1-109 - B1-3x109 -920.000 1608.51 B1-109 - B2-108 300.000 1608.51 B1-109 - B2-109 -640.000 1608.51 B1-109 - B2-3x109 -1740.00 1608.51 * B1-3x109 - B2-108 1220.00 1608.51 B1-3x109 - B2-109 -820.000 1608.51 B1-3x109 - B2-3x109 280.000 1608.51 B2-108 - B2-109 -940.000 1608.51 B2-108 - B2-3x109 -2040.00 1608.51 * B2-109 - B2-3x109 -1100.00 1608.51 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 5.5. So sánh vacxin B1 và B2 ở nồng độ 3x109 CFU/cá (sau khi công vi khuẩn cá còn sống sót). One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 683102.25 1 683102.25 14.986 .0607 Within groups 91164.50 2 45582.25 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 774266.75 3 Table of means for B1B23109.hieugia by B1B23109.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- b1-3x109 2 5413.5000 213.50000 150.96730 4954.1918 5872.8082 b2-3x109 2 6240.0000 .00000 150.96730 5780.6918 6699.3082 ------------------------------------------------------------------------- Total 4 5826.7500 106.75000 106.75000 5501.9701 6151.5299 Multiple range analysis for B1B23109.hieugia by B1B23109.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1-3x109 2 5413.5000 X b2-3x109 2 6240.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits b1-3x109 - b2-3x109 -826.500 918.616 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.