Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

ng khung 100% so vôùi trình töï goác treân plasmid pBIns (Hình 3.6). -84- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.4. Sô ñoà taùi taïo doøng gen mpi töø plasmid pBIns vaøo plasmid pET-43.1a taïo plasmid taùi toå hôïp pET43Ins bieåu hieän 6xHis-MPI. -85- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.5. Keát quaû saøng loïc doøng E. coli DH5α mang plasmid pET43Ins baèng phöông phaùp caét giôùi haïn. Gieáng 1, Thang DNA 1kb; 2, Plasmid pET43Ins caét baèng NdeI /XhoI; 3, Gen mpi. Hình 3.6. Keát quaû kieåm tra möùc ñoä ñoàng khung cuûa gen mpi treân plasmid pET43Ins. -86- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Nhö vaäy, chuùng toâi ñaõ taùi taïo doøng thaønh coâng gen mpi vaøo plasmid bieåu hieän pET-43.1a taïo plasmid taùi toå hôïp pET43Ins mang gen mpi dung hôïp maõ hoùa mini-proinsulin daïng dung hôïp vôùi theû 6xHis (6xHis-MPI). 3.1.3.2. Taïo doøng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins bieåu hieän 6xHis-MPI Plasmid pET43Ins ñöôïc bieán naïp vaøo teá baøo E. coli BL21(DE3) baèng phöông phaùp ñieän bieán naïp. Theå bieán naïp ñöôïc saøng loïc baèng caùch nuoâi caáy treân moâi tröôøng LB-Amp. Caùc khuaån laïc moïc ñöôïc treân moâi tröôøng naøy ñöôïc choïn laøm doøng döï tuyeån ñeå kieåm tra söï bieåu hieän protein 6xHis-MPI cuûa gen mpi. Tieán haønh thí nghieäm theo caùc thao taùc nhö ôû muïc 2.4.3, 2.4.4. Keát quaû phaân tích SDS-PAGE (Hình 3.7 A) cho thaáy coù söï xuaát hieän moät vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa (gieáng 5) khi doøng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ñöôïc caûm öùng vôùi IPTG. Ñaây laø daïng protein dung hôïp giöõa MPI vaø theû 6xHis. Caùc maãu ñoái chöùng (gieáng 2, 3, 4) khoâng xuaát hieän vaïch protein naøy. ÔÛ gieáng 3, xuaát hieän vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 64 kDa khi doøng E. coli BL21(DE3)/pET-43.1a ñöôïc caûm öùng, ñaây laø protein HisTag-NusA ñöôïc maõ hoùa bôûi plasmid pET-43.1a, ñöôïc söû duïng nhö moät chöùng döông nhaèm xaùc nhaän laø plasmid pET-43.1a ñöôïc bieán naïp vaøo chuûng E. coli BL21(DE3) cuõng coù theå bieåu hieän ñöôïc caùc protein theo trình töï treân plasmid khi ñöôïc caûm öùng baèng IPTG. Plasmid pET43Ins ñaõ ñöôïc caét boû vuøng gen maõ hoùa cho HisTag-NusA trong quaù trình caét noái neân khi caûm öùng chæ coù theå bieåu hieän 6xHis-MPI (gieáng 5). Keát quaû naøy cho thaáy doøng teá baøo E. coli BL21(DE3) coù mang pET43Ins coù khaû naêng toång hôïp protein dung hôïp 6xHis-MPI. Vaïch protein treân SDS-PAGE (ôû gieáng 5) ñöôïc khaúng ñònh laø protein dung hôïp 6xHis-MPI baèng phöông phaùp Western Blot söû duïng khaùng theå khaùng 6xHis vaø khaùng theå HUI-001 khaùng insulin. Caùc böôùc thao taùc như ñaõ ñöôïc trình baøy trong phaàn Phöông phaùp 2.4.4.c. Keát quaû ñöôïc trình baøy treân Hình 3.7 B, C. -87- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Tröôøng hôïp söû duïng khaùng theå khaùng 6xHis, baûn hieän phim Hình 3.7 B cho thaáy coù söï xuaát hieän hai vaïch: vaïch 9 kDa töông öùng vôùi 6xHis-MPI vaø vaïch 64 kDa töông öùng vôùi HisTag-NusA (chöùng döông) treân gel cuûa SDS-PAGE. Tröôøng hôïp söû duïng khaùng theå khaùng insulin (Hình 3.7 C), chæ xuaát hieän moät vaïch töông öùng vôùi vaïch khoaûng 9 kDa laø cuûa 6xHis-MPI (gieáng 5). Caùc keát quaû naøy cho pheùp keát luaän raèng protein coù troïng löôïng phaân töû khoaûng 9 kDa bieåu hieän töø chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins chính laø protein dung hôïp 6xHis-MPI. Hình 3.7. Kieåm tra söï bieåu hieän cuûa 6xHis-MPI bôûi E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. A, Keát quaû ñieän di SDS-PAGE; B, Keát quaû lai Western-Blot vôùi khaùng theå khaùng 6xHis; C, Western-Blot vôùi khaùng theå HUI-001 khaùng insulin. 1, Thang phaân töû löôïng protein; 2, E. coli BL21 (DE3); 3, E. coli BL21 (DE3)/pET43.1.a/IPTG; 4, E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins; 5, E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins/IPTG. 3.1.4. Kieåm tra trình töï amino acid cuûa 6xHis-MPI Maãu 6xHis-MPI thu nhaän ôû treân ñöôïc xöû lyù baèng CNBr ñeå caét loaïi theû 6xHis, thu nhaän MPI. Tieán haønh giaûi trình töï amino acid cuûa MPI theo phöông phaùp moâ taû ôû phaàn Phuï luïc. Keát quaû cho thaáy vieäc thuûy phaân khoâng hoaøn toaøn baèng trypsin taïo ra 23 peptide coù trình töï GFFYTPK töông öùng vôùi 7 amino acid -88- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän ñaàu C cuûa chuoãi B trong MPI (Hình 3.8 A). Hình 3.9 trình baøy saéc kyù ñoà khoái phoå nhaän daïng trình töï FFYTPKTR cuûa MPI. Caùc keát quaû cho thaáy MPI ñöôïc bieåu hieän coù trình töï amino acid töông öùng trình töï ñaõ coâng boá treân ngaân haøng gen coù maõ soá truy caäp gi:266373 [76]. (A) (B) Hình 3.8. Nhaän dieän caùc peptide ñöôïc taïo thaønh töø söï thuûy phaân MPI. A, Caùc peptide thu ñöôïc töø MPI chöùa trình töï GFFYTPK. B, Nhaän dieän peptide taïo ra treân MPI. -89- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.9. Saéc kyù ñoà MS/MS ñoaïn peptide chöùa trình töï FFYTPTR cuûa MPI. 3.2. Leân men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins toång hôïp 6xHis- MPI taùi toå hôïp ôû qui moâ phoøng thí nghieäm vaø qui moâ pilot 3.2.1. Hoaït hoùa, nhaân gioáng vaø kieåm tra khaû naêng bieåu hieän 6xHis-MPI cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins Chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ñöôïc nuoâi caáy moâi tröôøng LB agar ñeå thu nhaän khuaån laïc ñôn duøng ñeå hoaït hoùa vaø nuoâi caáy. Keát quaû theo doõi ñoäng hoïc taêng tröôûng cuûa chuûng trong quaù trình nhaân gioáng ñöôïc bieåu dieãn theo Hình 3.10. Quaù trình nhaân gioáng keát thuùc sau 6,5 giôø nuoâi caáy, ñaït OD600nm = 1,7. Phaân tích noàng ñoä teá baøo khoâ (DCW) ñaït 4,9 g/L. Luùc naøy chuûng ñang ôû pha taêng -90- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän tröôûng, coù hoaït tính toát nhaát, duøng laøm gioáng maàm cho caùc thí nghieäm veà sau cuûa nghieân cöùu naøy. Gioáng maàm ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh 4oC, söû duïng trong 1 tuaàn. Hieäu suaát sinh toång hôïp teá baøo tính treân cô chaát cao naám men Yx/s ñaït 49% (Yx/s=4,9/10*100 = 49%). 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 0 1 2 3 4 5 6 7 Thôøi gian nuoâi caáy (giôø) O D 60 0n m Hình 3.10. Ñoäng hoïc taêng tröôûng cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trong moâi tröôøng LB. Chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins sau quaù trình nhaân gioáng ñöôïc tieán haønh nuoâi caáy ñeå kieåm tra söï bieåu hieän theo phöông phaùp ñaõ trình baøy trong muïc 2.4.4. Keát quaû kieåm tra bieåu hieän theo phöông phaùp ñieän di SDS-PAGE vaø xaùc nhaän söï bieåu hieän baèng phöông phaùp Western Blot ñöôïc trình baøy treân Hình 3.11. Keát quaû treân Hình 3.11 A cho thaáy thaáy ôû gieáng 3 coù xuaát hieän moät vaïch kích thöôùc khoaûng 9 kDa, töông öùng vôùi kích thöôùc cuûa 6xHis-MPI trong khi ñoù ôû chöùng aâm (gieáng 2) khoâng thaáy xuaát hieän vaïch protein naøy. Keát quaû xaùc nhaän protein bieåu hieän baèng phöông phaùp lai Western Blot vôùi khaùng theå khaùng histidine. Hình 3.11 B cuõng cho thaáy coù söï xuaát hieän moät vaïch ôû gieáng 3, töông -91- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän öùng vôùi 6xHis-MPI. Töø ñoù coù theå keát luaän raèng chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins nuoâi caáy taïo gioáng maàm coù khaû naêng bieåu hieän 6xHis- MPI vöôït möùc khi ñöôïc caûm öùng baèng IPTG vaø gioáng maàm naøy coù theå söû duïng ñöôïc ñeå phuïc vuï cho caùc thí nghieäm leân men nghieân cöùu caûm öùng bieåu hieän sau naøy. Hình 3.11. Keát quaû kieåm tra söï bieåu hieän 6xHis-MPI cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins. A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, E. coli BL21(DE3)/pET43Ins; 3, E. coli BL21(DE3)/pET43Ins/IPTG. 3.2.2. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän bieåu hieän toái öu 6xHis-MPI cuûa E. coli BL21(DE3)/pET43Ins Nhaèm xaùc ñònh caùc ñieàu kieän toái öu ñeå toång hôïp 6xHis-MPI töø chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins, tieán haønh khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä, noàng ñoä IPTG vaø thôøi gian caûm öùng leân söï bieåu hieän 6xHis-MPI. 6xHis-MPI A B -92- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän a. Khaûo saùt nhieät ñoä caûm öùng toái öu Ñeå xaùc ñònh ñöôïc ñieàu kieän nhieät ñoä caûm öùng toái öu, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau töø 25oC ñeán 37oC. Caùc böôùc thöïc hieän nhö ñaõ moâ taû trong phaàn Phöông phaùp 2.4.6. Keát quaû thu nhaän ñöôïc trình baøy treân Hình 3.12. A B Hình 3.12. Keát quaû khaûo saùt nhieät ñoä caûm öùng bieåu hieän toái öu. A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, Chöùng aâm; 3, Caûm öùng bieåu hieän ôû 25oC; 4, Caûm öùng ôû nhieät ñoä 30oC; 5, Caûm öùng ôû nhieät ñoä 35oC; 6, Caûm öùng ôû nhieät ñoä 37oC. Keát quaû treân Hình 3.12 A cho thaáy ôû caùc gieáng 3, 4, 5, 6 coù xuaát hieän vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa ñöôïc xaùc nhaän laø 6xHis-MPI (baèng phöông phaùp lai Western Blot, Hình 3.12 B) khi ñöôïc caûm öùng baèng IPTG, trong khi ñoù ôû gieáng 2 (khoâng caûm öùng) khoâng thaáy coù xuaát hieän vaïch protein naøy. Keát quaû phaân tích möùc ñoä bieåu hieän baèng phaàm meàm Quantity One (Biorad) döïa vaøo ñaäm ñoä cuûa vaïch protein treân baûn ñieän di SDS-PAGE cho thaáy khi nuoâi caáy vaø caûm öùng bieåu hieän chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau töø 25Æ 35oC ñeàu coù bieåu hieän 6xHis-MPI toát vôùi möùc bieán ñoäng töø 15,4%- 15,9% toång protein teá baøo, ôû nhieät ñoä caûm öùng 37oC, möùc ñoä bieåu hieän laø 14,4%. 14,4kDa -93- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Chuùng toâi choïn ñieàu kieän caûm öùng 30oC ñeå tieán haønh caùc thí nghieäm nghieân cöùu veà sau. b. Khaûo saùt noàng ñoä IPTG caûm öùng bieåu hieän toái öu Noàng ñoä chaát caûm öùng IPTG coù vai troø quan troïng trong vieäc quyeát ñònh möùc ñoä bieåu hieän protein muïc tieâu cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Ñeå xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä caûm öùng bieåu hieän toái öu, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt baèng caùch thay ñoåi noàng ñoä IPTG boå sung vaøo trong giai ñoaïn caûm öùng. Caùc böôùc tieán haønh thí nghieäm nhö ñaõ ñöôïc trình baøy trong phaàn Phöông phaùp 2.4.6, vôùi nhieät ñoä caûm öùng laø 30oC. Keát quaû thu nhaän ñöôïc trình baøy treân Hình 3.13. A B Hình 3.13. Keát quaû khaûo saùt noàng ñoä IPTG caûm öùng toái öu. A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, Chöùng aâm; 3, IPTG 0,1 mM; 4, IPTG 0,2 mM; 5, IPTG 0,3 mM; 6, IPTG 0,4 mM; 7, IPTG 0,5 mM; 8, IPTG 0,6 mM. Keát quaû ñieän di SDS-PAGE treân Hình 3.13 A cho thaáy, khi nuoâi caáy chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins coù caûm öùng baèng IPTG thì ñeàu coù söï xuaát hieän vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa, ñöôïc xaùc ñònh laø protein dung hôïp 6xHis-MPI (gieáng 3Æ 8). Trong khi ñoù, ôû tröôøng hôïp khoâng coù caûm öùng (gieáng 2) thì khoâng coù söï bieåu hieän protein naøy. Khi taêng noàng ñoä chaát caûm öùng IPTG 14,4kDa -94- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän töø 0,1 mM leân 0,3 mM (töø gieáng 3 ñeán gieáng 5) thì möùc ñoä bieåu hieän 6xHis-MPI töông öùng cuõng taêng töø 6,4% leân 9,1%. Tuy nhieân, neáu tieáp tuïc taêng noàng ñoä chaát caûm öùng töø 0,3 mM ñeán 0,6 mM thì möùc ñoä bieåu hieän vaãn khoâng thay ñoåi, dao ñoäng ôû möùc töø 9,1-11,3% (gieáng 6, 7, 8). Ñieàu kieän caûm öùng 0,3 mM ñöôïc choïn laøm cô sôû cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu veà sau. c. Khaûo saùt thôøi gian caûm öùng bieåu hieän toái öu Tieán haønh khaûo saùt thôøi löôïng caûm öùng phuø hôïp nhaát ñeå thu nhaän protein muïc tieâu vôùi ñieàu kieän thöïc hieän nhö ñaõ ñöôïc moâ taû trong phaàn Vaät lieäu – Phöông phaùp vaø söû duïng caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc cuûa caùc thí nghieäm nghieân cöùu tröôùc. Hình 3.14. Keát quaû khaûo saùt thôøi löôïng caûm öùng toái öu. A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, Chöùng aâm; 3, caûm öùng16 giôø; 4, caûm öùng 20 giôø; 5, caûm öùng 24 giôø; 6, caûm öùng 28 giôø. Keát quaû thu ñöôïc treân Hình 3.14 cho thaáy khi chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ñöôïc caûm öùng baèng IPTG (gieáng 3, 4, 5, 6 Hình 3.14 A) coù xuaát hieän caùc vaïch protein ñöôïc xaùc nhaän laø 6xHis-MPI baèng phöông phaùp lai Western Blot vôùi khaùng theå khaùng Histidine, (Hình 3.14 B). Trong khi ñoù treân gieáng 2 (khoâng caûm öùng) thì khoâng coù vaïch protein naøy. ÔÛ thôøi löôïng caûm öùng 14,4kDa -95- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän 16 giôø, möùc ñoä bieåu hieän 6xHis-MPI ñaït 9,3%. Khi taêng thôøi löôïng caûm öùng töø 20 giôø ñeán 28 giôø (gieáng 4, 5, 6) thì möùc ñoä bieåu hieän cuõng taêng vaø dao ñoäng töø 10,4-11,2%. Chuùng toâi choïn thôøi löôïng caûm öùng bieåu hieän laø 20 giôø laøm cô sôû cho caùc nghieân cöùu sau. Töø caùc keát quaû khaûo saùt thu ñöôïc treân ñaây chuùng toâi coù theå keát luaän raèng ñieàu kieän caûm öùng toái öu nhaát cho vieäc toång hôïp 6xHis-MPI cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins laø nhieät ñoä 30oC, noàng ñoä IPTG 0,3mM trong thôøi gian 20 giôø. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa nhoùm taùc giaû Leâ Vaên Phuûng vaø coäng söï khi nghieân cöùu bieåu hieän proinsulin treân vector pET-28a(+) bieåu hieän trong E. coli BL21(DE3) [7], tuy nhieân noàng ñoä IPTG caàn thieát cho caûm öùng toái öu chæ caàn 0,3mM, nhoû hôn trong baùo caùo treân (0,4mM). Chuùng toâi söû duïng caùc ñieàu kieän naøy ñeå nuoâi caáy caûm öùng bieåu hieän MPI cho caùc thí nghieäm veà sau. 3.2.3. Xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy maät ñoä cao chuûng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ôû qui moâ phoøng thí nghieäm a. Thay theá trypton baèng pepton trong moâi tröôøng LB Nhaèm muïc tieâu tìm kieám nguoàn nguyeân lieäu reû tieàn duøng cho leân men qui moâ lôùn sau naøy, chuùng toâi choïn pepton thay theá trypton trong moâi tröôøng LB (giaù cuûa trypton laø 1,955,000 ñoàng/kg cao gaáp khoaûng 1,5 so vôùi cuûa pepton, 1,324,000 ñoàng/kg (HIMEDIA, INDIA) (Vieät AÙ, 2009)). Moâi tröôøng LB vôùi thaønh phaàn coù pepton ñöôïc goïi laø LBp. Tieán haønh khaûo saùt söï taêng tröôûng cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins treân moâi tröôøng nuoâi caáy LB vaø LBp ñöôïc thöïc hieän nhö trong phaàn Phöông phaùp 2.4.7. Keát quaû sau 6 giôø nuoâi caáy (luùc keát thuùc pha taêng tröôûng) ñöôïc ghi nhaän treân Hình 3.15 cho thaáy khuynh höôùng bieán ñoäng pH trong quaù trình nuoâi caáy treân caû hai loaïi moâi tröôøng laø nhö nhau, nhöng -96- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0 1 2 3 4 5 6 Thôøi gian nuoâi caáy, giôø O D 60 0n m 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 pH OD LB OD LBp pH LB pH LBp pH cuûa moâi tröôøng LBp luoân ôû möùc thaáp hôn khoaûng 0,2-0,5 ñôn vò pH. Nguyeân nhaân laø do pH cuûa moâi tröôøng LBp nhoû hôn pH cuûa moâi tröôøng LB, do pH cuûa pepton nhoû hôn pH cuûa trypton. Tuy nhieân khoâng thaáy coù söï khaùc bieät ñoäng hoïc taêng tröôûng cuûa chuûng treân hai loaïi moâi tröôøng naøy. Nhö vaäy, maëc duø pH cuûa moâi tröôøng LBp nhoû hôn pH cuûa moâi tröôøng LB nhöng khoâng gaây aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa chuûng. Giaù trò pH thaáp nhaát khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng LBp laø 6,35 ôû thôøi ñieåm nuoâi caáy giôø thöù 2,5. Ñieàu naøy cho thaáy chuûng coù theå taêng tröôûng toát ôû giaù trò pH thaáp khoaûng 6,30. Keát quaû phaân tích troïng löôïng teá baøo khoâ (DCW) khi keát thuùc quaù trình leân men ôû moâi tröôøng LBp laø 4,9 g/L, cao hôn trong tröôøng hôïp nuoâi caáy treân moâi tröôøng LB, 4,5 g/L. Hình 3.15. Ñoäng hoïc taêng tröôûng cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins vaø söï bieán ñoäng pH theo thôøi gian khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng LBp vaø moâi tröôøng LB. -97- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Ñeå ñaùnh giaù khaû naêng bieåu hieän cuûa chuûng khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng LBp so vôùi moâi tröôøng LB, chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm nuoâi caáy chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins treân moâi tröôøng LB vaø LBp baèng phöông phaùp nuoâi caáy meû treân heä thoáng leân men mini-jar ôû qui moâ 5 L. Caùc böôùc thao taùc nhö ñaõ ñöôïc moâ taû trong phaàn Phöông phaùp 2.4.8. Caùc ñieàu kieän kieåm soaùt leân men theo caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc töø caùc thí nghieäm tröôùc. Keát quaû kieåm tra möùc ñoä bieåu hieän theo phöông phaùp SDS-PAGE vaø xaùc nhaän söï bieåu hieän naøy baèng phöông phaùp Western Blot ñöôïc trình baøy treân Hình 3.16. Keát quaû treân Hình 3.16 A cho thaáy ôû gieáng 3 (LBp), gieáng 4 (LB) coù xuaát hieän vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa ñöôïc xaùc nhaän laø 6xHis-MPI vôùi möùc ñoä bieåu hieän töông öùng 18,5% vaø 17,5%. ÔÛ gieáng 1 (chöùng aâm) khoâng thaáy söï xuaát hieän cuûa vaïch protein naøy. Keát quaû bieåu hieän naøy ñöôïc xaùc nhaän baèng phöông phaùp Western Blot lai vôùi khaùng theå khaùng Histidine cho thaáy protein bieåu hieän treân gieáng 3 vaø gieáng 4 chính laø 6xHis-MPI (Hình 3.16, B). Hình 3.16. So saùnh möùc ñoä bieåu hieän 6xHis-MPI khi nuoâi caáy E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins treân moâi tröôøng LBp vôùi moâi tröôøng LB. A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, Chöùng aâm; 3, Moâi tröôøng LBp; 4, Moâi tröôøng LB. 6xHis-MPI 14,4kDa -98- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc treân ñaây cho pheùp khaúng ñònh raèng coù theå thay theá trypton trong moâi tröôøng LB baèng pepton maø khoâng gaây baát kyø aûnh höôûng xaáu naøo ñoái vôùi söï taêng tröôûng cuõng nhö möùc ñoä bieåu hieän protein muïc tieâu 6xHis-MPI chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Töø ñaây, chuùng toâi söû duïng pepton ñeå thay theá cho trypton trong pha cheá moâi tröôøng nuoâi caáy cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu veà sau. b. Khaûo saùt ñieàu kieän nuoâi caáy maät ñoä cao Do protein muïc tieâu 6xHis-MPI ñöôïc toång hôïp trong teá baøo chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins döôùi daïng khoâng tan trong teá baøo chaát neân ñeå thu nhaän ñöôïc nhieàu 6xHis-MPI caàn phaûi leân men vaø caûm öùng thu nhaän löôïng lôùn sinh khoái E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Ñeå thu nhaän löôïng sinh khoái lôùn cuûa teá baøo chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins coù khaû naêng bieåu hieän 6xHis-MPI, chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm nuoâi caáy meû-boå sung maät ñoä teá baøo cao vôùi caùc moâi tröôøng khaûo saùt laø H-LBp vaø aH-LBp ñöôïc thieát keá treân cô sôû cuûa moâi tröôøng LBp coù thaønh phaàn ñôn giaûn, reû tieàn nhöng vaãn baûo ñaûm ñöôïc caùc yeáu toá khoaùng vi löôïng caàn thieát ñeå vi sinh vaät coù theå taêng tröôûng vaø bieåu hieän toát (Baûng 2.2). Caùc böôùc tieán haønh vaø caùc ñieàu kieän kieåm soaùt nuoâi caáy nhö ñaõ ñöôïc moâ taû trong phaàn Phöông phaùp 2.4.9 vaø söû duïng keát quaû cuûa caùc thí nghieäm tröôùc. Keát quaû theo doõi quaù trình taêng tröôûng cuûa chuûng thoâng qua giaù trò OD600nm ñöôïc trình baøy treân Hình 3.17. Khi nuoâi caáy chuûng theo phöông thöùc meû-boå sung maät ñoä teá baøo cao treân moâi tröôøng H-LBp vaø aH-LBp, töø 0 - 6 giôø nuoâi caáy chuûng taêng tröôûng gioáng nhau nhöng sau 6 giôø khaû naêng taêng tröôûng cuûa chuûng treân moâi tröôøng H-LBp yeáu hôn so vôùi treân moâi tröôøng aH-LBp. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø moâi tröôøng H-LBp bò thieáu huït moät soá khoaùng vi löôïng caàn thieát cho taêng tröôûng khi nuoâi caáy maät ñoä teá baøo cao. Khi boå sung caùc khoaùng naøy vaøo -99- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 4 8 12 16 20 24 28 Thôøi gian nuoâi caáy O D 60 0 n m (* 30 ) H-LBp aH-LBp moâi tröôøng nuoâi caáy nhö trong tröôøng hôïp cuûa aH-LBp thì söï taêng tröôûng cuûa chuûng ñöôïc duy trì ôû möùc cao cho ñeán khi keát thuùc quaù trình leân men. Keát quaû phaân tích DCW khi keát thuùc leân men cuõng cho thaáy ôû tröôøng hôïp nuoâi caáy treân moâi tröôøng aH-LBp laø 28,76 g/L, cao hôn so vôùi treân moâi tröôøng H-LBp, 25,48 g/L. Hieäu suaát thu nhaän sinh khoái treân moâi tröôøng aH-LBp cao hôn treân moâi tröôøng H-LBp khoaûng 13% do moâi tröôøng aH-LBp coù chöùa nhieàu thaønh phaàn khoaùng, phuø hôïp cho vieäc toång hôïp sinh khoái cao. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vôùi nghieân cöùu tröôùc ñaây cuûa Shin et al (1997) [59] khi nuoâi caáy E. coli maät ñoä teá baøo cao phaûi boå sung caùc khoaùng vi löôïng vaøo trong thaønh phaàn moâi tröôøng, tuy nhieân hieäu suaát thu nhaän sinh khoái thì thaáp hôn. Nguyeân nhaân coù theå laø do söï khaùc bieät veà thaønh phaàn moâi tröôøng vaø moät soá ñieàu kieän leân men. Moâi Hình 3.17. Ñoäng hoïc taêng tröôûng cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins khi nuoâi caáy meû- boå sung maät ñoä teá baøo cao treân hai moâi tröôøng H-LBp vaø aH-LBp. -100- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän tröôøng nuoâi caáy söû duïng trong nghieân cöùu laø aH-LBp coù thaønh phaàn khaùc vôùi moâi tröôøng trong baùo caùo cuûa Shin (söû duïng glucose noàng ñoä laøm cô chaát vaø boå sung dung dòch ion kim loaïi hoãn hôïp (trace elements solution)). Keát quaû bieåu hieän protein taùi toå hôïp 6xHis-MPI khi nuoâi caáy meû-boå sung maät ñoä teá baøo cao trong caû hai tröôøng hôïp moâi tröôøng H-LBp vaø aH-LBp ñöôïc trình baøy treân Hình 3.18. Hình 3.18. So saùnh möùc ñoä bieåu hieän 6xHis-MPI khi nuoâi caáy E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins theo phöông thöùc meû- boå sung maät ñoä teá baøo cao treân moâi tröôøng H-LBp vôùi moâi tröôøng aH-LBp. A, SDS-PAGE ; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, Chöùng aâm; 3, Moâi tröôøng H-LBp; 4, Moâi tröôøng aH-LBp. ÔÛ gieáng 3 vaø 4 (Hình 3.18 A) coù xuaát hieän caùc vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa, vôùi möùc ñoä bieåu hieän nhö nhau, töông öùng laø 17,2% vaø 17,4%, ñöôïc xaùc ñònh laø 6xHis-MPI. ÔÛ gieáng 2 (chöùng aâm) khoâng thaáy söï xuaát hieän cuûa vaïch protein naøy. Keát quaû bieåu hieän naøy ñöôïc xaùc nhaän baèng phöông phaùp Western Blot lai vôùi khaùng theå khaùng Histidine (Hình 3.18 B). 14,4 20,1 6xHis-MPI BA -101- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Töø caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc treân ñaây, chuùng toâi coù theå khaúng ñònh laø ñaõ thaønh coâng trong vieäc thieát laäp ñöôïc moâi tröôøng aH-LBp, coù thaønh phaàn phuø hôïp vaø ñaõ xaây döïng ñöôïc cheá ñoä boå sung moâi tröôøng dinh döôõng thích hôïp ñeå nuoâi caáy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phöông thöùc nuoâi caáy meû- boå sung maät ñoä teá baøo cao ñeå bieåu hieän vöôït möùc protein taùi toå hôïp 6xHis-MPI ôû qui moâ phoøng thí nghieäm vôùi theå tích bình leân men 5 L. 3.2.4. Nuoâi caáy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phöông thöùc meû- boå sung ôû qui moâ 30 L ñeå toång hôïp 6xHis-MPI Söû duïng keát quaû cuûa caùc nghieân cöùu ôû qui moâ phoøng thí nghieäm treân ñaây, tieán haønh nuoâi caáy nuoâi caáy chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins treân moâi tröôøng aH-LBp (Baûng 2.2) theo phöông phaùp meû-boå sung maät ñoä cao ôû qui moâ pilot vôùi theå tích leân men 30 L. Caùc böôùc thao taùc vaän haønh vaø kieåm soaùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy nhö ñaõ ñöôïc trình baøy trong phaàn Phöông phaùp 2.4.10. Khi moâi tröôøng nuoâi caáy caïn kieät chaát dinh döôõng (khoaûng giôø nuoâi caáy thöù 3, 5, ñöôïc nhaän dieän khi pH vaø DOC taêng leân), tieán haønh naïp Moâi tröôøng boå sung theo nhu caàu söû duïng cuûa chuûng nuoâi caáy. Trong quaù trình nuoâi caáy, tieán haønh laáy maãu vaø ñaùnh giaù toác ñoä taêng tröôûng ñaëc tröng cuûa chuûng. Keát quaû theo doõi toác ñoä taêng tröôûng cuûa chuûng trong quaù trình nuoâi caáy thoâng qua giaù trò OD600nm ôû caùc thôøi ñieåm laáy maãu ñöôïc trình baøy treân Baûng 3.1 vaø Hình 3.19, cho thaáy söï taêng tröôûng cuûa chuûng trong quaù trình nuoâi caáy töông ñoái toát. Töø khi baét ñaàu ñeán giôø nuoâi caáy thöù 26, chuûng taêng tröôûng raát toát, vôùi toác ñoä taêng tröôûng ñaëc tröng trung bình μ = 0,076 giôø-1. Sau ñoù giaù trò OD giaûm, cho thaáy quaù trình nuoâi caáy baét ñaàu böôùc vaøo pha suy taøn, nguyeân nhaân coù theå laø do moâi tröôøng ñaõ caïn kieät dinh döôõng töø sau 26 giôø nuoâi caáy. -102- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Keát quaû phaân tích noàng ñoä teá baøo khoâ DCW khi keát thuùc nuoâi caáy cho thaáy coù theå ñaït 26,36 g/L, töông ñöông vôùi trong tröôøng hôïp leân men ôû qui moâ phoøng thí nghieäm. Baûng 3.1. Keát quaû ñoäng hoïc taêng tröôûng vaø taïo sinh khoái cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins khi nuoâi caáy meû-boå sung maät ñoä cao trong moâi tröôøng aH-LBp ôû qui moâ 30 lít Thôøi gian nuoâi caáy, giôø OD600nm(*30) DCW (g/L) μ (giôø−1) 0 0,022 3,92 0 2 0,074 5,16 0,138 4 0,139 5,46 0,083 6 0,209 7,43 0,107 8 0,280 9,80 0,115 10 0,347 13,72 0,125 12 0,404 16,53 0,120 14 0,454 17,36 0,106 16 0,500 20,31 0,103 18 0,541 22,56 0,097 20 0,582 23,84 0,090 22 0,618 25,73 0,086 24 0,647 27,32 0,081 26 0,659 28,04 0,076 28 0,633 26,36 0,068 -103- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Thôøi gian nuoâi caáy, giôø O D 60 0 n m (* 30 ) 0 5 10 15 20 25 30 D C W , g /d l OD600nm DCW Keát quaû khaûo saùt söï bieåu hieän 6xHis-MPI cuûa chuûng ñöôïc ñaùnh giaù baèng phöông phaùp ñieän di SDS-PAGE vaø xaùc nhaän söï bieåu hieän baèng phöông phaùp lai Western Blot ñöôïc ghi nhaän vaø trình baøy treân Hình 3.20. Keát quaû khi nuoâi caáy meû-boå sung maät ñoä cao E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ôû qui moâ pilot 30 lít vaø caûm öùng baèng IPTG coù söï xuaát hieän moät vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa (gieáng 3) töông öùng vôùi protein 6xHis-MPI vôùi möùc ñoä bieåu hieän laø 22,3%, trong khi ôû chöùng aâm (gieáng 2) thì khoâng thaáy xuaát hieän vaïch naøy. Töø caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc coù theå keát luaän raèng chuùng toâi ñaõ thaønh coâng trong vieäc nuoâi caáy theo phöông phaùp meû-boå sung maät ñoä cao chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins vaø ñaõ caûm öùng bieåu hieän vöôït möùc thaønh coâng protein dung hôïp 6xHis-MPI ôû qui moâ pilot (30 L). Hình 3.19. Ñoäng hoïc taêng tröôûng cuûa E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trong quaù trình nuoâi caáy theo phöông thöùc meû- boå sung ôû qui moâ 30 L. -104- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.20. Keát quaû bieåu hieän 6xHis-MPI ôû qui moâ leân men 30 lít. A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Gieáng 1, Thang protein; 2, Chöùng aâm (khoâng caûm öùng IPTG); 3, Caûm öùng baèng IPTG. 3.3. Thu nhaän MPI coù caáu hình töï nhieân 3.3.1. Thu nhaän theå vuøi chöùa 6xHis-MPI Sau khi quaù trình leân men keát thuùc, tieán haønh thöïc hieän caùc böôùc thu nhaän teá baøo töø dòch sau leân men nhö ñaõ ñöôïc moâ taû trong muïc 2.4.11. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän trong Baûng 3.2. Baûng 3.2. Keát quaû thu hoaïch sinh khoái teá baøo sau leân men Toång löôïng dòch sau leân men (L) 24,62 Toång löôïng sinh khoái töôi thu ñöôïc sau ly taâm (g) 576,21 Haøm löôïng sinh khoái khoâ (g/L) 6,02 Toång löôïng sinh khoái khoâ thu ñöôïc (g) 148,31 -105- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Huyeàn phuø sinh khoái töôi thu ñöôïc vaøo dòch ñeäm thuûy phaân, naïp vaøo maùy phaù teá baøo, thu nhaän ñöôïc dòch huyeàn phuø teá baøo phaù maøng. Tieán haønh thu nhaän theå vuøi baèng caùch röûa 3 laàn trong dung dòch röûa (dung dòch C). Theå vuøi ñöôïc hoøa tan trong dung dòch A (2.2.1.k), sau ñoù sulfonate hoùa theo phöông phaùp ñaõ trình baøy (2.4.12). Keát quaû thu nhaän theå vuøi ñöôïc trình baøy theo Baûng 3.3. Baûng 3.3. Keát quaû thu nhaän theå vuøi chöùa 6xHis-MPI töø sinh khoái teá baøo Khoái löôïng theå vuøi thoâ thu nhaän ñöôïc sau khi phaù teá baøo (g) 104,68 Khoái löôïng theå vuøi thu nhaän ñöôïc sau khi röûa (g) 62,55 Theå tích dòch theå vuøi tinh saïch thu nhaän ñöôïc (ml) 423,20 Löôïng theå vuøi tinh saïch thu nhaän ñöôïc (g) 62,55 Töø keát quaû thu nhaän ñöôïc, hieäu suaát thu nhaän theå vuøi laø: 62,55g theå vuøi/148,311 g sinh khoái = 42,17 g theå vuøi töôi / 100 g sinh khoái. 3.3.2. Thu nhaän 6xHis-MPI töø theå vuøi 100 ml dòch theå vuøi bieán tính thu ñöôïc trong phaàn treân duøng laøm nguyeân lieäu ñeå tinh cheá thu nhaän 6xHis-MPI baèng saéc kyù aùi löïc vôùi coät Ni-NTA theo phöông phaùp nhö ñaõ ñöôïc trình baøy trong muïc 2.4.13. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän trong Baûng 3.4. Baûng 3.4. Keát quaû thu nhaän vaø tinh cheá sô boä 6xHis-MPI töø theå vuøi baèng coät Ni- NTA Phaân ñoaïn Theå tích, ml Noàng ñoä, mg/ml Löôïng protein, mg Dòch hoøa tan theå vuøi tröôùc khi qua coät 100 23,56 2.356 Dòch 6xHis-MPI thu ñöôïc sau khi qua coät 387 0,72 278,64 -106- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Nhö vaäy chuùng toâi ñaõ thu nhaän ñöôïc 278,64 × (423,2/100) = 1,179 g 6xHis-MPI töø 148,311 g sinh khoái khoâ. Hieäu suaát thu nhaän 6xHis-MPI töø teá baøo: 1,179g/148,311g = 7,951 mg/g. Hieäu suaát thu nhaän 6xHis-MPI töø theå vuøi: 1,179g/62,55 g = 18,85 mg/g Ñeå ñaùnh giaù ñoä tinh saïch cuûa protein 6xHis-MPI sau khi tinh cheá qua coät Ni-NTA treân ñaây, chuùng toâi tieán haønh phaân tích baèng ñieän di SDS-PAGE vaø xaùc nhaän keát quaû baèng phöông phaùp lai Western Blot vôùi khaùng theå khaùng 6xHis. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän treân Hình 3.21. Hình 3.21. Kieåm tra ñoä tinh saïch cuûa 6xHis-MPI sau khi tinh cheá qua coät Ni-NTA. A, SDS-PAGE; B, Western Blot vôùi khaùng theå khaùng His. Gieáng 1, Thang protein; 2, Dòch 6xHis-MPI bieán tính tröôùc khi qua coät; 3, Phaân ñoaïn dòch gaén protein leân coät; 4, Phaân ñoaïn dòch röûa protein khoâng ñaëc hieäu; 5, Phaân ñoaïn dung ly protein ra khoûi coät. ÔÛ phaân ñoaïn dung ly protein ñaëc hieäu (gieáng 5) coù söï xuaát hieän cuûa moät vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa, töông öùng vôùi vaïch protein ôû gieáng 2 (dòch 6xHis-MPI bieán tính tröôùc tinh cheá) ñöôïc nhaän dieän laø protein dung hôïp 6xHis-MPI. Trong khi ñoù ôû gieáng 3, gieáng 4, laø caùc phaân ñoaïn dòch röûa tröôùc khi -107- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän dung ly protein ñaëc hieäu 6xHis-MPI thì khoâng thaáy coù vaïch protein naøy. Khi kieåm tra baèng phöông phaùp lai Western Blot (B) vôùi khaùng theå khaùng 6xHis, chuùng toâi nhaän thaáy coù tín hieäu döông ôû gieáng soá 2 vaø gieáng soá 5, töông öùng vôùi vaïch protein treân Hình 3.21 A, trong khi ñoù, ôû gieáng 3 vaø gieáng 4 khoâng thaáy söï xuaát cuûa vaïch protein naøy. Töø keát quaû treân coù theå khaúng ñònh chuùng toâi ñaõ thaønh coâng trong vieäc tinh cheá protein dung hôïp 6xHis-MPI töø dòch leân men qui moâ pilot. Ñaây laø nguoàn nguyeân lieäu 6xHis-MPI duøng ñeå phuïc vuï cho caùc muïc ñích thu nhaän MPI vaø insulin cuûa caùc nghieân cöùu sau. 3.3.3. Thu nhaän MPI töø 6xHis-MPI a. Caét loaïi 6xHis baèng CNBr Protein dung hôïp 6xHis-MPI ñöôïc xöû lyù baèng CNBr ñeå loaïi boû 6xHis thu nhaän MPI. Keát quaû xöû lyù ñöôïc trình baøy treân Baûng 3.5. Baûng 3.5. Keát quaû thu nhaän MPI khi xöû lyù 6xHis-MPI baèng CNBr Phaân ñoaïn Theå tích, ml Noàng ñoä protein, mg/ml Protein toång, mg Dòch 6xHis-MPI tröôùc khi tuûa vôùi Zn2+ 500 0,36 180 Dòch 6xHis-MPI trong ñeäm sau tuûa 80 2,22 177,6 Dòch 6xHis-MPI sau phaûn öùng caét 15 5,74 86,1 Ñeå kieåm chöùng keát quaû phaûn öùng caét loaïi 6xHis töø 6xHis-MPI, chuùng toâi tieán haønh phaân tích baèng phöông phaùp ñieän di SDS-PAGE vaø kieåm tra baèng phöông phaùp lai Western Blot vôùi khaùng theå khaùng insulin vaø khaùng theå khaùng Histidine. Keát quaû ñöôïc trình baøy treân Hình 3.22. -108- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.22. Keát quaû kieåm tra phaûn öùng phaân caét 6xHis-MPI baèng CNBr. A, SDS-PAGE; B, Western Blot vôùi khaùng theå khaùng 6xHis; C, Western-Blot vôùi khaùng theå khaùng insulin. Gieáng 1, Thang protein; 2, Dòch 6xHis-MPI tröôùc xöû lyù; 3, Dòch protein sau xöû lyù baèng CNBr. Keát quaû SDS-PAGE ôû Hình 3.22 A cho thaáy ôû gieáng 3 coù xuaát hieän moät vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa, töông öùng vôùi vaïch protein xuaát hieän trong gieáng 2, ñöôïc nhaän dieän laø 6xHis-MPI. Ngoaøi ra, ôû gieáng 3 coøn xuaát hieän moät vaïch protein coù kích thöôùc nhoû hôn vôùi kích thöôùc khoaûng 7 kDa, naèm ngay döôùi vaïch 6xHis-MPI. Ñaây laø protein ñöôïc döï ñoaùn laø MPI sau ñaõ caét rôøi theû 6xHis. Keát quaû xaùc nhaän baèng phöông phaùp Western Blot vôùi khaùng theå khaùng 6xHis treân Hình 3.22 B cho thaáy ôû gieáng 3 coù vaïch protein töông öùng nhö trong gieáng 2, ñaây chính laø 6xHis-MPI coøn laïi do phaûn öùng caét loaïi theû 6xHis khoâng trieät ñeå. Maët khaùc khoâng coù söï xuaát hieän cuûa vaïch tín hieäu protein beân döôùi vaïch 6xHis-MPI nhö trong keát quaû ñieän di ôû gieáng 3. Hình 3.22 C (keát quaû kieåm tra baèng Western Blot vôùi khaùng theå khaùng insulin) cho thaáy ôû gieáng 3 coù hai vaïch töông öùng nhö trong keát quaû ñieän di SDS-PAGE, protein trong caùc vaïch naøy ñöôïc -109- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän xaùc nhaän laø coù chöùa caáu truùc cuûa insulin neân coù tín hieäu khi lai vôùi khaùng theå khaùng insulin. Töø caùc keát quaû thu ñöôïc, chuùng toâi coù theå khaúng ñònh raèng khi duøng CNBr coù theå caét loaïi ñöôïc theû 6xHis ra khoûi caáu truùc protein dung hôïp 6xHis- MPI. Tuy nhieân, hieäu quaû caét chöa cao, trong dòch protein sau phaûn öùng coøn chöùa 6xHis-MPI. b. Tinh cheá thu nhaän MPI Dòch protein thu ñöôïc sau phaûn öùng caét ôû treân ñaây ñöôïc cho qua coät Ni- NTA ñeå thu nhaän MPI baèng heä thoáng FPLC. Caùc böôùc thao taùc ñaõ ñöôïc moâ taû trong phaàn muïc 2.4.14. Keát quaû ñöôïc trình baøy treân Baûng 3.6. Baûng 3.6. Keát quaû tinh cheá thu nhaän MPI töø dòch xöû lyù baèng CNBr Phaân ñoaïn Theå tích, ml Noàng ñoä, protein, mg/ml Protein toång, mg Dòch protein tröôùc tinh cheá 15 5,74 86,1 Dòch MPI sau tinh cheá 44 0,83 36,53 Dòch 6xHis-MPI vaø theû 6xHis 120 0,09 10,8 Ñeå ñaùnh giaù keát quaû tinh cheá MPI, chuùng toâi tieán haønh phaân tích dòch protein baèng phöông phaùp ñieän di SDS-PAGE vaø xaùc nhaän laïi baèng phöông phaùp lai Western Blot vôùi khaùng theå khaùng insulin. Keát quaû thu nhaän ñöôïc treân Hình 3.23 cho thaáy ôû gieáng 3 coù moät vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa, töông öùng vôùi vaïch protein ñöôïc nhaän dieän laø MPI trong dòch phaân caét tröôùc khi qua coät (gieáng 2). Nhö vaäy dòch protein trong phaân ñoaïn naøy ñöôïc xaùc ñònh laø MPI ñaõ ñöôïc tinh saïch töø hoãn hôïp dòch sau phaûn öùng phaân caét. ÔÛ gieáng 4 coù xuaát hieän moät vaïch protein coù kích thöôùc khoaûng 9 kDa, ñöôïc xaùc ñònh laø 6xHis-MPI coøn -110- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän laïi do phaûn öùng caét khoâng trieät ñeå. Keát quaû lai baèng Western Blot vôùi khaùng theå khaùng insulin (Hình 3.23, B) ñaõ xaùc nhaän laïi keát quaû treân. Nhö vaäy, töø 180 mg 6xHis-MPI chuùng toâi ñaõ thaønh coâng trong vieäc caét loaïi theû 6xHis vaø tinh cheá ñeå thu ñöôïc 36,53 mg MPI, ñaït hieäu suaát 20,29%. Keát quaû caét loaïi theû 6xHis baèng CNBr vaø tinh cheá thu nhaän MPI, ñaëc bieät laø giai ñoaïn caét loaïi theû 6xHis, ñaït hieäu suaát töông ñoái thaáp, coøn moät löôïng lôùn 6xHis-MPI sau phaûn öùng. Nguyeân nhaân coù theå laø do ñieàu kieän cuûa phaûn öùng caét baèng CNBr chöa toái öu. Caàn phaûi môû roäng khaûo saùt noàng ñoä CNBr, nhieät ñoä, thôøi gian phuø hôïp ñeå phaûn öùng dieãn ra trieät ñeå. Hình 3.23. Keát quaû tinh cheá MPI töø dòch phaân caét 6xHis-MPI baèng CNBr. A, SDS-PAGE; B, Western Blot vôùi khaùng theå khaùng insulin. Gieáng 1, Thang protein; 2, Protein sau khi xöû lyù; 3, Phaân ñoaïn protein chöùa MPI; 4, Phaân ñoaïn chöùa 6xHis-MPI sau khi dung ly ra khoûi coät Ni- NTA. A B -111- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän 3.4. Thu nhaän insulin töø MPI 3.4.1. Taùi gaáp cuoän MPI Saûn phaåm MPI thu ñöôïc ôû phaàn treân laø daïng bieán tính, caàn ñöôïc taùi gaáp cuoän ñeå coù caáu hình töï nhieân tröôùc khi ñöôïc xöû lyù baèng Trypsin/Carboxy- peptidase B ñeå thu nhaän insulin. Caùc böôùc thöïc hieän taùi gaáp cuoän MPI ñöôïc moâ taû trong phaàn muïc 2.4.15. Keát quaû taùi gaáp cuoän MPI ñöôïc kieåm tra baèng phöông phaùp ELISA giaùn tieáp. Saûn phaåm taùi gaáp cuoän ñöôïc coá ñònh treân ñóa ELISA vaø ñöôïc phaùt hieän baèng khaùng theå ñôn doøng OXI-005 nhaän dieän epitope laäp theå cuûa MPI. Keát quaû ELISA ñöôïc trình baøy treân Hình 3.24 vaø Baûng 3.7. Hình 3.24. Keát quaû ELISA xaùc nhaän caáu hình taùi gaáp cuoän cuûa MPI. Gieáng 1, Insulin chuaån; 2, Maãu traéng (PBS); 3, Maãu traéng (HCl); 4, MPI taùi gaáp cuoän (rMPI); 5, 6xHis-MPI; 6, MPI chöa taùi gaáp cuoän. Baûng 3.7. Keát quaû ELISA kieåm tra caáu hình taùi gaáp cuoän MPI theo OD492nm Gieáng Maãu A B Trung bình 1 Insulin chuaån 3,764 3,802 3,783 2 Maãu traéng PBS 0,202 0,215 0,206 3 Maãu traéng HCl 0,198 0,187 0,193 4 MPI taùi gaáp cuoän 1,934 1,916 1,925 5 6xHis-MPI 0,256 0,239 0,248 6 MPI chöa taùi gaáp cuoän 0,201 0,224 0,213 A B -112- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Caùc keát quaû treân cho thaáy ôû caëp gieáng 4 (MPI taùi gaáp cuoän) coù xuaát hieän tín hieäu maøu döông tính OD = 1,925, töông töï nhö ôû caëp gieáng 1 (insulin chuaån) trong khi 6xHis-MPI (gieáng 5) vaø MPI chöa ñöôïc taùi gaáp cuoän (gieáng 6) cho tín hieäu maøu aâm tính (giaù trò OD raát thaáp, töông ñöông vôùi OD cuûa caùc maãu traéng). Töø ñoù, chuùng toâi coù theå khaúng ñònh raèng ñaõ taùi gaáp cuoän thaønh coâng MPI daïng caáu hình töï nhieân. Tuy nhieân hieäu quaû taùi gaáp cuoän phuï thuoäc vaøo ñoä pH cuûa dung dòch taùi gaáp cuoän. Ñoái vôùi tröôøng hôïp cuûa proinsulin quaù trình taùi gaáp cuoän thöôøng ñöôïc tieán haønh ôû pH 10,5 (Joakim Nilsson, 1996)[49]. Trong tröôøng hôïp cuûa mini- proinsulin, theo Chang (1998) [16] thì pH toái öu cho quaù trình taùi gaáp cuoän laø 11,5. Ñeå kieåm tra laïi ñieàu kieän pH taùi gaáp cuoän toái öu trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt hieäu quaû taùi gaáp cuoän cuûa MPI khi thay ñoåi pH cuûa dung dòch taùi gaáp cuoän laø 10,6 vaø 11,5. Keát quaû ñaùnh giaù hieäu quaû taùi gaáp cuoän theo pH baèng phaûn öùng ELISA ñöôïc ghi nhaän treân Hình 3.25 vaø Baûng 3.8. Keát quaû treân Hình 3.25 cho thaáy ôû caëp gieáng soá 3, 4 (pH dung dòch taùi gaáp cuoän töông öùng laø 11,5 vaø 10,6) coù xuaát hieän tín hieäu döông ñaäm hôn so vôùi tín hieäu ôû caëp gieáng soá 2 (insulin chuaån) vaø cao hôn nhieàu so vôùi gieáng thöû khoâng (gieáng 1). Trong khi ñoù, ôû caëp gieáng soá 7 (dòch MPI bieán tính bôûi nhieät) thì cho tín hieäu aâm. Nhö vaäy, hieäu quaû taùi gaáp cuoän khoâng bò aûnh höôûng bôûi ñieàu kieän pH trong khoaûng töø 10,6 ñeán 11,5. Töø caùc keát quaû treân chuùng toâi keát luaän raèng ñaõ taùi gaáp cuoän thaønh coâng MPI töø dòch MPI daïng bieán tính. Vaø ôû trò pH 10,6 hay 11,5 thì hieäu quaû taùi gaáp cuoän laø töông ñöông nhau. Chuùng toâi choïn pH 11,5 laøm cô sôû cho vieäc thöïc hieän caùc thí nghieäm tieáp theo. -113- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.25. Keát quaû ELISA khaûo saùt pH dung dòch taùi gaáp cuoän. A, B laø hai gieáng cuûa moãi moät maãu thöû. Daõy 1, Maãu thöû khoâng; 2, Dòch insulin chuaån; 3, Dòch MPI taùi gaáp cuoän vôùi pH 11,5; 4, dòch MPI taùi gaáp cuoän vôùi pH 10,6; 5, Dòch insulin taùi gaáp cuoän ôû pH 11,5; 6, Dòch insulin taùi gaáp cuoän ôû pH 10,6; 7, Dòch MPI chöa taùi gaáp cuoän. Baûng 3.8. Keát quaû ghi nhaän giaù trò OD492nm cuûa phaûn öùng ELISA khaûo saùt pH cuûa dung dòch taùi gaáp cuoän. Gieáng Maãu A B Trung bình 1 Thöû khoâng 0,153 0,122 0,138 2 Insulin chuaån 3,586 3,708 3,647 3 MPI taùi gaáp cuoän ôû pH 11,5 6,000 6,000 6,000 4 MPI taùi gaáp cuoän ôû pH 10,6 6,000 6,000 6,000 5 Insulin taùi gaáp cuoän ôû pH 11,5 1,347 1,297 1,322 6 Insulin taùi gaáp cuoän ôû pH 10,6 1,132 0,924 1,028 7 MPI chöa taùi gaáp cuoän 0,201 0,224 0,213 Söû duïng caùc ñieàu kieän taùi gaáp cuoän neâu treân chuùng toâi thöïc hieän phaûn öùng taùi gaáp cuoän cho 40,62 mg MPI trong toång dung tích 92,4 ml. Keát quaû thu hoài MPI taùi gaáp cuoän ñöôïc trình baøy treân Baûng 3.9. -114- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Baûng 3.9. Keát quaû taùi gaáp cuoän MPI taïo caáu hình MPI töï nhieân Theå tích dòch MPI bieán tính tröôùc gaáp cuoän, ml 20 Haøm löôïng 6xHis-MPI trong dòch MPI tröôùc gaáp cuoän, mg/ml 2,31 Theå tích dòch taùi gaáp cuoän, ml 92,4 Noàng ñoä 6xHis-MPI taùi gaáp cuoän, mg/ml 0,5 MPI thu ñöôïc töø phaûn öùng taùi gaáp cuoän ñöôïc phaân tích baèng saéc kyù RP- HPLC. Keát quaû phaân tích (Hình 3.26) cho thaáy ôû tröôøng hôïp maãu chuaån insulin coù hoaït tính (1), coù söï xuaát hieän moät peak duy nhaát khoaûng 650 mAU ôû vò trí khoaûng 29,5 phuùt. Trong khi ñoù, ôû maãu insulin ñaõ laøm bieán tính baèng nhieät (2) thì khoâng thaáy coù xuaát hieän peak ôû vò trí töông öùng naøy nöõa. Ñieàu ñoù chöùng toû raèng ñieàu kieän saéc kyù baèng coät C18 söû duïng trong heä thoáng RP-HPLC naøy coù theå phaân bieät caáu hình insulin töï nhieân (coù hoaït tính) vaø caáu hình khoâng töï nhieân (bò bieán tính baèng nhieät). ÔÛ maãu MPI tröôùc khi taùi gaáp cuoän (3), chuùng toâi nhaän thaáy coù xuaát hieän peak tín hieäu duy nhaát vaøo khoaûng phuùt thöù 3. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø do MPI chöa coù caáu hình taùi gaáp cuoän neân khoâng theå töông taùc ñöôïc vôùi coät vaø thoaùt ra khoûi heä thoáng ngay sau khi naïp maãu khoaûng 3 phuùt. Trong tröôøng hôïp cuûa MPI ñaõ taùi gaáp cuoän (4), coù moät peak tín hieäu duy nhaát khoaûng 2000 mAU ôû khoaûng phuùt thöù 33, gaàn vôùi peak cuûa insulin coù hoaït tính. Coù theå suy luaän raèng MPI taùi gaáp cuoän coù caáu hình töï nhieân. Do MPI vaãn coøn ñoaïn C trong caáu truùc phaân töû neân thôøi gian löu giöõ trong coät cao hôn so vôùi tröôøng hôïp cuûa insulin (khoaûng 4 phuùt). Keát quaû ñaùnh giaù hieäu suaát taùi gaáp cuoän ñöôïc trình baøy theo Baûng 3.10. -115- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän min0 10 20 30 40 50 60 mAU 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\091707H1.D) *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090711H2.D) *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090711H3.D) *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090711I2.D) Hình 3.26. Keát quaû phaân tích dung dòch MPI taùi gaáp cuoän baèng RP-HPLC. (1) Maãu insulin chuaån coù hoaït tính, (2) Maãu insulin bieán tính baèng nhieät, (3) Maãu MPI chöa taùi gaáp cuoän, (4) Maãu MPI sau khi taùi gaáp cuoän. Baûng 3.10. Keát quaû phaân tích MPI taùi gaáp cuoän baèng RP- HPLC Löôïng naïp Noàng ñoä protein Löôïng protein Dieän tích peak Maãu insulin chuaån (A) 20μl 0,5 mg/ml 10μg 7.593 Maãu MPI taùi gaáp cuoän (B) 20μl 1,05 mg/ml 21μg 68.857 Töø keát quaû ghi nhaän ñöôïc, chuùng toâi ñaùnh giaù haøm löôïng MPI (MPItgc) coù trong dung dòch sau taùi gaáp cuoän laø: MPItgc = dt (B)/dt (A) * 10 = 68.857/7.3593 * 10 = 9,0685 μg So saùnh vôùi löôïng maãu naïp vaøo (21 μg), hieäu suaát taùi gaáp cuoän (HStgc) laø: HStgc = 9,0685 / 21* 100 = 43,18% 2 1 3 4 -116- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Töø caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc, coù theå khaúng ñònh raèng chuùng toâi ñaõ thaønh coâng trong vieäc taùi gaáp cuoän MPI daïng caáu hình töï nhieân vôùi hieäu suaát ñaït 43,18%. So vôùi hieäu suaát taùi gaáp cuoän ñöôïc baùo caùo bôûi Chang SG vaø coäng söï (1998) [16] thì keát quaû thu ñöôïc thaáp hôn. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø ñieàu kieän thí nghieäm chöa toái thích ñaëc bieät laø phaûi khoáng cheá noàng ñoä protein trong quaù trình taùi gaáp cuoän. Chuùng toâi söû duïng MPI taùi gaáp cuoän naøy cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu caét loaïi ñoaïn peptide C ñeå thu nhaän insulin. 3.4.2. Caét loaïi peptide C baèng trypsin Maãu mini-proinsulin taùi gaáp cuoän thu ñöôïc ôû phaàn treân ñöôïc tieán haønh xöû lyù caét loaïi ñoaïn peptide C baèng trypsin theo phöông phaùp ñöôïc moâ taû trong muïc 2.4.17. Dung dòch sau phaûn öùng thuûy phaân ñöôïc kieåm tra baèng phöông phaùp ñieän di SDS-PAGE vaø ñaùnh giaù caáu hình töï nhieân cuûa insulin taùi toå hôïp baèng phöông phaùp RP-HPLC. Keát quaû kieåm tra phaûn öùng caét loaïi peptide C ra khoûi caáu truùc MPI taùi gaáp cuoän baèng phöông phaùp ñieän di SDS-PAGE ñöôïc ghi nhaän treân Hình 3.27. ÔÛ gieáng 4, maãu dung dòch MPI sau khi caét loaïi ñoaïn peptide C coù xuaát hieän vaïch protein ñaäm coù kích thöôùc khoaûng 5,8 kDa töông öùng vôùi vaïch insulin chuaån (gieáng 2). Nhö vaäy trong dung dòch sau phaûn öùng caét coù chöùa insulin, ñöôïc hình thaønh töø vieäc caét loaïi ñoaïn peptide C ra khoûi caáu truùc MPI taùi gaáp cuoän. Maët khaùc, trong gieáng 4 coøn xuaát hieän moät vaïch protein nhaït hôn coù kích thöôùc töông öùng vôùi MPI trong gieáng 3. Coù theå ñaây laø MPI taùi gaáp cuoän coøn laïi trong dung dòch sau phaûn öùng maø nguyeân nhaân laø phaûn öùng caét loaïi peptide C khoâng ñaït hieäu quaû toái öu. Töø keát quaû thu ñöôïc coù theå khaúng ñònh raèng ñaõ caét loaïi ñöôïc peptide C ra khoûi MPI taùi gaáp cuoän. -117- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.27. Kết quả kiểm tra sự cắt loại petide C bằng ñiện di SDS-PAGE. Giếng 1, thang protein; 2, Iinsulin chuẩn; 3, MPI taùi gaáp cuoän tröôùc khi caét; 4, Dòch MPI taùi gaáp cuoän sau khi caét baèng trypsin. Keát quaû kieåm tra caáu hình insulin taùi toå hôïp thu nhaän ñöôïc baèng saéc kyù ngöôïc pha RP-HPLC ñöôïc trình baøy treân Hình 3.28. Keát quaû cho thaáy khoaûng phuùt thöù 29,5 coù xuaát hieän moät peak khoaûng 600 mAU töông öùng vôùi thôøi gian löu giöõ cuûa insulin chuaån treân coät (Hình 3.26). Keát quaû naøy cho pheùp khaúng ñònh raèng insulin taùi toå hôïp thu nhaän ñöôïc coù caáu hình töï nhieân. 14,4 20,1 Insulin taùi toå hôïp -118- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän m0 10 20 30 40 50 60 mAU -100 0 100 200 300 400 500 VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090827H1.D) Hình 3.28. Keát quaû phaân tích dòch caét loaïi ñoaïn peptide C baèng trypsin theo phöông phaùp RP-HPLC. 3.5. Kieåm tra hoaït tính cuûa insulin taùi toå hôïp treân chuoät Dung dòch insulin taùi toå hôïp thu nhaän ñöôïc sau khi xöû lyù baèng trypsin ñöôïc tieán haønh kieåm tra hoaït tính sô boä baèng caùch tieâm vaøo chuoät ñöôïc xöû lyù coù haøm löôïng ñöôøng trong maùu cao. Tieán haønh thí nghieäm theo phöông phaùp trong muïc 2.4.22. Keát quaû ghi nhaän ñöôïc trình baøy treân Baûng 5.3 (Phuï luïc). Xöû lyù tính toaùn soá lieäu theo phöông phaùp nhö ñaõ trình baøy trong muïc 2.4.22, keát quaû ñaùnh giaù ñöôïc trình baøy trong Baûng 3.11 vaø Hình 3.29. Keát quaû cho thaáy, caùc maãu insulin taùi toå hôïp thu ñöôïc (A, B) sau khi caét loaïi ñoaïn peptide C coù hoaït tính laøm giaûm ñöôøng huyeát chuoät sau khi tieâm 30 phuùt vaø 60 phuùt. Tuy nhieân so vôùi insulin chuaån thì hoaït tính cuûa caùc maãu insulin taùi toå hôïp thu ñöôïc thaáp hôn tính treân cuøng moät löôïng protein insulin tieâm vaøo chuoät. Nguyeân nhaân coù theå laø do ñoä tinh saïch cuûa insulin taùi toå hôïp thu ñöôïc chöa cao, ñieàu kieän thí nghieäm chöa ñöôïc toái öu neân hoaït tính coøn thaáp. -119- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Baûng 3.11. Keát quaû ñaùnh giaù hoaït tính insulin taùi toå hôïp treân chuoät Möùc bieán ñoäng haøm löôïng ñöôøng trong maùu chuoät sau tieâm (mg/dl) Chuoät maãu 0 phuùt 30 phuùt 60 phuùt 1. Chöùng döông (insulin chuaån) 0 154 109 2. Maãu Insulin A 0 67 28 3. Maãu Insulin B 0 53 28 -200 -150 -100 -50 0 0 30 60 Thôøi gian sau khi tieâm (phuùt) Ñ oä bi eán ñ oän g ha øm lö ôïn g ñö ôøn g tro ng m aùu (m g/ dl ) Insulin chuaån Maãu insulin taùi toå hôïp A Maãu insulin taùi toå hôïp B Hình 3.29. Söï bieán ñoäng haøm löôïng ñöôøng trong maùu chuoät sau khi xöû lyù baèng insulin taùi toå hôïp. 3.6. Sô ñoà qui trình coâng ngheä saûn xuaát insulin ôû qui moâ pilot Töø vieäc ñònh höôùng qui trình nghieân cöùu saûn xuaát insulin taùi toå hôïp theo moâ hình mini-proinsulin trong phaàn Toång quan (1.8), caùc keát quaû thu nhaän ñöôïc trong quaù trình nghieân cöùu vaø döïa vaøo caùc thieát bò saün coù, chuùng toâi xaây döïng qui trình coâng ngheä ñeå saûn xuaát insulin qui moâ pilot vôùi theå tích bình leân men laø 80 -120- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän lít. Sô ñoà ñöôïc trình baøy treân Hình 3.30. Caùc böôùc quan troïng cuûa qui trình bao goàm: Chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins coù khaû naêng bieåu hieän vöôït möùc MPI ñöôïc hoaït hoùa treân moâi tröôøng LB-Agar ôû 37oC trong voøng 16 giôø vaø ñöôïc nhaân gioáng qua hai caáp trong moâi tröôøng LBp coù boå sung ampicillin vôùi theå tích taêng daàn töø 200 ml ñeán 4 L. Nhieät ñoä nuoâi caáy cuûa giai ñoaïn nhaân gioáng laø 37oC sau thôøi gian khoaûng 7 giôø thì keát thuùc. Quaù trình leân men chính ñöôïc thöïc hieän theo phöông phaùp meû-boå sung trong bình leân men vôùi theå tích cuoái ñaït 80 L, trong ñoù moâi tröôøng ban ñaàu laø 43 L vaø Moâi tröôøng boå sung naïp vaøo laø khoaûng 37 L. Moâi tröôøng leân men söû duïng laø aH-LBp, vaø caûm öùng bieåu hieän baèng IPTG ôû nhieät ñoä 30oC trong 20 giôø. Sinh khoái teá baøo (khoâ) sau leân men ñaït khoaûng 2109 g, ñöôïc thu nhaän baèng caùch ly taâm ôû 6000 voøng/phuùt trong 15 phuùt. Qua quaù trình ñoàng hoùa teá baøo thu nhaän theå vuøi vaø tinh cheá thu nhaän 6xHis-MPI, löôïng 6xHis-MPI coù theå thu nhaän ñöôïc khoaûng 16,77 g. Tieán haønh caét loaïi 6xHis baèng CNBr ñeå thu nhaän ñöôïc khoaûng 3,4 g MPI vaø thöïc hieän taùi gaáp cuoän ñeå thu nhaän ñöôïc 1,47 g MPI caáu hình töï nhieân. Sau ñoù xöû lyù baèng trypsin ñeå caét loaïi ñoaïn peptide C ñeå thu nhaän insulin taùi toå hôïp coù hoaït tính. -121- Luaän aùn Tieán só Keát quaû –Bieän luaän Hình 3.30. Sô ñoà qui trình coâng ngheä saûn xuaát insulin ôû qui moâ pilot (80 L).