Luận văn Hân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP – PCR

trí cắt này. Do vậy vi khuẩn sẽ tránh bị các enzyme RE cắt chính hệ gene của chúng. 2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn Tên gọi thống nhất cho các enzyme cắt được quy định như sau: - Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn dùng để ly trích enzyme RE. - Hai chữ kế không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên. - Tiếp theo là một chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (trong trường hợp nhiều RE cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn). Đôi khi còn sử dụng một chữ viết hoa để chỉ chủng của vi khuẩn sử dụng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Ví dụ: Escherichia coli Ry13 và được viết tắt là EcoR. Giống Loài Chủng. Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzyme Trình tự 5’ – 3’ 3’ – 5’ Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Providencia stuartii Seratia marcesens Xanthomonas malvacearum HaeIII Sau3AI BamHI EcoRI HindIII PstI SmaI XmaI GG/CC CC/GG GATC CTAG G/GATCC CCTAG/G G/AATTC CTTAA/G A/AGCTT TTCGA/A CTGCA/G G/ACGTC CCC/GGG GGG/CCC C/CCGGG GGGCC/C (Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.4.1.3. Các loại RE Do đặc tính nhận biết và cắt DNA tại những vị trí khác nhau, người ta chia các enzyme cắt giới hạn thành 3 loại: - Loại 1: Khi enzyme nhận biết trình tự cắt, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1.000 – 5.000 nu và giải phóng độ vài chục nu. - Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt luôn tại trình tự đó. - Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự đặc trưng và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nu. Tuy có 3 loại enzyme cắt giới hạn nhưng chỉ có loại 2 là được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử. 2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE Ở sinh vật nhân thật, việc phân tích cả hệ gene là rất khó khăn. Do đó việc sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt nhỏ bộ gene khổng lồ là cần thiết để dễ dàng hơn trong nghiên cứu. Các nhà khoa học còn sử dụng RE trong nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn, lập bản đồ giới hạn hay so sánh bộ gene ở các loài khác nhau bằng kỹ thuật RFLP. 2.4.2. Sơ lƣợc về phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.4.2.1. Giới thiệu chung RFLP là phương pháp sử dụng một enzyme cắt giới hạn (RE) để cắt một mẫu DNA, sau đó sẽ so sánh số band DNA tạo thành thông qua kỹ thuật điện di để xác định đột biến điểm hay sự khác nhau của các trình tự DNA. Khi trình tự DNA của hai cá thể hoàn toàn khác nhau về kích thước và số lượng thì khi thực hiện cắt bằng cùng một enzyme thì sẽ cho số vạch và kích thước của các vạch khác nhau. Do đó, dựa vào kích thước và số lượng band khác nhau, ta có thể xác định có sự khác nhau trong trình tự đoạn DNA nghiên cứu. 2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP Một phản ứng RFLP chuẩn bao gồm các bước sau: - Bước 1: Tách chiết DNA và tinh sạch DNA. - Bước 2: Cắt mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn RE. - Bước 3: Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot. Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng RFLP cần phải thực hiện một phản ứng trung gian là Southern blot (Hình 2.2). Do đó kỹ thuật này rất tốn kém và phức tạp. Hình 2.2: Mô tả phản ứng RFLP (Nguồn: 2.4.3. Sơ lƣợc về kỹ thuật RFLP – PCR Do sự phức tạp, tốn kém và khó khăn khi phải thực hiện Southern blot nên khi nghiên cứu bộ gene người ta thường thực hiện phản ứng RFLP dựa trên PCR. Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme thích hợp. Dựa vào kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt để đánh giá sự đa hình của DNA. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này không phải thiết kế probe. Đồng thời phương pháp này tạo ra ít band hơn phương pháp RFLP nguyên thủy, tạo điều kiện dễ dàng hơn trong phân tích kết quả. Quy trình thực hiện: - Tách chiết DNA. - Thực hiện PCR khuếch đại trình tự đích bằng một cặp primer thích hợp. - Xử lý sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Điện di và nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết quả. Ngoài các ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thông thường thì phương pháp RFLP – PCR còn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết quả điện di trực tiếp bằng mắt không dùng đồng vị phóng xạ mà chỉ sử dụng ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả. 2.5. Giới thiệu về vùng ITS Vùng ITS là vùng nằm xen kẽ với các trình tự rDNA (Hình 2.3). Các trình tự rDNA mã hóa cho các rRNA, các rRNA sẽ kết hợp với protein để tạo ra ribosome có chức năng tổng hợp protein. Trong các vùng này thì vùng rDNA là vùng bảo tồn nhất, kế đến là vùng ITS còn vùng biến động nhất là vùng IGS. Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS của nấm (Nguồn: Đặc điểm của vùng ITS (Bridge và cộng sự, 2000): - Đây là vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR. - Vùng ITS có tính bất ổn hơn vùng gene mã hóa rDNA. - PCR có thể khuếch đại vùng này bằng các primer đặc trưng. Các nhà nghiên cứu đã lựa chọn vùng ITS để tìm những vùng gene đặc trưng cho loài, từ đó giúp xác định loài nhanh chóng. Do tính chất như vậy mà vùng ITS đã được sử dụng nghiên cứu với mục đích là tìm ra và xác định sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996). Năm 1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum. Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP, DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997). Đối với các loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn khá cao đối với các dòng nấm có quan hệ di truyền gần gũi nhau. Ngoài việc sử dụng vùng ITS để phân tích cây phát sinh loài, nó còn được sử dụng với mục đích phát hiện và định danh vi sinh vật (Vandepeer và cộng sự, 1996). Tuy nhiên, thông thường người ta sử dụng vùng ITS để xác định sự biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999). Nazar và cộng sự (1991) đã sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS để phát hiện và định danh nấm Verticillium albo-atrum và V. dabliae. Trong một nghiên cứu tương tự trên dòng Verticillium tricorpus, Moukhamedov và cộng sự (1993) đã định danh được chúng thuộc loài Verticillium. Trước đây, người ta phân loại chủ yếu dựa trên những đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả thường có độ tin cậy không cao. Với việc phát triển các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử trên vùng ITS, người ta có thể phân loại các dòng nấm một cách rất chính xác. Năm 1996, Boysen và cộng sự đã sử dụng PCR trên vùng ITS1, ITS2 của nấm Rhizoctonia solani để phân tích đặc tính bệnh và xác định được 3 nhóm phụ. Với các ưu điểm như vậy, vùng ITS càng ngày càng được nghiên cứu rộng rãi và phổ biến hơn. Nó là vùng đạt được kết quả nhiều nhất trong nghiên cứu sinh học phân tử của nấm. 2.6. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nƣớc và ngoài nƣớc Đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola. Tuy nhiên, do là loại nấm mới bùng phát nên đa số các nghiên cứu đều là nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh, khả năng sinh độc tố cassiicoline và sự phân bố của chúng trên nhiều lãnh thổ khác nhau. Những nghiên cứu này đã làm thay đổi cách đánh giá về khả năng gây bệnh của loài nấm này. Kết quả của những nghiên cứu cho thấy nấm Corynespora cassiicola có phổ ký chủ rất rộng, đồng thời khả năng sinh độc tố cũng thay đổi rất lớn tùy thuộc vào các dòng vô tính cao su được ghi nhận (Jayashinge và cộng sự, 1998). Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về nấm C. cassiicola là chưa nhiều. Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su. Vũ Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III, Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C. cassiicola (RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết quả không tìm thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này. Đa số các nghiên cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh… của chúng. Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên diện rộng. Ngoài khả năng sinh độc tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân hủy peptin và cellulose (C.K. Jayashinge, 2000). Năm 1995, Silva và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C. cassiicola khác nhau và đã phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền. Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm. Năm 2003, Safiah Atan và Noor Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm. Kết quả là đã xếp chúng vào 2 chủng khi nghiên cứu bằng RAPD. Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu. Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP trên vùng ITS của 32 dòng nấm. Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm này thành 7 nhóm di truyền. PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian nghiên cứu Tiến hành từ tháng 02/2006 đến tháng 08/2006. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu - Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam – Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương. - Nhân sinh khối nấm C. cassiicola tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. - Tiến hành ly trích DNA, chạy PCR, RFLP tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá của các dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh rụng lá Corynespora. 3.2. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola. 2. Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS. 3. Phân tích đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola bằng kỹ thuật RFLP – PCR.. 3.3. Vật liệu và phƣơng pháp 3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, giấy thấm, bông gòn, giá để ống nghiệm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, máy lắc, bút lông… Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar. Thuốc nhuộm Methylene Blue. Nước cất. Cách pha môi trƣờng PGA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất 2 lần đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong. Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc. Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 20g đường glucose. Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Phân vào các đĩa petri và các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử trùng ở 121 C/ 15 phút. 3.3.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu Lấy nguyên cả mẫu lá có triệu chứng bệnh, đặt trong hộp đựng mẫu có giấy thấm nước để giữ ẩm. Mẫu được ghi đầy đủ dữ liệu như: nơi lấy mẫu, dòng vô tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, lá non, lá già, triệu chứng đặc trưng (hình xương cá) hay không đặc trưng (vết tròn)…) 3.3.1.3. Phƣơng pháp phân lập nấm Mẫu nấm được phân lập từ các vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora theo các bước sau: - Mẫu đưa về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần. - Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử và cấy vào môi trường PGA. Hoặc cắt mẫu thành những miếng nhỏ, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cồn 70o rồi cấy vào môi đĩa môi trường PGA. - Ủ hai ngày. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường mới. - Tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng. Tiến hành quan trắc bào tử nấm C. cassiicola. Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử. 3.3.1.4. Phƣơng pháp tách đơn bào tử Sau khi phân lập được dòng nấm C. cassiicola thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau: - Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm. - Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng. - Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải một lớp mỏng agar. - Ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ. - Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ. Đánh dấu, sau đó tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA. - Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc. 3.3.1.5. Phƣơng pháp nhân sinh khối - Chuẩn bị môi trường PGA lỏng, cách pha giống với môi trường PGA (Mục 3.3.1.1) nhưng không bỏ agar. - Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường PGA lỏng. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vòng/phút, ở 26 – 30oC). - ......................................................................................................... Sa u 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên giấy lọc tiệt trùng. Sau đó làm khô sinh khối, giữ ở -20oC. 3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA của nấm 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm - Nitơ lỏng. - Phenol. - Chloroform. - Isoamyl alcohol. - Isopropanol. - Ethanol 100%, 70% - TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0. - Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% - mecaptoethanol. - Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex… 3.3.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA DNA nấm được tách chiết theo phương pháp của Lee & Taylor (1990). Quy trình cụ thể - Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. - Chuyển bột nghiền vào eppendorf. - Thêm 300 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. - Ủ ở 65oC trong 1giờ. - Di chuyển ống nghiệm ra khỏi bồn ổn nhiệt. - Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28oC. - Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới. - Kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở 28oC. - Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70o rửa sạch nhiều lần. - Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4oC hay -20oC. 3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di Sau khi thu DNA của sợi nấm, tiến hành chạy điện di kiểm tra DNA tổng số với mục đích định tính DNA nấm. Chạy kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%. 3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích Sản phẩm DNA tổng số được ly trích có nhiều tạp do nhiều nguyên nhân như protein khử không hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy… sẽ được tinh sạch trước khi đem chạy PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm DNA tổng số được thực hiện theo quy trình sau: - Bước 1: Pha loãng mẫu ly trích với nước cất vô trùng theo tỷ lệ 3 mẫu : 1 nước. - Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu 2 l enzyme RNase. Đem ủ ở 37oC trong 30 phút. - Bước 3: Sau khi ủ, hút 2 l hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ. - Bước 4: Đem ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 5 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác. - Bước 5: Cho vào eppendorf chứa dịch nổi 400 l ethanol 100% và ủ ở -70oC, trong 20 phút. - Bước 6: Ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 1 phút. - Bước 7: Loại bỏ dịch nổi. Tiến hành làm khô mẫu và cho TE 1X vào. 3.3.3. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR 3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 2 primer: ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC Dụng cụ thí nghiệm: Eppendorf các loại. Micropippette và đầu típ các loại. Lò vi sóng. Cân kỹ thuật 4 số. Máy luân nhiệt (thực hiện phản ứng PCR). 3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR Bảng 3.1: Thành phần một phản ứng PCR Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM 10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X MgCl2 1 25 mM 1 mM ITS A 1 25 pM/ l 25pM ITS B 1 25 pM/ l 25pM Taq polymerase 0,1 5U 0,5U Khuôn mẫu 1 Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: thực hiện trong 41 chu kỳ. - Chu kỳ 1: Biến tính: 94 C 3phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 39 chu kỳ tiếp theo: Biến tính: 94 C 1 phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 1 chu kỳ cuối: Biến tính: 94 C 1phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 9 phút. 3.3.3.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%. Hóa chất cho kỹ thuật điện di DNA ladder loại 1000bp (Biorad). Ethidium bromide 1%. Dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris HCl, 10 mM glacial acetate, EDTE 1 mM). - Loading buffer 6X, gel agarose. Dụng cụ và thiết bị điện di Micropippette và các đầu típ. Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad). UV transilluminator (Biorad). Máy chụp ảnh (DNA photography equipment) (Biorad). Cách thực hiện đổ gel và chạy điện di. - Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X. - Đun sôi khoảng 1 – 2 phút. - Để nguội đến 40 – 50oC. - Đổ gel vào bể điện di và đặt lược tạo giếng diện di. - Chờ gel đông lại. Cho vào bể điện di và đổ dung dịch TAE vào. - Lấy 4 l sản phẩm PCR trộn với 2 l loading dye cho vào giếng và tiến hành chạy điện di. - Phân tích sản phẩm PCR bằng máy chụp gel. 3.3.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 3.3.4.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Các enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I, Nde II, Sau 3A I, EcoR I, Cfo I, Rsa I. - Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola. - Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad). - Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml. 3.3.4.2. Thực hiện phân tích RFLP Bảng 3.2: Thành phần một phản ứng enzyme cắt Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối Enzyme Buffer enzyme Sản phẩm PCR Nước 0,1 2,5 3 vừa đủ phản ứng 25 l 10 U/ l 10 X 1U 1X Các bước để thực hiện một phản ứng enzyme cắt: - Hút 3 l dung dịch sản phẩm PCR cho vào một eppendorf. - Sau đó cho 0,1 l dung dịch enzyme cắt vào. - Ủ ở 37oC trong thời gian khoảng 3 – 14 giờ tùy thuộc vào yêu cầu của từng loại enzyme. - Làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 65oC trong thời gian 15 phút. Sau đó, sản phẩm cắt sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% - 1,5%, phân tích sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm. PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su 4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora Tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora là nấm Corynespora cassiicola. Đây là loại nấm có phổ ký chủ rộng, có khả năng thích nghi rất lớn với mọi thời tiết. Do vậy, bệnh này xuất hiện quanh năm trong mọi thời tiết và ở mọi khí hậu từ cận xích đạo, xích đạo và cả ôn đới. Đặc biệt trong mùa mưa, nước mưa sẽ làm bào tử của chúng phát tán ra môi trường. Do có khả năng thích nghi như vậy, nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Chúng gây bệnh trên rất nhiều dòng vô tính cây cao su. Nấm này gây hại trên cây cao su ở tất cả các giai đoạn từ cây trong vườn ươm, vườn kiến thiết hay vườn cây khai thác. Ở Việt Nam, bệnh này mới được phát hiện trên cây cao su vào năm 1999. Và bước đầu đã được ngăn chặn bằng cách chặt bỏ các dòng vô tính bị nhiễm. Đồng thời khuyến cáo không trồng các dòng vô tính cao su có tính mẫn cảm cao. Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì ở Việt Nam bệnh này đang trong giai đoạn ủ bệnh và tích lũy bệnh, do đó trong tương lai có thể bùng phát thành dịch bệnh nếu không có những biện pháp quản lý và kiểm soát bệnh (Phan Thành Dũng – Báo cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, hiện trạng và thách thức mới, 2006). Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới xuất hiện, quy mô gây hại tiềm ẩn rất lớn. Chúng ta phải thường xuyên kiểm tra ở tất cả các vườn cao su từ vườn ươm đến vườn cây khai thác. Hiện nay, theo số liệu thống kê do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam thì hầu hết các vườn tuyển non và vườn sơ tuyển tại Lai Khê đều bị nấm này tấn công trên quy mô lớn (Bảng 4.1). Bảng 4.1: Tình hình nhiễm bệnh tại một số vƣờn trên địa bàn Lai Khê – BD Tên vƣờn Ngày quan trắc Số dòng vô tính quan trắc Số dòng có triệu trứng bệnh Phần trăm dòng vô tính bị bệnh (%) Vƣờn tuyển non năm 2001 Vƣờn tuyển non năm 2002 Vƣờn sơ tuyển năm 2003 Vƣờn sơ tuyển năm 2004 29/05/2006 29/05/2006 17/04/2006 18/04/2006 1131 1808 72 74 1005 1720 44 47 88,9 95,1 61,1 63,5 Theo Bảng 4.1, tỷ lệ dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh là rất lớn. Tại các vườn tuyển non, tỷ lệ nhiễm bệnh cao có thể lý giải là do số lượng dòng vô tính rất lớn và khỏang cách giữa các cây là rất gần nhau. Do đó bệnh dễ dàng lây lan giữa các dòng với nhau. Còn các vườn sơ tuyển, đây là vườn lưu trữ các giống có tiềm năng đã qua chọn lọc nên tỷ lệ nhiễm bệnh có thấp hơn vườn tuyển non. Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm bệnh này là rất cao, cần có các biện pháp hợp lý để hạn chế sự phát triển của bệnh này. Theo thống kê chưa đầy đủ, tại các công ty cao su trực thuộc Tổng công ty cao su Việt Nam bệnh rụng lá Corynespora cũng đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn trên cây cao su con. Trong quá trình tiến hành làm thí nghiệm, tôi đã tiến hành thu thập mẫu nấm từ các mẫu lá có triệu chứng bệnh của nhiều dòng vô tính cao su khác nhau tại Vườn tuyển non Lai Khê - Viện nghiên cứu cây cao su Việt Nam (Hình 4.1). Để đơn giản và thuận tiện cho công việc tôi đã tiến hành mã hóa tên các dòng nấm thu được từ các dòng vô tính khác nhau thành các số thứ tự (xem Phụ lục 1.). Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora A: Lá mới bị bệnh C: Triệu trứng trên thân cây non B: Lá bị bệnh nặng D: Tán cây bị bệnh rụng lá Corynespora A B C D (Nguồn: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN) 4.1.2. Kết quả phân lập Sau khi thu được các mẫu bệnh từ các dòng vô tính khác nhau, tôi đã tiến hành phân lập nấm trên môi trường PGA. Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo (3 ngày sau khi cấy) Triệu chứng nấm này gây ra trên cao su biến thiên rất lớn. Từ dạng hình xương cá ở gân lá (triệu chứng đặc trưng), đến hình tròn ở trên phiến lá (triệu chứng không đặc trưng). Từ các mẫu lá có triệu chứng bệnh chúng tôi đã tiến hành phân lập bằng phương pháp cấy chuyền nhiều lần. Sau đó chọn những khuẩn lạc đặc trưng như màu xám nâu, hình dạng khuẩn lạc là tập hợp của nhiều vòng tròn đồng tâm… Sau khi tiến hành phân lập chúng tôi đã thu được tổng cộng 65 dòng nấm trên 65 dòng vô tính cao su khác nhau. Hình 4.3: Bào tử nấm C. cassiicola A: Bào tử nấm C.cassiicola trên môi trƣờng tự nhiên. B: Bào tử nấm C.cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo. (Nguồn: Phan Thành Dũng, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN) A B 4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử Để chuẩn bị tốt nguồn nấm cho các thí nghiệm kế tiếp, tôi đã tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền. Do bào tử của nấm Corynespora cassiicola có kích thước lớn nên có thể quan sát và tiến hành tách đơn bào tử rất dễ dàng trên kính hiển vi quang học. Bảng 4.2: Các dòng nấm đƣợc tách đơn bào tử STT đƣợc mã hóa Kí hiệu của dòng vô tính cao su Tên dòng vô tính cao su 1 RRIV2 LH82/122 3 26/20 LH9/0023 6 29/93 LH99/0053 7A 4/48 LH99/0081 7B 4/48 LH99/0081 11 28/37 LH99/0093 12 19/38 LH99/0098 14 4/84 LH99/0131 19 32/86 LH99/0337 23 1/24 LH99/0374 28 2/55 LH99/0412 30 30/88 LH99/0431 35 21/55 LH99/0617 42 7/70 LH99/0679 52 19/82S LH99/0050 53 29/93S LH99/0053 54 28/81S LH99/0112 55 22/25S LH99/0216 59 7/8S LH99/0636 60 22/70S LH99/0675 62 10/11S LH99/0757 63 10/34S LH99/0778 64 16/28S LH99/0672 65 RRIV4 Nấm Corynespora cassiicola là một loại nấm rất khó phát sinh bào tử trên môi trường nhân tạo (có thể do môi trường nuôi cấy chưa thích hợp hoặc do chế độ ánh sáng không thích hợp). Do đó, để có bào tử chúng tôi đã tiến hành kích thích cho nấm này phát sinh bào tử bằng cách: - Tạo vết thương trên bề mặt khuẩn lạc bằng kim lưỡi mác hoặc lame vô trùng. - Sau đó tiến hành ủ khuẩn lạc trong tối 3 ngày. - Rồi đem khuẩn lạc chiếu sáng 3 ngày liên tiếp, khuẩn lạc sẽ phát sinh bào tử. Bào tử nấm Corynespora cassiicola có màu nâu nhạt, hình bầu dục, nhiều vách ngăn, chiều dài biến thiên (có thể dài tới 700 m) (Phan Thành Dũng, 2004; Nguyễn Thị Huệ, 1997). Chúng tôi đã tiến hành tách đơn bào theo quy trình ở Mục 3.3.1.4. Tuy nhiên, do một số nguyên nhân như số lượng mẫu lớn, nấm khó sinh bào tử trên môi trường nhân tạo, thời gian thực hiện ngắn… nên chúng tôi chỉ tiến hành tách thành công được một số dòng nấm (xem Bảng 4.2). Đồng thời trong quá trình tách đơn bào tử, tôi nhận thấy khuẩn lạc hình thành từ 2 đơn bào tử của một số dòng nấm có nhiều điểm khác nhau như hình dạng, kích thước, màu sắc (Hình 4.4). Như vậy rất có thể có nhiều dòng nấm cùng ký sinh trên một ký chủ tại thời điểm phân lập nấm nhưng cũng có thể chỉ là sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc của một dòng nấm. Chúng tôi đã mã hóa hai khuẩn lạc (có màu sắc) thu được từ một dòng nấm thành hai dòng khác nhau để đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền. Và ký hiệu là A và B. Hình 4.4: Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc thu đƣợc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm 7A 7B 4.1.3. Kết quả nhân sinh khối Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Tiến hành chuyển sinh khối sợi nấm từ đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các bình tam giác này chứa môi trường PGA lỏng và được lắc ở 160 vòng/phút, ở nhiệt độ 28oC. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối (Hình 4.5). Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc Trong quá trình nhân sinh khối, đã thu nhận được sinh khối có 2 màu khác nhau là màu đen và màu vàng. Có thể giải thích là do chế độ ánh sáng chưa phù hợp nên sinh khối có màu sắc khác nhau. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát dịch lỏng trên kính hiểu vi quang học để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn (chỉ là phương pháp tương đối). Thông thường, mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc. 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm Các dòng nấm Corynespora cassiicola sau khi nhân sinh khối sẽ thu nhận sợi nấm và tiến hành li trích DNA tổng số. DNA của sợi nấm được li trích theo qui trình của Lee & Taylor (1990). Kết quả li trích DNA tổng số cho kết quả khá tốt, số lượng tạp (chủ yếu là RNA, protein) tương đối ít (Hình 4.6). DNA sau khi li trích sẽ được tinh sạch và pha loãng đến mức độ có thể chạy được PCR (band DNA xuất hiện trên gel điện di ở dạng vệt (track)). Hình 4.6: Kết quả li trích của 24 dòng nấm khác nhau Ghi chú: L1: 1 (LH82/122) L6:11 (LH99/0093) L11: 28 (LH99/0412) L2: 3 (LH9/0023) L7: 12 (LH99/0098) L12: 30 (LH99/0431) L3: 6 (LH99/0053) L8: 14 (LH99/0131) L13: 35 (LH99/0617) L4: 7A (LH99/0081) L9: 19 (LH99/0337) L14: 42 (LH99/0679) L5: 7B (LH99/0081) L10: 23 (LH99/0374) L15: 52 (LH99/0050) L16:53 (LH99/0053) L19: 59 (LH99/0636) L22: 63 (LH99/0778) L17: 54 (LH99/0112) L20: 60 (LH99/0675) L23: 64 (LH99/0672) L18: 55 (LH99/0216) L21: 62 (LH99/0757) L24: 65 (RRIV4) Theo Hình 4.6 thì độ đậm hay nhạt của band DNA có thể là do số lượng sợi nấm sử dụng không đều hoặc do chất lượng sợi nấm sau khi nhân sinh khối hoặc do đèn chụp UV không tốt. Tiến hành lấy sản phẩm li trích đem tinh sạch thu được kết quả tinh sạch sản phẩm DNA ly trích là rất tốt (Hình 4.7). Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch Ghi chú: L1: 3 (LH9/0023) L6: 14 (LH99/0131) L11: 52 (LH99/0050) L2: 7A (LH99/0081) L7: 23 (LH99/0374) L12: 53 (LH99/0053) L3: 7B (LH99/0081) L8: 28 (LH99/0412) L13: 54 (LH99/0112) L4: 11 (LH99/0093) L9: 35 (LH99/0617) L14: 55 (LH99/0216) L5: 12 (LH99/0098) L10: 42 (LH99/0679) L15: 59 (LH99/0636) L16: 60 (LH99/0675) L17: 62 (LH99/0757) L18: 63 (LH99/0778) L19: 64 (LH99/0672) L20: 65 (RRIV4) Tuy nhiên, trong quá trình tinh sạch có 4 dòng nấm không cho kết quả tốt. Đó là các dòng: 1, 6, 19, 30. Điều này có thể được giải thích là do lượng DNA mẫu sử dụng tinh sạch không tốt hay quá ít. Do đó, khi điện di kết quả tinh sạch không cho kết quả như mong muốn. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch lại nhưng vẫn không thành công. 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR Hiện nay, để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các dòng nấm phương pháp thông dụng nhất là đánh giá trên vùng gene mã hóa cho các rRNA. Vùng gene này nằm cả trong nhân và ty thể, chúng mã hóa cho hai tiểu đơn vị lớn rRNA và tiểu đơn vị nhỏ rRNA 5,8S. Trong vùng gene này có chứa các vùng bảo tồn và các vùng có khả năng biến dị. Các vùng gene mã hóa cho các tiểu đơn vị có tính bảo tồn cao hơn các vùng gene nằm xen kẽ các trình tự mã hóa đó. Hai vùng thường được sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng di truyền là hai vùng có tính biến dị cao đó là vùng ITS (internal transcribed spacers) và vùng IGS (intergenic spacers). Vùng ITS là vùng không có chức năng mã hóa nhưng có khả năng biến dị, nằm giữa các vùng mã hóa có tính bảo tồn cao. Do vậy mà vùng ITS được sử dụng rất nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể. Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng 2 primer là ITS A và ITS B (được thiết kế bởi Silva và cộng sự, 1998) để khuếch đại đoạn DNA nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S. Hai primer này khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA có kích thước 540 bp của vùng ITS nấm. Kết quả đã khuếch đại được đoạn DNA nằm giữa 2 primer. Khi tiến hành PCR theo chu trình nhiệt và hàm lượng primer trong phản ứng của Silva và cộng sự (1998), tôi có thu được đoạn DNA có kích thước 540 bp. Hình 4.8: Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) Tuy nhiên, theo Hình 4.8 thì lượng sản phẩm tạp là tương đối lớn. Sản phẩm tạp này có thể do nhiều nguyên nhân như lượng DNA mẫu cao, nhiệt độ bắt cặp thấp, số lượng chu kỳ nhiều, lượng primer và dNTPs cho một phản ứng quá nhiều… Và tôi đã tiến hành thay đổi một vài yếu tố trong phản ứng PCR và đã thu được sản phẩm rất đặc hiệu, không có tạp (Hình 4.9). Trong các yếu tố của phản ứng PCR được khảo sát thì tôi nhận thấy cần phải tăng nhiệt độ bắt cặp và giảm Tạp Sản phẩmPCR lượng primer trong mỗi phản ứng PCR thì vừa tiết kiệm primer lại vừa giảm được sản phẩm tạp. Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo qui trình mới Ghi chú: Điện di ở hiệu điện thế 50 V, nồng độ agarose 1,5%, thời gian 90 phút. L1: 3 (LH9/0023) L6: 14 (LH99/0131) L11: 52 (LH99/0050) L2: 7A (LH99/0081) L7: 23 (LH99/0374) L12: 53 (LH99/0053) L3: 7B (LH99/0081) L8: 28 (LH99/0412) L13: 54 (LH99/0112) L4: 11 (LH99/0093) L9: 35 (LH99/0617) L14: 55 (LH99/0216) L5: 12 (LH99/0098) L10: 42 (LH99/0679) L15: 59 (LH99/0636) L16: 60 (LH99/0675) L18: 63 (LH99/0778) L19: 64 (LH99/0672) L17: 62 (LH99/0757) L20: 65 (RRIV4) L21: Đối chứng âm Sau nhiều lần thay đổi, chúng tôi đã đưa ra một quy trình PCR tương đối ổn định cho việc khuếch đại vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng cặp primer ITS A và ITS B. Thành phần phản ứng PCR sau khi thay đổi được mô tả trong Bảng 4.3. Bảng 4.3: Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi Thành phần Liều lƣợng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối dNTP 0,25 10 mM 0,1 mM 10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X MgCl2 1 25 mM 1 mM ITS A 0,4 25 pM/ l 10 pM ITS B 0,4 25 pM/ l 10 pM Taq polymerase 0,1 5U 0,5U Khuôn mẫu 1 Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l 540bp Chu trình nhiệt có sự thay đổi, gồm 40 chu kỳ: - Chu kỳ 1: Biến tính: 94oC 3 phút. Biến tính: 94 C 2 phút. Bắt cặp: 57 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 38 chu kỳ tiếp theo: Biến tính: 94 C 1 phút. Bắt cặp: 57 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 1 chu kỳ cuối: Kéo dài: 72 C 9 phút. Giữ ở 4oC: 10 phút. 4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola Để phân tích sự khác nhau về mặt di truyền có rất nhiều phương pháp như RAPD, RFLP, AFLP…. Trong đó, để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các dòng nấm gây bệnh trên thực vật, người ta thường sử dụng phương pháp RFLP để phân tích. Đối với phương pháp RFLP thông thường phải trải qua một bước quan trọng là Southern blot, vì nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các enzyme cắt giới hạn để phân cắt bộ gene của từng cá thể. Tuy nhiên, nếu sử dụng phương pháp RFLP nguyên bản phải trải qua bước Southern blot rất phứt tạp, do đó để nghiên cứu tính đa dạng di truyền thường sử dụng phương pháp RFLP – PCR. Về cơ bản phương pháp RFLP – PCR không khác nhiều so với phương pháp RFLP thông thường. Nhưng thay vì phải trải qua bước Southern blot thì người ta tiến hành khuếch đại một đoạn DNA trong bộ gene của sinh vật với một cặp primer đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR thu được bằng các enzyme cắt giới hạn và so sánh giữa các cá thể thông qua số lượng các đoạn DNA xuất hiện trên bản gel điện di. Và khi đó, nếu hai cá thể giống nhau về mặt di truyền thì sau khi cắt sẽ cho ra các đoạn DNA có kích thước giống nhau. Sau khi tiến hành PCR, chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu và tiến hành phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. Trong điều kiện cho phép chúng tôi đã sử dụng 7 loại enzyme để phân cắt sản phẩm PCR đó là Hae III, EcoR I, Sau3A I, Alu I, Cfo I, Nde II, Rsa I. Sau khi tiến hành cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chúng tôi tiến hành điện di trên gel 1,5% để kiểm tra kết quả. Đối với enzyme Hae III, sản phẩm PCR của tất cả các dòng được cắt ra làm 2 band với kích thước 2 band là 390bp và 150bp, đồng thời không cho ra band đa hình (Hình 4.10). Hình 4.10: Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III Hình 4.11: Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I 300bp 100bp 540bp 540bp 400bp 100bp Theo Hình 4.11. khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoR I sẽ cho ra hai band có kích thước lần lượt là 240 bp và 300 bp. Hình 4.12: Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I Tương tự với hai enzyme Hae III và EcoR I, enzyme Sau3A I cũng phân cắt sản phẩm PCR thu được thành hai đoạn có kích thước khoảng 340 bp và 200 bp (Hình 4.12). Hình 4.13: Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I 540bp 400bp 400bp 100bp 540bp 100bp 400bp 100bp 540bp Hình 4.14: Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I Hình 4.15: Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I Hình 4.16: Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II Ghi chú: 1: 3 (LH9/0023) 6: 14 (LH99/0131) 11: 52 (LH99/0050) 2: 7A (LH99/0081) 7: 23 (LH99/0374) 12: 53 (LH99/0053) 3: 7B (LH99/0081) 8: 28 (LH99/0412) 13: 54 (LH99/0112) 4: 11 (LH99/0093) 9: 35 (LH99/0617) 14: 55 (LH99/0216) 5: 12 (LH99/0098) 10: 42 (LH99/0679) 15: 59 (LH99/0636) 16: 60 (LH99/0675) 19: 64 (LH99/0672) 400bp 100bp 540bp 400bp 400bp 17: 62 (LH99/0757) 20: 65 (RRIV4) 18: 63 (LH99/0778) DC: Đối chứng âm (sản phẩm PCR chưa cắt) Có kết quả phân cắt tương tự khi tiến hành cắt bằng Alu I, Cfo I, Nde II và Rsa I. Các enzyme này đều cắt sản phẩm PCR thành hai đoạn có kích thước được mô tả trong Bảng 4.4. Sản phẩm bị mờ do nhiều nguyên nhân như kích thước band quá nhỏ (nhỏ hơn 200 bp), do điện di trên bồn lớn đòi hỏi gel phải dày nên nhuộm ethidium bromide chưa đủ thời gian. Bảng 4.4: Kích thƣớc các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme RE Tên RE Kích thƣơc tƣơng đối đoạn DNA thứ nhất Kích thƣớc tƣơng đối đoạn DNA thứ hai Ghi chú Hae III 140 400 Đơn hình EcoR I 240 300 Đơn hình Sau3A I 340 200 Đơn hình Alu I 380 160 Đơn hình Cfo I 250 290 Đơn hình Nde II 200 340 Đơn hình Rsa I 200 340 Đơn hình Như vậy, tất cả các enzyme sử dụng đều có vị trí cắt trên sản phẩm PCR thu được. Tuy đã phân tích trên một số lượng mẫu tương đối lớn (20 mẫu) và sử dụng 7 loại enzyme để phân cắt nhưng chúng tôi vẫn không tìm thấy bất cứ sự sai khác nào về mặt di truyền của các dòng nấm đã phân tích. Các dòng nấm này tuy được phân lập trên nhiều dòng vô tính cây cao su khác nhau nhưng tất cả các dòng vô tính này đều thuộc quần thể Vườn tuyển non của Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam (Lai Khê, Bình Dương). Rất có thể có dòng nấm được phân lập đều 540bp thuộc cùng một chủng. Tuy nhiên vùng ITS của nấm là vùng khá bảo tồn, do đó rất khó để khẳng định chính xác các dòng nấm này đều thuộc cùng một chủng. Kết quả nghiên cứu còn đưa đến kết luận về sự biến thiên khuẩn lạc trong quá trình tách đơn bào tử. Hai dòng 7A và 7B là hai dòng được tách từ 2 đơn bào tử khác nhau của cùng một dòng nấm ban đầu, khi phân cắt bằng các enzyme cắt không tìm thấy sự khác niệt nào. Điều đó càng khẳng định nấm C. cassiicola là loài nấm có mức độ biến đổi sinh hóa cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước trước đây. Mặt khác rất có thể có sự khác biệt trong trình tự các nucleotide nhưng không ở vị trí cắt của các enzyme đã sử dụng, do đó sử dụng các enzyme cắt không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào. Vì vậy, cần phải có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự vùng ITS thì mới có thể kết luận chính xác có sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng hay không . PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Nấm C. cassiicola là một loài nấm mới, mức độ gây hại rất cao và có yếu tố phát sinh bệnh phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố cả môi trường, ký chủ cũng như vùng địa lý. Triệu chứng bệnh biến thiên rất lớn, do đó việc quản lý và kiểm soát bệnh do nấm này gây ra gặp rất nhiều khó khăn. Để việc kiểm soát được dễ dàng hơn chúng tôi đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của chúng và đã đi đến một số kết luận sau: - Nấm C. cassiicola là loài nấm có khả năng biến đổi sinh hóa cao. Màu sắc khuẩn lạc, sinh khối thay đổi tùy theo điều kiện ngoại cảnh. - Có thể áp dụng các quy trình ly trích DNA tổng số nấm đang phổ biến trên thế giới để tiến hành ly trích DNA tổng số của nấm C. cassiicola. - Tuy có sự khác biệt về màu sắc và hình dạng khuẩn lạc nhưng chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt về mặt di truyền khi phân tích bằng kỹ thuật RFLP – PCR. - Qua nghiên cứu chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR tương đối chính xác có thể áp dụng để phân tích PCR trên vùng ITS của nấm này. - Dựa vào sự khác nhau về ký chủ của nấm này chúng tôi đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của nấm bằng kỹ thuật RFLP – PCR và không tìm thấy sự khác biệt nào về mặt di truyền. Có thể kết luận tạm thời là các dòng nấm được phân tích đều thuộc một chủng duy nhất. 5.2. Đề nghị Nấm C. cassiicola là một loài nấm có phổ ký chủ rộng, triệu chứng bệnh biến thiên phứt tạp. Sau khi thu được một số kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số đề nghị sau: - Cần có những nghiên cứu rộng hơn về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa để có thể đánh giá chính xác hơn về tình trạng nhiễm bệnh của cây cao su tại Việt Nam. - Nghiên cứu sâu hơn bằng các sử dụng các phương pháp khác như RAPD, AFLP… để đánh giá chính xác mức độ khác biệt di truyền của các dòng nấm C. cassiicoal tại Việt Nam. - Tiếp tục nghiên cứu trên vùng ITS với các primer khác để có thể chẩn đoán nhanh bệnh do nấm này gây ra bằng kỹ thuật PCR. - Xây dựng quy trình và tiến hành giải trình tự vùng ITS để đánh giá chính xác sự khác biệt trong bộ gene của nấm. - Tiến hành nghiên cứu thêm về độ tố của nấm để có thể đề ra các biện pháp ngăn ngừa và điều trị bệnh rụng lá Corynespora. - Tiến hành nghiên cứu bệnh trên các ký chủ khác trong vườn cao su để từ đó đánh giá được chính xác khả năng truyền bệnh qua các ký chủ trung gian. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. 2. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh học phân tử. Giáo trình học tập, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3. Đặng Văn Vinh. 2000. Một trăm năm cao su ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. HCM. 11-38. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 5. Huỳnh Ngọc Phương, 2005. “Xác định gene gây độc và tính đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Thị Huệ, 1997. Cây cao su kiến thức tổng quát và kỹ thuật nông nghiệp. Nhà xuất bản trẻ. 7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh học. Nhà xuất bản nông nghiệp. 8. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.124 trang. 9. Phan Thành Dũng, 2006. Báo cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, thực trạng và thách thức mới. Báo cáo tại hội thảo “Bảo vệ thực vật cây cao su Việt Nam - hợp tác nghiên cứu và đào tạo giữa Đại học Nông Lâm và Ngành cao su Việt Nam”. 10. Tổng công ty cao su, 2004. Quy trình kỹ thuật cây cao su. Nhà xuất bản nông nghiệp. 11. Trần Thị Thủy Tiên, 2005. “Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 12. Trần Văn Lợt. Giáo trình cây công nghiệp. Học phần Cây Cao Su. Tài liệu học tập, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005. 70 trang. 13. Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005. “Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) bằng phương pháp RFLP – PCR”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 14. A. Safiah and A.H. Noor Hisham. Preliminary results: differentiating races of Corynespora cassiicola using molecular marker techniques. 15. Edel,V., Steinberg,C., Goutheron, N. and Alabouvette, C. (1996). Differentiation of Fusarium species by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR amplified rinosomal DNA. Frist International Fusarium Biocontrol Workshop. Beltsville Agricultural Research center, USA, p.21. 16. Jayashinge, C.K. and W.P.K., Silva, 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, indonesia 16-17, dec, 1996. 17. Liyanage, A. de., Jayashinge, C. cassiicolak and Liyanage, N.I.S (1988). Biology, epidemiology and pathogenicity of corynespora leaf fall disease workshop held at Bogor Research Instute, Indonesia 12 th to 13 th February, 1988. 18. Moukhamedov, R., Hu, X., Nazar, R.N. and Robb, J. (1993). Use of polymerase chain reaction amplified ribosomal intergenic sequences for the diagnosis of Vertiocillium tricorpus. Phytopathology 84, 256-259. 19. Nazar, R.N., Hu, X, Schmidt. J., Culham, D. and Robb, J. (1991). Potential use of PCR amplified ribosomal intergenic sequences in the detection and differentiation of Verticillium wilt pathogen. Physiological and Molecular Plant Pathology 39, 1- 11. 20. P.D. Bridge, D.K. Arora, C.A. Reddy and R.P. Elander, 2000. Application of PCR in mycology. University Press, Cambbridge. 21. P.Romruensukharom, S. Tragoonrung, A. Vanavichit and T. Toojinda. Genetic variability of Corynespora cassiicola population in ThaiLand. 22. R.T.V. Fox. Principles of diagnostic techniques in plant pathology. International Mycological Institute (an Institute of CAB International). 23. Sabu, P.I., 2000. Current status of Corynespora leaf fall in India. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 24. Saflah Atan and Noor Hisham Hamid. Dfferentiating Races of Corynespora cassiicola using RAPD and internal transcribed spacer markers. 25. Sambrook and Russell, 2001. Molecular cloning. A laboratory manual. 26. Silva, Deverall and Lyon. Molecular physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka. 27. Silva, W.P.K, Deverall, B.J và Lyon, B.R., 1995. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus C. cassiicola. Aust. J. Bot., 43, 609 – 618. 28. Silva, W.P.K, Eric H. Karunanayake, Ravi L.C. Wijesundera and Uhanowita M.S. Priyanka., 2003. Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence. Mycol Res. 2003 May;107(Pt 5):567-71 29. W.P.K. Silva, D.S. Multani, B. J. Deverall and B.R. Lyon. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus Corynespora cassiicola. Tài liệu internet 30. art=0&sa=N 31. 10%20PCR%20Steps%20Overall.GIF 32. bnid=BKvmI1A3S8P6fM:&tbnh=107&tbnw=74&hl=vi&start=5&prev=/images% 3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2522origin%2522%26svnum%3D10%26h l%3Dvi%26lr%3D . 33. 34. 35. 36. 37. tbnid=U9tYIYl2DUuMxM:&tbnh=88&tbnw=104&hl=vi&start=1&prev=/images %3Fq%3D%2B%2522ITS%2522%252B%2522fungi%2522%26imgc%3Dmono% 26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D 38. y/rubbgeo.htm&h=473&w=643&sz=35&tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn w=135&hl=vi&start=33&prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2 522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s a%3DN 39. y/rubbgeo.htm&h=473&w=643&sz=35&tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn w=135&hl=vi&start=33&prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2 522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s a%3DN 40. 41. 42. 43. e0006.htm 44. =corynespora+cassiicola 45. 46. 47. 48. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các dòng nấm Corynespora cassiicola phân lập từ các mẫu bệnh tại Vƣờn tuyển non Lai Khê - Bến Cát, Bình Dƣơng. STT đƣợc mã hóa Kí Hiệu DVT 1 RRIV2 LH82/122 2 7/24 LH99/0019 3 26/20 LH9/0023 4 39/19 LH99/0028 5 19/86 LH9/0042 6 29/93 LH99/0053 7 4/48 LH99/0081 8 11/85 LH99/0083 9 20/85 LH9/0084 10 11/89 LH99/0090 11 28/37 LH99/0093 12 19/38 LH99/0098 13 4/19 LH99/0122 14 4/84 LH99/0131 15 29/10 LH99/0217 16 28/80 LH99/0266 17 25/75 LH99/0296 18 28/77 LH99/0309 19 32/86 LH99/0337 20 26/7 LH99/0347 21 26/11 LH99/0360 22 4/24 LH99/0365 23 1/24 LH99/0374 24 6/92 LH99/0383 25 41/69 LH99/0396 26 15/51 LH99/0396 27 22/84 LH99/0411 28 2/55 LH99/0412 29 2/41 LH99/0431 30 30/88 LH99/0431 31 29/79 LH99/0460 32 7/2 LH99/0489 33 14/1 LH99/0513 34 19/8 LH99/0581 35 21/55 LH99/0617 36 19/5 LH99/0622 37 15/61 LH99/0627 38 24/72 LH99/0638 39 15/13 LH99/0648 40 27/62 LH99/0670 41 5/8 LH99/0670 42 7/70 LH99/0679 43 17/8 LH99/0696 44 4/9 LH99/0698 45 20/6 LH99/0699 46 10/3 LH99/0775 47 15/32 LH99/0780 48 15/36 LH99/0818 49 16/29 LH99/0863 50 16/29 LH99/0863 51 35/17 TD95/5 52 19/82S LH99/0050 53 29/93S LH99/0053 54 28/81S LH99/0112 55 22/25S LH99/0216 56 29/22S LH99/0219 57 26/88S LH99/0347 58 20/70S LH99/0599 59 7/8S LH99/0636 60 22/70S LH99/0675 61 7/69S LH99/0679 62 10/11S LH99/0757 63 10/34S LH99/0778 64 16/28S LH99/0672 65 RRIV4 LH99/0657 Phụ lục 2: Cách pha một số hóa chất A. Pha lysis buffer Lysis buffer có các thành phần cụ thể như sau: Tris HCl 50 mM, EDTA 50 mM, SDS 3%, - mercaptoethanol 1%. - Cho vào becher một thể tích nước siêu sạch gần bằng với thể tích dung dich buffer mong muốn. - Lần lượt cho các thành phần khác: Tris HCl, EDTA và SDS vào dung dịch với một lượng sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng như mong muốn. - .................................................................................. Khuấ y đều cho hỗn hợp hòa tan, sau đó cho - mercaptoethanol vào. - .................................................................................. Khuấ y đều và chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH = 8. Nếu sau khi chuẩn độ thể tích cuối cùng chưa đạt như mong muốn cần thêm nước siêu sạch vào cho đạt thể tích mong muốn. B. Pha Phenol - Hòa tan 100g phenol (tinh thể) đặt trong bồn ủ nhiệt ở 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol khi hòa tan). - Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch Tris bazơ 0,5 M, pH = 8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lưu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy hiểm đến sức khỏe. - Tiếp tục cho vào 100ml dung dịch Tris HCl 0.5 M, pH 8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên. - Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu được một lớp TE 1X (50ml). - Lưu ý là phải bảo quản dung dịch phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc). C. Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH8 Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8. Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nước tinh sạch. Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.