Luận văn Khảo sát một vài đặc điểm hóa sinh và phân tích chất lượng mùi thơm của một số giống lúa thơm ở đồng bằng Sông Cửa Long bằng phương pháp SPME – GC

4 giờ, sau đó những thành phần bay hơi đƣợc thu thập. Họ đã xác định đƣợc 70 chất và dò đƣợc 30 chất khác. Tsuzuki và CS. (1981) và Buttery và CS. (1983b) đã phân tích những thành phần bay hơi có trong cơm nấu từ gạo thơm. Kết quả là họ đã nhận biết đƣợc hơn 114 chất. Buttery và CS. (1988) đã xác định đƣợc những thành phần chính trong mùi thơm của gạo thơm hạt dài California là 2-acetyl-1-pyrroline, (E,E)-2,4-decandienal, nonanal, hexanal, (E)-2-nonenal, octanal, decanal, 4-vinyl-guaiacol và 4-vinylphenol. Widjaja và CS. (1996) đã tiến hành so sánh những chất bay hơi có trong gạo thông thƣờng và gạo thơm. Họ đã xác định đƣợc 70 chất và mô tả mùi thơm hầu hết những chất đó. Những chất bay hơi chính trong gạo thơm là các alkanal, alk-2-enal, alka(E)-2,4-dienal, 2-pentylfuran, 2-acetyl-1-pyrroline và 2-phenylethanol. Những giống gạo thông thƣờng chứa nhiều n-hexanal, (E)-2-heptanal, nonanal, (E)-2-octenal, 2-pentylfuran, 4-vinylguaiacol và 4-vinylphenol hơn so với gạo thơm. 2.4.2. Hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) Buttery và CS. (1983a) đã nghiên cứu 7 giống lúa thơm. Trong số các thành phần xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí, hợp chất 2AP đã tìm thấy và có mùi tƣơng tự nhƣ mùi thơm của cơm. Ngƣỡng mùi thơm của chất này trong nƣớc là 0,1 µg.L- 1 và mùi thơm tích lũy tƣơng tự nhƣ loại ngô nổ (pop – corn). Hussain và CS. (1987) thực hiện so sánh mùi thơm giữa lúa thơm (Basmati) và lúa không thơm. Xác định hợp chất thơm trên cơ sở tính vùng đỉnh của sắc ký, nơi thể hiện có nhiều pentadencan-2-one, haxanol và 2-pentylfurane ở lúa Basmati. Chất 2AP không tìm thấy. Tuy vậy hầu hết các nghiên cứu thực hiện sau 1983 (Buttery và CS., 1983b; Paule và Power, 1989; Lin và CS., 1990; Tanchotkul và Hseih, 1991) đều chỉ rõ vai trò quan trọng của hợp chất này, trong gạo chà hàm lƣợng của nó thay đổi từ 0,006 ppm đến 0,09 ppm. Trong thí nghiệm phân tích của Trung tâm Nghiên cứu vùng của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và IRRI (1982) cũng cho kết quả về hàm lƣợng chất 2AP của 8 giống lúa thơm và 2 giống lúa không thơm. Hàm lƣợng chất thơm 2AP của Khao Dawk Mali 105 và Basmati 370 là 0,07 và 0,06 ppm theo thứ tự, giống đối chứng Calrose là 0,006 ppm. 2-acetyl-1-pyrroline 2-acetyl-1,4,5,6 tetrahydro pyridine 2-acetyl pyrazine 2-acetyl-2-thiazoline Thành phần hóa sinh liên quan đến sự hình thành mùi vị, nhƣng sự hình thành mùi vị của cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố: di truyền, môi trƣờng, dinh dƣỡng và điều kiện cất giữ (Đỗ Khắc Thịnh, 2003). Vì vậy phân biệt mùi giữa lúa thơm và không thơm không chỉ dựa hoàn toàn vào thành phần hoá sinh (axit béo, amino axit, đƣờng hoặc chất màu trong mỗi giống). Mũi của ngƣời có thể phát hiện đƣợc nồng độ của chất thơm 2AP ở nồng độ 0,007 ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan, trong điều kiện nhất định và với những ngƣời có khứu giác bình thƣờng, kết quả có thể tin cậy đƣợc. Lorieux, Petrov và CS. (1996) đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và giống IR 64 (không thơm), phân tích định lƣợng của 15 hợp chất chính liên quan đến 2 giống trên. Không tìm thấy chất 2AP ở IR64 trong khi đó giống lúa thơm Azucena có hàm lƣợng cao. Trong số 89 hợp chất phân tích, xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt giữa giống lúa thơm và không thơm: pentanol, 2AP, benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-one, 6,10,14-imethylpentadecan-2-one và hexanol. Hiện nay có hai quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo. Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm đƣợc tạo ra từ các hợp chất aldehyde (-CHO) và keton (C=O) và từ các hợp chất với lƣu huỳnh (Ayano và Tsuzuki, 1976). Quan điểm thứ 2 cho rằng chất thơm lúa gạo do vòng pyrrol kiểm soát tính thơm của chất 2AP (Buttery và CS., 1983a). N COCH3 N COCH3 N N COCH3 N S COCH3 Hình 2.3 Công thức hoá học của các hợp chất thơm trong gạo (IRRI, 1982). 2.5. GIỚI THIỆU VỀ SẮC KÝ KHÍ (GAS CHROMATOGRAPHY) 2.5.1. Lịch sử phát triển sắc ký Năm 1903, nhà bác học Nga Txvet đã dùng cột nhôm oxit tách thành công các picmen của lá cây xanh thành các vùng màu riêng biệt. Ông đã giải thích hiện tƣợng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của sắc tố và đặt tên phƣơng pháp này là phƣơng pháp sắc ký (nghĩa là ghi màu) vì đã tách đƣợc những chất có màu. Năm 1931, sau khi Vinterstin và Lederer dùng phƣơng pháp của Txvet tách carotin thô thành - và β-carotin và nhận thấy giá trị của phƣơng pháp về phƣơng diện điều chế, phƣơng pháp sắc ký mới bắt đầu đƣợc chú ý đúng mức và phát triển nhanh chóng. Năm 1952, Martin công bố công trình đầu tiên về sắc ký khí dựa trên sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha động là chất khí. Chỉ trong vòng vài ba chục năm, sắc ký khí đã đạt đƣợc nhiều thành tựu tuyệt vời và hiện nay là một trong những phƣơng pháp hiệu nghiệm nhất về phân tích hỗn hợp các chất, đặc biệt các chất hữu cơ. 2.5.2. Nguyên tắc của sắc ký khí Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong gạo thơm sẽ bị hấp phụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lƣu khác nhau. Trên cơ sở khác nhau về thời gian lƣu này mà ngƣời ta có thể định tính và định lƣợng cấu tử cần nghiên cứu. Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector. Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra ở đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện, tín hiệu này đƣợc khuếch đại và xử lý trên hệ thống máy tính thành các peak khác nhau về cả chiều cao và diện tích. Trên sắc ký đồ thu đƣợc ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là peak. Thời gian lƣu của peak là đại lƣợng đặc trƣng cho chất cần tách (định tính) còn diện tích peak là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu (Phạm Hùng Việt, 2005). Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID (Phan Phƣớc Hiền, 2005). 2.5.3. Thiết bị sắc ký khí 2.5.3.1. Bộ phận bơm mẫu (injector) Mẫu có thể đƣợc đƣa vào cột theo các hình thức: - Gián tiếp và chia dòng. - Gián tiếp và không chia dòng. - Trực tiếp.  Bơm mẫu có chia dòng (split) Phƣơng pháp bơm mẫu theo cách chia dòng cho đến nay vẫn đƣợc sử dụng nhiều nhất. Mẫu đƣợc bơm vào máy theo thể thức thông thƣờng nhƣ đối với sắc ký khí cột nhồi, nhƣng sau đó bị chia nhánh sao cho chỉ có một phần nhỏ của lƣợng mẫu ban đầu đi vào cột mao quản. Tỷ lệ chia dòng thông dụng nhất nằm trong khoảng từ 1:50 cho tới 1:500. Nhƣợc điểm duy nhất của bộ phận bơm mẫu kiểu này là sự “phân biệt đối xử” đối với các cấu tử có độ bay hơi khác nhau của mẫu rất khác nhau. Nó làm cho thành phần của phần mẫu đi vào cột tách khác so với thành phần của mẫu ban đầu.  Bơm mẫu không chia dòng (splitless) Trong kỹ thuật này, khoảng 2 l dung dịch mẫu pha loãng đƣợc bơm vào buồng bay hơi mẫu. Nhiệt độ của buồng bay hơi mẫu đƣợc đặt rất thấp (tƣơng đƣơng nhiệt độ phòng). Sau một thời gian nhất định thì mở bộ chia dòng (splitter). Và sau khi peak dung môi xuất hiện, mới bắt đầu mở chƣơng trình nhiệt độ. Kỹ thuật bơm mẫu này làm cho peak dung môi nhỏ đi rất nhiều so với bình thƣờng và do vậy các peak ra ngay sau peak dung môi sẽ không bị xen phủ mất. Điều cần lƣu tâm duy nhất trong kỹ thuật này là thời gian lƣu lại của mẫu trong buồng bay hơi mẫu khá lớn, có thể dẫn đến khả năng hấp phụ. 2.5.3.2. Cột tách (column) Hiện nay ở Việt Nam, cột nhồi thông thƣờng vẫn là loại cột sắc ký phổ biến nhất. Trong khi đó, đa số các phòng thí nghiệm, kể cả trong kỹ nghệ, ở nhiều nƣớc khoa học tiên tiến, hầu nhƣ đã bỏ hẳn cột nhồi mà chỉ còn sử dụng cột mao quản. Cột nhồi thông thƣờng: loại cột này thƣờng có đƣờng kính trong từ 3 – 6 mm. Đối với mục đích điều chế thì sử dụng các cột tách có đƣờng kính trong lớn hơn, thƣờng tới 12 mm, đƣợc nhồi đầy bằng một loại chất mang có phủ trên bề mặt một lớp mỏng pha lỏng tƣơng ứng có khối lƣợng từ 0,1% – 25% khối lƣợng so với chất mang. Cột mao quản: là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1 mm và thành trong của cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất tách rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên thành cột và đƣợc pha tĩnh “lƣu giữ” lại với mức độ khác nhau. Có hai loại cột mao quản chủ yếu: Cột mao quản phim mỏng (WCOT – wall coated open tubular column) thƣờng có đƣờng kính trong khoảng 0,2 đến 0,5 mm. Thành trong của loại cột này đƣợc tẩm trực tiếp (mà không cần thông qua một lớp chất hấp phụ xốp) bởi một lớp phim pha tĩnh mỏng. Cột mao quản lớp mỏng (PLOT – porous layer open tubular column) còn có thêm một lớp mỏng chất hấp phụ (đóng vai trò nhƣ chất mang) giữa thành trong của cột tách và lớp phim của pha tĩnh. 2.5.3.3. Detectơ Detectơ có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện (trong trƣờng hợp này là nồng độ của các chất đƣợc tách khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện. Ngày nay, đã có gần 30 loại detectơ khác nhau. Trong đó, 3 loại detectơ phổ biến nhất là: detectơ dẫn nhiệt (TCD), detectơ ion hóa ngọn lửa (FID) và detectơ cộng kết điện tử (ECD). Detectơ FID là một trong những detectơ có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detectơ bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Cơ chế tạo thành ion trong trƣờng hợp benzen nhƣ sau: C6H6  6CH 6CH + 3O2  6CHO + + 6e Các ion tạo thành đƣợc chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa (thế hiệu giữa hai bản điện cực này khoảng 250 – 300 V). Dòng ion đó đƣợc giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (108 – 1012 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này đƣợc khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. 2.5.4. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần đƣợc lần lƣợt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này đƣợc so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thƣ viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thƣ viện phổ khối lƣợng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tƣơng hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tƣơng đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thƣờng thì độ tƣơng hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lƣợng quyết định rất lớn độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lƣợng có độ nhạy cao, khoảng 10-6 – 10-9 g, do đó có thể xác định đƣợc những cấu phần có hàm lƣợng thấp mà các phƣơng pháp khác không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lƣợng mẫu sử dụng ít (Phạm Hùng Việt, 2005). 2.6. Phƣơng pháp vi chiết pha rắn (SPME – Solid Phase Micro Extraction) Phƣơng pháp vi chiết xuất trên pha rắn (SPME) đƣợc phát minh bởi Pawliszyn và cộng sự năm 1989, dựa trên cơ chế hấp phụ của các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nƣớc hoặc pha khí lên sợi silica đƣợc phủ các chất hấp phụ thích hợp nhƣ polydimethylsiloxane (PDMS), PDMS/DVB (divinylbenzene), polyacrylate,… Các hợp chất bám trên sợi silica sẽ đƣợc giải hấp trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc ký khí. 2.6.1. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME Sợi chiết dùng trong kỹ thuật vi chiết pha rắn là một đoạn sợi silica biến tính ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11 mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polyme. Sợi chiết này khá ổn định ở nhiệt độ cao và có cấu tạo hóa học tƣơng tự nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc đặt trong 1 ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu ống xyranh. Hình 2.6 Dụng cụ thực hiện kỹ thuật vi chiết pha rắn (Gyorgy Vas, 2004). 2.6.2. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật SPME Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 bƣớc: - Phân bố chất phân tích giữa mẫu và pha tĩnh của sợi chiết. - Chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích. Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua septum, sau đó pittong sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết đƣợc nhúng vào mẫu lỏng (DI – direct immersion) hay nằm trong khoảng không gian hơi phía trên pha mẫu (HS – headspace). Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau một thời gian hấp phụ đã định, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu. Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí, pittong lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. (a) (b) Hình 2.7 Các kỹ thuật chiết SPME (a) Nhúng trực tiếp (DI – SPME) (b) Khoảng không gian (HS – SPME) 2.6.3. Ứng dụng SPME trong phân tích 2AP Theo Casey C. Grimm và cộng sự (2000), lƣợng 2AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 600C lên 850C. Ngƣợc lại, hàm lƣợng chất chuẩn 2,4,6- trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2AP khi chiết xuất mẫu ở 800C và 850C; do đó, 800C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết xuất. Theo Casey C. Grimm và cộng sự (2000), khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi, trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2AP thu đƣơc sau khoảng thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra nhận định thời gian chiết xuất mẫu phù hợp nhất là 15 phút . Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm lƣợng 2AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣơc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá trình chiết xuất là 200 µl. Để xác định lƣợng 2AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2AP pha loãng trong CHCl3. Hàm lƣợng 2AP trung bình thu đƣợc trong mẫu gạo Jasmine khoảng 2,2 ng trong 0,75 g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối tƣơng quan về nồng độ 2AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng. Cấu tử 2AP chỉ chiếm 1 lƣợng nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong thành phần chất thơm có trong cơm gạo. PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH  Thời gian: từ 4/2006 – 8/2006.  Địa điểm lấy mẫu: - Điểm nghiên cứu lúa gạo của Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Sóc Trăng. - Các điểm nghiên cứu lúa gạo của CIRAD ở Việt Nam (Long An, Nam Định), Ấn Độ, Ý và các siêu thị ở Pháp.  Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ  Vật liệu: các loại lúa thơm trồng phổ biến ở Việt Nam (ĐBSCL, Nam Định), Ấn Độ, Ý và các loại gạo thơm bán ở các siêu thị của Pháp. Bảng 3.1 Bảng thống kê các mẫu lúa và gạo thu thập đƣợc Chủng loại mẫu Nơi lấy mẫu Số lƣợng Jasmine 85 Sóc Trăng 8 VD20 Sóc Trăng 9 OM3536 Sóc Trăng 9 Nàng Thơm Chợ Đào Long An 4 Tám Xoan Nam Định 9 Khao Dawk Mali 105 Tiền Giang 1 Các dòng ST Sóc Trăng 8 Taroari Basmati Ấn Độ 1 Giano 96/6 Ý 1 Basmati Pháp 1 Viet Nam Pháp 1 Jasmine Pháp 1  Hóa chất sử dụng: Methanol (Merck – Đức), Ethanol (Merck – Đức), Acetone (Merck – Đức), 2,4,6-Trimethylpyridine (Sigma – Mỹ và Aldrich – Đức), K2SO4, CuSO4, H2SO4, Parafin, H3BO3, NaOH, KOH, Thymol blue (Trung Quốc).  Dụng cụ và thiết bị: Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức). Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ). Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ). Micropippete (Nichipet – Japan). Tủ mát (Darling - Việt Nam). Tủ lạnh (Hitachi – Japan). Tủ sấy (Memmert – Đức). Cá từ, lọ (Agilent – Mỹ), nắp lọ (Interchim – France), kềm bấm nắp (Supelco – Mỹ). Máy bóc vỏ trấu, khoa Cơ Khí Công Nghệ trƣờng Đại học Nông Lâm. Máy nhiệt từ (Ikamag – Đức). Máy phân tích đạm (Gerhardt – Đức). Máy vortex (Đức). 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Phân tích hàm lƣợng protein thô (theo phƣơng pháp Kjeldahl) và độ bền thể gel (theo phƣơng pháp của Khush và CS., 1979) có trong gạo thơm.  Chiết xuất các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME.  Định tính và định lƣợng các hợp chất bay hơi quan trọng trong gạo thơm kết hợp GC và GC – MS. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phân tích một vài đặc điểm hóa sinh của gạo thơm 3.4.1.1. Hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kjeldahl Dùng pippete hút 15 ml H2SO4đđ (d = 1,84) cho vào ống vô cơ hóa mẫu + 5 giọt parafin Lắp các ống vô cơ hóa mẫu có chứa mẫu, xúc tác và H2SO4 vào bộ đốt và chạy theo qui trình vô cơ hóa mẫu Bƣớc 1: 300C – 800C trong 15 phút Bƣớc 2: 800C – 1200C trong 10 phút Bƣớc 3: 1200C – 2500C trong 10 phút Bƣớc 4: 2500C – 4000C trong 2 giờ Thời gian làm mát: 15 phút Tắt bộ đốt mẫu và tiến hành chƣng cất mẫu: lắp ống vô cơ hóa mẫu vào bộ chƣng cất và lắp bình hứng chứa 20 ml H3BO3 4% + 3 giọt hỗn hợp chỉ thị màu Mẫu gạo Loại bỏ tạp, cho mẫu vào các túi giấy và sấy khô mẫu ở 80 0C cho đến khi trọng lƣợng không đổi Vô cơ hóa mẫu: cân 0,3 – 0,5 g mẫu cho vào ống vô cơ hóa mẫu Thêm vào 5 g hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 (10:1) Sơ đồ 3.1 Phân tích hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kjeldahl. Hình 3.1 Hệ thống máy phân tích đạm. Khởi động máy cất, bổ sung thêm 50 ml nƣớc cất 2 lần và 80 ml NaOH 32%, khi NH3 đã đƣợc cất hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nƣớc cất nhỏ tráng sạch axit dính đầu ống làm lạnh Tắt máy và chuẩn độ để xác định lƣợng amonitetraborat tạo thành bằng dung dịch HCl 0,25N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Tính kết quả: Protein tổng (%) = (VHCl (ml) * 6,25 * 0,35) / Pmẫu 3.4.1.2. Độ bền thể gel theo phƣơng pháp của Khush và CS. (1979) Sơ đồ 3.2 Phân tích độ bền thể gel theo phƣơng pháp của Khush và CS. (1979). Lƣu trữ mẫu trong tủ mát trong 2 ngày Lấy 10 hạt nguyên và nghiền nát thành bột Cho 100 mg bột vào ống nghiệm Cho 0,2 ml ethanol 95% chứa 0,025% thymol blue vào ống nghiệm chứa mẫu Cho tiếp 2 ml dung dịch KOH 0,2N vào ống nghiệm chứa mẫu Trộn đều mẫu bằng máy Vortex trong 5 phút Đun mẫu trong bồn nƣớc sôi (1000C) trong 8 phút. Đặt mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Làm lạnh mẫu trong bồn nƣớc đá trong 20 phút Đặt mẫu nằm ngang trên giấy đo và tiến hành đo (đơn vị mm) 3.4.2. Chiết xuất hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME Cân 1,5 ± 0,1g gạo (hoặc lúa đã bóc vỏ trấu) cho vào lọ 10 ml, thêm 200 μl nƣớc khử ion và cá từ vào lọ, đậy nắp. Cho vào bộ giữ nhiệt của máy nhiệt từ đã đƣợc thiết lập ở nhiệt độ 800C, 250 vòng/phút trong 5 phút. Đây là giai đoạn ủ để các chất bay hơi trong gạo và phần không khí có trong lọ đạt đƣợc pha cân bằng trƣớc khi tiến hành chiết xuất. Sau 5 phút, ghim kim SPME vào lọ bi và để fiber tiếp xúc với môi trƣờng trong lọ. Đây chính là giai đoạn chiết xuất các chất bay hơi có trong gạo. Giai đoạn hấp phụ này kéo dài trong 15 phút ở 800C. Trong giai đoạn này các chất bay hơi trong gạo sẽ đƣợc hấp phụ vào fiber. Sau khi kết thúc giai đoạn chiết xuất, bơm kim SPME vào máy GC để bắt đầu giai đoạn phân tích các cấu tử bay hơi có trong gạo. Hình 3.2 Hệ thống máy nhiệt từ. Sơ đồ 3.3 Phƣơng pháp SPME. Cân 1,5 g gạo và cho vào lọ Ủ ở 800C trong 5 phút Ghim kim vào lọ trong 15 phút ở 800C Rút kim và bơm mẫu vào máy GC Thêm vào lọ 200 μl H2O và cá từ Đặt vào bộ giữ nhiệt của máy nhiệt từ 3.4.3. Xác định các hợp chất bay hơi quan trọng có trong gạo thơm Các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm đƣợc xác định thành phần trên GC/MS. Chƣơng trình nhiệt và các thông số thực nghiệm đƣợc điều chỉnh trên GC, các thông số này đƣợc tối ƣu hóa và áp dụng trên GC/MS. Sau đây là các điều kiện thực nghiệm trên GC và GC/MS. 3.4.3.1. Trên sắc ký khí (GC) - Nhiệt độ lò: 400C - Đầu dò FID: 2500C - Dòng H2: 30 ml/phút N2: 30 ml/phút Không khí: 300 ml/phút - Bơm mẫu không chia dòng (splitless). - Cột Model No: Agilent 19091J – 113 HP – 5 5% Phenyl Methyl Siloxane 30 m 320 μm 0, 50 μm. - Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ đầu 400C, tăng 30C/phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 30 0C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. 3.4.3.2. Trên sắc ký khối phổ (GC/MS) - Nhiệt độ lò: 400C - Đầu dò MS: 2500C - Cột Agilent 19091J-413 HP-5 0, 25 mm x 30 m x 0, 25 m. - Bơm mẫu không chia dòng (splitless). - Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ đầu 400C, tăng 30C/phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 30 0C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. 3.4.3.3. Xác định hệ số phản hồi (Response factor – RF) Hợp chất 2AP tồn tại ở nồng độ rất thấp, không bền và khó tổng hợp nên không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng. Nếu muốn sử dụng hợp chất 2AP để xác định Hình 3.4 Máy sắc ký khí ghép khối ph Hình 3.3 Máy sắc ký khí đƣờng chuẩn thì phải tự tổng hợp. Do điều kiện phòng thí nghiệm chƣa đủ để tổng hợp tại chỗ hợp chất 2AP nên chúng tôi đã sử dụng collidine nhƣ một hỗn hợp ngoại chuẩn thay thế. Tiến trình pha chuẩn collidine trong xác định RF gồm các bƣớc sau: Pha dung dịch chính: hút 25 mg collidine cho vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm methanol cho đủ 50 ml. Pha dung dịch pha loãng: hút 1 ml từ dung dịch chính đã pha cho vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm methanol vào cho đủ 50 ml (nồng độ 0,01 mg/ml). Lƣu ý cách pha dung dịch pha loãng trong xác định chuẩn collidine khác với cách pha trong xác định RF (chỉ hút 100 l từ dung dịch chính, sau đó thêm nƣớc khử ion vào cho đủ 50 ml bình định mức – nồng độ 0,001 mg/ml). Xác định hệ số phản hồi theo công thức: (Ringuet J., 2005) Để gia tăng sự chính xác của hệ số phản hồi, tiến hành xác định hệ số phản hồi theo 2AP trong mẫu gạo thơm chuẩn Giano: (Ringuet J., 2005) 3.4.3.4. Định lƣợng 2-acetyl-1-pyrroline Xác định hàm lƣợng 2AP thu đƣợc khi chiết xuất bằng phƣơng pháp SPME (Ringuet J., 2005; Phan Phƣớc Hiền, 2005). Xác định nồng độ 2AP trong gạo [2AP] trong gạo (μg/kg) = [2AP] SPME x 0,003 (Bergman và CS., 2000). 3.4.4. Phƣơng pháp xử lý thống kê Các số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng Excel. Diện tích peak Hệ số phản hồi theo collidine (pA/μg) = [dd collidine] * thể tích bơm Diện tích peak 2AP Hệ số phản hồi theo [2AP] = Khối lƣợng gạo * [2AP] Diện tích peak x 1000 [2AP] SPME (μg/kg) = Khối lƣợng gạo (g) x hệ số phản hồi PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thiết lập phƣơng pháp SPME – GC 4.1.1. Xác định chuẩn 2,4,6-trimethylpyridine (collidine) Pha và chạy mẫu collidine (nồng độ 0,001 mg/ml) theo phƣơng pháp SPME – GC. Tiến hành chạy mẫu 3 lần, kết quả đạt đƣợc ( xem Bảng 4.1): Hình 4.1 Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của chuẩn collidine (nồng độ 0,001 mg/ml). Bảng 4.1 Thời gian lƣu, diện tích và chiều cao của chuẩn collidine (nồng độ 0,001 mg/ml) Lần chạy Thời gian lƣu (phút) Diện tích (pA*s) Chiều cao (pA) 1 13,811 357,6 36 2 13,803 321,890 27,772 3 13,878 316,361 38,893 Trung bình 13,830 331,950 34,222  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.1, thời gian lƣu trung bình của chuẩn collidine là 13,830 phút. Tuy nhiên, có sự khác nhau giữa thời gian lƣu của chuẩn collidine này (13,830 phút) so với thời gian lƣu của chuẩn collidine (cùng nồng độ 0,001 mg/ml) tại Pháp (21,280 phút) (Phan Phƣớc Hiền, 2005). Nhằm gia tăng độ tin cậy về sự xuất hiện của peak chuẩn collidine tại phút 13,830, chúng tôi tăng nồng độ chuẩn collidine lần lƣợt là 0,002 mg/ml; 0,003 mg/ml; 0,004 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0,006 mg/ml. Tiến hành chạy 3 lần ở mỗi nồng độ. Bảng 4.2 Thời gian lƣu, diện tích, chiều cao trung bình qua 3 lần chạy ở mỗi nồng độ Nồng độ (mg/ml) Thời gian lƣu (phút) Diện tích (pA*s) Chiều cao (pA) 0,002 13,832 490,467 49,514 0,003 13,824 545,521 63,412 0,004 13,811 654,932 74,165 0,005 13,796 724,596 89,665 0,006 13,798 862,111 93,311 y = 0,00008x - 0,0019 R 2 = 0,9815 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 20 40 60 80 100 Chiều cao (pA) Nồ ng đ ộ (m g/ m l) Biểu đồ 4.1 Mối tƣơng quan giữa chiều cao và nồng độ của chuẩn collidine. y = 0,00001x - 0,0025 R 2 = 0,9841 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 200 400 600 800 1000 Diện tích (pA*s) Nồ ng đ ộ (m g/ m l) Biểu đồ 4.2 Mối tƣơng quan giữa diện tích và nồng độ của chuẩn collidine.  Nhận xét: Số liệu Bảng 4.2, Biểu đồ 4.1 và 4.2 cho thấy mối tƣơng quan chặt chẽ giữa diện tích, chiều cao với nồng độ của chuẩn collidine. Do đó, chúng tôi xác định thời gian lƣu trung bình của chuẩn collidine là 13,815 phút. Thời gian lƣu của cùng một hợp chất ở cùng nồng độ khác nhau có thể do các nguyên nhân sau:  Độ tinh sạch của cột.  Chiều dài của cột.  Độ tinh sạch của khí (N2, H2, không khí).  Các thông số của chƣơng trình nhiệt trên máy GC. Dựa vào những nguyên nhân trên, chúng tôi có thể giải thích phần nào sự khác nhau về thời gian lƣu của chuẩn collidine:  Chiều dài của cột máy GC của Pháp là 60 m; trong khi của Việt Nam là 30 m.  Độ tinh sạch về khí ở Pháp là 99,9999% (Fréderic Gay, personal communication); trong khi ở Việt Nam là 99 %.  Về độ tinh sạch của cột cũng nhƣ của các dụng cụ, thiết bị dùng trong SPME – GC chúng tôi tiến hành kiểm tra sự nhiễm (Phụ lục A). 4.1.2. Xác định các hợp chất bay hơi chính có trong gạo thơm Với sự khác biệt về thời gian lƣu giữa mẫu chạy ở Pháp và ở Việt Nam do các nguyên nhân đã giải thích mục 4.1.1, chúng tôi tiến hành chạy 2 mẫu gạo đặc trƣng là Thái Lan và Basmati trên máy GC – MS bằng phƣơng pháp SPME nhằm xác định thời gian lƣu 3 hợp chất bay hơi (hexanal, 2AP, nonanal) để so sánh với thời gian lƣu của 3 hợp chất này (xem Bảng 4.3). Hình 4.2 Sắc ký đồ GC – MS (toàn bộ) phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo Thái Lan. Dựa vào kết quả Hình 4.2, tiến hành xác định thời gian lƣu 3 hợp chất trên bằng thƣ viện có trong máy GC – MS. Hình 4.3 Kết quả mẫu gạo Thái Lan trong thƣ viện máy GC – MS nhằm xác định hexanal. Hình 4.4 Kết quả mẫu gạo Thái Lan trong thƣ viện máy GC – MS nhằm xác định nonanal.  Nhận xét: Dựa vào các kết quả Hình 4.3 và Hình 4.4, thời gian lƣu của hexanal là 4,16 phút (độ tƣơng hợp 91); thời gian lƣu của nonanal là 18,45 (độ tƣơng hợp 86). Tuy nhiên, không xác định đƣợc 2AP vì 2AP đã bị phân thành một số mảnh ion phân tử (trình bày trang 34). Bảng 4.3 Thời gian lƣu và diện tích của 3 hợp chất hexanal, 2AP, nonanal có trong dòng gạo thơm 267/05 (Phan Phƣớc Hiền, 2005). STT Hợp chất Thời gian lƣu (phút) Diện tích (mV*phút) 1 Hexanal 10,43 1,5113e+000 2 2AP 16,98 9,9615e-002 3 Nonanal 27,50 3,5474e-001  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.3, có sự khác nhau rõ rệt giữa thời gian lƣu của hexanal và nonanal trong mẫu gạo phân tích tại Pháp và Việt Nam (hexanal: 10,43 phút so với 4,16 phút; nonanal: 27,50 phút so với 18,45 phút). Nhƣ vậy, độ sai lệch về thời gian lƣu giữa một chất phân tích tại Pháp và tại Việt Nam từ 6 – 10 phút (nguyên nhân đã đƣợc giải thích ở mục 4.1.1). Dựa vào nguyên tắc hoạt động của máy GC – MS, một hợp chất sẽ đƣợc chuyển thành trạng thái hơi sau đó chuyển thành những mảnh ion phân tử. Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra những mảnh ion phân tử này từ phút thứ 7 đến phút thứ 11 (do thời gian lƣu của 2AP là 16,98 – xem Bảng 4.3) nhằm xác định các mảnh ion phân tử của 2AP. Theo Bergman và CS. (2000), hợp chất 2AP có mảnh ion phân tử tại m/z 111 và với sự mất đi HCN sẽ tạo ra mảnh ion tại m/z 83. Theo Yoshihashi và CS. (2001), mảnh ion phân tử tại m/z 111 là hợp chất 2AP. Theo Buttery và CS. (1982), hợp chất 2AP tồn tại với sự hiện diện của mảnh ion phân tử tại m/z 111 và các mảnh ion phân tử khác tại m/z 43, 55, 67, 69. Hình 4.5 Các mảnh ion phân tử tại phút 9,255 của mẫu gạo thơm Thái Lan. Hình 4.6 Các mảnh ion phân tử tại phút 9,255 của mẫu gạo thơm Basmati.  Nhận xét: Dựa vào các kết quả Hình 4.5 và Hình 4.6, sự xuất hiện của các mảnh ion phân tử tại m/z 43, 55, 83, 111 chứng tỏ thời gian lƣu của 2AP là 9,22. Với các kết quả ghi nhận đƣợc dựa vào GC – MS, chúng tôi tiến hành chạy 2 mẫu gạo Thái Lan và Basmati trên máy GC đầu dò FID bằng phƣơng pháp SPME – GC nhằm xác định thời gian lƣu của hexanal, 2AP và nonanal. Hình 4.7 Sắc ký đồ GC phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo Thái Lan. Hình 4.8 Sắc ký GC phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo Basmati. Theo kết quả nghiên cứu của C. J. Bergman (2000), Casey C. Grimm và CS. (2000), hợp chất thơm 2AP sẽ xuất hiện trƣớc peak của chuẩn collidine từ 2 – 3 phút. Theo kết quả xác định ở phần 4.1.1, peak của chuẩn collidine xuất hiện ở thời gian lƣu 13,815 phút. Nhƣ vậy, có thể nhận định peak của hợp chất thơm 2AP sẽ xuất hiện trong khoảng thời gian từ 10 đến 11 phút. So sánh kết quả sắc ký đồ của các hợp chất trên máy GC và GC/MS, chúng tôi xác định đƣợc thời gian lƣu trung bình của hợp chất 2AP trên máy GC là 10,163 phút (xem Bảng 4.4). Bảng 4.4 Thời gian lƣu (phút) của hexanal, 2AP, nonanal có trong mẫu gạo Thái Lan và Basmati chạy trên GC và GC – MS. Mẫugạo Hợp chất Thái Lan Basmati GC GC – MS GC GC – MS Hexanal 4,930 4,16 4,924 4,16 2AP 10,139 9,22 10,187 9,24 Nonanal 19,603 18,45 19,635 18,44 4.1.3. Xác định hệ số phản hồi (Response factor – RP) của 2AP 4.1.3.1. Theo nồng độ chuẩn collidine Bảng 4.5 Hệ số phản hồi của chất chuẩn collidine khi bơm với thể tích 1,2 µl Dung dịch collidine (nồng độ 0,01 mg/ml) Diện tích peak (pA*s) Hệ số phản hồi (pA/μg) 1 40.47 3268 2 42.69 3447 3 60.39 4765 4 74.01 5840 5 86.27 6808 6 89.95 7099 7 118.30 9336 Trung bình 6000  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.5, hệ số phản hồi trung bình của hợp chất 2AP theo nồng độ chuẩn collidine là 6000 pA/μg. Trong quá trình xác định hệ số phản hồi theo chuẩn collidine, đôi khi có hiện tƣợng xuất hiện peak đôi. Do đó để gia tăng độ tin cậy của hệ số phản hồi của hợp chất 2AP, chúng tôi tiến hành xác định hệ số phản hồi theo nồng độ 2AP trong gạo thơm Giano. 4.1.3.2. Theo nồng độ 2AP trong gạo thơm Giano Gạo thơm Giano đƣợc chọn nhƣ là một mẫu tham khảo nhằm xác định hệ số phản hồi của 2AP vì theo kết quả nghiên cứu của Ringuet J. (2005) tại CIRAD, nồng độ 2AP trong gạo thơm Giano là 10 μg/kg. Tiến hành phân tích hàm lƣợng 2AP chiết xuất từ 1,5 g gạo Giano theo phƣơng pháp SPME – GC. Hình 4.9 Sắc ký đồ GC phân tích các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm Giano.  Nhận xét: Dựa vào sắc ký đồ GC (Hình 4.9), hợp chất 2AP xuất hiện tại peak có thời gian lƣu là 10,062 và có diện tích khoảng 80 pA*s. Do đó, hệ số phản hồi theo nồng độ 2AP của gạo thơm Giano là 5300 pA/μg. Từ 2 hệ số phản hồi thu đƣợc, chúng tôi xác định hệ số phản hồi trung bình của hợp chất 2AP là 5650 pA/μg. 4.2. Phân tích một vài đặc điểm hóa sinh của gạo thơm 4.2.1. Phân tích hàm lƣợng protein Tiến hành phân tích 17 loại gạo khác nhau với 2 lần lặp lại, kết quả hàm lƣợng protein trung bình của 2 lần lặp lại (xem Bảng 4.6) Bảng 4.6 Hàm lƣợng protein trung bình của 2 lần lặp lại Loại gạo Hàm lƣợng protein (%) Thái Lan 5,509 Taroari Basmati 8,478 Basmati 8,161 Giano 96/6 7,068 STWS05 – 213 5,958 STWS05 – 313 7,234 STWS05 – 311 6,929 STWS05 – 132 5,549 STWS05 – 231 7,089 STWS05 – 133 6,482 STWS05 – 123 6,983 STWS05 – 122 7,163 TX06 – T1 7,354 TX06 – T8 7,676 ST8 7,386 NTĐPIII 6,620 Khao Dawk Mali 105 TG 7,320 Bảng 4.7 Kết quả phân tích thống kê hàm lƣợng protein trong gạo Loại gạo Hàm lƣợng protein trung bình (%) CV (%) Gạo trong nƣớc 6,903 8,782 Gạo nƣớc ngoài 7,304 18,352  Nhận xét: Kết quả Bảng 4.7 cho thấy không có sự khác biệt theo phƣơng diện thống kê (p>0,05) về hàm lƣợng protein giữa các loại gạo trong nƣớc và gạo nƣớc ngoài. Trong các loại gạo khảo sát, gạo Thái Lan đƣợc bán trong các siêu thị ở Pháp có hàm lƣợng protein thấp nhất (5,509%); gạo Taroari Basmati có hàm lƣợng protein cao nhất (8,478%); các loại gạo nổi tiếng ở Việt Nam nhƣ Tám Xoan, ST8 và một số dòng gạo Jasmine 85 (313), VD20 (122), OM3536 (231) có hàm lƣợng protein cao hơn loại gạo thơm nổi tiếng của Ý là Giano 96/6; NTĐPIII có hàm lƣợng protein (6,620%) cao hơn so với kết quả nghiên cứu các dòng lúa NTCĐ triển vọng của TS. Đỗ Khắc Thịnh (6,290%). 4.2.2. Phân tích độ bền thể gel Tiến hành phân tích 15 loại gạo khác nhau với 2 lần lặp lại, kết quả trung bình của 2 lần lặp lại (xem Bảng 4.8) Bảng 4.8 Chiều dài thể gel trung bình của 2 lần lặp lại Loại gạo Chiều dài thể gel (mm) Thái Lan 70 Taroari Basmati 71 NTĐPIII 75 Khao Dawk Mali 105 TG 96 ST8 82 ST3 Ngã năm 77 TX06 – T1 85 TX06 – T8 95 STWS05 – 231 65 STWS05 – 133 69 STWS05 – 132 70 STWS05 – 313 68 STWS05 – 311 72 STWS05 – 123 85 STWS05 – 122 72  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.8, tất cả các loại gạo trên đều thuộc loại có độ bền thể gel mềm (soft) do nằm trong khoảng 61 – 100 mm. Nhƣ vậy, cả 15 loại gạo thơm trên đều có tính chất mềm, dễ nhai – đó là một trong những đặc tính đƣợc ƣa thích. Bên cạnh đó, độ bền thể gel mềm chứng tỏ hàm lƣợng amylose của 15 loại gạo trên ở mức trung bình đến thấp (Rani, 2005). Hình 4.10 Kết quả phân tích độ bền thể gel. 4.3. So sánh nồng độ 2AP trong các mẫu gạo thơm khảo sát Mục đích của việc so sánh nồng độ 2AP trong các mẫu gạo thơm khảo sát nhằm tìm ra đƣợc những dòng gạo thơm chất lƣợng cao hơn hẳn so với các dòng cùng loại trên cơ sở nồng độ 2AP. 4.3.1. So sánh nồng độ 2AP giữa các mẫu gạo thơm STWS05 Tiến hành so sánh 3 loại gạo: Jasmine 85, VD20 và OM3536 (tổng cộng 26 mẫu). Kết quả cho thấy loại gạo VD20 có nồng độ 2AP trung bình cao nhất, trong khi loại gạo OM3536 có nồng độ 2AP thấp nhất (Bảng 4.9). Bảng 4.9 Nồng độ 2AP trung bình của 3 loại gạo thơm Loại gạo [2AP] (theo Bergman và CS., 2000) (µg/kg) Jasmine 85 546,28 VD20 616,40 OM3536 434,67 Tiến hành so sánh từng dòng gạo trong mỗi loại gạo thơm nhằm xác định ra dòng gạo thơm có nồng độ 2AP trung bình qua 2 lần chạy cao nhất và thấp nhất (xem Bảng 4.10). Bảng 4.10 Nồng độ 2AP của từng dòng gạo Jasmine 85, VD20, OM3536 Loại gạo Dòng gạo [2AP] (theo Bergman và CS., 2000) (µg/kg) Jasmine 85 111 614,88 112 135,37 113 327,28 211 494,30 213 825,15 311 586,40 312 350,33 313 1036,54 VD20 121 537,53 122 1047,41 123 645,82 221 591,41 222 496,38 223 764,30 321 611,09 322 513,27 323 340,42 OM3536 131 283,59 132 637,62 133 406,06 231 836,18 232 252,85 233 480,39 331 431,03 332 354,90 333 229,39  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.10, chúng tôi có những nhận xét sau: Ở loại gạo Jasmine 85, dòng gạo 313 có [2AP] cao nhất (1036,54 µg/kg) và dòng gạo 112 có [2AP] thấp nhất (135,37 µg/kg). Ở loại gạo VD20, dòng gạo 122 có [2AP] cao nhất (1047,41 µg/kg) và dòng gạo 323 có [2AP] thấp nhất (340,42 µg/kg). Ở loại gạo OM3536, dòng gạo 231 có [2AP] cao nhất (836,18 µg/kg) và dòng gạo 333 có [2AP] thấp nhất (229,39 µg/kg). 4.3.2. So sánh nồng độ 2AP giữa các mẫu gạo thơm Tám Xoan Bảng 4.11 Nồng độ 2AP của từng dòng gạo Tám Xoan Loại gạo Dòng gạo [2AP] (theo Bergman và CS., 2000) (µg/kg) Tám Xoan TX06 – T3 589,20 TX06 – T5 637,30 TX06 – T8 1026,89 TX06 – T7 723,61 TX06 – T1 937,03 TX06 – T9 721,41 TX06 – T6 617,70 TX06 – T2 675,29 TX06 – T4 640,91  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.11, dòng gạo TX06 – T8 có [2AP] cao nhất (1026,89 µg/kg); dòng gạo TX06 – T3 có [2AP] thấp nhất (589,20 µg/kg). 4.3.3. So sánh nồng độ 2AP giữa các mẫu gạo thơm ST Bảng 4.12 Nồng độ 2AP của từng dòng gạo ST Loại gạo Dòng gạo [2AP] (theo Bergman và CS., 2000) (µg/kg) ST ST8 407,21 ST3 Ngã Năm 378,98 ST10 432,51 ST7 449,43 ST5 358,67 ST6 302,19 ST3 Chợ Cũ 547,47 ST9 697,27  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.12, dòng gạo ST9 có [2AP] cao nhất (697,27 µg/kg); dòng gạo ST6 có [2AP] thấp nhất (302,19 µg/kg). 4.3.4. So sánh nồng độ 2AP giữa các mẫu gạo thơm NTĐP Bảng 4.13 Nồng độ 2AP của từng dòng gạo NTĐP Loại gạo Dòng gạo [2AP] (theo Bergman và CS., 2000) (µg/kg) NTĐP II 413,05 III 216,25 IV 279,12 I 689,46  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.13, dòng gạo NTĐPI có [2AP] cao nhất (689,46 µg/kg); dòng gạo NTĐPIII có [2AP] thấp nhất (216,25 µg/kg). 4.3.5. So sánh nồng độ 2AP giữa các mẫu gạo thơm nƣớc ngoài Bảng 4.14 Nồng độ 2AP của từng loại gạo thơm nƣớc ngoài Loại gạo [2AP] (theo Bergman và CS., 2000) (µg/kg) Taroari Basmati 1873,41 Thái Lan 515,10 Basmati 489,55 Viet Nam 70,53 Giano 96/6 3865,50  Nhận xét: Dựa vào số liệu Bảng 4.14, gạo Giano 96/6 có [2AP] cao nhất (3865,50 µg/kg); gạo Viet Nam có [2AP] thấp nhất (70,53 µg/kg). Nhƣ vậy, trong tất cả các loại gạo thơm khảo sát, Giano 96/6 có nồng độ 2AP cao nhất (3865,50 µg/kg) và Viet Nam có nồng độ 2AP thấp nhất (70,53 µg/kg). Trong các loại gạo thơm đƣợc trồng ở Việt Nam , dòng 122 (VD20) có nồng độ 2AP cao nhất (1047,41 µg/kg) và dòng 112 (Jasmine 85) có nồng độ 2AP thấp nhất (135,37 µg/kg). PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1.1. Một vài đặc điểm hóa sinh của một số loại gạo thơm Hàm lƣợng protein của các mẫu gạo khảo sát biến thiên từ 5,509% đến 8,478%. Trong đó cao nhất là gạo Taroari Basmati (8,478%) và thấp nhất là gạo Thái Lan (5,509%). Không có sự khác biệt theo phƣơng diện thống kê về hàm lƣợng protein giữa các loại gạo trong nƣớc và gạo nƣớc ngoài. Các loại gạo thơm ở Việt Nam nhƣ Tám Xoan, ST8, dòng 313 (Jasmine 85), dòng 122 (VD20), dòng 231 (OM3536), NTĐPIII có hàm lƣợng protein khá cao. Độ bền thể gel của các mẫu gạo khảo sát biến thiên từ 65 mm đến 96 mm. Nhƣ vậy, chúng nằm trong khoảng 61 – 100 mm, thuộc loại gạo có độ bền thể gel mềm (soft). Trong đó, gạo Khao Dawk Mali 105 (Tiền Giang) có độ bền thể gel cao nhất (96 mm) và thấp nhất là gạo STWS05 – 231 (65 mm). 5.1.2. Phân tích hàm lƣợng hợp chất thơm 2AP Thời gian lƣu trung bình của chuẩn collidine đƣợc xác định bằng phƣơng pháp SPME – GC là 13,815 phút. Thời gian lƣu trung bình của hợp chất thơm 2AP trong các loại gạo thơm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp SPME – GC là 10,163 phút. So sánh nồng độ hợp chất thơm 2AP có trong 53 mẫu gạo thơm khảo sát đƣợc lấy ở Việt Nam, Pháp, Ý, Ấn Độ nhằm phân loại các loại gạo thơm có chất lƣợng khác nhau, đề xuất các loại gạo thơm có nồng độ 2AP cao để nhân giống và phát triển. Kết quả gạo Giano 96/6 (Ý) có nồng độ 2AP cao nhất (3865,50 µg/kg) và Viet Nam (Pháp) có nồng độ 2AP thấp nhất (70,53 µg/kg). Trong các loại gạo thơm đƣợc trồng ở Việt Nam, dòng 122 (VD20) có nồng độ 2AP cao nhất (1047,41 µg/kg) và dòng 112 (Jasmine 85) có nồng độ 2AP thấp nhất (135,37 µg/kg). 5.2. Đề nghị Thử nghiệm qui trình phân tích đối với các bộ phận khác của cây lúa (lá lúa, thân lúa) nhằm xác định nguồn gốc sinh tổng hợp hợp chất thơm 2AP trong cây lúa. Thử nghiệm phân tích nồng độ 2AP có trong lá dứa (Pandanus amaryllifolius) nhằm so sánh với nồng độ 2AP có trong gạo thơm. Tiến hành bảo quản mẫu ở các điều kiện khác nhau nhằm đánh giá tầm quan trọng của việc bảo quản mẫu trong phân tích gạo thơm. Thử nghiệm việc tổng hợp chuẩn 2AP nhằm đánh giá khách quan và chính xác hơn trong việc phân tích gạo thơm. Tiếp tục xây dựng và thực hiện phƣơng pháp SDE (Simultaneous steam Distillation and solvent Extraction) để so sánh với phƣơng pháp SPME. Tiếp tục khảo sát các đặc điểm hóa sinh quan trọng khác nhƣ: hàm lƣợng amylose, nhiệt độ hóa hồ để có đƣợc đánh giá tốt hơn về các loại gạo thơm. Qua so sánh các mẫu gạo thơm, chúng tôi đề xuất các loại gạo thơm nhƣ: Giano, Taroari Basmati, Jasmine 85 (dòng 313, dòng 311), VD20 (dòng 122), OM3536 (dòng 231, dòng 133), Tám Xoan (dòng T8, T1) do có nồng độ 2AP vƣợt trên 800 µg/kg và hàm lƣợng protein cao. PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Huy Đáp, 1999. Một số vấn đề về cây lúa. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, trang 20 – 56. 2. Trần Văn Đạt, 2002. Tiến trình phát triển sản xuất lúa gạo tại Việt Nam từ thời nguyên thủy đến hiện đại. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 300 trang. 3. Nguyễn Xuân Hiển, 1986. Điều tra thu thập giống và nghiên cứu quy trình sản xuất lúa thơm. Tài liệu báo cáo khoa học, Viện Khoa học kỹ thuật NN miền Nam, 1987. 4. Hiệp hội Lƣơng thực Việt Nam, 2003. Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động năm 2002 và phương hướng năm 2003. Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Đỗ Khắc Thịnh, Nguyễn Thị Cúc, Trƣơng Thị Hoài Nam và CTV., 1995. Kết quả chọn lọc dòng thuần giống lúa Nàng Hƣơng. Tạp chí NN-CNTP., 9/1995. 6. Đỗ Khắc Thịnh, 2003. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác và yếu tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sông Cửu Long. Luận án Tiến Sĩ Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 7. Ayano K., E. Tsuzuki et al., 1976. Components of aroma, in chapter 3 Inher. Physio. Ch. 437 – 440. Science of the rice plant Vol.3. Genetics, Food and Agri. Policy Res. Center, 1997. Tokyo, Japan. 8. Bergman C.J., Delgado J.T., Bryant R., Grimm C., Cadwallader K.R. and Webb B.D., 2000. Rapid gas chromatographic technique for quantifying 2-acetyl-1- pyrroline and hexanal in rice (Oryza sativa, L.).Cereal Chem. 77(4):454 – 458. 9. Buttery R.G. and Ling L.C., 1982. 2-acetyl-1-pyrroline: An important aroma component of cooked rice. Chem. Ind. (London). 958 – 959. 10. Buttery R.G., Ling L.C., Juliano B.O. and Turnbaugh J.G., 1983a. Cooked rice aroma and 2-acetyl-1-pyrroline. J. Agri. Food Chem., 31: 823 – 826. 11. Buttery R.G., Juliano B.O. and Ling L.C., 1983b. Identification of rice aroma compound 2-acetyl-1-pyrroline in Pandan leaves. Chem. Ind. (London). 23: 478 – 479. 12. Casey C. Grimm, Christine Bergman, Janis T. Delgado and Rolfe Bryant, 2000. Screening for 2-acetyl-1-pyrroline in the headspace of rice using SPME/GC – MS. J. Agric. Food Chem. 49: 245 – 249. 13. Eggum B.O., 1989. The nutrient value of rice in comparison with other cereals. In: Chemical aspects of grain quality. Manila, Philippine, IRRI. p. 83 – 90. 14. Erickson J.R., 1968. Annual report, Rice Genet. Invest., Rice Expt. sta. Biggs, California, USA. 15. Glazman J.C., 1987. Isozymes and classification of Asian rice varieties. Theor. Appli. Genet. 74: 21 – 30. 16. Gomez K.A. and De Datta S.K., 1975. Influence of environment on protein content of rice. Agron. J. 67: 565 – 568. 17. Gyorgy Vas and Károly Vékey, 2004. Solid – phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis. J. Mass Spectrom. 39: 233 – 254. 18. IRRI, 2002. IRRI rice almanac, Third edition, Manila, Philippine, IRRI. p:253. 19. Juliano B.O., 1972. Physiochemical properties of starch and protein in relation to grain quality and nutrient value of rice. In: Rice Breeding. Manila, Philippine, IRRI. p. 389 – 404. 20. Juliano B.O., Onate L.U. and del Mundo A.M., 1972. Note: amylose and protein content of milled rice as eating quality factors. Philipp. Agric. 56. p. 44 – 47. 21. Juliano B.O., 1985. Rice: chemistry and technology, 2nd edition. Am. Associ. Cereal chemists, St. Pant, MN. p. 774. 22. Kumar S.N., Shobha Rani and K. Krishnaiah, 1996. Problems and prospects of fine grain aromatic rice in India. In: INGER – IRRI. Reports of the INGER monitoring visit on fine grain aromatic rice in India, Iran, Pakistan and Thailand, 1996. 23. Lin C.F., Hsieh R.C.Y., Hoff B.J., 1990. Identification and quatification of the “popcorn” – like aroma in Lousiana aromatic Della rice (Oryza sativa L.). J. Food Sci. 35: 1466 – 1467. 24. Lorieux M., Petrov M., Huang N., Guiderdou E. and Ghesquiere A., 1996. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theor. Appl. Genet. 93: 1145 – 1151. 25. Phan Phuoc Hien, 2005. Methodes d’analyse des arômes du riz. Post Doc. Thesis, CIRAD, Montpellier, France. 26. Paule C.M. and Powers J.J., 1989. Sensory and chemical examination aromatic and non – aromatic rices. J. Food Sci. 54: 343 – 346. 27. Resurreccion A.P, Hara T., Juliano B.O. and Yoshida, 1977. Effects of temperature during ripening on grain quality of rice. Soil Sci. Plant Nutri. 23: 109 – 112. 28. Ringuet J., 2005. Optimisation d’une méthode de dosage de I’arôme du riz par SPME (Solid Phase Micro Extraction). MSc. Thesis, Montpellier University, France. 29. Rani N.S., 2000. The rice situation in Iran. International Rice Commission Newsletter, FAO. 30. Tanchotkul U. and Heish T.C.Y., 1991. An improved method for quantification of 2-acetyl-1-pyrroline a popcorn – like aroma in aromatic rice by high resolution gas chromatography / mass spectrometry / selected ion monitoring. J. Agri. Food Chem. 39:944 – 947. 31. United States Department of Agriculture (USDA), 2001. Grain: World Markets and Trade, Jan. 2002. 32. Yoshihashi T., 2001. Quantitative analysis on 2-acetyl-1-pyrroline of an aromatic rice by stable isotope dilution method and model studies on its formation during cooking, Vol. 67, Nr.2, J. Food Science. p. 629 – 622. PHỤ LỤC Phụ lục A. KIỂM SOÁT SỰ NHIỄM A.1. Kiểm tra cột Tiến hành kiểm tra cột bằng cách chạy máy GC không mẫu, không kim SPME theo chƣơng trình nhiệt đã thiết lập. Hình A.1 Sắc ký đồ GC kiểm tra sự nhiễm chỉ có cột  Nhận xét: Sắc ký đồ GC (Hình A.1) cho thấy không có sự nhiễm trên cột. Cột hoàn toàn sạch, đảm bảo sự chính xác trong phân tích mẫu. A.2. Kiểm tra kim SPME Tiến hành kiểm tra kim SPME (chủ yếu là fiber) bằng cách bơm kim không mẫu và chạy theo chƣơng trình nhiệt đã thiết lập. Hình A.2 Sắc ký đồ GC kiểm tra sự nhiễm chỉ có kim SPME  Nhận xét: Sắc ký đồ GC (Hình A.2) cho thấy không có sự nhiễm trên kim SPME (chủ yếu là fiber). Kim sạch, bảo đảm sự chính xác trong phân tích mẫu. A.3. Kiểm tra kim SPME + lọ sạch + septum Tiến hành kiểm tra kết hợp kim SPME, lọ sạch (chƣa sử dụng) và septum mới. Áp dụng phƣơng pháp SPME – GC chạy theo chƣơng trình nhiệt đã thiết lập. Hình A.3 Sắc ký đồ GC kiểm tra sự nhiễm kết hợp kim SPME + lọ sạch + septum  Nhận xét: Sắc ký đồ GC (Hình A.3) cho thấy kim và lọ sạch, các peak nhiễu xuất hiện không đáng kể, bảo đảm sự chính xác trong phân tích mẫu. A.4. Kiểm tra kim SPME + lọ đã sử dụng Lọ sau khi sử dụng đƣợc làm sạch theo quy trình sau: rửa với ethanol trong 5 phút, rửa tiếp với acetone trong 5 phút, cuối cùng làm khô trong tủ sấy ở 1500C trong 2 giờ. Tiến hành kiểm tra kết hợp kim SPME và lọ đã đƣợc làm sạch ở trên bằng cách áp dụng phƣơng pháp SPME chạy theo chƣơng trình nhiệt đã thiết lập. Hình A.4 Sắc ký đồ GC kiểm tra sự nhiễm kết hợp kim SPME + lọ đã sử dụng  Nhận xét: Sắc ký đồ GC (Hình A.4) cho thấy kim và lọ sạch, các peak nhiễu xuất hiện không đáng kể, bảo đảm sự chính xác trong phân tích mẫu. A.5. Kiểm tra lọ sạch + nƣớc khử ion Nƣớc đƣợc lấy từ máy cất nƣớc hai lần sau đó tiếp tục cho vào máy tạo nƣớc khử ion. Bơm 200 µl nƣớc khử ion vào lọ sạch, áp dụng phƣơng pháp SPME – GC chạy theo chƣơng trình nhiệt đã thiết lập. Hình A.5 Sắc ký đồ GC kiểm tra sự nhiễm kết hợp lọ sạch + nƣớc khử ion  Nhận xét: Sắc ký đồ GC (Hình A.5) cho thấy lọ và nƣớc khử ion sạch, các peak nhiễu xuất hiện không đáng kể, bảo đảm sự chính xác trong phân tích mẫu. Phụ lục B. XÁC ĐỊNH COLLIDINE VÀ 2AP Hình B.1 Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của chuẩn collidine thực hiện tại CIRAD (Pháp) (Phan Phƣớc Hiền, 2005). Hình B.2 Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của mẫu gạo 267/05 thực hiện tại CIRAD (Pháp) (Phan Phƣớc Hiền, 2005). Hình B.3 Các mảnh ion phân tử xác định dự hiện diện của 2AP (Bergman và CS., 2000) Phụ lục C. SẮC KÝ ĐỒ GC CỦA MỘT SỐ MẪU GẠO THƠM Hình C.1 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm Taroari Basmati. Hình C.2 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm TX06 – T3. Hình C.3 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm NTĐPI. Hình C.4 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm NTĐPIII. Hình C.5 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm ST6. Hình C.6 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm ST9. Hình C.7 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm STWS05 – 112. Hình C.8 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm STWS05 – 313. Hình C.9 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm STWS05 – 122. Hình C.10 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm STWS05 – 323. Hình C.11 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm STWS05 – 231. Hình C.12 Sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm STWS05 – 333.