Luận văn Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lá của cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển

- 35 - Chương 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. Khảo sát thực vật học 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái Thân: Cây gỗ nhỏ, xốp, mọc đứng, tán rộng nhiều cành, tiết diện tròn, cao từ 8- 12 m. Lá: mọc cách, kép lông chim 3 lần lẻ, có từ 5-7 cặp lá phụ bậc 1, 4-6 cặp lá phụ bậc 2, 6 - 9 cặp lá phụ bậc 3, lá phụ bậc 3 hình elíp, mọc đối, cuống ngắn 1-2 mm, gân lá hình lông chim, dài 1,5-2,5 cm; rộng 1,0-2,0 cm (Ảnh 3.2). Cụm hoa: xim 2 ngã, mọc ở nách lá hay ngọn cành (Ảnh 3.2). Hoa: màu trắng hơi ngả vàng, mùi thơm, cuống hoa dài 1-2cm; lá bắc hình sợi. Hoa có 5 lá đài nhỏ màu xanh, hình tam giác, 5 cánh hoa màu trắng, gần bằng nhau, lõm vào trong giống hình 1 cái muỗng, dài 1,5cm, rộng khoảng 0,5 cm. Bộ nhị: gồm 5 nhị thụ màu vàng xen với 5 nhị lép, nhị thụ nằm đối diện với cánh hoa, nhị lép nằm xen kẽ cánh hoa; bao phấn 2 ô, hướng ngoài. Bộ nhuỵ: 3 lá noãn dính với nhau tạo thành 1 ô, đính phôi trắc mô; bầu noãn thượng (Ảnh 3.1), (Ảnh 3.2). Quả: nang treo, có 3 cạnh, dài 25 - 30cm, màu xanh, hơi gồ lên ở chỗ có hạt, khía có rãnh dọc. Hạt: màu đen, to bằng hạt đậu Hà Lan, tròn có 3 cạnh và 3 cánh màu đà, dạng màng mỏng (Ảnh 3.2). Hoa thức: *♀ K5 C5 A5 G(3) Hoa Đồ: Hoa đồ của hoa Chùm ngây được thể hiện ở hình 3.1 - 36 - Hình 3.1. Hoa đồ của hoa Chùm ngây Ảnh 3.1. Các bộ phận trong Hoa Chùm ngây 50µm 0,2mm Đài Cánh Bộ nhị HoaBộ nhuỵ Bầu noãnHạt phấn - 37 - Dạng sống Lá Cụm hoa Hoa Quả Hạt Ảnh 3.2. Thân, lá, hoa, quả, hạt Chùm ngây ngoài tự nhiên tại Đồng Nai - 38 - 3.1.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu thực vật ¾ Thân: Tiết diện tròn, từ ngoài vào trong gồm có: (Ảnh 3.3) Lớp bần: gồm 2-4 lớp tế bào hình chữ nhật vách hóa bần, sắp xếp thành dãy đồng tâm và xuyên tâm, rãi rác có những đám tế bào bị rách bong ra ngoài. Nhu mô vỏ: gồm những tế bào có hình đa giác hay bầu dục, vách cellulose, bên trong có tinh thể calci oxalate hình cầu gai. Sợi Trụ bì: hóa mô cứng thành từng đám. Libe I: gồm những tế bào vách cellulose có màu hồng đậm, sắp xếp lộn xộn thành từng đám trên 1 vòng tròn. Libe II: phân bố đều trên 1 vòng, gồm những lớp tế bào hình chữ nhật vách cellulose, trong tế bào chứa những tinh thể calci oxalate hình cầu gai. Gỗ II: phân bố đều trên 1 vòng, gồm các mạch gỗ to hình cầu hay bán nguyệt, sắp xếp liên tục thành 1 dãy từ trong ra ngoài, nhu mô gỗ sắp xếp thành những vòng liên tục, xen kẽ có những tia gỗ thẳng hàng. Gỗ I: sắp xếp thành từng cụm dưới gỗ II, gồm 2-3 mạch gỗ, xung quanh có những đám tế bào nhu mô gỗ vách cellulose. Nhu mô tủy: ở trong cùng. - 39 - Ảnh 3.3. Cấu tạo giải phẫu của thân Chùm ngây. A : Toàn bộ vi phẫu. B1, B2, B3 : Cấu tạo các mô từ ngoài vào trong Chú Thích 1: Lớp bần 2: Mô cứng 3: Nhu mô vỏ 4: Sợi Trụ bì 5: Libe I 6: Libe II 7: Calci oxalate 8: Gỗ II 9: Gỗ I 10: Nhu mô tuỷ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B1 B3 B2 - 40 - ¾ Lá cây Phần gân giữa: Mặt trên phẳng, mặt dưới lồi. Biểu bì trên tế bào to hơn biểu bì dưới, ở ngoài phủ một lớp cutin, có lông che chở đơn bào. Nhu mô: gồm những tế bào hình đa giác, vách mỏng bằng cellulose, sắp xếp lộn xộn để hở những khoảng gian bào nhỏ, trong tế bào có chứa tinh thể calci oxalate hình cầu gai. Bó dẫn xếp thành hình cung, gỗ ở trên, libe ở dưới. Mô dày góc ở trên biểu bì dưới (Ảnh 3.4). Phiến lá: Tế bào biểu bì trên có kích thước to hơn tế bào biểu bì dưới và có lông che chở; biểu bì dưới có lỗ khí, không có lông che chở. Dưới biểu bì trên là nhu mô hình giậu chứa những hạt lục lạp. Nhu mô khuyết: tế bào có hình bầu duc hay đa giác, vách cellulose, sắp xếp lộn xộn chừa những khuyết to, trong tế bào có chứa calci oxalate canxi hình cầu gai; rải rác có những bó libe–gỗ của gân phụ (Ảnh 3.4). Ảnh 3.4. Cấu tạo giải phẫu của lá Chùm ngây. A : Toàn bộ vi phẫu lá B1 : Cấu tạo các mô ở gân giữa B2 : Cấu tạo các mô ở phiến lá Chú Thích 1: Biểu bì trên 2: Nhu mô giậu 3: Calci oxalate 4: Gỗ 5: Libe 6: Mô dày 7: Biểu bì dưới 8: Nhu mô khuyết A 1 2 3 4 5 6 7 1 2 8 B2 B1 - 41 - ¾ Rễ cây Mặt cắt rễ gần tròn, từ ngoài vào trong có: (Ảnh 3.5) Lớp bần: gồm những tế bào nhỏ, dẹt, xếp thành dãy đồng tâm và xuyên tâm, phía ngoài có nhiều chỗ bị bong ra. Nhu mô vỏ: cấu tạo từ những tế bào hình đa giác, vách mỏng, xếp lộn xộn, rải rác trong vùng này có những cụm mô cứng. Libe I: bị ép dẹp khó xác định. Libe II: gồm những lớp tế bào hình chữ nhật vách bằng cellulose, sắp xếp thành dãy xuyên tâm rõ. Gỗ II: chiếm tâm, mạch gỗ II ít, xếp rãi rác, nhu mô gỗ vách cellulose, sắp xếp thành dãy xuyên tâm. Ảnh 3.5. Cấu tạo giải phẫu của rễ Chùm ngây A : Toàn bộ vi phẫu rễ B1, B2: Cấu tạo các mô từ ngoài vào trong của rễ Chú Thích 1: Lớp bần 2: Nhu mô vỏ 3: Cụm mô cứng 4: Tia libe 5: Libe I 6: Libe II 7: Mạch gỗ II 8: Nhu mô gỗ II 1 2 3 4 5 6 7 8 A B1 B2 - 42 - 3.1.1.3. Xác định tên khoa học cây Chùm ngây Cây Chùm ngây nghiên cứu trồng tại Đồng Nai hay ở Thành Phố Hồ Chí Minh có tên khoa học là “Moringa oleifera Lam.”. 3.1.2. Khảo sát vài đặc tính sinh lý của lá cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non 3.1.2.1. Xác định lá chức năng Kết quả đo cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ngoài tự nhiên ở giai đoạn tăng trưởng từ lá số 1 đến lá số 7 (Ảnh 3.6) được trình bày ở bảng 3.1. Ảnh 3.6. Vị trí các lá trên cây Chùm ngây. Lá số 4 Lá số 5 Lá số 6 Lá số 7 Lá số 1 Lá số 2 Lá số 3 - 43 - Bảng 3.1. Cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng Vị trí lá Cường độ quang hợp (µmol CO2/m2.s) 1 40,54 ± 0,83b 2 45,72± 0,14c 3 62,56± 0,69d 4 88,84± 0,28f 5 64,46± 1,22d 6 37,87± 1,03a 7 36,45± 0,33a Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% 40,54 45,72 62,56 88,84 64,46 37,87 36,45 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 Vị trí lá Cư ờ ng đ ộ qu an g hợ p Hình 3.2. Cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ở các vị trí khác nhau Cường độ quang hợp của lá tăng dần từ lá số 1 đến lá số 4, từ lá thứ 5 trở đi cường độ quang hợp giảm nhanh. Lá số 4 có cường độ quang hợp cao nhất (88,84 %). Do đó lá số 4 là lá chức năng của cây. (µmol /m2/s) - 44 - 3.1.2.2. Khảo sát cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non Lá số 4 của cây ở giai đoạn tăng trưởng Lá số 4 của cây ở giai đoạn ra hoa Lá số 4 của cây ở giai đoạn có trái non Ảnh 3.7. Lá số 4 của cây Chùm ngây ở các giai đoạn phát triển. Lá chức năng (lá số 4) của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non (Ảnh 3.7) được tiến hành đo cường độ quang hợp, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Cường độ quang hợp lá chức năng của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Cây ở giai đoạn Cường độ quang hợp (µmol CO2/m2/s) Tăng trưởng 88,84± 0,28d Ra hoa 69,74± 0,37b Có trái non 63,42± 0,18a - 45 - 88,84 69,74 63,42 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 Giai đoạn phát triển C ư ờ ng đ ộ qu an g hợ p Hình 3.3. Cường độ quang hợp của lá chức năng cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. 1: Tăng trưởng 2: Ra hoa 3: Có trái non 3.1.2.3. Khảo sát trọng lượng khô/trọng lượng tươi Lá chét của lá số 4 của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được xác định trọng lượng khô/trọng lượng tươi. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Tỷ lệ TLK/TLT của lá chét Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% TLT: Trọng lượng tươi, TLK: Trọng lượng khô Lá chét của lá chức năng ở cây TL Tươi TB (g) TL Khô TB (g) Tỷ lệ TLK/TLT (%) Tăng trưởng 10,07 ± 0,02a 1,84 ± 0,02a 18,27 ± 0,02a Ra hoa 10,03 ± 0,05a 2,25 ± 0,01b 22,43 ± 0,03b Có trái non 10,05 ± 0,05a 2,43 ± 0,08c 24,18 ± 0,05c (µmol /m2/s) - 46 - 18,27 22,43 24,18 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 Giai đoạn phát triển Tỷ lệ T LK /T LT (% ) Hình 3.4. Sự thay đổi tỷ lệ TLK/TLT của lá chét Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. 1: Tăng trưởng 2: ra hoa 3: Có trái non Tỷ lệ TLK/TLT tăng theo từng giai đoạn phát triển, cao nhất ở giai đoạn cây có trái non (24,18 %) và thấp nhất ở giai đoạn cây tăng trưởng (18,27 %). 3.1.2.4. Khảo sát hoạt tính chất ĐHSTTV nội sinh Ly trích và đo hoạt tính hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật ở lá chức năng của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Hoạt tính hợp chất ĐHSTTV nội sinh trong lá chức năng Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Hoạt tính chất ĐHSTTV (mg/l) Lá chức năng của cây Auxin Cytokinin Giberelin AAB Tăng trưởng 1,57± 0,14d 1,78± 0,22d 0,02±0,01a 0,18±0,07a Ra hoa 0,74±0,23b 1,46± 0,17c 0,08±0,01a 0,45±0,12b Có trái non 0,58±0,20a 0,65± 0,14a 0,04±0,01a 0,52±0,15b Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% - 47 - 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 1 2 3 Giai đoạn phát triển Ho ạt tí nh c hấ t Đ H ST TV (m g/ l) Auxin Cytokinin Giberelin ABA Hình 3.5. Hoạt tính chất ĐHSTTV trong lá chức năng của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Theo từng giai đoạn phát triển hoạt tính auxin và cytokinin nội sinh cao ở giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và thấp ở giai đoạn có trái non. Hoạt tính giberelin không có sự khác biệt giữa 3 giai đoạn, hoạt tính acid abcisic lại tăng theo giai đoạn phát triển. 3.1.3. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật của lá Chùm ngây Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5. - 48 - Bảng 3.5. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng Thành phần Phản ứng định tính Kết quả Tinh dầu - Mùi thơm nhẹ đặc trưng ++ Chất béo - Vết trong mờ +++ Carotenoid - Phản ứng Carr-Price ++ Triterpenoid - Phản ứng Liebermamn – Burchard + Coumarin - Tăng cường độ huỳnh quang ++ Alkaloid - TT Valse- Mayer - TT Dragendrorff + Anthraquinon - Tăng màu trong dd NaOH 10% - Flavonoid - Tạo phức với AlCl3 - Tạo phức với FeCl3 - Phản ứng Cyanidin +++ ++++ ++ Saponin - Phản ứng tạo bọt - Các chất khử - TT Fehling ++ Các acid hữu cơ - Tinh thể Na2CO3 ++ Tanin - dung dịch FeCl3 +++ Ghi chú : (−) : không có (+) : có ít (++) : có (+++) : có nhiều (++++) : có rất nhiều Kết quả cho thấy trong lá của cây Chùm ngây có các nhóm hợp chất sau: Chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tanin, acid hữu cơ… nhưng trong đó hợp chất: flavonoid, tanin, chất béo… có nhiều hơn. 3.1.4. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Chùm ngây 3.1.4.1. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí lá ¾ Độ ẩm - 49 - Xác định độ ẩm trên 7 mẫu bột lá của cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng, kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Độ ẩm bột lá. Vị trí lá 1 2 3 4 5 6 7 Độ ẩm (%) 6,52 6,83 7,23 6,34 7,65 6,48 7,23 ¾ Định tính flavonoid Dịch chiết lá số 4 của cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng được định tính flavonoid bằng SKLM với quercetin làm chất chuẩn. Hệ dung môi khai triển: n- Butylacetat – nước – acid formic (15:5:5). Phát hiện bằng UV 254 nm, UV 365 nm, hơi NH3. UV 254 nm UV 365 nm hơi NH3 đậm đặc Hình 3.6. Sắc ký đồ quercetin chuẩn (Q) và dịch chiết từ bột lá Chùm ngây (C) Sắc ký đồ cho thấy dịch chiết của bột lá Chùm ngây có 2, 3 vết flavonoid (phát quang ở bước sóng 365 nm, và 254 nm và có màu xanh đen khi tiếp xúc hơi NH3 đậm - 50 - đặc). Trong đó vết trùng với vết của quercetin chuẩn chiếm hàm lượng lớn nhất, do đó được xem là chất chuẩn dùng để định lượng flavonoid toàn phần trong lá Chùm ngây. ¾ Hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá - Kết quả đo độ hấp thu của quercetin chuẩn tại các nồng độ khác nhau ở bước sóng 415 nm được trình bày ở bảng 3.7, từ kết quả đo độ hấp thu của từng nồng độ quercetin ta dựng đường chuẩn quercetin được trình bày ở hình 3.7. Bảng 3.7. Độ hấp thu của dung dịch quercetin chuẩn trong MeOH. Nồng độ Quercetin (μg/ml) Độ hấp thu 1 0,045 5 0,227 10 0,432 20 0,97 30 1,42 40 1,84 50 2,49 60 2,90 - 51 - Biểu đồ tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ Quercetin y = 20,438x + 0,6241 R2 = 0,998 0 10 20 30 40 50 60 70 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Độ hấp thu A N ồn g đ ộ Q ue rc et in Hình 3.7. Đường chuẩn quercetin (y = 20,438x + 0,6241). Đường chuẩn quercetin (y = ax + b) có hệ số a (20,438) lớn hơn nhiều so với hệ số b (0,6241) và R2 = 0,998 gần bằng 1, điều đó chứng tỏ phương pháp chính xác ít có sai số. - Kết quả xác định hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá trên cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi) bằng phương pháp UV-Vis được thể hiện ở bảng 3.8 và phụ lục 2.1. Bảng 3.8. Hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá trên cây Chùm ngây. Vị trí lá Hàm lượng flavonoid toàn phần (%) 1 1,17 2 1,51 3 2,16 4 2,38 5 1,13 6 0,63 7 0,44 (µg/ml) - 52 - 1,17 1,51 2,16 2,38 1,13 0,63 0,44 0 0,5 1 1,5 2 2,5 1 2 3 4 5 6 7 Vị trí lá H àm lư ợ ng fl av on oi d (% ) Hình 3.8. Hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá trên cây Chùm ngây 3 tháng tuổi. Trên cây Chùm ngây 3 tháng tuổi, hàm lượng (%) flavonoid toàn phần có sự thay đổi theo từng vị trí của lá trên cây, tăng cao dần ở những lá non từ lá số 1 đến lá số 4, giảm dần ở lá già từ lá số 5 trở đi. Hàm lượng flavonoid cao nhất ở lá số 4 (2,38 %), sau đó có sự giảm đáng kể ở lá số 7 (0,44 %). 3.1.4.2. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây ở 3 giai đoạn phát triển Lá số 1 đến lá số 5 của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được dùng để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần. ¾ Độ ẩm Độ ẩm của bột lá của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được trình bày ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Độ ẩm bột lá của cây ở 3 giai đoạn phát triển. Bột lá ở cây Tăng trưởng Ra hoa Có trái non Độ ẩm (%) 7,52 7,83 7,03 - 53 - ¾ Định tính flavonoid Lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được định tính flavonoid bằng SKLM với quercetin làm chất chuẩn. Hệ dung môi khai triển: n-Butylacetat – nước – acid formic (15:5:5). Phát hiện bằng UV 254 nm, UV 365 nm. Sắc ký đồ cho thấy có flavonoid trong dịch chiết của lá ở 3 giai đoạn phát triển. Hình 3.9. Sắc ký đồ dịch chiết lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. M1, M2, M3 : Dịch chiết lá tuần tự ở cây tăng trưởng, ra hoa và có trái non; Q: Quercetin chuẩn Sắc ký đồ cho thấy dịch chiết lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển đều có flavonoid vì trùng với vết của quercetin chuẩn. ¾ Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non bằng phương pháp UV-Vis được trình bày ở bảng 3.10. UV 365 nm UV 254 nm - 54 - Bảng 3.10. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Cây ở giai đoạn Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá (%) Tăng trưởng 1,67 Ra hoa 1,51 Có trái non 1,09 1,67 1,51 1,09 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 1 2 3 Giai đoạn phát triển của cây H àm lư ợ ng fl av on oi d tr on g lá (% ) Hình 3.10. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây ở giai đoạn tăng trưởng (1), ra hoa (2), có trái non (3). Kết quả cho thấy hàm lượng % flavonoid toàn phần trong lá của cây ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi) là cao nhất (1,67 %), và giảm dần ở giai đoạn ra hoa (1,51 %), có trái non (1,09 %) là thấp nhất.. 3.1.5. Nuôi cấy tạo mô sẹo 3.1.5.1. Thử nghiệm khử trùng mẫu Các hạt Chùm ngây sau khi khử trùng ở tỷ lệ javel/nước và thời gian khác nhau. Nuôi cấy trong môi trường MS0. Kết quả thế hiện ở bảng 3.11. - 55 - Bảng 3.11. Tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS0 Ảnh 3.8. Hạt tạo cây mầm sau 1, 2 tuần nuôi cấy trong môi trường MS0 Tỷ lệ mẫu không nhiễm khi khử trùng bằng Javel/nước cất (1: 2) trong thời gian 15 phút là 96 % là tốt nhất. 3.1.5.2. Tạo cây con in-vitro Sau 3 tuần nuôi cấy hạt trong môi trường MS có bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau, hạt nảy mầm tạo rễ và tạo cây con (Bảng 3.12). Tỷ lệ (Javel: nước cất) Thời gian khử trùng (phút) 1:2 1:3 10 80% 70% 15 96% 90% - 56 - Bảng 3.12. Tỷ lệ tạo rễ và hình thành cây con sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường bổ sung GA3 ở nồng độ khác nhau Môi trường Tỉ lệ tạo rễ Tỷ lệ tạo cây con MS 100% 80% MS + GA3 0,2 mg/l 100% 100% MS + GA3 0,5 mg/l 100% 80% MS + GA3 1,0 mg/l 100% 60% Sau 3 tuần nuôi cấy tất cả các môi trường đều tạo rễ 100% nhưng chỉ có môi trường MS + GA3 0,2 mg/l cho ta kết quả tốt nhất (100% tạo rễ và cây con), cây con hình thành phát triển tốt về chiều cao , có 2 lá non ở ngọn (Ảnh 3.9). Ảnh 3.9. Cây con in-vitro sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS + GA3 0,2 mg/l 3.1.5.3. Khảo sát sự tạo sẹo Lá chét cây con in-vitro 3 tuần tuổi được cấy trên môi trường kích thích tạo sẹo có tỷ lệ NAA và BA thay đổi. Kết quả cho thấy lá non cây Chùm ngây in-vitro rất dễ dàng tạo sẹo trên các môi trường đã khảo sát sau 1 tuần nuôi cấy, nhưng trên môi trường MS + NAA 1mg/l, sẹo tạo thành nhanh chóng phân hóa tạo rễ, chỉ một ít tiếp - 57 - tục nhân sẹo. Nhưng trên môi trường MS + NAA 1mg/l + BA 0,2 mg/l, sẹo tạo thành rất sớm và nhân lên rất nhanh (Ảnh 3.10). Ảnh 3.10: Hình thái mô sẹo lá sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường 3.1.5.4. Khảo sát đặc điểm hình thái và giải phẫu mô sẹo Mô sẹo trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l sau 2 tuần tuổi được cấy sang môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l. Quan sát mô tả hình thái của mô sẹo theo thời gian. Mô sẹo thu được chủ yếu là sẹo xốp, tuần 1 mô sẹo có màu xanh lá chuối non, tuần 2, 3 mô sẹo chuyển sang màu trắng đục và tiếp tục phát triển, sang tuần 4 sẹo phát triển chậm, có màu nâu (Bảng 3.13). MS + NAA 1 mg/l MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l Rễ non - 58 - Bảng 3.13. Đặc điểm hình thái mô sẹo và ảnh minh họa. Thời gian Đặc điểm hình thái Ảnh minh họa Tuần 1 Tế bào bắt đầu phân chia, tạo sẹo từ màu xanh lá chuối non chuyển sang màu trắng đục. Tuần 2 Sẹo vẫn phát triển mạnh, chuyển dần sang màu trắng đục và vàng nhạt. Tuần 3 Sẹo tiếp tục phát triển, hình thái giống giai đoạn tuần 2. Tuần 4 Sẹo phát triển chậm, có màu nâu. - 59 - Ảnh 3.11. Cấu trúc giải phẫu của lá và mô sẹo lá 1, 2 tuần tuổi. Mô sẹo được hình thành chủ yếu là do sự phản phân hoá lớp tế bào ở vùng nhu mô và vùng tượng tầng giữa bó gỗ và bó libe. Sự phản phân hoá xảy ra ở tuần 1, sang tuần thứ 2 thì có sự phân chia mạnh. 3.1.5.5. Khảo sát sự tăng trọng của mô sẹo theo thời gian Mô sẹo sau 2 tuần tuổi nuôi cấy được cấy sang môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l, khảo sát sự tăng trưởng của mô sẹo theo thời gian. Trọng lượng cấy ban đầu là 1,0 g tươi. Kết quả sự tăng trưởng của mô sẹo được trình bày ở hình 3.11 và bảng 3.14. Bảng 3.14. Trọng lượng của mô sẹo lá Chùm ngây theo thời gian trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l. Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) 0 1,00± 0,06a 0,05± 0,02a 1 2,84 ± 0,13c 0,14 ± 0,06b 2 4,81 ± 1,14f 0,29 ± 0,13d 3 5,67 ± 0,57fg 0,34 ± 0,05df 4 6,08 ± 0,32g 0,34 ± 0,01df Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% Lá ban đầu Mô sẹo lá 1 tuần Mô sẹo lá 2 tuần Bó gỗ Nhu mô Nhu mô phân chia Nhu mô phân chia mạnh - 60 - 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 1 2 3 4 5 Thời gian (tuần) Kh ớ i l ư ợ ng (g ) Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hình 3.11. Sự tăng trưởng của mô sẹo lá Chùm ngây theo thời gian trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l Đường cong tăng trưởng của mô sẹo có dạng hình chữ S. Tuần 1 đến tuần 2 mô sẹo tăng trọng nhanh, đến tuần thứ 3 mô sẹo tăng trọng chậm lại và có dấu hiệu ngưng tăng trọng ở tuần thứ 4. 3.1.5.6. Khảo sát hàm lượng flavonoid trong sẹo lá theo thời gian ¾ Độ ẩm mô sẹo Xác định độ ẩm trên 4 mẫu mô sẹo, kết quả được trình bày ở bảng 3.15. Bảng 3.15. Độ ẩm mô sẹo lá theo thời gian Mẫu 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần Độ ẩm (%) 6,37 5,62 6,03 6,23 6,34 ¾ Định tính flavonoid trong mô sẹo lá bằng SKLM Định tính flavonoid trong lá cây con in-vitro ban đầu và mô sẹo lá sau 1, 2, 3, 4 tuần tuổi bằng phương pháp SKLM với quercetin (Q) làm chất chuẩn.. Hệ dung môi - 61 - khai triển: n Butylacetate acetat – nước – acid formic (15:5:5). Phát hiện bằng thuốc thử FeCl3 5 %. Hình 3.12. Sắc ký đồ dịch chiết lá cây con in-vitro ban đầu (0) và mô sẹo của nó ở 1, 2, 3, 4 tuần tuổi (1, 2, 3, 4) so với quercetin chuẩn (Q). Sắc ký đồ cho thấy có sự hiện diện của flavonoid (queretin) trong lá cây con in- vitro ban đầu và trong mô sẹo của nó ở 1, 2, 3, 4 tuần tuổi. ¾ Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong mô sẹo theo thời gian Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá cây in-vitro ban đầu và mô sẹo lá 1, 2, 3, 4 tuần tuổi được trình bày ở bảng 3.16. Phun TT FeCl3 5% - 62 - Bảng 3.16. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong mô sẹo lá theo thời gian. Tuổi mô sẹo (tuần) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong mô sẹo lá (%) 0 0,67 1 0,87 2 0,99 3 0,92 4 0,92 0,67 0,87 0,99 0,92 0,92 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 2 3 4 5 Thời gian tăng trưởng sẹo (tuần) Hà m lư ợ ng fl av on oi d to àn p hầ n (% ) Hình 3.13. Hàm lượng % flavonoid toàn phần trong mô sẹo lá theo thời gian Hàm lượng flavonoid toàn phần trong mô sẹo tăng dần theo thời gian nuôi cấy, cao nhất ở mô sẹo 2 tuần tuổi, sao đó giảm ở mô sẹo 3, 4 tuần tuổi. 0 1 2 3 4 - 63 - 3.2. THẢO LUẬN 3.2.1. Khảo sát thực vật học và xác định tên khoa học của cây Chùm ngây Cây Chùm ngây khảo sát lấy từ cây trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh và Đồng Nai có tên khoa học là Moringa oleifera. Đặc điểm hình thái của cây giống như những mô tả về cây Chùm ngây trong các tài liệu [2], [3], [5], [50]. Theo Phạm Hoàng Hộ (2006) [7], Võ Văn Chi (1999) [3] ở Việt Nam chỉ có 1 loài Chùm ngây là Moringa oleifera Lam. Các đặc điểm về hình thái và giải phẫu của cây đã mô tả trong bài giúp tránh nhầm lẫn khi thu hái cây này làm dược liệu. 3.2.2. Đặc tính sinh lý của lá cây Chùm ngây Cây Chùm ngây có lá mọc cách, kép lông chim 3 lần lẻ, có từ 5-7 cặp lá phụ bậc 1, 4-6 cặp lá phụ bậc 2, 6 - 9 cặp lá phụ bậc 3, lá phụ bậc 3 hình elíp. Về cấu tạo giải phẫu thì lá chét có nhu mô giậu tập trung dưới biểu bì trên ở 2 bên phiến lá (Ảnh 3.4). Quang hợp là một quá trình cơ bản trong hoạt động sống của cơ thể thực vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố bên trong (nội sinh) và bên ngoài môi trường (ngoại sinh). Theo Bùi Trang Việt (2002) các yếu tố nội sinh như loài thực vật, đặc tính hình thái và cấu trúc của lá: diện tích bề mặt lá, số lượng và độ mở khí khẩu, bề dày lớp cutin... đều ảnh hưởng đến cường độ quang hợp của lá, hay tình trạng sinh lý của lá: lá trưởng thành quang hợp mạnh, lá non hay lá già có quang hợp kém hơn. Phân tích cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây cho thấy, CĐQH tăng dần từ lá số 1 đến lá số 4 (CĐQH lá số 4 cao nhất 88,84 µmol CO2/m2/s), từ lá thứ 5 trở đi cường độ quang hợp giảm dần (Bảng 3.1). Các lá 1, 2, 3 là lá non nên cường độ quang hợp thấp. Lá số 4 có cường độ quang hợp cao nhất, đây là lá trưởng thành và là lá chức năng của cây Chùm ngây đang tăng trưởng. Từ lá số 5 đến lá số 7 cường độ quang hợp giảm, chứng tỏ các lá này già nên CĐQH thấp So sánh cường độ quang hợp lá số 4 của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn: tăng trưởng, ra hoa và có trái non thì thấy lá số 4 của cây ở giai đoạn tăng trưởng có cường - 64 - độ quang hợp cao nhất (Bảng 3.1), điều này có thể giải thích khi cây ở giai đoạn ra hoa hay giai đoạn có trái non lá số 4 có thể là lá già, không còn là lá chức năng của cây. Có sự thay đổi tỷ lệ TLK/TLT của lá theo từng giai đoạn phát triển (Bảng 3.3), tỷ lệ TLK/TLT của lá số 4 cao nhất ở giai đoạn cây có trái non (24,18 %) và thấp nhất ở giai đoạn cây tăng trưởng (18,27 %). Điều này cho thấy cùng vị trí lá số 4 nhưng trạng thái sinh lý của chúng khác nhau ở các cây Chùm ngây có giai đoạn phát triển khác nhau, ở cây đang tăng trưởng, lá số 4 là lá chức năng nên có cường độ quang hợp cao nhất, nhưng không phải là lá già nên tỷ lệ TLK/TLT thấp hơn so với các lá số 4 ở các cây trong giai đoạn ra hoa và giai đoạn có trái non. Như vậy về mặt trạng thái sinh lý thì lá số 4 của cây ở giai đoạn có trái non là già nhất trong 3 giai cây khảo sát. Phân tích hợp chất ĐHSTTV nội sinh trong lá số 4 của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non thì thấy hoạt tính auxin và cytokinin nội sinh cao ở giai đoạn tăng trưởng và ra hoa, thấp ở giai đoạn có trái non (Bảng 3.4). Điều này có thể giải thích lá số 4 của cây ở giai đoạn tăng trưởng đang còn chức năng tổng hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật giúp cây phát triển hơn, còn hoạt tính giberelin thì không có sự khác biệt có ý nghĩa trong 3 giai đoạn phát triển. nhưng acid abcisic lại tăng dần theo giai đoạn phát triển. 3.2.3. Sơ bộ thành phần hoá thực vật của lá cây Chùm ngây Qua khảo sát sơ bộ thành phần hoá thực vật chúng tôi nhận thấy trong lá của cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) có các nhóm hợp chất như: Chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tannin, acid hữu cơ….trong đó hợp chất: flavonoid, tanin, chất béo… có nhiều hơn (Bảng 3.5). Điều này giúp định hướng cho nghiên cứu về sau tốt hơn (Ngô Vân Thu 1998) [11], và từ đó chúng tôi chọn hợp chất flavonoid để khảo nghiên cứu. 3.2.4. Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong từng vị trí trên lá cây Chùm ngây Hàm lượng flavonoid khác nhau trong thực vật có rất nhiều nguyên nhân như đất đai, vùng sinh sống, thời tiết…hay hàm lượng flavonoid cũng có thể thay đổi theo - 65 - mùa trong năm, theo độ tuổi của cây [37], hàm lượng flavonoid cũng khác nhau trong các cơ quan khác nhau trong các cơ quan của cùng 1 cây [29]. Theo nghiên cứu của Harborne and Williams, 2000 [31] về hàm lượng flavonoid trên thực vật thì lá non ở thực vật có hàm lượng flavonoid cao hơn so với lá già. Thực vậy thực vật tổng hợp flavonoid cho chính bản thân chúng và dự trữ trong tế bào biểu bì của lá, nhằm chống lại sự có hại của tia UV (Kozaki and Takeba, 1996) [17], [43]. Nghiên cứu trên cây Chùm ngây cho thấy hàm lượng (%) flavonoid toàn phần có sự thay đổi theo từng vị trí của lá trên cây (Bảng 3.8), Hàm lượng flavonoid cao ở lá non (lá 1, 2, 3, 4) và giảm đáng kể ở lá già (lá 5, 6, 7). Sự thay đổi hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá Chùm ngây là phù hợp với những báo cáo của K. KARLOVÁ, K. PETŘÍKOV, (2005) về khảo sát hàm lượng flavonoid trong lá cây Achillea collina, rằng lá cây non có hàm lượng flavonoid toàn phần cao hơn so với lá cây già [33]. Rodrigo Lois, (1994) [40] dựa vào những đột biến ở Arabidopsis đã chứng minh rằng tia UV là nguyên nhân trong việc gia tăng hàm lượng flavonoid. Kết quả báo cáo rằng vai trò sinh lý của flavonoid là được sinh ra nhằm bảo vệ thực vật chống lại sự ảnh hưởng của tia UV. 3.2.5. Sự thay đổi hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non Flavonoid có vai trò rất lớn góp phần trong màu sắc của hoa và trái, trong thực vật, nhân tố ảnh hưởng đến màu sắc của hoa, trái là do gen chi phối, thêm vào đó cũng do yếu tố môi trường như dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến nó. Nhân tố quyết định chính cho màu sắc cuối cùng của hoa và trái là flavonoid anthocyanin (Koes et al. 1994). Nghiên cứu trên cây Chùm ngây cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng là cao nhất 1,67 %, giảm ở giai đoạn ra hoa 1,51 % và thấp nhất là giai đoạn có trái non 1,09 % (Bảng 3.9). Điều này được lý giải là có - 66 - sự sinh tổng hợp sắc tố anthocyanin nhiều ở chồi và di chuyển đến hoa và trái đế tạo màu sắc cho hoa và trái Koes et al. (1994), (Brenda, 2001) [16]. Brenda, (2001) đã chứng minh quá trình sinh tổng hợp flavonoids và điều hoà biến dưỡng flavonoid có liên quan đến màu sắc của hoa và trái. Ở trạng thái bình thường trong giai sinh trưởng và phát triển thực vật tổng hợp flavonoid ở dạng flavonol như: qercetin, kaempferol, myrcetine dự trữ trong lá, bảo vệ lá chống lại tác hại của tia UV, nhưng đến giai đoạn ra hoa và trái thực vật tổng hợp nhiều sắc tố anthocyanidin (sắc tố tạo màu sắc cho hoa) và muốn tổng hợp anthocyanidin thì phải có sự hydroxyl hóa flavonol (qercetin, kaempferol) tạo nên sắc tố anthocyanidin, anthocyanidin được thay đổi bằng cách gắn thêm đường (Glucose) hoặc các nhóm thơm khác tạo nên những màu sắc của hoa. Chính vì vậy ở giai đoạn ra hoa và có trái hàm lượng flavonoid dạng flavonol giảm. Gabor Lazar* and Howard M. Goodman, (2006) [28] nghiên cứu quá trình điều hoà biến dưỡng trong con đường sinh tổng hợp flavonoid ở Arabidopsis đã chứng minh bình thường trong chồi ngọn, chồi bên sớm có những gen mã hoá cho enzyme khởi đầu quá trình sinh tổng hợp flavonoid và những gen mã hoá cho những enzme xúc tác Dihydro kaempferol và Dihydro quercetin tạo thành kaempferol và quercetin. Còn gen mã hoá tạo nên sắc tố anthocyanin xuất hiện trễ hơn. Điều này chứng tỏ quercetin, kaempferol được sinh ra sớm ở lá non nhằm giúp cho chúng chống tác hại của tia VU của mặt trời, còn khi cây đã trưởng thành và ra hoa thì cần sắc tố anthocyanin nhiều cho màu sắc của hoa thì bây giờ có sự xuất hiện enzyme xúc tác Dihydro kaempferol và Dihydro quercetin tạo thành sắc tố anthocyanin vì vậy hàm lượng kaempferol và quercetin bây giờ bị giảm lại ở trong lá. 3.2.6. Tạo mô sẹo và hàm lượng flavonoid trong mô sẹo Sau 3 tuần nuôi cấy ta thấy hạt trong môi trường MS + GA3 0,2 mg/l nảy mầm tạo rễ và tạo cây con tốt nhất (100%). Điều đó chứng tỏ GA3 giúp hạt nảy mầm tốt hơn, khơi dạy chồi ngủ trong hạt, nhưng với nồng độ cao thì lại cản sự nảy mầm. ¾ Tạo mô sẹo: - 67 - Mô sẹo là đám tế bào không phân hoá, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, để tạo mô sẹo cần chú ý đến tuổi (tình trạng sinh lý của mô cấy). Auxin thường được sử dụng để kích thích tạo sẹo, đồng thời có thể phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000). Tất cả các bộ phận của thực vật (thân, lá, rễ) đều có thể cảm ứng tạo mô sẹo, khi nơi đó có vết cắt và đặt chúng trong điều kiện nuôi cấy thích hợp [1]. Tiến hành tạo sẹo trên lá chét cây con in-vitro Chùm ngây 3 tuần tuổi, cho thấy trên môi trường MS + NAA 1,0 mg/l + BA 0,2 mg/l lá chét cây Chùm ngây in-vitro rất dễ dàng tạo sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, sẹo tạo thành rất sớm và nhân lên rất nhanh nhưng trên môi trường MS + NAA 1mg/l, sẹo tạo thành nhanh chóng phân hóa tạo rễ. Sự bổ sung BA ở nồng độ 0,2 mg/l kết hợp NAA 1 mg/l đã giúp cho sự tăng sinh mô sẹo. Việc sử dụng cytokinin riêng lẻ hay kết hợp với auxin ngoại sinh ở điều kiện thích hợp có thể cảm ứng tạo mô sẹo (Profumo et al, 1985) [1]. ¾ Sự tăng trọng của mô sẹo và cấu tạo giải phẫu của mô sẹo theo thời gian: Mô sẹo lá Chùm ngây in-vitro được cấy trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l dùng cho quan sát sự tăng trọng và đặc điểm hình thái theo thời gian nuôi cấy. Mô sẹo thu được chủ yếu là sẹo xốp, tuần 1 mô sẹo có màu xanh lá chuối non, tuần 2, tuần 3 mô sẹo chuyển sang màu trắng đục và tiếp tục phát triển, sang tuần 4 sẹo phát triển chậm, có màu nâu. Sự tăng trọng của mô sẹo theo thời gian được biểu hiện qua trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo, đồ thị này có dạng là đường cong tăng trưởng hình chữ S (Hình 3.11) và chia làm 2 pha: + Pha lag (pha luỹ thừa): trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo tăng nhanh ở tuần thứ 2 sau đó dạt cực đại ở tuần thứ 3. + Pha tĩnh: sự tăng trưởng tế bào mô sẹo chậm dần, trọng lượng tươi và trọng lượng khô ngưng ở tuần thứ 4. Sự tăng trưởng tế bào chậm dần hoặc - 68 - ngừng tăng trưởng là do các yếu tố dinh dưỡng cần thiết trong môi trường cạn kiệt hoặc môi trường trở nên độc đối với tế bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Lát cắt ngang mẫu lá chét Chùm ngây sau 1, 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l. Quan sát cấu trúc giải phẫu của mô sẹo cho thấy sự tạo mô sẹo được hình thành chủ yếu là do sự phản phân hoá lớp tế bào ở vùng nhu mô và vùng tượng tầng giữa bó gỗ và bó libe. Sự phản phân hoá xảy ra ở tuần 1, sang tuần thứ 2 thì có sự phân chia mạnh của tế bào. Theo Bùi Trang Việt (2000), sự tạo mô sẹo ở thực vật trong nuôi cấy in-vitro, nhờ auxin, thuộc về 1 trong 3 quá trình: + Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô. + Sự phân chia của tế bào tượng tầng. + Sự xáo trộn của mô phân sinh sơ khởi. ¾ Khả năng thu flavonoid trong mô sẹo: Các cơ quan thực vật khác nhau hay các mô đã bị biệt hoá có thể bị khử biệt hoá tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, các tế bào khử biệt hoá có thể tiếp tục tăng trưởng như 1 khối mô không phân hoá được gọi là mô sẹo, hoặc tái biệt thành các cơ quan chuyên biệt biểu hiện qua những thay đổi về hình thái và chức năng sinh lý khác nhau (Bùi Trang Việt 2000). Những khối mô sẹo này hay những cơ quan biệt hoá này có thể có chứa những sản phẩm thứ cấp tương tự như cơ quan bình thường (Di Cosmo F., Misawa M., 1995) [22]. Khi định tính flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng các mẫu mô sẹo thu nhận được, cho thấy mẫu mô sẹo lá các tuần tuổi đều có các vết flavonoid (Hình 3.12). Qua đó, cho thấy được tính toàn năng của tế bào (Schwann và Schleiden, 1983) [23]. Khi định lượng flavonoid toàn phần trong mô sẹo bằng phương pháp UV-Vis (Bảng 3.13), cho thấy có sự gia tăng hàm lượng flavonoid trong mô sẹo ở tuần thứ 2(0,99%) nhưng hơi giảm ở tuần thứ 3, 4 (0,92%). Như vậy trong mô sẹo cũng có flavonoid. Tuy nhiên so với lá cây nguyên ở ngoài tự nhiên thì hàm lượng flavonoid ở mô sẹo thấp hơn 2,5 lần. Điều này có thể là do môi trường ngoài tự lá cây chịu tác động trực tiếp của mặt trời nên flavonoid tạo ra nhiều nhằm giúp cây chống lại tác hại - 69 - của tia UV, trong khi đó mô sẹo chỉ được nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang nê hàm lượng flavonoid thấp [45].