Luận văn Thiết kế và nghiên cứu hệ thống bioreactor cho cây dứa cayenne

1). Bioreactor sủi bọt dạng cầu (Ballon type bubble bioreactor – BTBB) Bioreactor dạng này có hình cầu và có nắp ở trên đỉnh. Ở gần đáy của bình có một khóa hình chữ Y hoặc chữ T có nhiệm vụ châm thêm môi trường và là cổng thu sản phẩm. Bằng việc sử dụng một thiết bị sủi bọt với các lỗ đồng tâm đặt đáy bình, điều này đã làm cho lượng bọt được giảm. Ngoài ra, trên nắp bình còn có gắn thêm các thiết bị đo pH, oxy hòa tan. Những bioreactor dạng này được sử dụng trong vi nhân giống tạo phôi soma (Son et al., 1999; Kim, 1999; Lian, 2001; Paek et al., 2001). Bioreactor thổi khí trên bề mặt (Overlay aeration bioreactor) Dạng bioreactor này thổi khí từ trên bề mặt xuống dung dịch lỏng và đôi khi kết hợp với sục khí nhẹ nhưng hệ số oxy hòa tan khá thấp (nhỏ hơn 1). Kiểu bioreactor này được báo cáo là chưa thành công lắm trong nuôi cấy mô (Ishibashi et al., 1987). Bioreactor ngập chìm gián đoạn tự động (Automated temporary immmersion bioreactor) Hệ thống ngập chìm tự động này đã được thương mại dưới tên gọi là “RITA” do Teisson và Alvard thiết kế (1995). Hệ thống bioreactor này gồm hai bình chứa, một bình dùng cho sự tăng trưởng của thực vật, một bình dùng để chứa môi trường lỏng. Hai bình này được nối với nhau bằng ống silicon và thủy tinh. Không khí nén từ một thiết bị bơm khí sẽ đẩy môi trường lỏng từ bình chứa thứ nhất sang bình chứa thứ hai, làm ngập chìm hoàn toàn mẫu thực vật. Sau đó thì khí sẽ rút khỏi bình chứa môi trường, làm cho môi trường ở bình nuôi cấy hạ xuống. Trong mỗi trường hợp như vậy thì không khí được thổi qua một màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,2 mm. Một thiết bị điều khiển có thể hẹn giờ được dùng để ấn định khoảng thời gian cho một chu 34 trình dâng lên và hạ xuống. Có một hệ thống van 3 cổng dạng so-le được dùng trong trường hợp điều khiển đóng mở này. Hệ thống bioreactor này đã được báo cáo là nuôi cấy thành công trên một số cây như: cây lê (Damiano et al., 2000), cây dứa (Esscalo et al., 1999) và cây coffea arabica (Etienne et al., 1999). 2.8. Giới thiệu các phƣơng pháp nhân chồi cây dứa  Hệ thống nuôi cấy in vitro bán rắn Là hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng giá thể chứa chất dinh dưỡng để giữ cho cây đứng vững đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Khái niệm về giá thể Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu được sử dụng làm vật nâng đỡ, là chỗ cho rễ bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển. Vật liệu làm giá thể phải chắc chắn và ổn định trong các điều kiện khác nhau, chịu được hấp vô trùng mà không bị biến tính, trơ với các chất trong môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, vật làm giá thể phải sạch và không được chứa các chất lạ do thành phần của môi trường dinh dưỡng là xác định và cần kiểm soát được trong từng trường hợp nuôi cấy. Chất tạo đông thông dụng nhất là agar, nhưng theo thời gian, nhiều loại giá thể khác được phát triển với những tính năng ưu việt hơn như rockwool, oasis, v.v. Agar Agar là một polysaccharide chiết xuất từ rong biển. Agar được sử dụng như một tác nhân tạo đông trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô in vitro. Agar là loại giá thể sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm. Alginate Giá thể này có đặc tính tương tự như agar nhưng có nồng độ ion calcium cao hơn. Phytagel Được tổng hợp từ glucuronic acid, glucose và rhamnose. Môi trường tạo ra từ loại gel này rất sạch, độ bền cao, trong suốt nên dễ phát hiện ra hiện tượng nhiễm vi sinh vật. Agargel 35 Là hỗn hợp của agar và phytagel. Ưu điểm của giá thể này là có tác dụng giảm được hiện tượng thủy tinh thể (mọng nước) trong nuôi cấy in vitro. Hơn nữa, loại gel này cũng có độ trong cao nên dễ dàng phát hiện vi sinh vật nhiễm trong môi trường. Transfergel Được sử dụng làm đông môi trường nuôi cấy chồi mầm, chồi đỉnh, phôi soma. Các chất tạo gel khác như bacto agar, gellam gum, v.v, có tác dụng tương tự như agar nhưng giá thành cao hơn do có độ tinh khiết cao hơn và có nhiều công dụng hỗ trợ khác cho nuôi cấy mô. Tuy vậy, nuôi cấy mô trên môi trường bán rắn vẫn bộc lộ nhiều khiếm khuyết: - Chất tạo gel biến môi trường dinh dưỡng thành một hệ kín, hạn chế khả năng di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó nhất. Hơn nữa, những chất độc do chính thực vật tiết ra bị tích lũy xung quanh mẫu cấy và ức chế trở lại sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (thường gặp nhất là hiện tượng tích tụ phenol gây chết mẫu). - Chất dinh dưỡng được bổ sung cùng với agar trước khi hấp, kết quả là các cấu tử dinh dưỡng phân bố đều khắp các lỗ, trong khi mô cấy chỉ sử dụng được một lượng nhỏ chất dinh dưỡng ở phạm vi hẹp quanh mẫu nên hệ số hấp thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy trong môi trường thạch thấp. Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút. - Môi trường bán rắn chỉ sử dụng được một lần, không cho phép thay đổi thành phần môi trường cho những giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật vi nhân giống, đòi hỏi mẫu cấy phải được cấy chuyền liên tục. - Để hòa tan agar, ta cần sử dụng một nhiệt lượng để nâng nhiệt độ lên 60oC, kết hợp với giá thành agar hiện nay tương đối cao đã làm giảm hiệu quả kinh tế của việc sử dụng agar vào nhân giống in vitro. - Khi đặt mẫu vào môi trường thạch, mẫu sẽ phát triển không đồng đều do có những vị trí trên mẫu không được tiếp xúc với môi trường. Ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường thạch, sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ không đều do sự trao đổi khí, gradient của các hợp chất gây độc, chất ức chế mà thực vật tiết ra môi trường không giống nhau ở những vị trí tiếp xúc khác nhau giữa khối mô sẹo và môi trường Những 36 nhược điểm trên đã đưa đến yêu cầu về một hệ thống nuôi cấy mới phù hợp hơn, đáp ứng những đòi hỏi ngày càng cao của công tác nhân giống in vitro. Trước tình hình đó, hệ thống nuôi cấy sử dụng môi trường lỏng tỏ ra có triển vọng hơn cả. Hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng môi trƣờng lỏng tĩnh Nuôi cấy lỏng là một cách thức lý tưởng cho mục tiêu giảm chi phí và tự động hóa vi nhân giống thực vật. Nuôi cấy lỏng cung cấp điều kiện nuôi cấy đồng nhất hơn, môi trường có thể thay mới mà không cần phải chuyển mẫu sang bình chứa khác, có thể thực hiện khử trùng bằng vi lọc và việc cọ rửa chai lọ sau khi nuôi cấy cũng đơn giản hơn. So với việc nuôi cấy trên thạch, nuôi cấy lỏng cho phép sử dụng những loại bình nuôi cấy dung tích lớn từ đó giảm được số lần cấy chuyền. Mô của một số loài thực vật biểu hiện tốt hơn trên môi trường lỏng so với trên môi trường đặc, chẳng hạn như chồi cây đào (Prunus persica), phôi soma lúa mì (Triticum aestivum), và phôi soma cây bông (Gossypium hirsutum). Nuôi cấy lỏng thực ra đã có từ rất lâu đời. Trong thời kỳ đầu, Haberlandt đã tiến hành nuôi cấy mô lá của các cây đơn tử diệp bằng môi trường lỏng. Việc nghiên cứu nồng độ khoáng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được thực hiện với môi trường lỏng. Tuy nhiên, môi trường lỏng được sử dụng trong thời kỳ này đơn giản chỉ là môi trường lỏng tĩnh. Hệ thống nuôi cấy lỏng có nhiều lợi điểm không thể phủ nhận: - Môi trường nuôi cấy lỏng có độ đồng nhất cao do các chất tinh dưỡng khuếch tán đều trong dung môi lỏng, tạo điều kiện để mẫu cấy sử dụng triệt để chất dinh dưỡng sẵn có. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt mẫu được tiếp xúc trực tiếp với môi trường nên việc hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả hơn, cây sinh trưởng tốt hơn, thời gian nuôi cấy có thể được rút ngắn. - Nuôi cấy lỏng cho phép kiểm soát các thông số hóa lý một cách chủ động, đây là một điều kiện cần có để thực hiện tự động hóa. Do vậy, nuôi cấy lỏng rất phù hợp khi triển khai ra quy mô công nghiệp. - Chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm thấp hơn so với nuôi cấy bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động. Bên cạnh những mặt mạnh, việc nuôi cấy lỏng cũng vấp phải nhiều khó khăn, nhất là khả năng thoáng khí kém, hiện tượng thủy tinh thể và đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Để hạn chế những nhược điểm này, một số phương pháp đã được đề xuất như bổ sung thêm các giá đỡ mẫu nuôi cấy trong môi trường 37 lỏng tĩnh, bổ sung môi trường lỏng vào môi trường thạch đã sử dụng trước đó, và sử dụng các bioreactor sục khí. Một vấn đề lớn thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là sự nhiễm vi sinh vật. Nấm mốc, vi khuẩn và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân gây mất nguồn mẫu thực vật chủ yếu trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự nhiễm vi sinh vật sẽ là rất nhanh và nghiêm trọng hơn cả so với các loại môi trường khác. Sự gây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm, để hạn chế nguy cơ bị nhiễm, người ta thường tạo một không gian vô trùng bằng dòng không khí được lọc qua các lớp màng lọc. Trước hai mặt được và chưa được của hệ thống này, các nhà khoa học tích cực nghiên cứu phát triển những hệ thống mới để vừa tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng, vừa khắc phục những yếu điểm cố hữu của nó. Hệ thống nuôi cấy lỏng sử dụng giá thể Giá thể được sử dụng với mục đích nâng một phần hoặc toàn bộ mẫu cấy lên khỏi môi trường lỏng mà vẫn đảm bảo dinh dưỡng cho cây nhờ sự thẩm thấu của các cấu tử dinh dưỡng qua giá thể đến mẫu. Các loại vật liệu làm giá thể rất đa dạng, từ những vật liệu dễ kiếm như bông gòn, giấy lọc đến những vật liệu cao cấp như rockwool, oasis, v.v. Điển hình cho giá thể cao cấp là rockwool. Bản chất của rockwool là thể sợi (wool) có nguồn gốc từ đá (rock). Đá, chủ yếu là đá basalt, được đun chảy ở nhiệt độ 1600oC, được đổ vào các ống và quay với tốc độ cao, biến dịch đá lỏng thành các sợi. Chiều dài và đường kính sợi được kiểm soát thông qua tốc độ quay, nhiệt độ nung và một số các yếu tố khác. Khi nghiên cứu trên đối tượng cây chuối Nam Định, Nhut (2002) đã chứng minh rằng cây nuôi cấy trên rockwool và oasis có chiều cao thân và số lượng lá nhiều hơn hẳn các hệ thống sử dụng agar truyền thống. Hệ thống nuôi cấy lỏng lắc Mẫu cấy được đặt trong môi trường lỏng và được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ thích hợp. Chuyển động lắc tạo điều kiện cho không khí tự do khuếch tán vào môi trường tốt hơn, tăng lượng oxygen hòa tan trong môi trường, thỏa mãn nhu cầu hô hấp của cây. Tewary P.K. và Oka S. (1999) đã sử dụng hệ thống lỏng lắc để nhân giống chồi bên cây dâu tằm với tốc độ lắc 120 vòng/phút. Kết quả thu được sau 6 tuần rất tốt: 90% mẫu cảm ứng tạo chồi mới với chiều dài mỗi chồi khoảng 3,3cm. 38 Hệ thống nuôi cấy lỏng trong bioreactor Khi nuôi mẫu trong dung dịch lỏng kết hợp với tăng cường độ thoáng khí, mẫu cấy vẫn hô hấp tốt dù bị ngập trong dung dịch. Có thể mở rộng quy mô của hệ thống này bằng cách sử dụng các bình chứa dung tích lớn (hệ thống bioreactor cấp khí cưỡng bức) để nhân sinh khối hay thu hợp chất thứ cấp từ thực vật. Các phương pháp tạo điều kiện thoáng khí khi nuôi cấy lỏng trong các bioreactor gồm có: sục khí cưỡng bức, ngập chìm tạm thời, v.v. Hiện nay có rất nhiều hệ thống bioreactor sục khí được thiết kế nhằm nhân giống cây hoa lily với số lượng lớn. Trong các hệ thống này, mặc dù vảy củ lily chìm xuống đáy bình nhưng sự tăng trưởng của chúng vẫn rất tốt. E. Jiménez và cộng sự (1999) đã chứng minh rằng hệ thống ngập chìm tạm thời cho hiệu quả tạo củ khoai tây bi tốt hơn so với môi trường bán rắn truyền thống: củ bi được hình thành trên tất cả các đốt thân sau 9 tuần nuôi cấy, trung bình khoảng 3,1 củ/đốt. Trọng lượng tươi và kích thước củ cũng lớn hơn củ hình thành trên môi trường thạch. Tóm lại, các hệ thống cải tiến đều có những tiến bộ và hầu hết đều tập trung giải quyết vấn đề thoáng khí khi nuôi cấy trong môi trường lỏng. Ngoài ra, một yếu tố không thể thiếu cần cân nhắc khi thiết kế các hệ thống mới là hiệu quả kinh tế của hệ thống. Có như vậy, hệ thống mới được nhanh chóng thương mại hóa và có khả năng cạnh tranh với những hệ thống nhân giống truyền thống khác. Các hệ thống bioreactor nuôi cấy in vitro được tìm hiểu trong đề tài này cũng hướng đến các yếu tố đó với mục đích chọn lựa được hệ thống nuôi cấy phù hợp cho một số đối tượng thực vật cụ thể. 2.9. Các yếu tố ảnh hƣởng trong quá trình nuôi cấy ngâm chìm định kỳ Thời gian ngập chìm Thời gian để mẫu ngập trong môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng do nó ảnh hưởng đến sự hấp thu chất dinh dưỡng của mô thực vật cũng như tham gia điều khiển hiện tượng thủy tinh thể. Yếu tố này thay đổi theo đối tượng nuôi cấy, mục đích nuôi cấy và loại hệ thống ngập chìm được sử dụng. Thời gian ngập chìm dài (1 giờ ngập trong chu kỳ 6 giờ) tỏ ra hiệu quả cho sự hình thành củ khoai tây bi, trong khi thời gian ngập chìm rất ngắn (1 phút ngập trong chu kỳ 12 giờ) lại tốt cho sự hình thành phôi soma ở cây cà phê (C. arabica) và cao su. Ngoài ta, tần số ngập chìm cao (30 giây ngập, 30 giây rút) cho hiệu quả nhân chồi cao khi nuôi cấy chồi nho trong hệ 39 thống bioreactor nghiêng lắc. Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần số ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây “serviceberry”. Cây bị mọng nước khi xử lý ở chế độ ngập chìm 5 phút/30 phút (5 phút ngập trong chu kỳ 30 phút), và không bị mọng nước khi xử lý ngập chìm 5 phút/60 phút. Tuy nhiên, chế độ xử lý trước (5 phút/30 phút) lại tốt cho sự nhân về số lượng chồi. Từ kết quả này, tác giả đề nghị sử dụng chu kỳ 5 phút/30 phút ở giai đoạn đầu nuôi cấy để nhân số lượng và áp dụng chu kỳ sau 5phút/60 phút để duy trì chất lượng chồi. Qua thí nghiệm này, tác giả cũng quan sát được khoảng thời gian thích nghi của thực vật khi thời gian ngập chìm bị thay đổi. Khi chuyển từ tần số cao sang tần số thấp, một số chồi bị stress và bị chết, nhưng phục hồi trở lại sau đó. Thể tích môi trƣờng dinh dƣỡng Thể tích môi trường cần được tối ưu hóa khi nuôi cấy bằng bioreactor ngập chìm mà không thay môi trường mới (bioreactor nghiêng lắc, bình đôi hoặc RITA®). Lorenzo và cộng sự (1998) xác định thể tích môi trường 50 ml cho một mẫu cấy là tối ưu khi nhân chồi Saccharum spp. trong hệ thống bioreactor bình đôi BIT®. Khi tăng dần thể tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, thể tích môi trường sử dụng không ảnh hưởng lên chiều dài chồi. Thể tích nhiều hơn tỏ ra không hiệu quả cho nhân chồi. Giải thích hiện tượng này, tác giả cho rằng trong quá trình nuôi cấy, thực vật tiết ra ngoài tế bào những hợp chất có tác dụng kích thích tạo chồi, và với thể tích nuôi cấy lớn, lượng chất này có thể bị pha loãng đi. Cũng sử dụng hệ thống nuôi cấy tương tự, Escalona và cộng sự (1999) chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy. Sử dụng thể tích lớn hơn đã làm giảm hệ số nhân chồi trong trường hợp này. Thể tích bình nuôi cấy Tất cả các hệ thống bioreactor ngập chìm đều có thể tích và không gian thoáng khí bên trên lớn hơn các bình nuôi cấy truyền thống. Hơn nữa, có thể áp dụng các loại bình chứa khác nhau với thể tích từ 1 đến 20 l để thiết lập hệ thống. Krueger và cộng sự (1991) chứng minh rằng thể tích bình chứa lớn (7 l) có ảnh hưởng tích cực lên hiệu quả vi nhân giống cây “serviceberry”, đặc biệt là hệ thống giúp tránh được hiện tượng mẫu cấy tập trung quá nhiều, đồng thời kích thích kéo dài chồi so với các bình cấy 40 dung tích nhỏ (140 ml). Monette (1983) đã chỉ ra rằng khi nuôi cấy chồi cây nho trong những bình chứa lớn sẽ thu được chồi có kích thước dài hơn. Chồi cây nho tăng trưởng rất nhanh trong môi trường lỏng sử dụng hệ thống bioreactor nghiêng lắc (trong những hộp vuông Mason 910 ml, miệng rộng) so với trong bình tam giác dung tích 125 ml do mẫu không bị dồn quá nhiều một chỗ, dễ dàng thu mẫu sau nuôi cấy và ngăn chặn được sự thiếu hụt chất dinh dưỡng. Việc sử dụng những vật chứa lớn để nuôi cấy cho phép sử dụng nhiều môi trường, điều này có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành và phát triển của thực vật nuôi cấy bằng bioreactor. Sự thoáng khí tự nhiên và thoáng khí cƣỡng bức Thí nghiệm vi nhân giống cây chuối trong môi trường lỏng đã chứng minh rằng sự thiếu hụt oxygen khi nuôi cấy lỏng là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành những cây con có kích thước nhỏ. Cung cấp oxygen bằng phương pháp sục khí có thể kích thích cây tăng trưởng nhưng phương pháp ngập chìm tạm thời tỏ ra có hiệu quả nhất trong trường hợp này.Hệ thống ngập chìm tạm thời có thay môi trường mới bằng áp lực khí sẽ tạo ra điều kiện thoáng khí cưỡng bức và làm mới bầu khí quyển trong bình cấy sau mỗi chu kỳ chìm ngập. Theo Teisson và Alvard (1995), không khí được thay mới trong quá trình chất lỏng di chuyển và do một lượng khí mới được cấp vào từ máy bơm khí. Trong điều kiện cấp khí bắt buộc, hàm lượng khí và độ ẩm tương đối sinh ra trong bình cấy có thể có ảnh hưởng tích cực đến việc nuôi cấy. Độ ẩm tương đối sinh ra do ảnh hưởng của trao đổi khí có tác dụng kích thích sự thoát hơi nước ở thực vật, giúp cây in vitro có khả năng thích nghi tốt hơn khi chuyển ra môi trường ex vitro 2.10. Ảnh hƣờng hệ thống ngâm chìm định kỳ đến chất lƣợng cây trồng Đặc điểm hình thái của thực vật sản xuất từ các bioreactor ngập chìm tạm thời : Lá của những chồi phát sinh trong hệ thống ngập chìm tạm thời có kích thước nhỏ hơn lá từ chồi nuôi cấy trong môi trường lỏng. Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong bioreactor thường có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn quanh tâm. Do đó, một số chồi con có kích thước không lớn và cần được kéo dài trong cùng hệ thống trước khi cho ra rễ ngoài ống nghiệm. Ngược lại, chồi cây “cow tree” có 41 thân dài hơn và ra nhiều lá hơn khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch. Chồi cây “serviceberry” nuôi cấy trong hệ thống này cũng dài và nặng hơn chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Chồi cây nho và Amelanchier alnifolia khi nuôi cấy trong hệ thống bioreactor nghiêng-lắc có kích thước lớn và ra rễ nhanh hơn so với khi nuôi cấy trên thạch. Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn. Hệ thống ngập chìm tạm thời có ảnh hưởng rất tốt đến sự phát triển phôi soma của các cây Citrus, cho phép hình thành lá mầm và vỏ phân sinh ngọn (protoderm) ngay trong hệ thống. Điều này không xảy ra được trong nuôi cấy huyền phù tế bào. Hình thái của các phôi này rất giống với phôi nhân. Mặt khác, ở các cây cà phê, cao su, chuối, phôi soma tạo ra trong hệ thống RITA® có chất lượng tốt hơn phôi hình thành trên môi trường thạch hay lỏng trong các bình erlen. Ở cao su, tỷ lệ phôi soma bất thường giảm đi phân nửa khi nuôi cấy bằng hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch. Hệ thống này cũng đã được áp dụng thành công lần đầu tiên khi cho phôi soma C. arabica nảy mầm trong môi trường lỏng. Mật độ 1600 phôi/1 ảnh hưởng tốt lên hình thái nảy mầm của phôi do kích thích sự kéo dài đỉnh phôi (4-5 mm), tăng trọng lượng tươi (100%) và giảm diện tích lá mầm. Ba yếu tố này sẽ có liên quan đến tỷ lệ phát triển thành cây con cũng như hệ số tăng trưởng của cây con sau này. Hiện tƣợng thuỷ tinh thể Vi nhân giống trong môi trường lỏng giúp cho sự hấp thu chất dinh dưỡng thực hiện dễ dàng hơn và do đó kích thích cây tăng trưởng, tuy nhiên, hiện tượng mọng nước cũng thường xảy ra. Hiện tượng này xuất hiện khi cho tiếp xúc liên tục với chất lỏng. Đặc trưng của thực vật bị mọng nước là mô có những rối loạn về hình thái và sinh lý như biểu hiện mọng nước, có màu trong như thủy tinh, chồi sinh trưởng bất thường, đặc biệt là những dị thường ở lá. Có thể giảm bớt hiện tượng mọng nước bằng cách tăng cường độ thoáng khí, cho mô tiếp xúc gián đoạn với môi trường lỏng. Cả hai yếu tố này đều được thỏa mãn với hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 2.11. Ảnh hƣởng của hệ thống ngập chìm tạm thời đến chi phí sản xuất Những tính toán ban đầu đã cho thấy hệ thống có tác dụng làm tăng hiệu quả của việc nhân giống trong môi trường lỏng. Khi nhân chồi mía (Saccharum spp.), Lorenzo 42 và cộng sự (1998) đã chứng minh được rằng sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời giúp giảm được 46% chi phí so với quy trình nuôi cấy chuẩn trên môi trường thạch. Chi phí tiết kiệm được chủ yếu nhờ vào việc giảm được nhân công và không gian sử dụng cho nuôi cấy mô. Ở cây dứa, chồi được nhân trong hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời có tỷ lệ nhân gấp 100 lần so với nuôi cấy trên thạch trong khoảng thời gian 4 tháng. Quy trình này giúp giảm 20% chi phí sản xuất tính cho 1 cây so với phương pháp nuôi cấy lỏng truyền thống. Theo tác giả, yếu tố dẫn đến thành công là ở việc giảm được số lượng bình chứa, dụng cụ thao tác; giảm thiểu các công đoạn cấy, trồng; loại bỏ công đoạn ra rễ in vitro và hạn chế được mức độ nhiễm vi sinh vật. Khả năng duy trì mẫu chồi Pinus radiata trong thời gian dài (18 tháng) mà không cần cấy chuyền của hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời có sự thay mới môi trường giúp giảm chi phí lao động và mở ra khả năng tự động hóa sản xuất, kết quả cuối cùng là giảm được giá thành cho cây vi nhân giống . Từ hệ thống này (sử dụng bình chứa dung tích 600 ml), chồi được thu hoạch với sản lượng 672 chồi/giờ so với khoảng 1100 chồi thu hoạch từ 1 m2 diện tích môi trường thạch trong 1 tháng. Theo tỷ lệ này, hệ thống chỉ tiêu tốn 1/7 chi phí so với quy trình sản xuất Pinus radiata theo phương pháp cấy chuyền trên thạch thông thường. Trong sản xuất phôi soma, công đoạn cho phôi nảy mầm là tốn kém nhất do mất nhiều lao động trong việc cấy chuyền. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm có thể được sử dụng để vừa nhân phôi, vừa cho phôi nảy mầm. Sản xuất phôi soma nảy mầm trong hệ thống kết hợp với gieo mầm trực tiếp ra đất giúp giảm 13% cho phí thao tác và 6,3% diện tích so với chi phí khi sử dụng kỹ thuật đưa cây nuôi cấy từ môi trường thạch ra vườn ươm. Ngoài ra, hệ thống này giúp rút ngắn giai đoạn cho phôi trưởng thành và nảy mầm ba tháng. Hệ thống ngập chìm tạm thời hiện nay đang từng bước được thương mại hóa. CIRAD sử dụng hệ thống RITA® để sản xuất một lượng lớn cây giống lai C.abrabica F1 ở Trung Mỹ và Tanzania. Một nhóm các nhà nghiên cứu thuộc Trung tâm Sinh học Thực vật ở Centro de Bioplantas ở Ciego de Avila, Cuba đang phát triển một quy trình nhân giống thương mại trên hai đối tượng thực vật là cây mía và cây dứa sử dụng phương pháp nhân mô phân sinh trong hệ thống bình đôi BIT®. Tóm lại, hệ thống ngập chìm tạm thời có những tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn nuôi cấy chồi và phôi soma của thực vật. Hệ số nhân và sự tăng trưởng ở 43 thực vật nuôi cấy trong hệ thống này thường cao hơn nuôi cấy trên thạch hoặc trong các hệ thống bioreactor khác. Cây con tái sinh và phôi soma tạo thành có chất lượng tốt hơn, khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên và tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm cũng cao hơn. Hệ thống này kết hợp được hai ưu điểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy rắn. Trong môi trường lỏng, mô thực vật hấp thu chất dinh dưỡng dễ dàng hơn, trong khi khả năng trao đổi khí của thực vật tốt hơn trên môi trường rắn. Khi sử dụng hệ thống để nuôi cấy mô thực vật, thời gian và tần số ngập chìm là các thông số quan trọng nhất cần được xác định. Việc tối ưu hóa các thông số này trên từng đối tượng thực vật và ở từng đối tượng nuôi cấy sẽ cho hiệu suất nuôi cấy cao hơn, cho phép điều khiển tốt hơn sự phát sinh hình thái của thực vật cũng như khống chế được hiện tượng mọng nước thường xảy ra khi nuôi cấy lỏng. Ngoài ra, thành phần môi trường dinh dưỡng sử dụng cũng như mật độ mẫu cấy cũng là những yếu tố quan trọng, tuy nhiên những yếu tố này vẫn chưa được hiểu cặn kẽ và do đó cần có nhiều nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn nữa. Không những ứng dụng tốt trong nuôi cấy mô, hệ thống ngập chìm tạm thời còn có thể trở thành công cụ đắc lực cho việc nghiên cứu cơ chế của các quá trình trao đổi chất. Chẳng hạn như những nghiên cứu trên cây cà phê (Coffea spp.) đã cho thấy rằng thời gian ngập chìm có ảnh hưởng đến hiện tượng mọng nước và trạng thái nước của mô sẹo và phôi soma. Chính xác hơn, các thông số về nước (hàm lượng, thế nước) có liên quan mật thiết đến hiện tượng mọng nước và chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của tần số và thời gian xử lý ngập. Ở cây cao su, hệ thống cho phép nghiên cứu những cảm ứng của hiện tượng stress oxygen hóa trong giai đoạn ngập khi nuôi cấy phôi. Các dạng hệ thống ngập chìm khác nhau có thể được sử dụng thích hợp trong việc nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần không khí trong khí quyển đến sự sinh trưởng của thực vật. Từ khi Harris và Mason (1983) công bố hệ thống ngập chìm đầu tiên, đã có một số hệ thống bán tự động hoạt động theo nguyên lý tương tự được chế tạo, và vấn đề này ngày càng thu hút nhiều sự quan tâm. Hệ thống đã được đơn giản hóa rất nhiều so với những hệ thống bioreactor đầu tiên và có thể trở thành một phương pháp nuôi cấy thực vật in vitro phổ biến. Các hệ thống hiện nay đã giúp giảm được chi phí sản xuất và hoàn toàn thích hợp để đưa vào sản xuất lớn. Những nghiên cứu trên hệ thống này 44 vẫn tiếp tục được thực hiện để giảm chi phí đồng thời tối ưu hóa điều kiện sản xuất những chủng loài thực vật khác nhau 2.12. Các nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tƣợng cây dứa Nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tƣợng cây dứa ở trong nƣớc Chưa thấy có cơ quan nào nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa được công bố Nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tƣợng cây dứa ở ngoài nƣớc : Năm 1999, Esscalo và cộng sự đã nghiên cứu trên đối tượng cây dứa. Nhiều nghiên cứu tiếp theo đã cho thấy hiệu quả của việc sử dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa : số chồi thu được trên 1 chồi ban đầu là 30 (Plant Cell Rep,2003), giá thành hạ, chi phí nhân công thấp, cây trồng khi đưa ra vườn cũng phát triển tốt hơn (Plant Cell Rep, 2005), 45 Phần3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006 tại phòng nuôi cấy mô của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM 3.2 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế hệ thống điều khiển tự động cho bioreactor ngâm chìm định kỳ : Dựa trên nguyên lý hoạt động của bioreactor TIB (dòng dung dịch được chuyển qua lại giữa bình môi trường và bình nuôi cấy theo một quy trình). - So sánh hiệu quả nhân chồi dứa giữa TIB và nuôi cấy bằng bioreactor sục khí - Khảo sát thời gian ngâm chìm định kỳ thích hợp cho sự phát triển chồi của cây dứa 3.3. Vật liệu Trang thiết bị Tủ cấy, nồi hấp,máy đo pH, cân điện tử, đèn huỳnh quang, timer Omron, , máy bơm khí (Resun, TQ),.... Dụng cụ Bình erlen 2l, kẹp, kéo, dây silicon, film lọc vô trùng Satorius(0,2 m), adapter 220-110V, pipet 5ml, co L.... Mẫu cấy Mẫu cấy l cây dứa được nuôi cấy trong phòng tăng trưởng của bộ môn CNSH trong thời gian 6 tháng. Mẫu dứa invitro được nuôi cấy trong môi trường MS+30g/l đường sucrose + 2mg/l BA 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí tự tạo Hệ thống được thiết kế với yêu cầu đảm bảo vô trùng và tự động - Dùng nút cao su số 9 đục 2 lỗ có kích thước vừa với pipet 5ml và đầu co L( đường kính 1cm). Dùng pipet 5ml và co L đút vô 2 lỗ trên nút cao su. - Dùng dây silicone tạo thành vòng tròn, bịt kín một đầu. Trên ống dây silicone dùng kim đục có lỗ với kích thước <=2mm. Nối đầu còn lại với pipet 5ml 46 -Gắn một đầu dây silicone vào ống pipet 5ml, đầu dây silicone còn lại được bịt kín nên khí đi vào sẽ thoát qua theo đường các lỗ kim trên thân ống silicone. - Khí được sục qua đầu lọc 2 m , khí ra cũng được đưa qua đầu lọc 2 m tạo thành hệ thống kín vô trùng. Hình 3.1- Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor sục khí hình cầu kiểu Hàn Quốc 47  Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động Hệ thống được thiết kế gồm 2 bình thông nhau, môi trường dinh dưỡng được di chuyển qua lại một cách tự động. Toàn bộ hệ thống phải đảm bảo vô trùng. Hình 3.2-Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ *Giải thích quá trình vận hành: bơm đưa dòng khí theo hướng mũi tên qua đầu lọc vô trùng tạo một áp suất trong bình, áp suất tác động lên bề mặt chất lỏng và đẩy chất lỏng theo ống pipet qua bình chứa mẫu. Tắt máy bơm khí (ở hình i), dung dịch 48 được ữ trong bình mẫu một thời gian quy định. Sau đó, bật máy bơm để tạo dòng khí theo hình mũi tên(hình h) tạo áp suất lên bề mặt chất lỏng trong bình mẫu, đẩy dung dịch từ bình mẫu trở về bình môi trường ban đầu, giữ dung dịch trong bình môi trường trong một thời gian quy định. 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 8 chồi dứa hủy đỉnh sinh trưởng. Các bƣớc tiến hành : Các bước tiến hành sau đều giống nhau ở các thí nghiệm - Bước 1: Hấp khử trùng riêng từng bộ phận của bình bioreactor - Bước 2: Hủy đỉnh sinh trưởng của 8 chồi dứa và đưa chồi dứa đã hủy đỉnh sinh trưởng bỏ vào bình bioreactor. - Bước 3 : Gắn đầu lọc vào 2 đầu dây silicone tạo thành hệ thống kín vô trùng - Bước 4 : Dùng băng keo quấn quanh nút cao su thật chặt. Từ bước 2 đến bước 4 thực hiện trong tủ cấy vô trùng. *Các chỉ tiêu theo dõi : -Trọng lượng tươi trung bình(g) : Trọng lượng tươi của tất cả các mẫu sau khi loại bỏ hết nước bám quanh mẫu/8 -Trọng lượng khô trung bình(g) : Trọng lượng tươi tất cả các mẫu được sấy ở nhiệt độ 37oC trong 72 giờ/tổng số mẫu -Hệ số nhân chồi: tổng số chồi tạo ra/8. -Chiều cao chồi(cm) : tính từ rễ cho đến lá cao nhất của chồi dứa. Thí nghiệm 1:Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí. Thí nghiệm 1a: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreator sục khí liên tục 49 Bảng 3.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1a Nghiệm thức Thể tích môi trƣờng(lít) 1 1 2 1,5 Thí nghiệm 1b: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí gián đoạn (10phút/1chu kỳ) Bảng 3.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1b Nghiệm thức Thể tích môi trƣờng(lít) 1 1 2 1,5 * Ngoài các bước tiến hành chung ở trên cần tiến hành gắn thêm timer vào hệ thống, bơm sục khí gián đoạn 10 phút/1 chu kỳ ( 10 phút sục khí, 10 phút nghỉ) Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian ngâm chìm định kỳ thích hợp cho việc nhân chồi cây dứa. Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2 Nghiệm thức Thời gian ngâm chìm(phút/giờ) 1 10 phút/1giờ 2 10 phút/2giờ 50 * Ngoài các bước tiến hành chung ở trên cần tiến hành gắn bình TIB vào hệ thống điều khiển tự động đã được thiết kế. 3.5 Xử lý số liệu : Số liệu được xử lý trên phần mềm Statgraphic 7.0 51 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí và ngâm chìm định kỳ (TIB) 4.1.1Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí Hệ thống được thiết kế đã hoạt động tốt. Khí được sục qua các lỗ kim trên thành ống silicone tạo thành các bọt khí, cung cấp oxy cho môi trường. Hình 4.1-Bioreactor sục khí 4.1.2 Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động Dựa trên nguyên lý hoạt động của bioreactor ngâm chìm định kỳ(TIB) mạch điện được thiết kế với mục đích tự động hoá quá trình trên : T4A T2B T1 T1A T3A T2B T1B T2 T3 T3A T3B T4 Bom B Van V K CHÚ THÍCH -T: timer -1,2,3,4:số thứ tự timer -Kí hiệu A :cổng ra của timer -Kí hiệu B : cổng ra của timer -Bom : máy bơm sục khí - Van : van solenoid 3 lỗ -K : công tắc nguồn -Kí hiệu :thường đóng -Kí hiệu :thường mở -Kí hiệu : cuộn dây của timer. 52 Hình 4.2- Sơ đồ mạch điện thiết kế cho TIB tự động *Giải thích mạch điện : Khi đóng nguồn thì T1 hoạt động để bơm khí vào bình 1 trong một thời gian quy định, sau đó T1 tắt và T2 mở làm cho máy bơm ngừng hoạt động trong một thời gian đã định. Tiếp đó T2 nghỉ và T3 hoạt động đồng thời valve 3 chiều cũng mở theo làm dòng khí đi qua bình 2(thay vì qua bình 1 như lúc trước) sau trong một thời gian đã định. Tiếp đó, T3 nghỉ và bơm ngừng hoạt động đồng thời T4 hoạt động làm cho máy bơm ngừng hoạt động trong một thời gian đã định . Cuối cùng T4 nghỉ và T1 lại họat động, lặp lại chu kỳ như trên. Hệ thống tự động này tiết kiệm được 1 máy bơm thay vì 2 máy bơm nhờ sử dụng van solenoid 3 lỗ, đồng thời tiết kiệm được sức lao động trong quá trình canh thời gian để chạy máy bơm, bên cạnh đó có thể chủ động được thời gian cho môi trường qua lại giữa 2 bình một cách hiệu quả. Hình 4.3-Hộp điều khiển tự động TIB tự chế 53 4.2 Kết quả thí nghiệm. 4.2.1 Thí nghiệm 1 : Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí liên tục. Thí nghiệm 1a:Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreator sục khí liên tục Bảng 4.1- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1a Nghiệm thức MT lỏng sục khí liên tục 1L MT lỏng sục khí liên tục 1,5L Trọng lƣợng tƣơi trung bình(g) 3,12 3,75 Trọng lƣợng khô trung bình(g) 0,3 0,35 Hệ số nhân chồi 12,5 13,5 Chiều cao chồi(cm) 2,15 2,32 Đặc điểm hình thái Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Bảng 4.2-Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí liên tục Nghiệm thức Hệ số nhân chồi SỤC LIÊN TỤC THỂ TÍCH 1L 10,97a SỤC LIÊN TỤC THỂ TÍCH 1,5L 14,10b 54 Nhận xét : -Kết quả nhận được cho thấy với cùng một mẫu cây dứa như nhau khi xử lý với thể tích khác nhau cho kết quả tăng chồi trung bình khác nhau. Khi phân tích trên thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 2 phương pháp. -Mẫu chồi dứa trong bình thể tích 1,5 lít có số chồi tăng hơn so với thể tích 1 lít. Giải thích điều này là do trong thể tích 1,5 lít lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nhân chồi nhiều hơn so với thể tích 1 lít. Với hệ thống ngâm chìm định kỳ, Escalona và cộng sự (1999) chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy. Sử dụng thể tích lớn hơn đã làm giảm hệ số nhân chồi. Lorenzo và cộng sự (1998) khi nhân chồi Saccharum spp. trong hệ thống bioreactor bình đôi BIT® cũng đã chứng minh khi tăng dần thể tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy. Sục khí liên tục Sục khí gián đoạn 10’/1lần Hình 4.4-Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình bioreactor sục khí liên tục và sục khí gián đoạn. Thí nghiệm 1b: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí gián đoạn (10phút/1chu kỳ) 55 Bảng 4.3-Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1b Bảng4.4-Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí gián đoạn Nhận xét : -Kết quả trên cho thấy phương pháp sục khí gián đoạn với 2 thể tích khác nhau cho kết quả thống kê khác nhau. Nghiệm thức Sục khí gián đoạn 1L Sục khí gián đoạn 1,5L Trọng lƣợng tƣơi trung bình (g) 0,71 0,96 Trọng lƣợng khô trung bình (g) 0,078 0,11 Hệ số nhân chồi 11 7,25 Chiều cao chồi(cm) 1,3 1,63 Đặc điểm hình thái Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Nghiệm thức Hệ số nhân chồi SỤC KHÍ GIÁN ĐOẠN 1L 11,13 a SỤC KHÍ GIÁN ĐOẠN 1,5L 7,24 b 56 -Trong phương pháp sục khí gián đoạn lượng oxy cung cấp cho mẫu cây dứa không đủ. Do vậy, bình 1,5L có thể tích lớn hơn nên lượng oxy trung bình cung cấp cho mẫu dứa không bằng lượng oxy trung bình cung cấp cho bình 1L. Kết quả là mẫu cây dứa không thể phát triển cũng như sử dụng chất dinh dưỡng một cách hiệu quả. Oxygen chỉ hòa tan một phần trong nước (0,25 mmol l-1 ở 25oC, 1 atm, oxygen chiếm 21% thể tích không khí) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxygen cần được khuếch tán vào môi trường nuôi cấy. Những yếu tố liên quan đến vấn đề hòa tan oxy gồm có độ thoáng khí, tốc độ khuấy đảo, hình dạng cánh khuấy, độ hòa trộn không khí và kết cấu của bioreactor. Ngoài ra, mức độ đảo trộn của mẫu cấy cũng là một yếu tố cần quan tâm do oxygen hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô, tế bào hấp thu. Tóm lại, để đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô và tế bào thực vật, lượng oxygen hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ). Trong thực tế, người ta căn cứ vào giá trị DO2htcđ để thiết kế bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn (Leather, 1995) 4.2.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của thời gian ngâm chìm định kỳ đến khả năng nhân chồi dứa bằngTIB. 57 Bảng 4.5-Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 Nghiệm thức MT lỏng ngâm chìm định kỳ 10'/1h MT lỏng ngâm chìm định kỳ 10'/2h Trọng lƣợng tƣơi trung bình(g) 2,07 4,73 Trọng lƣợng khô trung bình(g) 0,15 0,287 Hệ số nhân chồi 14,83 21,25 Chiều cao chồi (cm) 2,27 2,76 Đặc điểm hình thái Cây con phát triển tốt, lá xanh ,mềm,không tích nước, không có hiện tượng thủy tinh thể Cây con phát triển tốt, lá xanh ,mềm,không tích nước, không có hiện tượng thủy tinh thể 58 Chồi dứa sau 4 ngày nuôi Chồi dứa sau 4 tuần nuôi Hình 4.5- Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình TIB 10’/2h 59 Bảng 4.6-Ảnh hưởng của yếu tố thời gian ngâm chìm đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor TIB Nhận xét: Hiệu quả nhân chồi ở 2 nghiệm thức là khác nhau. Hệ số nhân chồi trung bình của nghiệm thức 10’/2h(10 phút trong chu kỳ 1h) có kết quả vượt trội so với nghiệm thức 10’/1h. Kết quả trên cũng là một điều hợp lý. Vì cây dứa vốn là loại thực vật thích hợp với điều kiện khô ráo thoáng khí. Do vậy khi ngâm chìm với tần số 10’/1h làm cho cây dứa phát triển không tốt, hiệu quả nhân chồi không cao. Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần số ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây “serviceberry”. Cây bị mọng nước khi xử lý ở chế độ ngập chìm 5 phút/30 phút (5 phút ngập trong chu kỳ 30 phút), và không bị mọng nước khi xử lý ngập chìm 5phút/60phút. Tuy nhiên, chế độ xử lý 5 phút/30 phút lại tốt cho sự nhân về số lượng chồi. Từ đó, tác giả đề nghị sử dụng chu kỳ 5phút/30phút ở giai đoạn đầu nuôi cấy để nhân số lượng và áp dụng chu kỳ sau 5phút/60phút để duy trì chất lượng chồi. Qua thí nghiệm này, tác giả cũng quan sát được khoảng thời gian thích nghi của thực vật khi thời gian ngập chìm bị thay đổi. -Thí nghiệm cho thấy cây dứa thích hợp với điều kiện ngâm chìm 10phút/2giờ hơn so với 10phút/1h. -Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có một sự khác biệt so với một số tác giả khi thiết lập hệ thống : sử dụng bông gòn lót ở mặt dưới đáy giúp cho việc giữ môi trường dinh dưỡng lâu hơn. Còn ở thí nghiệm của một số tác giả : sử dụng một miếng lưới lót phía dưới dẫn tới chất dinh dưỡng được rút hết toàn bộ. Nghiệm thức Hệ số nhân chồi TIB 10’/1H 14,78 a TIB 10’/2H 21.32 b 60 HỆ SỐ NHÂN CHỒI 0 5 10 15 20 25 SKLT 1L SKGĐ 1L SKLT 1,5L SKGĐ 1,5L TIB 10'/1h TIB 10'/2h Hình 4.6-Biểu đồ hệ số nhân chồi CHÚ THÍCH :  SKLT 1L : sục khí liên tục 1lít  SKGĐ 1L : sục khí gián đoạn 1 lít  SKLT 1,5L : sục khí liên tục 1,5 lít  SKGĐ 1,5L : sục khí gián đoạn 1,5 lít  TIB 10’/1h : ngâm chìm định kỳ 10 phút/1 giờ  TIB 10’/2h : ngâm chìm định kỳ 10 phút/2 giờ *Nhận xét : Biểu đồ trên cho thấy phương pháp nuôi cấy ngâm chìm định kỳ (TIB) cho hiệu quả nhân chồi cao hơn hẳn so với phương pháp nuôi cấy sục khí. Đặc biệt, tần số ngâm chìm đình kỳ 10’/2h cho hiệu quả cao nhất. 61 Phần 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận : Hệ thống bioreactor đã chứng tỏ khả năng nhân sinh khối với nhiều ưu điểm. Tuy nhiên, mỗi loại cây cần có một kiểu bioreactor thích hợp.Trong các kiểu bioreactor đó, TIB đã cho thấy những ưu điểm phù hợp với sự phát triển của cây dứa. Từ những kết quả đạt được có thể kết luận như sau : +Bioreactor sau khi thiết kế đã hoạt động tốt +Hình thức nuôi cấy cây dứa bằng bioreactor sục khí là không phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thể tích môi trường 1,5L cho kết quả khả quan hơn so với thể tích 1L khi nuôi cấy bằng bioreactor sục khí liên tục. +Bioreactor sục khí liên tục giúp cho cây dứa phát triển tốt hơn so với bioreactor sục khí gián đoạn. +Bioreactor ngâm chìm định kỳ là loại bioreactor phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thời gian ngâm chìm định kỳ 10 phút/2h là thích hợp hơn cho cây dứa. +Cây con ở bioreactor ngâm chìm định kỳ có hình thái đẹp (lá xanh non, không bị đen) hơn so với bioreactor sục khí. 5.2. Đề nghị : -Cần khảo sát thêm thời gian ngâm chìm đình kỳ thích hợp nhất cho khả năng ra chồi của cây dứa. -Nghiên cứu quá trình thay đổi thành phần môi trường trong quá trình nuôi cho phù hợp với sự tăng sinh chồi của cây dứa. -Nghiên cứu cải tiến thêm hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ, khắc phục các nhược điểm của hệ thống, kiểm soát và điều khiển một cách tự động các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của cây dứa(pH, không khí, dinh dưỡng...) -Tiếp tục nghiên cứu quá trình đưa cây dứa ra ngoài vườn sau thời gian nuôi cấy thích hợp. -Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ cho các đối tượng khác như : chuối, tiêu... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM. 2.Dương Tấn Nhựt và csv, 2004. Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc gia tăng sinh khối và năng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium longiflorum). Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học, 2(4), 487 – 499 3.Nguyễn Thành Hải, 2005. Nghiên cứu chế tạo bioreactor mô hình phục vụ công tác nhân giống nhanh cây cây hoa Thu hải đường (Begonia tuberous) – một loài hoa có giá trị kinh tế cao. Khoá luận cử nhân khoa học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM 4.Nguyễn Đức Lượng và Lê Hồng Thủy Tiên, 2002. Công nghệ Tế bào. NXB Đại học Quốc gia, Tp.HCM 5. Tôn Bảo Linh, 2005. Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus). Khóa luận tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. HCM TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 6.Aitken-Christie J., 1991. Automation. In: Debergh P.C. & Zimmerman R.J.(eds). Micropropagation: Technology and Application. Kluwer Academic 7.Alvard D., Cote F.&Teisson C., 1993. Comparison of methods of liquid medium cultures for banana micropropagation. Effects of temporary immersion of explants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 32, 55 – 60. 8.Debergh P., 1988. Improving mass propagation of in vitro plantlets. In: Proceedings of the International Symposium on High Technology in Protected Cultivation, Tokyo, 45 – 57. 9.Escalona M. và csv, 1999. Pineapple (Ananas comosus L. Merr) micropropagation in temporary immersion systems.(Plant Cell R ep) 10.E. Firoozabady · N. Gutterson, (2003). Cost-effective in vitro propagation methods for pineapple (Plant Cell Rep) 11.Gawel N.J & Robacker C.D, 1990. Gossypium hirsutum genotypes in semi-solid versus liquid proliferation media. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 23, 201 – 204. 63 12.Hammerschlag F , 1982. Factors affecting establishment and growth of peach shoots in vitro. HortSci., 17, 85 – 86 13.Jones A.M. & Petolino J.F., 1988. Effects of support medium on embryo and plant production from cultured anthers of soft-red winter wheat. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 12, 243 – 261. 14.Lian M.L., Chkrabarty D. & Peak K.Y, 2002 Growth and the uptake of sucrose and mineral ions by Lilium bulblets during bioreactor culture. L. Hortic. Sci. Biotechnol, 77, 253 – 257. 15.Leathers R.R., Smith M.A.L. & Christie J.A., 1995. Automation of the bioreactor process for mass propagation and secondary metabolism. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, TheNetherlands, 187 – 214 16.Maene L. & Debergh P, 1985. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 5, 23–33. 17.Nhut D.T., 2002. In vitro growth and physiological aspects of some horticultural plantlets cultured under red and blue light – emitting diodes (LEDs). Doctoral thesis, Kagawa University, Japan 18.Peak K.Y., Chkrabarty D. & Hahn E.J, 2005. Application of bioreactor systems for large scale production of horticultural and medicinal plants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 81, 287 – 300. 19.Takayama S, 1991. Mass propagation of plants through shake and bioreactor culture techniques. Biotechnology in Agriculture and Forestry 20.Teisson C. & Alvard D, 1999. In vitro production of potato microtubers in liquid medium using temporary immersion. Potato Res., 42, 499 – 504. 64 PHẦN PHỤ LỤC  Bảng ANOVA phân tích hệ số nhân chồi trong phương pháp sục khí liên tục với thể tích khác nhau : One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------- - Data: SUCLT.nhanchoi Level codes: SUCLT.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------- - Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------- - Between groups 14.726667 1 14.726667 10.322 .0325 Within groups 5.706667 4 1.426667 ---------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 20.433333 5 0 missing value(s) have been excluded.  Bảng Multiple Range Analysis của PP sục khí liên tục(hệ số nhân chồi) Multiple range analysis for SUCLT.nhanchoi by SUCLT.T ---------------------------------------------------------------------- - Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------- - 1L 3 10.966667 X 1,5L 3 14.100000 X ---------------------------------------------------------------------- - contrast difference +/- limits 1 - 2 -3.13333 2.70869 * ---------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference. 65  Bảng ANOVA phân tích hệ số nhân chồi trong phương pháp sục khí gián đoạn với thể tích khác nhau : One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------- - Data: SUCGD.NHANCHOI (pp sục khí gián đoạn) Level codes: SUCGD.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------- - Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------- - Between groups 22.698150 1 22.698150 86.805 .0007 Within groups 1.045933 4 .261483 ---------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 23.744083 5 0 missing value(s) have been excluded.  Bảng Multiple Range Analysis của PP sục khí gián đoạn(hệ số nhân chồi) : Multiple range analysis for SUCGD.NHÂNCHOI by SUCGD.T --------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------- 1,5L 3 7.243333 X 1L 3 11.133333 X ---------------------------------------------------------------------- - contrast difference +/- limits 1 - 2 3.89000 1.15963 * ---------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference. 66  Bảng ANOVA phân tích hệ số nhân chồi trong phương pháp ngâm chìm định kỳ với thời gian ngâm chìm khác nhau : One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------- - Data: TIB.NHANCHOI (pp ngâm chìm định kỳ) Level codes: TIB.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------- - Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------- ---------- Between groups 64.137782 1 64.137782 31.206 .0050 Within groups 8.221259 4 2.055315 ---------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 72.359041 5 0 missing value(s) have been excluded.  Bảng Multiple Range Analysis của PP ngâm chìm định kỳ(TIB) : Multiple range analysis for TIB.NHANCHOI by TIB.T ---------------------------------------------------------------------- - Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------- - 10'/1h 3 14.777667 X 10'/2h 3 21.316667 X ---------------------------------------------------------------------- - contrast difference +/- limits 1 - 2 -6.53900 3.25115 * ---------------------------------------------------------------------- - * denotes a statistically significant difference.