Luận văn Tìm hiểu về một loại nấm Linh chi thu hái tại Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

ết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy từ từ xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận trong nấm Linh chi đỏ có chứa triterpenoid. 33 3.3.9.4. Phƣơng pháp định tính acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết nƣớc cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3, hơ nhẹ qua ngọn lửa. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ. 3.3.9.5. Phƣơng pháp định lƣợng polysaccharides (GLPs) Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhƣng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai đƣợc ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs. Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001) Quả thể nấm Linh chi thái mỏng hoặc tơ nấm đã sấy khô đem ngâm nƣớc ở 70 oC trong 3 giờ, tiến hành chiết thu đƣợc dịch chiết lần 1 và bã chiết lần 1. Lặp lại quá trình ngâm và chiết với bã chiết lần 1 ta thu đƣợc dịch chiết và bã chiết lần 2. Bã chiết lần 2 ngâm với cồn 80 % ở 70oC trong hai giờ ta thu đƣợc dịch chiết lần 3. Thu nhận cả 3 dịch chiết và lọc. Thu phần cặn, sấy khô và cân trọng lƣợng. Từ đó đánh giá hàm lƣợng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đỏ. 3.3.10. So sánh các thành phần dƣợc chất giữa quả thể và tơ nấm So sánh sự giống và khác nhau giữa tơ nấm và quả thể nấm Linh chi đỏ về sự tồn tại của các thành phần dƣợc chất. 3.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê Số liệu đƣợc xử lý và vẽ biểu đồ trên phần mềm Excel. Tốc độ sinh trƣởng trung bình của hệ sợi nấm trên các môi trƣờng đƣợc tính nhƣ sau: Ghi chú: - xi: tốc độ sinh trƣởng trên các môi trƣờng (cm/ngày) - ni: số quan sát Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0 để so sánh sự khác biệt về tốc độ tăng trƣởng hệ sợi nấm trên các nghiệm thức thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95 %) (Least Significant Difference). Xi = x1 + x2 + x3 + … + xi ni 34 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quan sát hình thái giải phẫu quả thể và định danh sơ bộ nấm Linh chi đỏ mọc tự nhiên tại trƣờng Đại học Nông Lâm bằng bào tử dƣới kính hiển vi 4.1.1. Hình thái giải phẫu quả thể nấm Linh chi đỏ A B Hình 4.1. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ trồng thí nghiệm A. Mặt trên quả thể nấm B. Mặt dƣới quả thể nấm Thể quả của nấm Linh chi đỏ có cuống ngắn, thƣờng đính bên, đôi khi đính tâm do quá trình liền tán mà thành. Cuống nấm hình trụ hoặc thanh mảnh (cỡ 0.3 – 0.8 cm đƣờng kính), hoặc mập khỏe (tới 2 – 3.5 cm đƣờng kính), đôi khi có uốn khúc cong quẹo. Lớp vỏ cuống láng bóng, màu đỏ – nâu đỏ phủ suốt lên bề mặt tán nấm. Chỗ đính cuống hoặc lồi lên, hoặc lõm xuống nhƣ lõm rốn. Mầm nấm có hình tròn, màu trắng. Sau 20 – 25 ngày thì mầm nấm chuyển thành hình quạt và có màu đỏ - đỏ nâu, mép nấm có màu trắng. Sau 30 – 35 ngày tiếp theo thì mép nấm màu trắng chuyển dần thành màu đỏ. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có những vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm không đồng nhất, mép nấm tròn hoặc uốn lƣợn. Tán nấm rộng từ 4 – 13cm, dày khoảng 1 – 2,5cm. Mặt trên mũ nấm có lớp vỏ cứng màu nâu đỏ nhẵn bóng hoặc gồ ghề. Mặt dƣới nấm là lớp bào tầng màu trắng đục, có nhiều lỗ nhỏ tiếp giáp vào tầng sinh bào tử. Hình 4.2. Hình thái cấu trúc giải phẫu nấm Linh chi đỏ 35 4.1.2. Hệ sợi nấm Linh chi đỏ Sợi nấm hình trụ, có phân nhánh, mọc đan xen nhau tạo thành hệ sợi chằng chịt, khi kết thành hệ sợi thì rất dai Hình 4.3. Hình thái sợi nấm Linh chi đỏ (100x) 4.1.3. Cấu trúc bào tử nấm Linh chi đỏ Bào tử đảm (Basidiospores) có màu nâu quế, hình trứng. Bào tử có cấu trúc lớp vỏ kép, bên trong chứa dịch trong suốt, có thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi quang học. Lớp vỏ ngoài nhẵn. Lớp vỏ trong có nhiều gai nhỏ, nối liền hai lớp vỏ và mỏng hơn lớp ngoài, thƣờng cản quang mạnh, do vậy đậm màu hơn dƣới kính hiển vi quang học. Bào tử nấm có kích thƣớc trung bình 4.5 – 6,5 m x 8,5 – 11,5 m Hình 4.4. Cấu trúc bào tử nấm Linh chi đỏ (100x) 4.1.4. Định danh sơ bộ nấm Linh chi đỏ mọc tự nhiên Dựa vào những đặc điểm về hình thái quả thể, hình thái sợi nấm và cấu trúc bào tử của nấm Linh chi mọc tự nhiên ở trƣờng Đại học Nông Lâm, thấy rằng chúng có những đặc điểm và cấu trúc tƣơng đồng với loại nấm Ganoderma lucidum đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu mô tả (Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi – Dược liệu quý ở Việt Nam; Đỗ Tất Lợi, Lê Duy Thắng, Trần Văn Luyến. Nấm Linh chi – nuôi trồng và sử dụng). Từ đây, chúng tôi có thể kết luận sơ bộ rằng đây là giống Ganoderma lucidum (Linh chi đỏ), một loại nấm mà từ lâu đã đƣợc coi là một loại “thƣợng dƣợc” trong y học. 36 4.2. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh chi đỏ 4.2.1. Tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm Linh chi đỏ trên môi trƣờng agar Trên môi trƣờng agar, hệ sợi nấm Linh chi đỏ phát triển dƣới dạng hình rễ khá sớm và tốc độ tƣơng đối nhanh. Trong quá trình theo dõi sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Linh chi đỏ, chúng tôi nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trƣởng rất chậm. Sau 3 ngày, trên môi trƣờng PGA và PGA bổ sung phát triển khá nhanh. Xung quanh rìa mẫu cấy là hệ sợi nấm đang tăng trƣởng, màu trắng đục. Hình 4.5. Hệ sợi nấm Linh chi đỏ trên các môi trƣờng agar Trên các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau, tốc độ tăng trƣởng của sợi nấm Linh chi đỏ khác nhau. Trên môi trƣờng PGA + 10 % dịch chiết cà rốt có tốc độ lan rất nhanh và sau 5 ngày đa số sợi nấm đã phủ kín mặt thạch trên đĩa petri. Mặt khác, mật độ hệ sợi nấm trên các môi trƣờng PGA, PGA bổ sung và Mizuno rất dày, hệ sợi phân nhánh, nhô lên bề mặt thạch, nhìn nhƣ một lớp bông. Trên môi trƣờng Czapek – Dox, hệ sợi nấm rất mỏng và tốc độ tăng trƣởng sợi nấm trên môi trƣờng Czapek – Dox rất chậm, sau 7 ngày hệ sợi nấm mới phủ kín mặt thạch trên đĩa petri. Bảng 4.1. Tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm Linh chi đỏ trên môi trƣờng agar Nghiệm thức Ngày Đƣờng kính tơ nấm (cm) 1 2 3 4 5 3 3.44 b 4,46 c 3,58 b 3.26 b 2.33 a 4 6,1 bc 7,1 c 5,86 b 5,68 b 4,16 a Ghi chú: Những kí tự theo sau trong cùng hàng giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê P3 ngày = 0,0001; P4 ngày = 0,0081 dựa theo trắc nghiệm phân hạng LSD PGA PGA + 10% cà rốt PGA + 10% nƣớc dừa già Mizuno Czapek – Dox 37 Hình 4.6. Biểu đồ sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đỏ trên các môi trƣờng agar Ghi chú: Nghiệm thức: 1 – môi trƣờng PGA 2 – môi trƣờng PGA + 10 % dịch chiết cà rốt 3 – môi trƣờng PGA + 10 % nƣớc dừa già 4 – môi trƣờng Mizuno 5 – môi trƣờng Czapek – Dox Nhận xét: theo kết quả Bảng 4.4, tốc độ sinh trƣởng sợi nấm trên các môi trƣờng 1, 3 và 4 tƣơng đƣơng nhau. Ở môi trƣờng 2 (PGA có bổ sung 10 % dịch chiết cà rốt), hệ sợi nấm phát triển mạnh nhất. Điều này cho thấy hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng 2 phù hợp nhất cho sự phát triển của tơ nấm. Môi trƣờng 5 tơ nấm phát triển yếu nhất. Chứng tỏ, hệ sợi nấm kém phát triển trên môi trƣờng không có chứa maltose và dịch chiết khoai tây. 4.2.2. Sự sinh trƣởng của sợi nấm trên môi trƣờng nhân giống Tơ nấm Linh chi có thể mọc lan sâu vào trong môi trƣờng nhân giống. Tốc độ lan sâu tƣơng đối chậm, nhƣng khá đồng đều về mọi phía. Trong 3 ngày đầu tốc độ lan sâu rất chậm. Sau đó tốc độ lan sâu nhanh hơn. Sau 13 – 15 ngày thì tơ nấm sẽ lan kín ống nghiệm. Đối với những môi trƣờng nhân giống khác nhau thì tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm cũng khác nhau. Trên môi trƣờng 3 (mùn cƣa và cám gạo) hệ sợi tơ mỏng hơn những môi trƣờng còn lại. Tốc độ lan hệ sợi nấm sau 12 ngày nuôi cấy (Bảng 4.2). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 NGÀY4 NGÀY 3 Nghiệm thức cm/ngày 38 Bảng 4.2. Tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm trên các môi trƣờng nhân giống. Nghiệm thức Ngày Chiều sâu tơ nấm (cm) 1 2 3 4 6 6,34 b 5,51 ab 4,72 a 4,54 a 9 9,96 c 8,74 b 7,88 ab 7,3 a 12 13,97 c 12,67 b 11,2 a 11,1 a Ghi chú: Những kí tự theo sau trong cung hàng giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê. P6 ngày = 0,0317; P9 ngày = 0,0011; P12 ngày = 0,0011 dựa theo trắc nghiệm phân hạng LSD 0 2 4 6 8 0 12 14 16 18 1 2 3 4 Nghiệm thức cm/ngày Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Hình 4.7. Biểu đồ sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Linh chi đỏ trên các môi trƣờng nhân giống Ghi chú: Nghiệm thức: 1 – Lúa 90 % + mạt cƣa 5 % + cám gạo 5 % 2 – Lúa 50 % + mạt cƣa 25 % + cám gạo 25 % 3 – Mạt cƣa 50 % + cám bắp 50 % 4 – Lúa 50 % + cám bắp 25 % + cám gạo 25 % Nhận xét: tốc độ lan sâu hệ sợi nấm trên các môi trƣờng nhân giống không giống nhau. Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm trên môi trƣờng 1 là nhanh nhất và ở môi trƣờng 4 là chậm nhất. Điều này chứng tỏ, hệ sợi nấm phát triển tốt trên môi trƣờng chứa 90 % lúa, bổ sung thêm mạt cƣa và cám gạo. Đây là môi trƣờng nhân giống cấp hai tốt nhất cho sự phát triển của hệ sợi nấm. Tốc độ lan sâu của tơ nấm ở môi trƣờng 3 và 4 là thấp nhất, hầu nhƣ có rất ít sự khác biệt với nhau. 39 Hình 4.8. Sự lan sâu của hệ sợi nấm Linh chi đỏ 4.2.3. Khả năng tích lũy sinh khối của nấm Linh chi đỏ trong môi trƣờng lỏng Sau khi khảo sát sự phát triển của hệ sợi nấm trên môi trƣờng rắn, ta chọn đƣợc môi trƣờng cho hệ sợi nấm phát triển tốt nhất là môi trƣờng PGA có bổ sung 10% dịch chiết cà rốt. Từ đó ta pha chế đƣợc môi trƣờng lỏng PGB có bổ sung 10% dịch chiết cà rốt dùng để khảo sát khả năng tích lũy sinh khối của nấm Linh chi đỏ trong môi trƣờng lỏng. Lấy một mẫu giống nhỏ cấy vào môi trƣờng nuôi cấy lỏng sao cho giống cấy vào phải nổi trên mặt môi trƣờng. Nếu giống cấy bị chìm thì hệ sợi nấm sẽ không phát triển đƣợc. Sự phát triển của hệ sợi nấm (Bảng 4.3). Bảng 4.3. Khả năng tích lũy hệ sợi nấm của nấm Linh chi đỏ trong môi trƣờng lỏng Thời gian (ngày) Sinh khối (gam) 10 0,53 a 15 0,75 b 20 0,95 b Ghi chú: Những kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê. P lỏng = 0,0103 dựa theo trắc nghiệm phân hạng 0.53 0.75 0.95 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 10 15 20 Ngày Trọng lượn (g) Hình 4.9. Biểu đồ khả năng tích lũy sinh khối của nấm Linh chi đỏ trong môi trƣờng lỏng 40 Nhận xét: hai ngày sau khi cấy giống, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển và lan dần ra xung quanh. 15 ngày đầu hệ sợi nấm phát triển rất nhanh, sau đó thì phát triển chậm dần. Sau 12 – 15 ngày thấy xuất hiện màu nâu đỏ quanh mẫu cấy, vòng sắc tố lan dần và đậm dần theo thời gian nuôi cấy. Hình 4.10. Sinh khối của nấm Linh chi đỏ trong môi trƣờng lỏng 4.2.4. Sự sinh trƣởng và phát triển nấm Linh chi đỏ trên các môi trƣờng giá thể Linh chi là loại cây phá gỗ nên việc tận dụng các chất phế thải nông, lâm, công nghiệp để trồng nấm rất dễ dàng và rất có ích cho việc loại bỏ chất phế thải làm sạch môi trƣờng. Trong đó, mạt cƣa là nguồn nguyên liệu có nguồn carbon rất cao, thích hợp cho việc trồng nấm. Tuy nhiên chất dinh dƣỡng trong mạt cƣa rất thấp do đó nhất thiết phải phối trộn thêm những thành phần khác có chứa các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển của nấm để có thể rút ngắn thời gian trồng và tăng hiệu suất trồng nấm. Các chất phối trộn thƣờng là cám gạo, cám bắp, bột khoai… Các nguyên liệu này sẽ cung cấp vitamin hay acid amin cho hệ sợi nấm sinh trƣởng nhanh. Ngoài ra, các loại phân hóa học nhƣ: Urê, DAP, NPK… cũng đƣợc sử dụng rất nhiều trong nuôi trồng. Thực tế cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ với hàm lƣợng rất thấp nhƣng lại có tác dụng tốt rõ rệt đối với sự phát triển của nấm. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sinh trƣởng nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) trên giá thể mạt cƣa gỗ tạp, sử dụng bịch PP kích thƣớc 15 x 25 cm, chứa 340 gam cơ chất khô / bịch ( Hình 4.11) 41 Hình 4.11. Quy trình trồng và thu hoạch nấm Linh chi đỏ - Tháo nút bông - Chuyển sang nhà tƣới, duy trì độ ẩm 85 – 95% - Nhiệt độ 26 – 35oC - Ánh sáng tán xạ (700 – 800 lux) - Vào túi màng mỏng PP - Thanh trùng 2 lần (cách 1 ngày) ở 121oC trong 1 giờ - Rây (sàng) bỏ dăm bào - Trộn nƣớc vôi 0,25% - ủ đống qua đêm - Thêm dinh dƣỡng - Rọc đƣờng nhỏ bên hông bịch - Độ ẩm 85– 95%, nhiệt độ 26–35oC - Ánh sáng tán xạ (700 – 800 lux) Mạt cƣa gỗ tạp Cơ chất trồng nấm Bịch mạt cƣa đã khử trùng - Nuôi ủ cho hệ sợi nấm đầy bịch Bịch phôi Quả thể nấm lần 1 - Thu tai nấm - Sấy ở nhiệt độ 60oC trong 48 giờ Ống thạch giống Cấy giống Chai lúa giống (meo hạt) - Bảo quản giống: Khi hệ sợi nấm đầy ống nghiệm, tiến hành cấy qua ống agar mới. - Cấy một ít hệ sợi nấm sang môi trƣờng lúa để tạo lƣợng giống lớn cho giai đoạn trồng trên mạt cƣa. Bịch phôi Quả thể nấm lần 2 Cắt gốc Nấm khô 42 Cấy giống sau 20 - 25 ngày thì trên GT1, GT2 và GT3 hầu nhƣ tơ đều lan kín bịch, còn GT4 thì tơ lan kín các bịch sau đó 5 – 7 ngày. Nhƣng ở M1 và M2 lớp tơ rất dày còn ở M3 và M4 thì mỏng và yếu hơn. Sau 25 ngày tất cả các bịch đều đƣợc chuyển ra ngoài nhà lƣới và tháo nút bông ở cổ bịch ra. Sau 10 – 15 ngày thì ở M1, M2 và M3 xuất hiện mầm nấm dạng núm tròn, mập, màu trắng. Môi trƣờng M4 thì xuất hiện sau đó 5 – 7 ngày. Qua quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng pha ủ sợi kéo dài 20 – 25 ngày, khi hệ sợi bắt đầu bện kết, đƣa các bịch nấm đã mọc trắng ra nhà lƣới, tiến hành tƣới phun sƣơng để duy trì độ ẩm 80 – 95%, ánh sáng nhẹ (700 – 800 lux), độ thông khí cao. Pha phát triển thể quả: ngày thứ 35 – 40 thì mầm quả thể bắt đầu hình thành, ngày thứ 45 – 70 thì mầm nấm đang trong giai đoạn tăng trƣởng. Từ ngày 100 – 120 quả thể nấm bắt đầu già. Ta tiến hành thu hái quả thể. Sau khi thu quả thể, dùng một con dao nhọn rọc một đƣờng nhỏ trên hông bịch nấm sao cho đƣờng rạch không phạm vào phần cơ chất trồng nấm. Tiếp tục duy trì độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng thích hợp để đón quả thể nấm đợt hai. Sau 5 – 10 ngày thì từ các vết rọc và từ cổ của một số bịch hình thành mầm quả thể. Từ ngày 50 – 70 thì quả thể nấm đợt hai bắt đầu già, có thể thu hái đƣợc. Trong quá trình chăm sóc cần tƣới nƣớc dạng phun sƣơng đều đặn, đảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, khống chế ánh sáng và tránh gây tổn thƣơng cơ học do ruồi, muỗi, chích hút… Đặc biệt trong giai đoạn phát triển của thể quả nếu nhiệt độ cao, cƣờng độ ánh sáng mạnh, có độ thoáng khí kém sẽ gây ức chế sự hình thành và phát triển của quả thể. Sau khi thu hái cần có phƣơng pháp bảo quản thể quả tốt hay chế biến ngay để bảo đảm chất lƣợng và độ cảm quan của nấm. Hình 4.12. Quả thể nấm trồng thí nghiệm tại nhà lƣới 43 4.2.4.1. Sự tăng trƣởng của sợi nấm Linh chi đỏ Sau khi mang ra nhà lƣới, các bịch nấm đƣợc gỡ nút bông và đƣợc chăm sóc để hệ sợi nấm phát triển thành quả thể. Đây là giai đoạn dễ bị nhiễm nấm mốc và các côn trùng gây hại. Nếu hàm lƣợng nƣớc trong môi trƣờng quá cao, nấm mốc rất dễ phát triển, còn nếu quá thấp thì hệ sợi nấm sẽ khó phát triển. Do đó phải tùy vào điều kiện khí hậu cũng nhƣ vị trí thí nghiệm mà có phƣơng pháp chăm sóc hiệu quả nhất. Nhà lƣới trồng nấm của chúng tôi đƣợc đặt ngoài trời, có che mái và cây che bóng mát. Do đó khi trời âm u hay mƣa thì độ ẩm rất cao không phải tƣới. Tuy nhiên, phải thƣờng xuyên thu dọn nhà lƣới khi trời mƣa vì nƣớc mƣa tạt trong nhà lƣới sẽ khiến hàm lƣợng nƣớc trong môi trƣờng tăng cao, nấm mốc phát triển, ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm. Hình 4.13. Biểu đồ tỉ lệ sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đỏ trên các môi trƣờng giá thể trồng nấm. Ghi chú: GT1: Mùn cƣa gỗ tạp 65% + Cám gạo 15% + Cám bắp 10% + Trấu 10% + Vôi 1% + SA 5‰ + Lân 1% + MgSO4.7H2O 0.5 ‰ GT2: Mùn cƣa 75% + Trấu 25% + SA 2‰ + Vôi 1% GT3: Mùn cƣa 75% + Cám gạo 25% + Vôi 0.25% GT4: Mùn Cƣa 100% + SA 5‰ + DAP 2.5‰ + Vôi 0.25% Nhận xét: tỉ lệ sinh trƣởng của nấm trên giá thể 1 và 2 là rất mạnh. Chỉ sau 20 ngày mà hệ sợi tơ hầu nhƣ lan kín hết các bịch. Còn ở giá thể 4 rất chậm phát triển. Điều đó chứng tỏ rằng những giá thể có phối trộn với cám gạo, cám bắp và có bổ sung nguồn đạm SA đƣợc nấm hấp thụ tốt hơn là sử dụng 100% mùn cƣa và SA. Từ đó, chúng ta 97 95.5 83.33 36.66 0 20 40 60 80 100 120 GT1 GT2 GT3 GT4 Giá thể Tỉ lệ sinh trƣởng (%) 44 có thể lựa chọn đƣợc giá thể trồng nấm sao cho sợi nấm phát triển nhanh và kết quả thể sớm. 4.2.4.2. Giai đoạn phát triển quả thể nấm Linh chi đỏ Giai đoạn phát triển quả thể nấm đợt 1 Sau khi hệ sợi nấm phủ đầy bịch (giai đoạn sinh trƣởng), chúng bắt đầu chuyển sang giai đoạn phát triển. Trong giai đoạn mới, hệ sợi nấm đan vào nhau và bắt đầu kết mầm nấm. Thời gian kết mầm ở môi trƣờng M1, M2 và M3 vào 35 – 40 ngày, riêng môi trƣờng M4 thì thời gian kết mầm tƣơng đối lâu 45 – 50 ngày. Nhìn chung các bịch môi trƣờng sau khi cấy giống vào đều xuất hiện mầm quả thể và thời gian xuất hiện mầm giữa các môi trƣờng chênh lệch nhau 7 – 10 ngày. Khi hệ sợi không bện kết đƣợc ở đầu cổ bịch phôi, phải dùng dao tạo vết rạch ở đáy hoặc ở gốc bịch giúp cho mầm nấm xuất hiện. Trong quá trình nuôi trồng, hầu hết các môi trƣờng không có hiện tƣợng sợi nấm không bện kết ở đầu cổ bịch phôi và mỗi bịch phôi thƣờng chỉ tạo ra một quả thể. a b c d Hình 4.14. Quá trình hình thành quả thể nấm a. Hệ sợi bện kết (sau 25 – 30 ngày). b. Mầm nấm (sau 35 – 40 ngày) c. Mầm nấm tăng trƣởng (sau 45 – 60 ngày) . d. Hình thành quả thể ( sau 70 – 80 ngày) Theo dõi quá trình tạo quả thể nấm Linh chi đỏ, chúng tôi nhận thấy hình dạng quả thể ở các môi trƣờng rất đồng nhất: quả thể nấm hình quạt, cuống ngắn. Riêng quả 45 thể ở môi trƣờng 1 và 2 có một số dị dạng. Về kích thƣớcc thì ở môi trƣờng 1, 2, 3 khá đồng đều, còn ở môi trƣờng 4 quả thể rất nhỏ và thời gian phát triển cũng chậm hơn các môi trƣờng còn lại. Giai đoạn phát triển quả thể nấm đợt 2 Hình 4.15. Quả thể nấm mọc từ đƣờng rọc hông bịch Phần lớn các giá thể 1, 2 và 3 đều tiếp tục ra quả thể. Riêng ở giá thể 4 chỉ một nửa số bịch có thể tiếp tục ra quả thể và quả thể rất nhỏ. Quả thể đợt hai nhỏ hơn và mau già hơn. 4.3. Trọng lƣợng nấm tƣơi trên các môi trƣờng giá thể Trọng lƣợng của nấm tƣơi trên mỗi loại giá thể và trong từng đợt khác nhau. Trong đợt 1 quả thể nấm to, mập khác hẳn với đợt 2 có quả thể nhỏ, gầy. Điều này là do các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi trồng đã cạn dần sau giai đoạn ra quả thể đợt 1. Mặt khác, do một số bịch vừa ra quả thể từ vết rạch, vừa ra quả thể từ cổ bịch nên chất dinh dƣỡng không đủ cung cấp cho 2 quả thể cùng phát triển mạnh. Kết quả là quả thể đợt 2 nhỏ hơn nhiều so với quả thể đợt 1. Bảng 4.4. Trọng lƣợng nấm tƣơi trên các môi trƣờng giá thể Môi trƣờng giá thể Trọng lƣợng nấm tƣơi đợt 1 (g) Trọng lƣợng nấm tƣơi đợt 2 (g) GT 1 39 c 17,7 a GT 2 40,15 c 15,52 b GT 3 23,37 b 13,53 bc GT 4 9,62 a 4,24 d Ghi chú: Những kí tự theo sau trong cùng cột giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê. Pđợt 1 = 0,0000; Pđợt 2= 0,0000; dựa theo trắc nghiệm phân hạng 46 0 10 20 30 40 50 GT1 GT2 GT3 GT4 Giá thể Trọng lượng (g) Đợt 1 Đợt 2 Hình 4.16. Biểu đồ tỉ lệ trọng lƣợng nấm tƣơi trên các môi trƣờng giá thể Ghi chú: GT1: Mùn cƣa gỗ tạp 65% + Cám gạo 15% + Cám bắp 10% + Trấu 10% + Vôi 1% + SA 5‰ + Lân 1% + MgSO4.7H2O 0.5 ‰ GT2: Mùn cƣa 75% + Trấu 25% + SA 2‰ + Vôi 1% GT3: Mùn cƣa 75% + Cám gạo 25% + Vôi 0.25% GT4: Mùn Cƣa 100% + SA 5‰ + DAP 2.5‰ + Vôi 0.25% Nhận xét: trọng lƣợng quả thể thu đƣợc giữa hai đợt là khác nhau. Đợt 1 trọng lƣợng quả thể thu đƣợc gấp đôi đợt hai. Trọng lƣợng quả thể ở GT1 và GT2 tƣơng đƣơng nhau và lớn nhất. Còn trọng lƣợng quả thể ở GT4 thấp nhất trong cả hai đợt. Trong khi GT4 là môi trƣờng tối ƣu nhất cho sự phát triển của nấm Linh chi đen (Nguyễn Minh Khang, 2005) thì đối với nấm Linh chi đỏ nó là giá thể xấu nhất. Rõ ràng là GT4 không thích hợp cho sự phát triển của loại nấm Linh chi đỏ này. Vì vậy, khi chọn giá thể để trồng loại nấm này nên chọn GT1 hoặc GT2 là tốt nhất. 4.4. Hiệu suất sinh học của nấm Linh chi đỏ trên các môi trƣờng giá thể Sau mỗi lần thu hoạch nấm, tất cả quả thể nấm đƣợc cân trọng lƣợng tƣơi để đánh giá hiệu suất sinh học mà nấm Linh chi đạt đƣợc sau quá trình nuôi cấy trên các môi trƣờng giá thể khác nhau. Sau đó, đem tất cả nấm đi sấy khô ở nhiệt độ 60oC trong 2 ngày để bảo quản nấm khỏi hƣ và mốc. Bảng 4.5. Hiệu suất sinh học đạt đƣợc trên các giá thể trồng nấm Môi trƣờng giá thể Hiệu suất sinh học (%) GT 1 16,68 GT 2 16,37 GT 3 10,85 GT 4 4,08 47 4.08 10.85 16.68 16.37 0 5 10 15 20 25 GT1 GT2 GT3 GT4 Giá thể Hiệu suất (% ) Hình 4.17. Biểu đồ hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi Ghi chú: GT1: Mùn cƣa gỗ tạp 65% + Cám gạo 15% + Cám bắp 10% + Trấu 10% + Vôi 1% + SA 5‰ + Lân 1% + MgSO4.7H2O 0.5 ‰ GT2: Mùn cƣa 75% + Trấu 25% + SA 2‰ + Vôi 1% GT3: Mùn cƣa 75% + Cám gạo 25% + Vôi 0.25% GT4: Mùn Cƣa 100% + SA 5‰ + DAP 2.5‰ + Vôi 0.25% Nhận xét: nhƣ vậy, hiệu suất nuôi trồng nấm trên giá thể 1 và 2 có hiệu suất cao nhất (16,68 và 16,37 %). Hiệu suất nuôi trồng trên giá thể 4 là rất thấp, không đạt tới 10%. 4.5. Định tính các dƣợc chất có trong hệ sợi nấm và trong quả thể nấm 4.5.1. Định tính alkaloid Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc thử Mayer thì nhận thấy xuất hiện kết tủa vô định hình màu trắng ngà. Ống NT1: dịch chiết quả thể nấm với nƣớc acid + thuốc thử Mayer Ống NT2: dịch chiết tơ nấm với nƣớc acid + thuốc thử Mayer Ống DC1: dịch chiết tơ nấm đối chứng với nƣớc acid + thuốc thử Mayer Ống DC2: nƣớc cất + thuốc thử Mayer Hình 4.18. Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 48 Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc Dragendorff nhận thấy chỉ có ống chứa dịch chiết tơ nấm đối chứng (DC1) có xuất hiện kết tủa màu cam - nâu dạng tủa bông, từ từ lắng xuống đáy ống nghiệm. Ống NT1: dịch chiết quả thể với nƣớc acid + thuốc thử Dragendorff Ống NT2: dịch chiết tơ nấm với nƣớc acid + thuốc thử Dragendorff Ống DC1: dịch chiết tơ nấm đối chứng với nƣớc acid + thuốc thử Dragendorff Ống DC2: nƣớc cất + thuốc thử Dragendorff Hình 4.19. Định tính alkaloid với thuốc thử Dragendorff Nhận xét: dịch chiết nấm Linh chi đỏ ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 LOẠI thuốc thử Mayer VÀ Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dƣơng tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử nghiệm thì kết quả là âm tính Bột dƣợc liệu trích với nƣớc – acid: có thể trích hết các alkaloid ở dạng baz tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nƣớc), alkaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+  O), dạng glycosid, alkaloid loại có tính phân cực mạnh, nhƣng sẽ trích luôn những hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp chất không phải là alkaloid nhƣng có thể cho kết quả dƣơng tính với thuốc thử. Do đó, nếu trong dịch chiết phần 1 không có alkaloid thì có thể sẽ cho kết quả dƣơng tính giả. Bột dƣợc liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích đƣợc những alkaloid dạng N–oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nƣớc. Phƣơng pháp này trích tốt các alkaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng nhƣ các alkaloid có cấu trúc đặc thù –C=C–N–. Nhƣ vậy, có thể kết luận sơ bộ là trong nấm Linh chi đỏ không có chứa Alkaloid hoặc có nhƣng ở hàm lƣợng rất thấp mà phản ứng định tính không thể nquan sát đƣợc. 49 4.5.2. Định tính saponin 4.5.2.1. Thử nghiệm tính chất tạo bọt Ống NT1: dịch chiết quả thể nấm sau khi lắc Ống NT2: dịch chiết tơ nấm sau khi lắc Ống DC1: dịch chiết tơ nấm đối chứng sau khi lắc Ống DC2: nƣớc cất sau khi lắc Hình 4.20. thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi đỏ Kết quả ghi nhận nhƣ sau: Độ bền của bọt Kết quả Sau 15 phút + Sau 30 phút ++ Sau 60 phút +++ Nhƣ vậy dƣợc liệu từ sinh khối và quả thể nấm Linh chi đỏ có chứa hoạt chất saponin 4.5.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel 1 2 3 4 5 6 7 Hình 4.21. Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel Ống 1: dịch chiết bột quả thể nấm sau khi cho baz vào Ống 2 : dịch chiết bột quả thể nấm sau khi cho acid vào Ống 3 : dịch chiết bột tơ nấm sau khi thêm baz vào 50 Ống 4: dịch chiết bột tơ nấm sau khi thêm acid vào Ống 5: dịch chiết bột tơ nấm đối chứng sau khi thêm baz vào Ống 6: dịch chiết bột tơ nấm đối chứng sau khi thêm acid vào Ống 7: nƣớc cất đối chứng Kết quả ghi nhận: - Bọt trong cả 2 ống nghiệm bền hơn 15 phút - Cột bọt trong ống nghiệm chứa dịch chiết với baz cao hơn cột bọt trong ống nghiệm chứa dịch chiết và acid. Nhƣ vậy, sơ bộ kết luận trong tơ nấm trong quả thể nấm Linh chi đỏ có saponin steroid. 4.5.3. Định tính triterpenoid Khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ thì ta nhận thấy xuất hiện vòng đỏ nâu nơi tiếp giáp giữa 2 lớp dung dịch,lớp dung dịch phía trên lớp ngăn cách dần chuyển sang nàu xanh dƣơng đậm. Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi đều có chứa hoạt chất triterpenoid. 1 2 3 4 Hình 4.22. Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard Ống 1: dịch chiết quả thể + acid đậm đặc Ống 2: dịch chiết tơ nấm + acid đậm đặc Ống 3: dịch chiết tơ nấm đối chứng + acid đậm đặc Ống 4: đối chứng nƣớc cất + acid 4.5.4. Định tính acid hữu cơ Sau khi cho dịch chiết nƣớc bột nấm Linh chi đỏ tác dụng với tinh thể Na2CO3 và hơ nóng thì nhận thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí. Nhƣ vậy, dịch chiết nƣớc từ quả thể nấm Linh chi đỏ có chứa thành phần acids hữu cơ. 51 1 2 3 4 Hình 4.23. Định tính acid hữu cơ có trong quả thể Linh chi đỏ Ống 1: dịch chiết nƣớc quả thể nấm + tinh thể Na2CO3 Ống 2: dịch chiết nƣớc tơ nấm + tinh thể Na2CO3 Ống 3: dịch chiết nƣớc tơ nấm đối chứng + tinh thể Na2CO3 Ống 4 (đối chứng) : nƣớc cất + tinh thể Na2CO3 4.5.5. Định lƣợng polysaccharide thô từ quả thể nấm Linh chi đỏ Tiến hành ly trích polysaccharides từ 20 gam nấm Linh chi đã sấy khô. Sau quá trình lọc và sấy khô thu nhận đƣợc 0.25 gam polysaccharide thô. Nhƣ vậy hàm lƣợng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đỏ chỉ đạt khoảng 1.25%. Hình 4.24. Sản phẩm bột polysaccharide thô từ quả thể nấm Linh chi đỏ 4.5. So sánh thành phần dƣợc chất có trong quả thể và trong tơ nấm Linh chi đỏ Sau khi kiểm tra sinh hóa, chúng tôi nhận thấy rằng những dƣợc chất có trong quả thể và tơ nấm là nhƣ nhau. Nghĩa là, so với quả thể thì tơ nấm cũng có tác dụng chữa bệnh nhƣ nhau. Tuy nhiên, chúng có thể chứa hàm lƣợng khác nhau, điều này cần xác định cụ thể bằng những phƣơng pháp định lƣợng để cho ra kết luận chính xác hơn. 52 Bảng 4.6. So sánh các dƣợc chất có trong quả thể và trong tơ nấm Linh chi đỏ Dƣợc chất Phƣơng pháp định tính Kết quả Quả thể Tơ nấm Alkaloid - Thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và Dragendorff. – – Saponin - Thử nghiệm tính tạo bọt - Thử nghiệm Fontan – Kaudel (xác định có saponin triterpenoid hay saponin steroid) + (Saponin triterpenoid) + (Saponin triterpenoid) Triterpenoid - Thử nghiệm bằng phản ứng Liebermann – Burchard + + Acid hữu cơ - Cho vài tinh thể Na2CO3 vào dịch chiết nấm, hơ nóng. Nếu có bọt khí sủi lên thì kết luận có acid hữu cơ + + 53 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết Luận ě Định danh sơ bộ giống Linh chi đỏ mọc tự nhiên ở trƣờng Đại học Nông Lâm là giống Ganoderma lucidum ě Môi trƣờng cấp một tốt nhất là môi trƣờng PGA có bổ sung 10% dịch chiết cà rốt. ě Môi trƣờng nhân giống cấp 2 thích hợp: Lúa 95% + 5% mạt cƣa + 5% cám gạo. ě Trên môi trƣờng lỏng PGB hệ sợi nấm phát triển tốt. ě Môi trƣờng sản xuất có hiệu suất cao: gồm 2 môi trƣờng có hiệu suất tƣơng đƣơng. 1) GT1: Mùn cƣa gỗ tạp 65 % + Cám gạo 15 % + Cám bắp 10 % + Trấu 10% + vôi 1% + SA 5‰ + Lân 1% + MgSO4.7H2O 0.5 ‰ Hiệu suất sinh học đạt đƣợc : 16,68 % 2) GT2: Mùn cƣa 75 % + Trấu 25 % + SA 2 ‰ + Vôi 1%. Hiệu suất sinh học đạt đƣợc: 16,37 % ě Các thành phần dƣợc chất có trong sinh khối hệ sợi và quả thể Linh chi đỏ mọc tự nhiên ở trƣờng Đại học Nông Lâm so với nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) của trƣờng Khoa Học Tự Nhiên là giống nhau, bao gồm: alkaloid, saponine, saponin triterpenoid, triterpenoid và acid béo. ě Trong quả thể nấm Linh chi đỏ có chứa hàm lƣợng polysaccharide thô khoảng 1,25%. 5.2. Đề nghị ě Nhằm hoàn thiện quy trình trồng và có thể ứng dụng trong ngành dƣợc chúng ta cần khảo sát sâu hơn về kỹ thuật nuôi trồng, về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý, lâm sàng của loại nấm này. ě Dùng phƣơng pháp sắc ký lỏng để định lƣợng hàm lƣợng dƣợc chất có trong quả thể và tơ nấm, từ đó có thể suy ra tác dụng chữa trị tốt nhất cho từng loại bệnh. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thi Sơn, Zanl Fderico, 2000. Nấm ăn – cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 2. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm – Tập 1, 2. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi – dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà xuất bản mũi Cà Mau. 4. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điểm hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr) Karst. bằng phân tích hạt nhân, đánh dấu đồng vị và kỹ thuật liên hợp. Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam. 5. Đỗ Tất Lợi, Lê Duy Thắng, Trần Văn Luyến, 2001. Nấm Linh chi – Nuôi trồng và sử dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Nguyên tác: Trần Quốc Lƣơng, Trần Huệ, Trần Hiểu Thanh, 1998 - Biên dịch: Công Diễn. Linh chi phòng và trị bệnh. Nhà xuất bản mũi Cà Mau. 7. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích – Tập 1: Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 8. Lê Duy Thắng, 1999. Kỹ thuật trồng nấm – Tập 1: Nuôi trồng một số nấm ăn thông dụng ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.HCM. 9. Lê Duy Thắng, Trần Văn Minh, 2001. Sổ tay hướng dẫn trồng nấm. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 10. Nguyễn Minh Khang, 2005. Đề tài “Trồng nấm Linh chi đen”. Khóa luận tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM. 11. Phạm Thị Trân Châu – Nguyễn Thị Hiền – Phùng Gia Tƣờng, 2000. Thực hành sinh hóa học. Nhà xuất bản Giáo dục. 12. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999. Vi sinh vật học đại cương. Đại học Quốc gia TP.HCM – Trƣờng Đại học Nong Lâm TP.HCM 55 13. Trần Thanh Thu Thủy, 2004. Đề tài “Tận dụng bã thải mụn dừa để làm nguyên liệu trồng nấm mèo (Auricularia polytricha)”. Khóa luận cử nhân sinh học, khoa sinh học, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM. 14. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 1999. Đề tài: “Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao Linh chi Ganoderma lucidum trên chủng Staphylococcus aureus – Vibrio cholerae và trong mô hình bệnh lý ở Mus Musculus Var.Albino”. Tiểu luận tốt nghiệp, khoa sinh học, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM. 15. Trần Hùng, 2004. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại dọc Y Dƣợc TP.HCM. 16. Báo Nông nghiệp (ngày 27/04/2004) – Công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), (Theo Cơ sở Khoa học & Công nghệ nuôi trồng - NXB Hà Nội 2002) 17. DS. Trần Xuân Thuyết. Tạp chí Sức khoẻ và đời sống (số 224, 225). Bài viết: Thực hư về nấm Linh chi. (www_vietlinh_com_vn nong nghiep & nong thon - agriculture & rural rau an toan, rau sach - safe vegestable) Tài liệu tiếng Anh 18. Shwu-Bin Lin, Chyi-Hann Li, Shiuh-Sheng Lee, Lou-Sing Kan,2003. Triterpene-enriched extracts from ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase c, activating mitogen- activated protein kinases and g2-phase cell cycle arrest. Life Sciences 72 (2003) 2381 – 2390. 19.Kosmas Haralampidis, Miranda Trojanowska and Anne E. Osbourn, 2001. Biosynthesis of triterpenoid saponins in plants. Sainsbury Laboratory, John Innes Centre, Colney Lane,Norwich NR4 7UH, UK, e-mail: annie.osbourn@bbsrc.ac.uk 56 Tài liệu từ Internet 20. Ganoderma Lucidum (Reishi).htm 21. Reishi Mushroom by Ray Sahelian, M_D_, Benefits, Dosage, Side effects.htm 22. Lingzhi.htm 23. .activeCompoundsReishi.html 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: ĐƢỜNG KÍNH TƠ NẤM NGÀY 3 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: DIA1.dkinh Level codes: DIA1.mtr Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 6.9786267 4 1.7446567 20.660 .0001 Within groups .8444667 10 .0844467 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 7.8230933 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DIA1.dkinh by DIA1.mtr --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 3.4333333 .0520683 .1677763 3.1689259 3.6977408 2 3 4.4633333 .1166667 .1677763 4.1989259 4.7277408 3 3 3.6100000 .2400694 .1677763 3.3455925 3.8744075 4 3 3.2533333 .2034153 .1677763 2.9889259 3.5177408 5 3 2.3366667 .1594086 .1677763 2.0722592 2.6010741 --------------------------------------------------------------------------- Total 15 3.4193333 .0750318 .0750318 3.3010867 3.5375799 Multiple range analysis for DIA1.dkinh by DIA1.mtr --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 5 3 2.3366667 X 4 3 3.2533333 X 1 3 3.4333333 X 3 3 3.6100000 X 2 3 4.4633333 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -1.03000 0.52881 * 1 - 3 -0.17667 0.52881 1 - 4 0.18000 0.52881 1 - 5 1.09667 0.52881 * 2 - 3 0.85333 0.52881 * 2 - 4 1.21000 0.52881 * 2 - 5 2.12667 0.52881 * 3 - 4 0.35667 0.52881 * denotes a statistically significant difference. 58 Phụ lục 2: ĐƢỜNG KÍNH TƠ NẤM NGÀY 4 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: DIA2.dkinh Level codes: DIA2.mtruong Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 13.440440 4 3.3601100 6.391 .0081 Within groups 5.257533 10 .5257533 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 18.697973 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DIA2.dkinh by DIA2.mtruong --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 6.1266667 .2210078 .4186300 5.4669257 6.7864076 2 3 7.1100000 .1417745 .4186300 6.4502590 7.7697410 3 3 5.5200000 .8029944 .4186300 4.8602590 6.1797410 4 3 5.6766667 .2186575 .4186300 5.0169257 6.3364076 5 3 4.1900000 .3386739 .4186300 3.5302590 4.8497410 --------------------------------------------------------------------------- Total 15 5.7246667 .1872170 .1872170 5.4296215 6.0197118 Multiple range analysis for DIA2.dkinh by DIA2.mtruong --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 5 3 4.1900000 X 3 3 5.5200000 X 4 3 5.6766667 X 1 3 6.1266667 XX 2 3 7.1100000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.98333 1.31948 1 - 3 0.60667 1.31948 1 - 4 0.45000 1.31948 1 - 5 1.93667 1.31948 * 2 - 3 1.59000 1.31948 * 2 - 4 1.43333 1.31948 * 2 - 5 2.92000 1.31948 * 3 - 4 -0.15667 1.31948 * denotes a statistically significant difference. 59 Phụ lục 3: ĐỘ LAN SÂU CỦA TƠ NẤM NGÀY 6 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: ONGN6.csau Level codes: ONGN6.mtr Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 5.6707667 3 1.8902556 4.927 .0317 Within groups 3.0693333 8 .3836667 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 8.7401000 11 22 missing value(s) have been excluded. Table of means for ONGN6.csau by ONGN6.mtr --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 6.3400000 .2916048 .3576156 5.7567120 6.9232880 2 3 5.5133333 .1826046 .3576156 4.9300454 6.0966213 3 3 4.7200000 .1900000 .3576156 4.1367120 5.3032880 4 3 4.6466667 .5975599 .3576156 4.0633787 5.229954 --------------------------------------------------------------------------- Total 12 5.3050000 .1788078 .1788078 5.0133560 5.5966440 Multiple range analysis for ONGN6.csau by ONGN6.mtr --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 4 3 4.6466667 X 3 3 4.7200000 X 2 3 5.5133333 XX 1 3 6.3400000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.82667 1.16658 1 - 3 1.62000 1.16658 * 1 - 4 1.69333 1.16658 * 2 - 3 0.79333 1.16658 2 - 4 0.86667 1.16658 3 - 4 0.07333 1.16658 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 60 Phụ lục 4: ĐỘ LAN SÂU CỦA TƠ NẤM NGÀY 9 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: ONGN9.csau Level codes: ONGN9.mtr Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 12.024625 3 4.0082083 15.441 .0011 Within groups 2.076667 8 .2595833 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 14.101292 11 20 missing value(s) have been excluded. Table of means for ONGN9.csau by ONGN9.mtr --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 9.9600000 .2900000 .2941560 9.4802175 10.439782 2 3 8.7366667 .1386042 .2941560 8.2568842 9.216449 3 3 7.8800000 .1513275 .2941560 7.4002175 8.359782 4 3 7.3000000 .4689350 .2941560 6.8202175 7.779782 --------------------------------------------------------------------------- Total 12 8.4691667 .1470780 .1470780 8.2292754 8.709058 Multiple range analysis for ONGN9.csau by ONGN9.mtr --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 4 3 7.3000000 X 3 3 7.8800000 XX 2 3 8.7366667 X 1 3 9.9600000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 1.22333 0.95956 * 1 - 3 2.08000 0.95956 * 1 - 4 2.66000 0.95956 * 2 - 3 0.85667 0.95956 2 - 4 1.43667 0.95956 * 3 - 4 0.58000 0.95956 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 61 Phụ lục 5: ĐỘ LAN SÂU CỦA TƠ NẤM NGÀY 12 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: ONGN12.csau Level codes: ONGN12.mtr Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 17.020367 3 5.6734556 15.280 .0011 Within groups 2.970400 8 .3713000 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 19.990767 11 20 missing value(s) have been excluded. Table of means for ONGN12.csau by ONGN12.mtr --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 13.966667 .0825295 .3518049 13.392856 14.540477 2 3 12.673333 .0437163 .3518049 12.099523 13.247144 3 3 11.200000 .0529150 .3518049 10.626190 11.773810 4 3 11.046667 .6953736 .3518049 10.472856 11.620477 --------------------------------------------------------------------------- Total 12 12.221667 .1759024 .1759024 11.934761 12.508572 Multiple range analysis for ONGN12.csau by ONGN12.mtr --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 4 3 11.046667 X 3 3 11.200000 X 2 3 12.673333 X 1 3 13.966667 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 1.29333 1.14762 * 1 - 3 2.76667 1.14762 * 1 - 4 2.92000 1.14762 * 2 - 3 1.47333 1.14762 * 2 - 4 1.62667 1.14762 * 3 - 4 0.15333 1.14762 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 62 Phụ lục 6: TRỌNG LUỢNG TƠ NẤM NUÔI TRONG MÔI TRƢỜNG LỎNG One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: LONG1.kluong Level codes: LONG1.ngaythu Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .2658516 2 .1329258 10.781 .0103 Within groups .0739787 6 .0123298 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .3398302 8 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for LONG1.kluong by LONG1.ngaythu --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 10 3 .5293333 .1005938 .0641087 .4183770 .6402896 15 3 .7540000 .0094516 .0641087 .6430437 .8649563 20 3 .9500000 .0460579 .0641087 .8390437 1.0609563 --------------------------------------------------------------------------- Total 9 .7444444 .0370132 .0370132 .6803838 .8085051 Multiple range analysis for LONG1.kluong by LONG1.ngaythu --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 10 3 .5293333 X 15 3 .7540000 X 20 3 .9500000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 10 - 15 -0.22467 0.22191 * 10 - 20 -0.42067 0.22191 * 15 - 20 -0.19600 0.22191 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 63 Phụ lục 7: TRỌNG LƢỢNG NẤM LINH CHI TƢƠI ĐỢT 1 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: NAMTUOI1.KLUONG Level codes: NAMTUOI1.GIAHTE Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1884.1541 3 628.05136 152.782 .0000 Within groups 32.8862 8 4.11077 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 1917.0403 11 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for NAMTUOI1.KLUONG by NAMTUOI1.GIAHTE --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 39.000000 1.3095037 1.1705803 37.090728 40.909272 2 3 40.153333 .4285765 1.1705803 38.244061 42.062605 3 3 23.373333 1.8483897 1.1705803 21.464061 25.282605 4 3 9.616667 .4074446 1.1705803 7.707395 11.525939 --------------------------------------------------------------------------- Total 12 28.035833 .5852902 .5852902 27.081197 28.990469 Multiple range analysis for NAMTUOI1.KLUONG by NAMTUOI1.GIAHTE --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 4 3 9.616667 X 3 3 23.373333 X 1 3 39.000000 X 2 3 40.153333 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -1.15333 3.81854 1 - 3 15.6267 3.81854 * 1 - 4 29.3833 3.81854 * 2 - 3 16.7800 3.81854 * 2 - 4 30.5367 3.81854 * 3 - 4 13.7567 3.81854 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 64 Phụ lục 8: TRỌNG LƢỢNG NẤM LINH CHI TƢƠI ĐỢT 2 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------- Data: TUOI2.KLUONG Level codes: TUOI2.GTH Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 315.54056 3 105.18019 40.242 .0000 Within groups 20.90953 8 2.61369 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 336.45009 11 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TUOI2.KLUONG by TUOI2.GTH --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 3 17.700000 1.1111406 .9333973 16.177585 19.222415 2 3 15.516667 1.4664053 .9333973 13.994251 17.039082 3 3 13.526667 .3155066 .9333973 12.004251 15.049082 4 3 4.240000 .0200000 .9333973 2.717585 5.762415 --------------------------------------------------------------------------- Total 12 12.745833 .4666987 .4666987 11.984626 13.507041 Multiple range analysis for TUOI2.KLUONG by TUOI2.GTH --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 4 3 4.240000 X 3 3 13.526667 X 2 3 15.516667 XX 1 3 17.700000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 2.18333 3.04483 1 - 3 4.17333 3.04483 * 1 - 4 13.4600 3.04483 * 2 - 3 1.99000 3.04483 2 - 4 11.2767 3.04483 * 3 - 4 9.28667 3.04483 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.