Luận văn Ứng dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố

2 giờ Hút 0,2ml dịch tiền tăng sinh sang môi trường RV ủ 42oC 24 giờ Ria cấy trên môi trường XLD ủ 37oC 24 giờ. Chọn khuẩn lạc điển hình: trong suốt, có tâm đen Thử sinh hóa Thử kháng huyết thanh Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của vi khuẩn Salmonella, bao gồm các thử nghiệm sau: KIA/TSI (+); Urease (-); Indol (-); MR-VP (-) và LDC (+). - Kết quả khẳng định có sự hiện diện của Salmonella khi hội đủ tất cả các điều kiện thử nghiệm sinh hóa trên. b. Kiểm E. coli (TCVN 5155:90) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml TSB Pha loãng 3 lần Dịch đồng nhất Hút 0,2ml dung dịch mẫu cấy láng trên EMB ủ 44oC 24giờ Đếm và chọn khuẩn lạc điển hình: màu tím thẩm, có hoặc không có ánh kim Thử tính chất sinh hóa bằng phản ứng IMViC (+/ +/ -/ -) Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của E. coli bao gồm các thử nghiệm sau: IMViC: Indol (+); MR (+); VP (-) và Citrate (-). - Kết quả khẳng định sự hiện diện của E. coli khi cho kết quả thử nghiệm sinh hóa IMViC là: +/ +/ -/- c. Kiểm S. aureus (TCVN 5156:1990) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml đệm pepton Dịch đồng nhất Pha loãng mẫu 10 lần Hút 0,2ml dung dịch mẫu cấy láng trên môi trường Baird Paker ủ 37oC 24giờ Chọn khuẩn lạc điển hình: có bờ đều, lồi, màu vàng nhạt đến vàng sậm Thử tính chất sinh hóa Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của S. aureus bao gồm các thử nghiệm sau: Phản ứng đông huyết tương (+) và Catalase (+). Nhuộm Gram bắt màu gram (+), hình chùm nho. - Kết quả khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn này khi hội đủ tất cả các điều kiện như trên. d. Kiểm B. cereus (AOAC 2000 - 980.30) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml đệm pepton Hút 0,2ml dung dịch mẫu trải trên môi trường MYP ủ 44oC 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình: bờ răng cưa, màu hồng, xung quanh có vòng đục Thử nghiệm sinh hóa Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của B. cereus bao gồm các thử nghiệm sau: Phản ứng Glucose kị khí (+), VP (+), Lysozym (+), Tyrosin (+), di động (+). - Khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn này khi có phản ứng đúng với những thử nghiệm sinh hóa trên. e. Kiểm C. perfringens (QĐ 3348/QĐ-BYT) Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml đệm pepton Dịch đồng nhất Pha loãng mẫu 10 lần Hút 0,2ml dung dịch mẫu cấy sâu ống môi trường TSN ủ 37oC 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình: hình tròn (bầu dục), màu đen Thử nghiệm sinh hóa Đọc kết quả - Thử tính chất sinh hóa của C. perfringens bao gồm các thử nghiệm sau: phản ứng Nitrit (+), Iron-milk (+), Lactose (+), Gelatin (+), hơi (+). - Khi kết quả phản ứng đúng với những thử nghiệm sinh hóa thì kết luận có sự hiện diện của C. pefringens trong mẫu. * Các quy trình thử nghiệm sinh hóa sử dụng trong phương pháp nuôi cấy được tóm tắt như sau: Sau khi nuôi cấy phân lập các vi khuẩn, chọn những khuẩn lạc điển hình đem thử nghiệm sinh hóa hoặc nuôi cấy chọn lọc trên môi trường thích hợp cho từng chủng, hút dịch nuôi cấy để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa + Thử nghiệm KIA/TSI: (Salmonella) - Chọn khuẩn lạc trong suốt, có hoặc không có tâm đen cấy sâu và ria trên bờ mặt ống nghiệm thạch nghiên chứa môi trường KIA. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ - Xem kết quả: kết tủa nâu trong môi trường  (+), không có hiện tượng kết tủa  (-) + Thử nghiệm urease (Salmonella) - Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường RSUB, lắc nhẹ, ủ ở 37oC trong 48 giờ. - Xem kết quả: chuyển từ màu vàng cam sang đỏ tím  (+) + Thử nghiệm Indol (Salmonella và E. coli) - Cho 1ml mẫu (sau khi nuôi cấy) vào 10ml môi trường trypton water, ủ 37oC trong 24 giờ, bổ sung 1ml xylen, lắc  nhỏ 5 giọt thuốc thử kovac’c. Để yên theo dõi sự tạo màu. - Đọc kết quả: chuyển từ màu vàng sang màu đỏ  (+) + Thử nghiệm MR-VP (Salmonella, B. cereus và E. Coli) - Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường MR-VP, bổ sung 0,1ml methyl đỏ, lắc. - Đọc kết quả: có sự chuyển màu từ vàng/ cam sang màu đỏ  (+) + Thử nghiệm LDC (Salmonella) - Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 5ml môi truừơng LDC, bổ sung 2 - 3 ml dầu khoáng, ủ 37oC trong 24 – 48 giờ - Đọc kết quả: môi trường đục, có màu tím  (+), môi trường trong, màu vàng  (-). + Thử nghiệm Citrate (E. coli) - Cấy 1ml mẫu vào ống thạch nghiên chứa môi trường Simon citrare agar, ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ. - Đọc kết quả: có sự chuyển màu của môi trường từ xanh lục sang xanh dương  (+) + Thử nghiệm nitrare (B. cereus, C. perfringens ) - Cấy 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường Nitrate Broth lỏng, ủ 37oC, trong 24 giờ. Acid hóa môi trường bằng HCl 1N, bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide và N-napthylenediamine hydrochlo- -ride. - Đọc kết quả: kết luận (+) khi môi trường xuất hiện màu hồng + Thử nghiệm tính di động (B. cereus và C. perfringens) - Dùng que cấy khuẩn lạc chủng cần thử nghiệm vào ống nghiệm chứa môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar/KIA, ủ ở 37oC trong 18 -24 giờ. - Đọc kết quả: thử nghiệm (+) khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh + Thử nghiệm gelatin (C. perfringens) - Cấy 2ml mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng chứa gelatin nutrient, ủ ở 37oC trong 3 - 14 ngày. - Thử nghiệm (+) khi môi trường bị tan chảy + Thử nghiệm khả năng lên men Glucose (B. cereus) - Cấy 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường phenol Red Glucose Broth, ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ trong điều kiện kỵ khí - Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển từ màu đỏ  màu vàng 2.2.3.5. Xử lý kết quả: Phương pháp nuôi cấy Phương pháp PCR Số kết quả dương tính Số kết quả âm tính Số kết quả dương tính PA PD Số kết quả âm tính ND NA Độ chính xác tương đối (AC%) ND PD NA PA 100)NA(PA   X Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 )   PDND PDND   21 Kết quả thu nhận được từ hai phương pháp sẽ được thống kê như sau: PA (positive agreement): tổng số mẫu dương tính (PCR (+) và nuôi cấy (+)) NA (negative agreement): tổng số mẫu âm tính (PCR (-) và nuôi cấy (-)) PD (positive deviation): độ lệch dương (PCR (+), nuôi cấy (-)) ND (negative deviation): độ lệch âm (PCR (-), nuôi cấy (+)) Phương pháp PCR được xem là tương đương với phương pháp nuôi cấy khi không có sự khác biệt về kết quả giữa hai phương pháp ( 2 < 3,84). Theo tiêu chuẩn “AOAC international methods committee guidelines for validation for qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis” [74]. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trong nhóm thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM Trong quá trình kiểm nghiệm mẫu bằng phương pháp nuôi cấy, để kết luận mẫu dương tính hay âm tính, mẫu sau khi tăng sinh và phân lập sẽ được tiến hành các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho từng vi khuẩn. Kết quả nuôi cấy và khẳng định sinh hóa của các chủng vi sinh vật nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7, Hình 3.8, Hình 3.9 và Hình 3.10. Hình 3.1. Khuẩn lạc Salmonella LDC (+) KIA (+) VP (-) Indole (-) Urê (-) (1): Đối chứng (2): Thử nghiệm Hình 3.2. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Salmonella 1 2 1 2 2 1 2 1 2 1 2 1 Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli Methyl red (+) Indol (+) VP (-) Citrate (-) (1): Đối chứng (2): Thử nghiệm Hình 3.4. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định E. coli Hình 3.5. Khuẩn lạc S. aureus Hình 3.6. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định S. aureus Hình 3.7. Khuẩn lạc B. cereus 2 1 2 2 1 1 2 1 1 2 1 2 2 2 1 Di động (+) Nitrate (+) VP (+) Lên men (kỵ khí) (1): Đối chứng Glucose (2): Thử nghiệm Hình 3.8. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus Đông tụ sữa (+) Di động (-) Nitrate (+) Gelatin (+) (1): Đối chứng (2): Thử nghiệm Hình 3.9. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens Hình 3.10. Khuẩn lạc C. perfringens Để phân tích các chỉ tiêu vi sinh bằng kỹ thuật PCR, mỗi bộ kit PCR cho từng chủng đều sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho từng vi sinh vật và cho ra tín hiệu 1 2 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 2 1 2 khuếch đại với những kích thước nhất định cho mỗi chủng. Kết quả được xem dưới đèn UV tương ứng với những vạch khuếch đại đặc hiệu của từng vi sinh vật. Dựa trên những tín hiệu khuếch đại này mà xác định được sự có mặt hay không của các chỉ tiêu E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens trong mẫu phân tích. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh hiện diện trong các mẫu thực phẩm đường phố được phân tích (sữa, kem và nước giải khát) bao gồm các vi khuẩn: E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng phương pháp PCR. Kết quả của phản ứng PCR đối với các chủng trên được thể hiện ở Hình 3.11. Hình 3.11. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR Giếng 1: thang 100bp Giếng 2: vạch khuếch đại PCR của C. perfringens Giếng 3: vạch khuếch đại PCR của E. coli Giếng 4: vạch khuếch đại PCR của Salmonella Giếng 5: vạch khuếch đại PCR của S. aureus Giếng 6: vạch khuếch đại PCR của B. cereus Giếng 7: kết quả mẫu PCR âm tính 3.1.1. Kết quả phân tích mẫu sữa 3.1.1.1. Kết quả phân tích nhóm mẫu sữa bằng hai phương pháp được thống kê ở phần phụ lục. 3.1.1.2. Nhận xét về tình hình vệ sinh thực phẩm trên nhóm sữa 600bp 500bp 300bp 520bp 365bp 283bp 276bp 299bp 1 2 3 4 5 6 Trong 21 mẫu sữa kiểm tra bao gồm các loại: sữa đậu xanh, sữa chua, sữa đậu nành, sữa đậu phộng, được phân tích theo phương pháp PCR và nuôi cấy. Kết quả được ghi nhận theo Bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm sữa tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy Salmonella E. coli S. aureus B. cereus Chỉ tiêu thống kê PCR NC PCR NC PCR NC PCR NC Mẫu không đạt (N = 21) 0 0 1 10 7 6 9 8 Tỉ lệ mẫu không đạt (%) 0 0 47,62 47,62 33,33 28,57 42,86 38,1 NC: phương pháp nuôi cấy; PCR: phương pháp PCR Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trong nhóm sữa trên địa bàn TP. HCM bằng cả hai phương pháp được thể hiện trên Biểu đồ 3.1. 0 0 47.6247.62 33.33 28.57 42.86 38.1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Salmonella E. coli S. aureus B. cereus PCR NC Biểu đồ 3.1. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nhóm sữa trên địa bàn TPHCM Trong quá trình khảo sát lấy mẫu thực tế ở hầu hết các điểm bán sữa (sữa tươi, sữa chua, sữa đậu xanh, sữa đậu nành) cho thấy tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đều không được đảm bảo: - Sản phẩm sữa chứa trong những chai nhựa hoặc thủy tinh mà nắp đậy chỉ là một mảnh nilong nhỏ được buộc bởi một sợi thun, hay cho vào những can nhựa lớn mà nắp đậy chỉ là một mảnh nhựa, đôi khi chỉ là một mảnh giấy carton, nên các vi khuẩn gây bệnh dễ nhiễm vào sản phẩm; khi bán hết những chai nhựa hoặc thủy tinh nhỏ thì sản phẩm được lấy ra từ thùng nhựa lớn mà không cần vệ sinh dụng cụ, do vậy các vi sinh vật gây bệnh có thể nhiễm từ tay người sang dụng cụ và sang người tiếp theo; chưa kể đến tình trạng sản phẩm không đảm bảo chất lượng do còn thừa lại từ hôm trước mà vẫn được đem bán, với dụng cụ không đảm bảo vệ sinh cùng sự biến đổi chất lượng sữa là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. - Mặt khác trong khi tìm hiểu thực tế cũng cho thấy, một số nơi đã dùng nước máy để làm sữa chua, sữa tươi (pha từ sữa đặc có đường đóng hộp) khuấy bằng tay, có thể làm S. aureus từ tay người nhiễm sang sản phẩm, vi khuẩn này có nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển rất cao: từ 5 - 50oC, tối ưu ở 28 - 40oC, bào tử của chúng có thể chịu được nhiệt độ trên 100oC và khả năng chịu nhiệt của S. aureus được gia tăng trong các thực phẩm có dầu và hàm lượng chất béo cao như sữa, nên khi đun tiệt trùng có thể chưa tiêu diệt hết. Chính vì vậy, các mẫu sữa rất dễ bị nhiễm loại vi khuẩn này. Trong thời gian lên men, sản phẩm được chứa trong một thau hoặc thùng nhựa không được vệ sinh sạch và không có nắp đậy, để dưới sàn bằng xi măng đã lâu ngày ẩm thấp, đây là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh. - Hơn nữa, tại các tủ lạnh đựng các sản phẩm sữa còn chứa thêm các loại thực phẩm tươi sống như: rau, cá tươi, thịt tươi, hoặc các loại thực phẩm khác nhằm tận dụng không gian chứa và tiết kiệm chi phí. Như vậy dễ làm cho các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tươi sống nhiễm sang các mẫu sữa. Vì vậy, kết quả khảo sát trên các mẫu sữa tại một số quận trên địa bàn TP. HCM đã cho kết quả như sau: * Kết quả kiểm tra theo phương pháp nuôi cấy - Phân tích 21 mẫu sữa: số mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh là: 10 mẫu (E. coli), 6 mẫu (S. aureus), 8 mẫu (B. cereus), số mẫu không đạt chung là 11 mẫu chiếm tỷ lệ 52,4% và nhiễm chủ yếu là E. coli (47,62%). * Kết quả kiểm tra theo phương pháp PCR - Phân tích 21 mẫu sữa: số mẫu không đạt tiêu chuẩn là: 10 mẫu (E. coli), 7 mẫu (S. aureus), 9 mẫu (B. cereus), số mẫu không đạt chung là 11 mẫu chiếm tỉ lệ 52,4% và chủ yếu cũng do nhiễm E. coli (47,62%). Như vậy, mẫu sữa không đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm do nhiễm E. coli là chủ yếu chiếm 47,62% (cả phương pháp PCR và nuôi cấy), tiếp theo là do nhiễm B. cereus (42,86%: PCR và 38,1%: nuôi cấy) và sau đó là do nhiễm S. aureus (33,33%: PCR và 28,57%: nuôi cấy). Đây cũng là nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm tại các trường học trên địa bàn TP. HCM, chẳng hạn vụ ngộ độc thực phẩm vào ngày 16/01/2006 tại 3 trường tiểu học Chu Văn An, Thanh Đa và Tầm Vu quận Bình Thạnh, với 238 học sinh bị ngộ độc. Nguyên nhân được xác định là do nhiễm E. coli và S. aureus trong sữa chua được cung cấp bởi cơ sở bánh Vinh Khoa (P. An Bình, Q.2). 3.1.1.3. Nhận xét về tính tương đồng kết quả phân tích của 2 phương pháp PCR và nuôi cấy trong mẫu sữa Trong 21 mẫu sữa được kiểm tra theo phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy, bao gồm các loại: sữa đậu xanh, sữa chua, sữa đậu nành và sữa đậu phộng. Tính tương đồng về kết quả của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy được thống kê, phân tích và tổng hợp ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Thống kê kết quả kiểm tra trên mẫu sữa tại TP. HCM bằng phương pháp PCR và nuôi cấy Salmonella E. coli S. aureus B. cereus Chỉ tiêu thống kê PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) NC (+) 0 0 9 1 5 1 8 0 NC (-) 0 21 1 10 2 13 1 12 Độ chính xác tương đối (AC%) 100% 90,48% 85,71% 95,24% Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 ) 0 0,5 1,33 0 NC: phương pháp nuôi cấy; PCR: phương pháp PCR Kết quả phân tích 21 mẫu sữa cho thấy tính tương đồng của phương pháp PCR và nuôi cấy như sau: a. Đối với chỉ tiêu Salmonella Kết quả giữa phương pháp PCR và phương pháp truyền thống hoàn toàn khớp nhau. Tỉ lệ tương đồng giữa hai phương pháp đạt 100%. Không có sự khác biệt giữa hai phương pháp. Chứng tỏ độ tin cậy của phương pháp PCR và nuôi cấy là như nhau . b. Đối với chỉ tiêu E. coli + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 9/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 42,86% + Kết quả tương đồng (-): 10/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 47,62% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% Như vậy, bộ kit E. coli cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 90,48%, kết quả không tương đồng giữa PCR và NC là 9,52%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0,5 nhỏ hơn 3,84. Chứng tỏ không có sự khác biệt về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy. c. Đối với chỉ tiêu S. aureus + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 5/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 23,81% + Kết quả tương đồng (-): 13/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 61,9% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 2/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 9,52% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% Bộ kit S. aureus cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 85,71%, kết quả không tương đồng PCR (+), nuôi cấy (-) là 14,29%. Nguyên nhân là do số trường hợp PCR cho kết quả dương tính nhiều hơn so với nuôi cấy. Kết quả này có thể giải thích là do độ nhạy của phương pháp PCR cao hơn so với phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên, độ khác biệt giữa hai phương pháp là 1,33 vẫn nhỏ hơn 3,84. Điều này khẳng định độ tin cậy về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương nhau. d. Đối với chỉ tiêu B. cereus + Kết quả tương đồng (+) của hai phương pháp: 8/21 mẫu, chiếm 38,1% + Kết quả tương đồng (-): 12/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 57,14% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 0/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 0% Bộ kit B. cereus cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 95,24 %, kết quả không tương đồng PCR (+), NC (-) là 4,76%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0 nhỏ hơn 3,84, chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương nhau. 3.1.2. Kết quả phân tích nhóm mẫu nước giải khát 3.1.2.1. Kết quả phân tích mẫu nước giải khát (nước sâm, nước mía và nước rau má) tại TP. HCM bằng phương pháp PCR và nuôi cấy được thống kê ở phần phụ lục. 3.1.2.2. Nhận xét về tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trên nhóm nước giải khát tại TP. HCM Phân tích 26 mẫu nước giải khát (nước sâm, nước mía và nước rau má) theo phương pháp PCR và nuôi cấy, kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.3 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy E. coli S. aureus C. perfringens Chỉ tiêu thống kê PCR NC PCR NC PCR NC Mẫu không đạt(N = 26) 17 19 0 0 6 5 Tỉ lệ mẫu không đạt (%) 65,38 73,1 0 0 23,08 19,23 NC: phương pháp nuôi cấy; PCR: phương pháp PCR Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trong nhóm nước giải khát trên địa bàn TP. HCM bằng cả hai phương pháp được thể hiện ở Biểu đồ 3.2 65.38 73.1 0 0 23.08 19.23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 E. coli S. aureus C.perfringens PCR NC Biểu đồ 3.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại địa bàn TP. HCM * Kết quả kiểm tra 26 mẫu nước giải khát (nước sâm, nước mía và nước rau má) theo phương pháp nuôi cấy - Số mẫu không đạt tiêu chuẩn là: 19 mẫu nhiễm E. coli, 5 mẫu nhiễm C. perfringens, số mẫu không đạt chung là 20 mẫu chiếm tỷ lệ 76,9% và nhiễm chủ yếu là E. coli (73,1%). * Kết quả kiểm tra 26 mẫu nước giải khát theo PCR - Số mẫu không đạt tiêu chuẩn là: 17 mẫu nhiễm E. coli, 6 mẫu nhiễm C.perfringens, số mẫu không đạt chung là 20 mẫu chiếm tỉ lệ 76,9% và chủ yếu cũng do nhiễm E. coli (65,38%). Như vậy mẫu nước giải khát không đạt tiêu chuẩn chủ yếu là do nhiễm E. coli (73,1%: nuôi cấy, 65,38%: PCR), tiếp theo là nhiễm C. perfringens (23,08%: PCR, 19,23%: nuôi cấy). Kết quả trên đã phản ánh rõ thực trạng vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nhóm nước giải khát (nước sâm, nước mía và nước rau má) trên địa bàn TP. HCM hiện nay: - Trong quá trình khảo sát lấy mẫu thực tế nước giải khát tại một số quận ở TP. HCM đã cho thấy tình trạng dùng tay cho đá lạnh vào thùng chứa nước sâm; sử dụng lại đá lạnh, ống hút và hiện tượng dùng ca múc nước sâm có khi nhúng cả tay vào thùng nước sâm rất mất vệ sinh, đây là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm của các vi khuẩn gây bệnh vào nước sâm. - Một số xe ép mía không được vệ sinh, bị gỉ sét, do còn dính lại nhiều đường nên ruồi, nhặng bu bám vào rất nhiều. Ruồi, nhặng thường sống ở những nơi rất bẩn, cơ thể chúng (nhất là chân) thường mang theo rất nhiều sinh vật gây bệnh. Mặt khác, những cây mía đã bỏ vỏ không được bảo quản cẩn thận mà chỉ cho vào bao tải để dưới sàn xi măng có khi để trên vỉa hè làm cho các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, S. aureus, C. perfringens rơi vãi trong đất nhiễm vào dễ dàng. - Trong khi tìm hiểu thực tế còn cho thấy, rau má mua về chỉ rửa sơ qua một lần nước, thậm chí có lúc không rửa nên các vi sinh vật gây bệnh từ đất, phân bám vào rau má vẫn còn, sử dụng nước máy để xay và không vệ sinh tay trước khi vắt bã. Do vậy dễ dàng nhiễm các vi khuẩn E. coli, B. cereus, C. perfringens, Salmonella từ đất và S. aureus từ tay người. 3.1.2.3. Nhận xét về tính tương đồng kết quả phân tích của 2 phương pháp PCR và nuôi cấy Trong 26 mẫu nước giải khát được kiểm tra bao gồm các loại: nước sâm, nước mía và nước rau má. Tính tương đồng về kết quả của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống được thống kê, phân tích và tổng hợp ở Bảng 3.4 Bảng 3.4. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy E. coli S. aureus C. perfringens Thống kê PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) NC (+) 17 2 0 0 5 0 NC (-) 0 7 0 26 1 20 Độ chính xác tương đối (AC%) 92,31% 100% 96,15% Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 ) 0.5 0 0 Qua bảng thống kê cho thấy: a. Đối với chỉ tiêu S. aureus Kết quả giữa phương pháp PCR và phương pháp truyền thống hoàn toàn khớp với nhau. Tỉ lệ tương đồng giữa hai phương pháp đạt 100%. b. Đối với chỉ tiêu E. coli + Kết quả tương đồng (+) của hai phương pháp: 17/26 mẫu, chiếm tỉ lệ 65,38% + Kết quả tương đồng (-): 7/26 mẫu, chiếm tỉ lệ 26,92% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 2/26 mẫu, chiếm tỉ lệ 7,69% Như vậy, bộ kit E. coli cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 92,31%, kết quả không tương đồng giữa PCR và NC là 7,69%. Nhưng độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0,5 vẫn nhỏ hơn 3,84, chứng tỏ không có sự khác biệt về kết quả giữa phương pháp PCR và nuôi cấy. c. Đối với chỉ tiêu C. perfringens + Kết quả tương đồng (+) của hai phương pháp: 5/26 mẫu, chiếm tỉ lệ 19,23% + Kết quả tương đồng (-): 20/26 mẫu, chiếm tỉ lệ 76,92% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 1/26 mẫu, chiếm tỉ lệ 3,85% Bộ kit C. perfringens cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 96,15%, kết quả không tương đồng PCR (+) và NC (-) là 3,85%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0 nhỏ hơn 3,84. Chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương. 3.1.3. Kết quả phân tích nhóm mẫu kem 3.1.3.1. Thống kê kết quả phân tích bằng hai phương pháp Phân tích 30 mẫu kem (kem ly, kem ký, kem tươi, kem chiên, kem marino và kem cây) theo phương pháp PCR và nuôi cấy, kết quả được thống kê ở phần phụ lục. 3.1.3.2. Nhận xét về tình hình vệ sinh thực phẩm trên nhóm kem Trong khi lấy mẫu và khảo sát thực tế tại các điểm bán kem trên địa bàn một số quận của TP. HCM đã ghi nhận: - Dùng nước máy để pha chế các nguyên liệu, sử dụng dụng cụ đã cũ, không sạch sẽ và dùng tay để trộn các nguyên liệu rất mất vệ sinh. - Tủ đựng kem còn chứa các thực phẩm tươi sống khác như: rau, thịt, cá, hải sản,… nên các vi sinh vật gây bệnh từ các loại thực phẩm này dễ dàng nhiễm sang kem. Chính vì vậy mà qua khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong mẫu kem tại TP. HCM cho kết quả như sau: Kết quả đánh giá tình hình nhiễm vi sinh vật trong 30 mẫu kem trên địa bàn TP. HCM theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế được ghi nhận ở Bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy Salmonella E. coli S. aureus C. perfingens Thống kê PCR NC PCR NC PCR NC PCR NC Số mẫu không đạt (N = 30) 0 0 25 21 7 9 0 0 Tỉ lệ mẫu không đạt (%) 0 0 83,33 70 23,33 30 0 0 NC: phương pháp nuôi cấy; PCR: phương pháp PCR Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại TP. HCM bằng cả hai phương pháp được thể hiện ở Biểu đồ 3.3 65.38 73.1 0 0 23.08 19.23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 E. coli S. aureus C.perfringens PCR NC Biểu đồ 3.3. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại TP. HCM * Kết quả kiểm tra 30 mẫu kem theo phương pháp nuôi cấy - Số mẫu không đạt tiêu chuẩn là: 21 mẫu nhiễm E. coli chiếm 70%, 9 mẫu nhiễm S. aureus chiếm 30%, số mẫu không đạt chung là 20 mẫu chiếm tỷ lệ 70% và nhiễm chủ yếu là E. coli (70% ), sau đó là do S. aureus (30%). * Kết quả kiểm tra 30 mẫu kem theo phương pháp PCR - Số mẫu không đạt tiêu chuẩn là: 25 mẫu nhiễm E. coli chiếm 83,33%, 7 mẫu nhiễm S. aureus chiếm 23,33%, số mẫu không đạt chung là 20 mẫu chiếm tỉ lệ 70% và chủ yếu cũng do nhiễm E. coli (83,33%), sau đó là do nhiễm S. aureus (23,33%). Như vậy, mẫu kem không đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm do nhiễm E. coli là chủ yếu (PCR: 83,33%, nuôi cấy: 70%), sau đó là do nhiễm S. aureus (PCR: 23,33%, nuôi cấy: 30%). Như vậy tỉ lệ nhiễm vi sinh vật trên mẫu kem rất cao, cao nhất trong ba nhóm mẫu được khảo sát, trong đó hiện diện nhiều nhất là E. coli, kế tiếp là do S. aureus, điều này cho thấy tình trạng không đảm bảo vệ sinh trong khâu chế biến, bảo quản và sử dụng sản phẩm rất phổ biến. Do vậy, cần đảm bảo vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đối với các loại thực phẩm là điều cần thiết và cấp bách hiện nay. 3.1.3.3. Nhận xét về tính tương đồng về kết quả phân tích giữa phương pháp PCR và nuôi cấy Kết quả kiểm tra 30 mẫu kem theo phương pháp PCR và nuôi cấy. Tính tương đồng của hai phương pháp được thể hiện ở Bảng 3.6 Bảng 3.6. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy Salmonella E. coli S. aureus C. perfringensKý hiệu mẫu PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) NC (+) 0 0 21 0 7 2 0 0 NC (-) 0 30 4 5 0 21 0 30 Độ chính xác tương đối (AC%) 100% 86,67% 93,33% 100% Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 ) 0 2,25 0,5 0 Qua bảng thống kê cho thấy tính tương đồng của phương pháp PCR so vớiu phương pháp nuôi cấy như sau: a. Đối với chỉ tiêu Salmonella và C. perfringens Độ tương đồng giữa hai phương pháp là 100%, cả hai phương pháp đều không pháp hiện Salmonella và C. perfringens trong các mẫu kem. b. Đối với chỉ tiêu E. coli + Kết quả tương đồng (+) của hai phương pháp: 21/30 mẫu, chiếm 70% + Kết quả tương đồng (-): 5/30 mẫu, chiếm tỉ lệ 16,67% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 4/30 mẫu, chiếm tỉ lệ 13,33% Như vậy, bộ kit PCR phát hiện E. coli cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 86,67%, kết quả không tương đồng giữa là 13,33%. Nhưng độ khác biệt giữa hai phương pháp là 2,25 vẫn nhỏ hơn 3,84. Chứng tỏ không có sự khác biệt về kết quả phân tích giữa phương pháp PCR và nuôi cấy. c. Đối với chỉ tiêu S. aureus + Kết quả tương đồng (+): 7/30 mẫu, chiếm tỉ lệ 23,33% + Kết quả tương đồng (-): 21/30 mẫu, chiếm tỉ lệ 70% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 2/30 mẫu, chiếm tỉ lệ 6,67% Như vậy, bộ kit PCR phát hiện S. aureus cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và NC là 93,33%, kết quả không tương đồng giữa PCR và NC là 6,67%. Tuy nhiên, độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0,5 nhỏ hơn 3,84, chứng tỏ không có sự khác biệt về kết quả giữa phương pháp PCR và nuôi cấy. Từ các kết quả phân tích trên đã khẳng định: các quy trình, bộ kit PCR phát hiện E. coli, S. aureus, Salmonella, B. cereus và C. perfringens hiện diện trong thực phẩm đều cho kết quả tương đương với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Vì vậy, có thể áp dụng quy trình và các bộ kit này để phát hiện sự có mặt của các vi sinh vật trên trong các mẫu thực phẩm. 3.2. Kết luận chung 3.2.1. Mức độ nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM Chúng tôi đã tiến hành thu thập và kiểm tra tổng cộng 77 mẫu, bao gồm: 21 mẫu sữa (sữa đậu xanh: 6 mẫu, sữa đậu nành: 5 mẫu, sữa chua: 5 mẫu và sữa tươi: 5 mẫu); 26 mẫu nước giải khát (nước sâm: 8 mẫu, nước mía: 8 mẫu và nước rau má: 10 mẫu) và 30 mẫu kem (kem tươi: 10 mẫu, kem ký: 6 mẫu, kem ly: 4 mẫu, kem cây: 8 mẫu, 1 mẫu kem Marino và 1 mẫu kem chiên) tại các địa điểm: Quận 3 (chợ Bùi Phát, đường Nguyễn Thị Minh Khai, đường Võ Văn Tần và đường Cách Mạng Tháng Tám); Quận 5 (đường Nguyễn Biểu, đường Hồng Bàng, đường Trần Bình Trọng và đường Nguyễn Văn Cừ); Quận 8 (chợ Rạch Ông, đường Nguyễn Biểu, đường Nguyễn Thị Tần, đường Phạm Thế Hiển, đường Dạ Nam và đường Âu Dương Lân); Quận 10 (đường Nguyễn Tri Phương, đường 3 tháng 2, đường Lê Hồng Phong và đường Sư Vạn Hạnh) và Quận Tân Bình (đường Cách Mạng Tháng Tám, đường Bàu Cát và đường Bình Giã). Qua kết quả kiểm tra cho thấy tình hình nhiễm các loại vi sinh vật gây bệnh trên nhóm thực phẩm đường phố tại địa bàn TP. HCM như sau: 3.2.1.1. Đối với nhóm sữa Tiến hành thu và phân tích 21 mẫu sữa, kết quả phân tích theo phương pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong nhóm sữa chiếm tỉ lệ 52,4% so với quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với mẫu sữa của Bộ Y tế (867/QĐ-BYT, 04/1998). Trong đó tỉ lệ nhiễm cao nhất là E. coli (47,62%), sau đó là nhiễm B. cereus (40,48%) và cuối cùng là do nhiễm S. aureus (30,95%), không phát hiện sự hiện diện của Salmonella. 3.2.1.2. Đối với nhóm nước giải khát Phân tích 26 mẫu nước giải khát theo hai phương pháp, kết quả cho thấy tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong nhóm thực phẩm này chiếm 76,9% so với chỉ tiêu cho phép của Bộ Y tế (867/QĐ-BYT, 04/1998), trong đó nhiễm cao nhất vẫn là E. coli (69,24%), sau đó là do nhiễm C. perfringens (21,16%), trong nhóm này không phát hiện sự hiện diện của S. aureus. 3.2.1.3. Đối với nhóm kem Phân tích 30 mẫu kem, kết quả của hai phương pháp cho thấy, số mẫu không đạt so với chỉ tiêu cho phép của Bộ Y tế (867/QĐ-BYT, 04/1998) chiếm tỷ lệ 70% , trong đó, tỉ lệ nhiễm cao nhất vẫn là E. coli (76,67% ), tiếp đó tới S. aureus (26,67%), ở nhóm này không phát hiện sự hiện diện của Samonella và C. perfringens. Như vậy qua khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên nhóm thực phẩm đường phố tại địa bàn TP. HCM cho thấy tình hình nhiễm vi sinh trong nhóm thực phẩm này rất cao so với quy định của Bộ Y tế. Chính vì thế cần phải có những giải pháp để khắc phục hiện trạng này, nhằm đảm bảo sức khỏe, tính mạng người dân và sự phát triển bền vững của đất nước. 3.2.2. Nhận xét chung về độ chính xác tương đối của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong ba nhóm thực phẩm đường phố là sữa, nước giải khát và kem trên địa bàn TP. HCM đều cho thấy tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy là tương đương nhau. Tính tương đồng về kết quả giữa phương pháp PCR và nuôi cấy được thống kê, phân tích và tổng hợp theo Bảng 3.7 và Bảng 3.8. Bảng 3.7. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu Salmonella, E. coli, S. aureus Salmonella E. coli S. aureus Chỉ tiêu PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) PCR(+) PCR(-) NC (+) 0/51 0/51 48/77 3/77 12/77 3/77 NC (-) 0/51 51/51 4/77 22/77 2/77 60/77 Độ chính xác tương đối AC%) 100 90,91 93,51 Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 ) 0 0 0 Bảng 3.8. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu B. cereus C. perfringens B. cereus C. perfringens Chỉ tiêu PCR(+) PCR (-) PCR(+) PCR (-) NC (+) 8/21 0/21 5/56 0/56 NC (-) 1/21 12/21 1/56 50/56 Độ chính xác tương đối (AC%) 95,24 98,21 Độ khác biệt giữa hai phương pháp ( 2 ) 0 0 Kết quả phân tích tính tương đồng cuả phương pháp PCR và nuôi cấy ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8 cho thấy: a. Trường hợp các chỉ tiêu Salmonella Bộ kit PCR phát hiện Salmonella trong thực phẩm cho kết quả tương đồng giữa phương pháp PCR và nuôi cấy là 100%. Độ chính xác tương đối đạt 100%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0. Chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy trong phân tích này là tương đương nhau. b. Trường hợp các chỉ tiêu E. coli + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 48/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 62,34% + Kết quả tương đồng (-): 22/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 28,57% + Kết quả PCR (+) và NC (-): 4/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 5,19% + Kết quả PCR (-) và NC (+): 3/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 3,90%. Bộ kit PCR phát hiện E. coli trong thực phẩm cho kết quả tương đồng giữa phương pháp PCR và nuôi cấy là 90,91%, kết quả không tương đồng giữa hai phương pháp là 9,09%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0. Chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương. c. Trường hợp các chỉ tiêu S. aureus + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 12/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 15,58% + Kết quả tương đồng (-) : 60/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 77,92% + Kết quả PCR (+) và NC (-) : 2/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 2,60% + Kết quả PCR (-) và NC (+) : 3/77 mẫu, chiếm tỉ lệ 3,89% Bộ kit PCR phát hiện S. aureus trong thực phẩm cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là 93,51%, kết quả không tương đồng giữa hai phương pháp là 6,49%. Không có sự khác biệt giữa hai phương pháp. Chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương. d. Trường hợp các chỉ tiêu B. cereus + Kết quả tương đồng (+) : 8/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 38,1% + Kết quả tương đồng (-) : 12/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 57,14% + Kết quả PCR (+) và NC (-) : 1/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 4,76% + Kết quả PCR (-) và NC (+) : 0/21 mẫu, chiếm tỉ lệ 0% Bộ kit PCR phát hiện B. cereus trong thực phẩm cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là 95,24 %, kết quả không tương đồng giữa hai phương pháp là 4,76%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0. Chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là như nhau. e. Trường hợp các chỉ tiêu C. perfringens + Kết quả tương đồng (+) của cả hai phương pháp: 5/56 mẫu, chiếm tỉ lệ 8,93% + Kết quả tương đồng (-) : 50/56 mẫu, chiếm tỉ lệ 89,29% + Kết quả PCR (+) và NC (-) : 1/56 mẫu, chiếm tỉ lệ 1,78% + Kết quả PCR (-) và NC (+) : 0/65 mẫu, chiếm tỉ lệ 0% Bộ kit PCR phát hiện C. perfringens trong thực phẩm cho kết quả tương đồng giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là 98,21%, kết quả không tương đồng giữa hai phương pháp là 1,78%. Độ khác biệt giữa hai phương pháp là 0. Chứng tỏ độ tin cậy về kết quả giữa hai phương pháp PCR và nuôi cấy là tương đương. Từ các kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh ở trên, có thể khẳng định: quy trình và các bộ kit PCR phát hiện sự hiện diện của Salmonella, E. coli, S. aureus, B. cereus và C. perfringens trong thực phẩm là đáng tin cậy và tương đương với phương pháp nuôi cấy truyền thống. 3.2.3. Nhận xét về ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống 3.2.3.1. Ưu điểm - Các kết quả phân tích giữa phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy truyền thống trên các chỉ tiêu vi sinh: E. coli, Salmonella, S. aureus, B.cereus và C. perfringens đều cho thấy kết quả của phương pháp PCR là tương đương với phương pháp nuôi cấy. Trong đó có một số trường hợp sai khác như sau: + Trong nhóm sữa Ở chỉ tiêu S. aureus, kết quả phân tích theo phương pháp PCR có 7/21 mẫu (+), kết quả phân tích theo phương pháp nuôi cấy có 6/21 mẫu (+). Chỉ tiêu B. cereus, kết quả theo phương pháp PCR có 9/21 mẫu (+), theo phương pháp nuôi cấy có 8/21 mẫu (+). Các chỉ tiêu khác đều như nhau. + Trong nhóm nước giải khát Ở chỉ tiêu E. coli, kết quả phân tích theo phương pháp PCR có 17/26 mẫu (+), kết quả theo phương pháp nuôi cấy có 19/26 mẫu (+). Chỉ tiêu C. perfringens, kết quả theo PCR có 6/26 mẫu (+), theo nuôi cấy có 5/26 mẫu (+). Các chỉ tiêu khác thì tương đương. + Trong nhóm kem Ở chỉ tiêu E. coli, kết quả phân tích theo phương pháp PCR có 25/30 mẫu (+), kết quả theo phương pháp nuôi cấy có 21/30 mẫu (+). Chỉ tiêu S. aureus, kết quả theo phương pháp PCR có 7/30 mẫu (+), theo nuôi cấy có 9/30 mẫu (+). Các chỉ tiêu còn lại như nhau. Mặc dù có một vài sai khác về kết quả khi phân tích chỉ tiêu vi sinh trong các mẫu thực phẩm trên, nhưng độ khác biệt giữa hai phương pháp trong tất cả các trường hợp đều nhỏ hơn 3,84. Chứng tỏ, hai phương pháp này có độ tin cậy như nhau. Mặc khác, trong một số trường hợp phương pháp PCR tỏ ra có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống và đây cũng là ưu điểm của phương pháp PCR đối với mục đích xét nghiệm nhanh truy tìm nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm hiện nay ở nước ta. - Ngoài ra, phương pháp PCR còn có ưu điểm là cho kết quả nhanh, trong vòng 24 giờ đối với tất cả các vi sinh vật cần xét nghiệm. Vì thế, phương pháp PCR giúp tìm ra nguyên nhân gây ngộ độc nhanh hơn so với phương pháp nuôi cấy. Đây là điểm vượt trội của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy trong việc xác định nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm. - Hơn nữa, phương pháp PCR có thể xét nghiệm dễ dàng hầu hết các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm trong cùng một thời gian, cùng một nguyên tắc và cùng một thiết bị, do đó ít tốn nhiều nhân lực, thời gian khi tiến hành xét nghiệm. - Hiện nay, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Trường ĐHKHTN, ĐHQG TP. HCM, đã và đang cung cấp các bộ kit xét nghiệm này cho các cơ quan, xí nghiệp có nhu cầu với giá khoảng 30.000 VND [51]. 3.2.3.2. Nhược điểm Tuy nhiên, phương pháp PCR cũng có một số hạn chế là giá thành bộ kit phân tích ở các chỉ tiêu E. coli, S. aureus, B. cereus và C. perfringens vẫn còn cao hơn so với phương pháp truyền thống. Nhưng, giá thành của các bộ kit này vẫn còn thấp hơn nhiều lần so với các bộ kit cùng chủng loại được nhập từ nước ngoài mà vẫn đảm bảo ưu điểm về thời gian cũng như tính chích xác về kết quả của bộ kit. Mặc khác, phương pháp PCR đòi hỏi phải có các trang thiết bị hiện đại như máy PCR, máy ly tâm, máy vortex, hệ thống điện di và máy xem kết quả điện di thì mới có thể tiến hành kỹ thuật PCR. 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Với các kết quả thực nghiệm thu được đã trình bày ở phần trên, chúng tôi có một số kết luận như sau: - Kết quả ứng dụng quy trình, bộ kit PCR phát hiện E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens trong thực phẩm để kiểm tra tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm trên nhóm thực phẩm đường phố tại TP. HCM cho thấy đa số các thực phẩm thuộc nhóm sữa, kem và nước giải khát trên địa bàn TP. HCM đều có chỉ tiêu vi sinh cao hơn so với tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế đối với nhóm thực phẩm này. Cụ thể là: + Đối với nhóm sữa (sữa đậu xanh, sữa đậu nành, sữa tươi và sữa chua), tỉ lệ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh cao hơn so với tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế (04/1998) là 52,4%, trong đó hiện diện nhiều nhất là E. coli (chiếm 47,62%), sau đó là nhiễm B. cereus (chiếm 42,86%) và cuối cùng do nhiễm S. aureus (chiếm 33,33%). + Đối với nhóm nước giải khát (nước sâm, nước mía và nước rau má) có tỉ lệ nhiễm vi sinh cao hơn so với chỉ tiêu cho phép của Bộ Y tế là 76,9%, trong đó nhiễm chủ yếu cũng là E. coli (chiếm 73,1%), sau đó là do sự hiện diện của C. perfringens (chiếm 23,08%). + Đối với nhóm kem (kem tươi, kem ký, kem ly, kem cây, kem Marino và kem chiên), tình hình nhiễm vi sinh vật cao hơn so với tiêu chuẩn của Bộ Y tế là 70%, đứng đầu là do nhiễm E. coli (chiếm 83,33%), sau đó là do nhiễm S. aureus (chiếm 30%). - Từ các kết quả về tính tương đồng và độ tin cậy giữa phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy như ở trên, có thể kết luận rằng: kết quả phân tích của quy trình, bộ kit PCR phát hiện E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens bằng phương pháp PCR là hoàn toàn tương đương với phương pháp nuôi cấy. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh hiện diện trong thực phẩm bằng phương pháp PCR là đáng tin cậy. - Ưu điểm của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy là độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể phát hiện sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh ở mức 1 - 10CFU/25g mẫu thực phẩm. Thời gian cho kết quả nhanh, trong vòng 24 giờ, ngắn hơn rất nhiều so với phương pháp nuôi cấy (từ 3 - 7 ngày). Hơn nữa, các thao tác cuả kỹ thuật PCR đơn giản, dễ thực hiện và có thể xét nghiệm hầu hết các vi sinh vật trong cùng một thời gian và thiết bị. Với những ưu điểm này, phương pháp PCR có thể thay thế phương pháp nuôi cấy truyền thống và phổ biến rộng rãi hơn nữa trong việc xét nghiệm sự hiện diện của các vi sinh vật gây ngộ độc trong thực phẩm. Tuy nhiên, phương pháp PCR cũng có nhược điểm là giá thành còn cao và đòi hỏi các trang thiết bị hiện đại. 4.2. Đề nghị - Cần ứng dụng quy trình, bộ kit PCR xét nghiệm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm ở nhiều lĩnh vực trong việc giám sát tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm trong nước và xuất nhập khẩu hiện nay tại Việt Nam. - Sử dụng phương pháp PCR để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong nhiều nhóm thực phẩm khác thuộc thức ăn đường phố tại nhiều địa phương trong cả nước, nhằm đưa ra kết luận chung về tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố ở nước ta hiện nay. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Thị Thu Thuận, Phạm Văn Sổ (1975), Kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực thực phẩm (Theo TCVN và 867/1998/QĐ - BYT). 3. Lê Đình Hùng (1998), Đại cương về phương pháp kiểm tra vi sinh vật thực phẩm, Trung tâm tiêu chuẩn đo lường chất lượng khu vực III, TP. HCM. 4. Lê Huy Chính (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, Nhà xuất bảm Y học, TP. HCM 5. Lương Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật và an toàn vi sinh thực phẩm, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 6. Lương Đức Phẩm và một số tác giả (1980), Vi sinh vật trong lương thực, thực phẩm, tạp chí lương thực, thực phẩm, Nhà xuất bản Hà Nội. 7. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2001), Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại học Kỹ Thuật TP. HCM. 8. Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, TP. HCM 9. Trần Thị Nhài (2005), Nghiên cứu hiện trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt tươi sống trên thị trường Hà Nội, Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. Tiếng Anh 10. Adams abd M.O.Moss (2001), Food Microbiology, published by the Royal society of chemistry, 60 - 81. 11. C. Schultsz et. Al (1994), Detection of enterotoxigenic Escherichia coli in stool samples by using nonradioactively labeled oligonucleotide DNA probes and PCR, J Clin Microbiol. 32 (10), 2392 – 2397. 12. Collins, Lyne (1995), Microbiological Methods. 7th ed. Butterworth. 13. Cynthia W. Brasher, Angelo Depaola, Daniel D. Jones, Asim K. Bej (1998), Detection of Microbial Pathogens in Shellfish with Multiplex PCR, Curren Microbiology, 37 (2), 101 – 108. 14. E. Augustynowicz, A. Gzyl and J. Slusarczyk. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens with a duplex PCR. J. Med. Microbiol. Patrick. Vol. 54. 15. George A. Wistreich (1997), Microbiology Laboratory Fundamentals and Applications, Prentice-Hall, Inc., USA 16. Hau-Yang Tsen et. Al. (2002), Bacillus cereus group strains, their hemolysin activity and their detection in foods using a 16S RNA ang hemolysin gene- targeted multiplex polymerase chain reaction system, Journal of Food Protection, 63 (11), 1496 – 1502. 17. James M.Jay (1996), Modern food and microbiology. 18. James P. Nataro, James B. Kaper (1998), Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiology Reviews, 11 (1), 142 – 201. 19. Microbiological analysis. FAO food and nutrient paper. Rome. 20. Patrick Fach and Michel R. Popoff (1997), Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in food and fecal samples with a duplex PCR and the slide latex agglutination test. Applied and Enviromental Microbiology Journal. Vol. 63. No. 11. 21. W. Andrews (1992), Manual of food quality control 4 Rev. 1. Microbiological analysis. FAO food and nutrient paper. Rome. 22. Wijnands LM., Dufrenne JB., Leusden FM (2002), Characterization of Bacillus cereus, 2509 – 12002. 23. William C., Frcezier and Denmis C.Westhoff. Food Mcrobiology, Mc Graw- Hill Book Company,. 24. Ziemer CJ,Steadham SR (2003), Evaluation of the specifity of Salmonella PCR primers using intestinal bacterial species, Lett Appl Microbiol. 37 (6), 463 – 469. Từ Internet 25. vne.xpress.net/Vietnam/suc_khoe/2001/06/3B9B1E63/13K. 26. www.biotechvn.com.vn/ 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. poisoning 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. www.kcom.edu/faculty/chamberlain/website/lectures/lecture/G14.htm 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. B cereus FAR.pdf 57. www.moh.gov.vn/homebyt/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=222&cat=1909&ID=33 79 - 49k 58. www19.dantri.com.vn/suckhoe/2006/7/127935.vip - 88k 59. D=2 60. 61. 62. 63. 64. www.moh.gov.vn/tainanthuongtich/details.asp?CatMainID=2&Cat_ID=7&NewsI D=781 - 44k 65. www.rfa.org/vietnamese/in_depth/2005/07/26/FoodSafetyBelowStandards_TMi/ - 24k 66. 67. 68. 6 69. nelID=46 70. 71. 72. 73. D=2079 74. PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM MẪU THEO PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ NUÔI CẤY 1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU SỮA Salmonella E. coli S. aureus B. cereus Địa điểm thu mẫu Tên mẫu PCR NC PCR NC PCR NC PCR NC SX3  KPH < 3 KPH  KPH  KPH SC3  KPH < 3 KPH  KPH  KPH Quận 3 Chợ Bùi Phát ST3  KPH ≥ 3 3,0.102  4  KPH SX5  KPH ≥ 3 2,0.103  KPH  2,4.102 SN5  KPH < 3 KPH  KPH  7 SX5  KPH < 3 KPH  1,2.102  1,5.102 SC5  KPH < 3 KPH  4  4 Quận 5 Đường Nguyễn Biểu ST5  KPH ≥ 3 2,7.103  KPH  KPH SX8  KPH < 3 1,0.101  4  KPH SN8  KPH < 3 KPH  2,6.102  KPH SC8  KPH < 3 KPH  KPH  KPH Quận 8 Chợ Rạch Ông ST8  KPH ≥ 3 1,2.101  KPH  KPH SX10  KPH ≥ 3 2,0.105  KPH  4,3.101 SN10  KPH ≥ 3 2,8.101  KPH  1,5.101 SN10  KPH ≥ 3 1,3.101  KPH  9 SC10  KPH < 3 KPH  KPH  KPH Quận 10 Chợ Nguyễn Tri Phương ST10  KPH ≥ 3 8,0.101  KPH  KPH SXTB  KPH ≥ 3 KPH  KPH  KPH SNTB  KPH < 3 KPH  3,5.102  KPH SCTB  KPH < 3 KPH  KPH  KPH Quận Tân Bình Đường Cách Mạng Tháng Tám STTB  KPH ≥ 3 4,5.104  KPH  4 SX: sữa đậu xanh; SN: sữa đậu nành; SC: sữa chua; ST: sữa tươi ; KPH: không phát hiện 2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU NƯỚC GIẢI KHÁT E. coli S. aureus C.perfringens Địa điểm thu mẫu Tên mẫu Ký hiệu mẫu PCR NC PCR NC PCR NC Nước sâm H11  KPH  KPH  KPH Nước mía H12  9  KPH  KPH Nước rau má H13  KPH  KPH  2,3.10 1 Nước rau má H14  KPH  KPH  KPH Quận 5 Đường Hồng Bàng Nước sâm H15  KPH  KPH  KPH Nước mía H16  1,1.102  KPH  KPH Nước rau má H17  3  KPH  KPH Nước rau má H18  KPH  KPH  KPH Nước sâm H19  9  KPH  2 Nước sâm H20  3  KPH  KPH Nước mía H21  4  KPH  KPH Quận 8 Đường Nguyễn Biểu – Nguyễn Thị Tần Nước mía H22  9,3.101  KPH  KPH Nước rau má H25  9,3.10 1  KPH  KPH Quận 10 Đường 3/2 Nước rau má H26  4  KPH  KPH Nước sâm H27  3,2.10 3  KPH  KPH Nước sâm H28  1,1.10 2  KPH  KPH Nước mía H29  3,0.102  KPH  KPH Nước mía H30  9,3.101  KPH  KPH Nước rau má H31  9,3.10 1  KPH  8,0.102 Quận 3 Đường Nguyễn Thị Minh Khai – Võ Văn Tần Nước rau má H32  6,0.10 4  KPH  KPH Nước sâm H33  1,0.10 3  KPH  KPH Nước sâm H34 (+) 9,3.10 1  KPH  KPH Nước rau má H35  KPH  KPH  2,0.10 2 Nước rau má H36  15  KPH  6,0.10 1 Nước mía H37  KPH  KPH  KPH Quận Tân Bình Đường Cách Mạng Tháng Tám Nước mía H38  1,5.103  KPH  KPH 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU KEM Salmonella E. coli S. aureus C.perfringensĐịa điểm thu mẫu Tên mẫu Ký hiệu PCR NC PCR NC PCR NC PCR NC Kem tươi H75  KPH  9  KPH  KPH Kem tươi H76  KPH  1,0.10 1 < 10 2,3.101  KPH Kem ký H77  KPH  2,0.101 ≥ 10 2,3.101  KPH Kem ký H78  KPH  2,0.103 ≥ 10 2,3.101  KPH Kem cây H79  KPH  4,0.10 1 < 10 2,3.101  KPH Quận 3 Đường Cách mạng tháng tám Kem cây H80  KPH  2,0.10 2 ≥ 10 2,3.101  KPH Đường Trần Bình Trọng Kem tươi H81  KPH  1,0.101  KPH  KPH Kem cây H82  KPH  KPH  KPH  KPH Quận 5 Đường Trần Tuấn Khải Kem cây H83  KPH  6,3.10 2  KPH  KPH Kem tươi H84  KPH  2,0.10 1  KPH  KPH Kem tươi H85  KPH  3,0.10 1  KPH  KPH Đường Nguyễn Văn Cừ Kem tươi H86  KPH  9  KPH  KPH Kem cây H87  KPH  KPH  KPH 10 KPH Kem ký H88  KPH  7,0.101 ≥ 10 2,3.101  KPH Đường Phạm Thế Hiển Kem cây H89  KPH  1,7.10 2 ≥ 10 2,3.101  KPH Kem Marino H90  KPH  KPH  KPH  KPH Đường Dạ Nam Kem ký H91  KPH  KPH  KPH  KPH Quận 8 Đường Âu Dương Lân Kem tươi H92  KPH  2,0.101  KPH < 10 KPH Kem ly H93  KPH  4,2.102  KPH  KPH Kem Baby Lê Hồng Phong Kem ly H94  KPH  5.103 ≥ 10 9,3.101 < 10 KPH Tin A - Sư Vạn Hạnh Kem ly H95  KPH  KPH  KPH < 10 KPH Đường Sư Vạn Hạnh Kem ly H96  KPH  KPH  KPH  KPH Sư Vạn Hạnh Kem chiên H97  KPH  KPH  KPH  KPH Quận 10 Đường 3/2 Kem tươi H98  KPH  KPH  KPH  KPH Kem tươi H99  KPH  1,0.10 1  KPH  KPH Đường Bàu Cát Kem tưoi H100  KPH  2,0.10 1 ≥ 10 9,3.101  KPH Kem cây H101  KPH  4,0.10 1  KPH  KPH Đường Bình Giã Kem cây H102  KPH  1,3.10 2  KPH  KPH Kem ký H103  KPH  1,0.103  KPH  KPH Quận Tân Bình Cách Mạng Tháng Tám Kem ký H104  KPH  KPH <10 KPH  KPH