Luận văn Xác định gen kháng ceftriaxone ở vi khuẩn shigella sonnei phân lập từ các mẫu bệnh phẩm

KEÁT QUAÛ VAØ BIEÄN LUAÄN 3.1 Khaùng sinh ñoà cuûa S. sonnei CroR Caùc chuûng vi khuaån S. sonnei coù kieåu hình khaùng ceftriazone phaân laäp töø caùc maãu beänh phaåm ñöôïc tieán haønh laøm khaùng sinh ñoà baèng phöông phaùp khueách taùn ñóa. Keát quaû theå hieän trong baûng 3.1 vaø bieåu ñoà 3.1. Baûng 3.1 Khaùng sinh ñoà cuûa vi khuaån S. sonnei CroR STT Chuûng Amp SxT Chl Na Te CN Ofx Cip Gat Cro Caz 1 DE611 R R S S R S S S S R S 2 EG162 R R S R R S S S S R S 3 EG187 R R S S R S S S S R S 4 EG204 R R S R R S S S S R S 5 EG250 R R S R R S S S S R S 6 EG356 R R S R R S S S S R S 7 EG373 R R S S R S S S S R S 8 EG384 R R S R R S S S S R S 9 EG390 R R S R R S S S S R S 10 EG395 R R S R R S S S S R S 11 EG421 R R S R R S S S S R S 12 EG424 R R S R R S S S S R S 13 EG430 R R S R R S S S S R S 14 EG472 R R S R R S S S S R S 15 EG1007 R R S R R S S S S R S 16 EG1008 R R S R R S S S S R S 17 EG1009 R R S R R S S S S R S 18 EG1010 R R S R R S S S S R S 19 EG1011 R R S R R S S S S R S 20 EG1012 R R S R R S S S S R S 21 EG1013 R R S R R S S S S R S Ghi chuù: R: Khaùng khaùng sinh S: Nhaïy khaùng sinh Bieåu ñoà 3.1 Tyû leä khaùng khaùng sinh cuûa S. sonnei CroR Ghi chuù: Caùc chöõ khaùng sinh vieát taét: Amp: Ampicillin Chl: Chloramphenicol Te: Tetracycline Ofx: Ofloxacine Gat: Gatifloxacin Caz: Ceftazidime SxT: Trimethoprim – sulfamethoxazole Na: Nalidixic acid CN: Gentamicin Cip: Ciprofloxacin Cro: Ceftriaxone Caùc chuûng S. sonnei CroR phaân laäp ñöôïc vaãn coøn nhaïy vôùi chloramphenicol, gentamicin, ofloxacine, ciprofloxacin, gatifloxacin, vaø ceftazidime. Tuy nhieân, taát caû caùc chuûng S. sonnei naøy ñeàu laø vi khuaån ña khaùng thuoác. 100% chuûng ña khaùng vôùi caùc khaùng sinh thoâng thöôøng nhö ampicillin, trimethoprime/sulphamethoxazole vaø tetracycline, trong soá ñoù coù 85,7% (18/21) khaùng theâm nalidixic acid (bieåu ñoà 3.1). Ñieàu naøy cho thaáy tình hình khaùng khaùng sinh cuûa caùc chuûng Shigella ngaøy caøng nghieâm troïng. Do ñoù, vieäc duøng caùc khaùng sinh thoâng thöôøng haàu nhö khoâng coøn hieäu quaû. Tình hình S. sonnei ña khaùng thuoác ôû Vieät Nam ñoái vôùi caùc khaùng sinh nhö ampicillin, tetracycline, trimethoprime/sulphamethoxazole cuõng töông töï nhö ôû Nhaät, Iran, Trung Quoác [8, 9, 25] Tính khaùng cuûa Shigella spp. noùi chung vaø S. sonnei noùi rieâng ñoái vôùi ceftriaxone ñang coù khuynh höôùng gia taêng treân theá giôùi vaø ôû Vieät Nam. Töø naêm 1995 – 1998, vaãn chöa coù tröôøng hôïp khaùng ceftriaxone naøo ñöôïc coâng boá ôû chaâu AÙ. Tuy nhieân, töø naêm 2001 – 2004, tyû leä Shigella CroR laø 5% toång soá ca phaân laäp ñöôïc ôû Haøn Quoác, Ñaøi Loan, Singapore, Vieät Nam, Sri Lanka, Thaùi Lan, Hoàng Koâng vaø Philippine [8]. Taïi Vieät Nam, ca nhieãm Shigella khaùng vôùi ceftriaxone ñaàu tieân ñöôïc baùo caùo töø moät beù trai 10 tuoåi taïi beänh vieän Beänh Nhieät ñôùi Thaønh phoá Hoà Chí Minh (HTD) vaøo thaùng 2 naêm 2001. Tuy nhieân, töø thaùng 6 naêm 2006 ñeán thaùng 1 naêm 2008, tyû leä nhieãm Shigella CroR phaân laäp ñöôïc töø caùc maãu beänh phaåm (taïi HTD vaø beänh vieän Ñoàng Thaùp) laø 15,3% (11 ca trong toång soá 72 ca Shigella phaân laäp ñöôïc), trong ñoù S. sonnei chieám ñeán 91,7% [28]. Ñaëc bieät, trong 3 thaùng ñaàu naêm 2009, taát caû caùc Shigella phaân laäp ñöôïc töø beänh phaåm taïi HTD ñeàu laø S. sonnei vaø ñeàu khaùng vôùi cefriaxone (Haø Vinh, soá lieäu chöa coâng boá). Soá lieäu treân cho thaáy vieäc khaùng ceftriaxone cuûa Shigella, ñaëc bieät laø S. sonnei taêng nhanh moät caùch ñaùng keå. Tình hình naøy, cuøng vôùi vieäc Shigella ña khaùng thuoác ñang gia taêng laøm vieäc choïn löïa khaùng sinh duøng trong ñieàu trò Shigella trôû neân khoù khaên hôn. 3.2 Kieåu hình taïo ESBL cuûa S. sonnei CroR Thöû nghieäm khaû naêng sinh ESBL baèng phöông phaùp duøng ñóa ñoâi xaùc nhaän keát quaû theo höôùng daãn cuûa WHO. Keát quaû ESBL döông tính khi ñöôøng kính voøng voâ khuaån cuûa ñóa khaùng sinh chöùa ceftazidime keát hôïp vôùi clavulanic acid vaø/hoaëc ñöôøng kính voøng voâ khuaån cuûa ñóa khaùng sinh chöùa cefotaxime keát hôïp vôùi clavulanic acid lôùn hôn ñöôøng kính voøng voâ khuaån xung quanh ñóa chæ chöùa khaùng sinh 5mm. Ñieàu naøy laø do clavulanic acid ñaõ öùc cheá enzyme ESBL sinh ra bôûi vi khuaån, laøm vi khuaån trôû neân nhaïy caûm vôùi khaùng sinh β-lactam. Cefotaxime / Clavulanic id Cefotaxime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic acid Ceftazidime Ceftazidime Cefotaxime Cefotaxime B Cefotaxime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic Ceftazidime Cefotaxime A Cefotaxime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic acid Ceftazidime Cefotaxime C D Hình 3.1 Keát quaû kieåm tra khaû naêng taïo ESBL cuûa caùc chuûng Shigella khaùng ceftriazone. (A) ESBL döông tính (vôùi caû hai caëp ñóa); (B) ESBL döông tính (vôùi 1 trong hai caëp ñóa); (C) ESBL aâm tính (chuûng S. sonnei nhaïy vôùi taát caû caùc khaùng sinh); (D) ESBL aâm tính (S. flexneri khaùng vôùi ceftriaxone). Keát quaû kieåm tra khaû naêng sinh enzyme ESBL cuûa caùc chuûng S. sonnei CroR (hình 3.1) cho thaáy taát caû caùc chuûng S. sonnei CroR (21/21 chuûng) phaân laäp ñöôïc töø caùc maãu beänh phaåm ñeàu sinh enzyme ESBL. Trong ñoù, 18/21 chuûng (85,7%) döông tính vôùi caû hai caëp ñóa khaùng sinh (ceftazidime vaø ceftazidime/clavulanic acid; cefotaxime vaø cefotaxime/clavulanic acid); 3 chuûng coøn laïi (14,3%) chæ cho keát quaû döông tính vôùi caëp ñóa khaùng sinh cefotaxime vaø cefotaxime/clavulanic acid (baûng 3.2). Keát quaû ESBL cho thaáy enzyme ESBL cuûa Shigella sonnei coù khaû naêng phaân caét cefotaxime cao hôn ceftazidime (ñöôøng kính voøng voâ khuaån xung quanh ñóa ceftazidime cao gaáp 2 ñeán 3 laàn so vôùi ñöôøng kính voøng voâ khuaån xung quanh ñóa cefotaxime). Caùc chuûng cho keát quaû ESBL döông tính vôùi hai caëp ñóa khaùng sinh – khaùng sinh/chaát öùc cheá (hình 3.1A) phaân caét cefotaxime vaø ceftazidime toát hôn nhöõng chuûng chæ döông tính vôùi moät caëp ñóa khaùng sinh – khaùng sinh/chaát öùc cheá (hình 3.1B) (theå hieän ôû ñöôøng kính voøng voâ khuaån nhoû hôn). ÔÛ kieåu hình ESBL döông tính vôùi caû 2 caëp ñóa khaùng sinh – khaùng sinh/chaát öùc cheá, clavulanic acid ñaõ öùc cheá enzyme ESBL, laøm vi khuaån trôû neân keùm hieäu quaû trong phaân giaûi cefotaxime cuõng nhö ceftazidime. ÔÛ kieåu hình ESBL chæ döông tính vôùi 1 caëp ñóa khaùng sinh – khaùng sinh/chaát öùc cheá, clavulanic acid öùc cheá enzyme ESBL laøm vi khuaån keùm phaân giaûi cefotaxime, nhöng khoâng aûnh höôûng ñeán söï phaân giaûi ceftazidime (do ESBL cuûa nhöõng chuûng naøy phaân giaûi ceftazidime raát keùm) (baûng 3.3). Baûng 3.2 Keát quaû kieåm tra khaû naêng sinh enzyme ESBL cuûa S. sonnei CroR Ñöôøng kính voøng voâ khuaån (mm) STT Chuûng CAZ/CLA CAZ CTX/CLA CTX Keát quaû ESBL 1 DE611 32 28 28 13 Döông tính vôùi 1 caëp ñóa 2 EG162 29 18 30 0 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 3 EG187 30 27 30 13 Döông tính vôùi 1 caëp ñóa 4 EG204 30 19 27 0 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 5 EG250 31 19 23 0 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 6 EG356 32 28 23 9 Döông tính vôùi 1 caëp ñóa 7 EG373 30 18 31 0 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 8 EG384 32 20 24 7 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 9 EG390 32 22 30 10 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 10 EG395 30 20 31 9 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 11 EG421 31 20 31 8 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 12 EG424 31 21 32 9 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 13 EG430 32 21 31 10 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 14 EG472 33 21 30 10 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 15 EG1007 33 22 31 10 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 16 EG1008 33 20 31 8 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 17 EG1009 32 21 31 8 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 18 EG1010 32 21 32 10 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 19 EG1011 30 21 31 8 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 20 EG1012 31 20 31 10 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa 21 EG1013 30 19 30 8 Döông tính vôùi 2 caëp ñóa Baûng 3.3 Ñöôøng kính voøng voâ khuaån trung bình Keát quaû ESBL CAZ/CLA CAZ CTX/CLA CTX Döông tính vôùi 2 caëp ñóa (n = 18) 31,14 mm 20,14 mm 30,03 mm 7,03 mm Döông tính vôùi 1 caëp ñóa (n = 3) 31,33 mm 27,67 mm 27 mm 11,67 mm Ghi chuù: Caùc chöõ khaùng sinh vieát taét CAZ: Ceftazidime CAZ/CLA: Ceftazidime/Clavulanate CTX: Cefotaxime CTX/CLA: Cefotaxime/Clavulanate 3.3 Plasmid cuûa S. sonnei khaùng vôùi ceftriaxone vaø S. sonnei nhaïy vôùi ceftriaxone Töø kieåu hình hoaït ñoäng cuûa enzyme ESBL ôû caùc chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone chuùng toâi ñaët giaû thuyeát enzyme ESBL naøy coù theå thuoäc hoï CTX-M, vaø gen blaCTX-M maõ hoùa cho protein naøy naèm treân plasmid [5, 6, 11]. Vì vaäy, chuùng toâi ñaõ khaûo saùt ñoä töông ñoàng veà kieåu plasmid giöõa moät soá chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone vaø moät soá chuûng S. sonnei nhaïy vôùi ceftriaxone. Plasmid ñöôïc taùch baèng phöông phaùp cuûa Kado-Liu. Keát quaû taùch plasmid theå hieän trong hình 3.2. Hình 3.2 Keát quaû ñieän di caùc plasmid cuûa 1 soá chuûng Shigella sonnei. M: chuûng E. coli 39R861 (4 plasmid vôùi caùc kích thöôùc laàn löôït laø 147 kb, 63 kb, 36 kb vaø 6 kb); töø EG373 ñeán EG1009: caùc chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone; töø DE115 ñeán DE1198: caùc chuûng S. sonnei nhaïy vôùi ceftriaxone. Taát caû caùc chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone ñöôïc khaûo saùt ñeàu chöùa từ 6 đến 10 plasmid với nhiều kích thước khaùc nhau, vaø ñeàu chöùa plasmid lôùn coù kích thöôùc naèm trong khoaûng töø 63 kb đến 147 kb. Trong khi ñoù, 6/9 chủng (66,7%) S. sonnei nhaïy caûm vôùi ceftriaxone khoâng chöùa plasmid lôùn coù kích thöôùc naèm 63 kb 147 kb 36 kb 6 kb trong khoaûng naøy. Vì vaäy chuùng toâi ñöa ra giaû thuyeát raèng gen khaùng ceftriaxone naèm treân plasmid lôùn coù kích thöôùc trong khoaûng töø 63 kb ñeán 147 kb cuûa S. sonnei. 3.4 Taïo doøng chuûng E. coli mang gen khaùng ceftriaxone 3.4.1 Caét plasmid baèng AluI vaø caét pUC baèng SmaI Plasmid cuûa S. sonnei CroR phaân laäp töø caùc maãu beänh phaåm sau khi taùch baèng boä kít cuûa NucleoBond ñöôïc caét ngaãu nhieân vôùi enzyme AluI. Phaûn öùng caét thaønh coâng khi taïo ra ñöôïc nhöõng ñoaïn DNA coù kích thöôùc töø 300 bp ñeán 12 kb, vaø khoâng coøn plasmid chöa caét (hình 3.3). Caùc ñoaïn DNA coù kích thöôùc töø 500 bp ñeán 2000 bp ñöôïc tinh cheá laïi töø gel, vaø ñöôïc söû duïng ñeå noái vôùi plasmid pUC19 (sau khi caét vôùi enzyme SmaI). Vì plasmid pUC19 chæ coù moät vò trí caét cuûa enzyme SmaI, neân saûn phaåm caét ñöôïc taïo ra laø DNA maïch thaúng vôùi kích thöôùc laø 2686 bp (hình 3.3, coät 7). Hình 3.3 Saûn phaåm caét plasmid cuûa S. sonnei vôùi enzyme AluI vaø pUC19 vôùi enzyme SmaI. L: thang 1 kb plus; 1, 4: plasmid cuûa S. sonnei tröôùc khi caét vôùi enzyme AluI; 2-3, 5-6: plasmid cuûa S. sonnei sau khi caét vôùi enzyme AluI; 7: pUC19 sau khi caét vôùi enzymeSmaI. 3.4.2 Taïo doøng chuûng E. coli mang gen khaùng ceftriaxone Keát quaû taïo doøng cho ñöôïc khuaån laïc traéng treân ñóa moâi tröôøng LB-Amp- X_gal (hình 3.4). Nhö vaäy, phaûn öùng noái nhöõng ñoaïn DNA plasmid cuûa vi khuaån sau khi caét baèng enzyme AluI vôùi pUC19 sau khi caét baèng enzymeSmaI thaønh coâng. Tuy nhieân, treân moâi tröôøng LB-CRO khoâng coù khuaån laïc naøo moïc ñöôïc, nghóa laø khoâng taïo doøng ñöôïc gen chòu traùch nhieäm cho tính khaùng ceftriaxone cuûa S. sonnei. 2 500 2686 bp Hình 3.4 Khuaån laïc treân moâi tröôøng LB-Amp-X_gal. Khuaån laïc xanh: khoâng coù saûn phaåm cheøn vaøo pUC19; khuaån laïc traéng: coù saûn phaåm cheøn vaøo pUC19. Tuy taïo doøng gen laø moät phöông phaùp sinh hoïc phaân töû mang tính chaát ñoät phaù trong vieäc phaùt hieän moät gen chöa bieát nhöng phaûi taïm döøng vì thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi coù haïn. PCR söû duïng caëp moài ñaëc hieäu cho caùc nhoùm gen maõ hoùa enzyme ESBL ñöôïc löïa choïn laø phöông phaùp thay theá. 3.5 Keát quaû PCR gen maõ hoùa ESBL Vieäc kieåm tra khaû naêng taïo ESBL cuûa caùc chuûng S. sonnei CroR cho thaáy, taát caû caùc chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone ñeàu coù keát quaû ESBL döông tính. Ñieàu naøy cho thaáy raèng gen chòu traùch nhieäm cho tính khaùng ceftriaxone ôû S. sonnei laø gen maõ hoùa cho ESBL. Gen maõ hoùa cho ESBL goàm caùc nhoùm nhö SHV, TEM, OXA vaø CTX-M. Tuy nhieân, do ESBL taïo ra bôûi S. sonnei khaùng ceftriaxone bò öùc cheá bôûi clavulanic acid neân ESBL naøy khoâng theå laø enzyme thuoäc hoï OXA (ñaëc tröng bôûi tính khaùng laïi chaát öùc cheá nhö clavulanic acid) [6]. Vì vaäy, chuùng toâi chæ söû duïng 3 caëp moài ñaëc hieäu cho caùc nhoùm ESBL thuoäc hoï SHV, TEM vaø CTX-M. Trình töï moài vaø chöông trình chaïy PCR ñöôïc theå hieän trong phaàn 2.7. Keát quaû chaïy ñieän di saûn phaåm PCR (hình 3.5) cho thaáy taát caû caùc chuûng S. sonnei CroR ñeàu döông tính vôùi caëp moài ñaëc hieäu cho gen thuoäc hoï CTX-M khi treân gel agarose xuaát hieän 1 vaïch coù kích thöôùc 585 bp. Ôû caëp moài SHV treân gel agarose xuaát hieän moät soá vaïch môø nhöng khoâng coù vaïch ôû vò trí 593 bp ñaëc hieäu cho saûn phaåm PCR cuûa caëp moài naøy. Nhö vaäy, keát quaû treân phuø hôïp vôùi giaû thuyeát chuùng toâi ñaët ra ban ñaàu khi döïa vaøo ñaëc ñieåm cuûa enzyme ESBL do S. sonnei CroR taïo ra (phaân giaûi cefotaxime maïnh hôn ceftazidime, moät ñaëc tröng cuûa enzyme ESBL thuoäc hoï CTX-M). Hình 3.5 Keát quaû ñieän di vôùi caùc caëp moài SHV, TEM vaø CTX-M. (1) caëp moài SHV; (2) caëp moài TEM; (3) caëp moài CTX-M; L: thang 1kb plus; DE611 – EG1013: chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone; EG211: chuûng S. sonnei nhaïy vôùi ceftriaxone; chöùng aâm: chöùa nöôùc thay vì DNA. Chuùng toâi tieán haønh phaûn öùng PCR vôùi caùc caëp moài ñaëc hieäu cho moät soá nhoùm thuoäc hoï gen CTX-M nhö CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-9. Keát quaû cho thaáy 18/21 chuûng (85,7%) döông tính vôùi caëp moài CTX-M-1 vaø 3/21 chuûng (14,3%) döông tính vôùi caëp moài CTX-M-9 (hình 3.6). Hình 3.6 Keát quaû ñieän di vôùi caùc caëp moài CTX-M-1, CTX-M-2 vaø CTX-M-9. (1) caëp moài CTX-M-1; (2) caëp moài CTX-M-2; (3) caëp moài CTX-M-9; L: thang 1kb plus; DE611 – EG1013: chuûng S. sonnei khaùng ceftriaxone; EG211: chuûng S. sonnei nhaïy vôùi ceftriaxone; chöùng aâm: chöùa nöôùc thay vì DNA. ÔÛ nhöõng chuûng DE611, EG187 (döông tính vôùi caëp moài CTX-M-9) vaø EG162 (döông tính vôùi caëp moài CTX-M-1), ngoaøi vaïch döông tính vôùi töøng caëp moài nhö ñaõ noùi treân, chuùng toâi thaáy coù theâm 1 vaïch môøø coù cuøng kích thöôùc ôû saûn phaåm khueách ñaïi cho caëp moài CTX-M-1 (chuûng DE611 vaø EG187), vaø caëp moài CTX-M-9 (chuûng EG162). Ñeå kieåm tra caùc saûn phaåm naøy coù ñaëc hieäu vôùi caùc caëp moài neâu treân hay khoâng, chuùng toâi thöïc hieän vieäc giaûi maõ trình töï saûn phaåm khueách ñaïi neâu treân. Keát quaû cho thaáy nhöõng tín hieäu khoâng roõ raøng cuûa caùc trình töï (nhieàu tín hieäu cuûa nhieàu trình töï khaùc nhau trong saûn phaåm khueách ñaïi). Nhö vaäy,ñaây laø caùc saûn phaåm khueách ñaïi khoâng ñaëc hieäu. Chuùng toâi thaáy raèng coù söï töông quan giöõa keát quaû PCR vôùi keát quaû ESBL ñaõ thöïc hieän tröôùc ñoù (baûng 3.2). Caùc chuûng S. sonnei cho keát quaû ESBL döông tính vôùi caû hai caëp ñóa khaùng sinh – khaùng sinh/chaát öùc cheá coù keát quaû PCR döông tính vôùi caëp moài CTX-M-1. Trong khi ñoù, nhöõng chuûng S. sonnei coù keát quaû ESBL chæ döông tính vôùi moät caëp ñóa khaùng sinh – khaùng sinh/chaát öùc cheá cho keát quaû PCR döông tính vôùi caëp moài CTX-M-9 (baûng 3.4). Baûng 3.4 So saùnh keát quaû kieåm tra ESBL vaø PCR cuûa caùc chuûng S. sonnei CroR Soá chuûng Chuûng Keát quaû ESBL Keát quaû PCR 18 chuûng (85,7%) EG162, EG204, EG250, EG373, EG384, EG390, EG395, EG421, EG424, EG430, EG472, EG1007, Döông tính vôùi 2 caëp ñóa khaùng sinh CTX-M-1 EG1008, EG1009, EG1010, EG1011, EG1012, EG1013 3 chuûng (14,3%) DE611, EG187, EG356 Döông tính vôùi 1 caëp ñóa khaùng sinh CTX-M-9 3.6 Trình töï gen maõ hoùa ESBL Saûn phaåm PCR (vôùi caëp moài CTX-M-1 vaø CTX-M-9) ñöôïc giaûi trình töï vaø phaân tích baèng phaàn meàm BioEdit vaø Vector NTI 7.0. Keát quaû sau khi phaân tích ñöôïc so saùnh vôùi cô sôû döõ lieäu cuûa ngaân haøng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information). Keát quaû giaûi trình töï cho thaáy taát caû trình töï cuûa caùc saûn phaåm khueách ñaïi töø caùc chuûng baèng caëp moài CTX-M-1 töông ñoàng 100% vôùi trình töï cuûa gen blaCTX-M-15 (maõ soá FJ668785.1) (hình 3.7). Trong khi ñoù, taát caû trình töï saûn phaåm khueách ñaïi töø caùc chuûng baèng caëp moài CTX-M-9 töông ñoàng 100% vôùi trình töï cuûa gen blaCTX-M-14 (maõ soá DQ350884.1) ñaõ coâng boá treân Ngaân haøng Gen NCBI. Hình 3.7 Ñoä töông ñoàng veà trình töï nucleotide cuûa caùc saûn phaåm khueách ñaïi vôùi caëp moài CTX-M-1 Chuùng toâi nhaän thaáy coù söï khaùc bieät ñaùng keå giöõa hai trình töï gen blaCTX- M-15 vaø blaCTX-M-14 khi so saùnh ñoä töông ñoàng cuûa chuùng baèng phaàn meàm Vector NTI 7.0. Ñoä khaùc bieät giöõa hai gen naøy laø 31,6% (hình 3.8). Hình 3.8 Ñoä töông ñoàng veà trình töï nucleotide cuûa caùc saûn phaåm khueách ñaïi vôùi caëp moài CTX-M-1 (maãu EG162) vaø CTX-M-9 (maãu DE611) Keå töø laàn ñaàu tieân ñöôïc phaùt hieän vaøo naêm 1986 taïi Nhaät Baûn, caùc enzyme ESBL thuoäc hoï CTX-M hieän nay ñaõ trôû phoå bieán treân theá giôùi, ñaëc bieät ôû moät soá khu vöïc nhö Nam Myõ, Chaâu AÂu vaø vuøng Ñoâng AÙ [13, 23, 26]. Caùc CTX-M naøy chuû yeáu ñöôïc phaùt hieän ôû caùc loaøi E. coli, Klebsiella pneumonia vaø Salmonella enterica. Hieän nay ôû chaâu AÙ, CTX-M phoå bieán nhaát laø CTX-M-15 vaø CTX-M-14. ÔÛ Ñoâng Nam AÙ, CTX-M môùi chæ ñöôïc coâng boá ôû Vieät Nam (naêm 2002), ôû Singapore (naêm 2004) vaø ôû Thaùi Lan (naêm 2007). Trong ñoù, CTX-M taïi Vieät Nam ñaõ ñöôïc coâng boá ôû loaøi K. pneumonia laø CTX-M-14 vaø CTX-M-17; taïi Singapore laø CTX-M-9, CTX-M-11, CTX-M-15, CTX-M-2 vaø CTX-M-20 ôû E. coli vaø K. pneumonia; taïi Thaùi Lan laø CTX-M-9, CTX-M-14 vaø CTX-M-15 phaùt hieän ôû caùc loaøi vi khuaån E. coli vaø K. pneumonia [4, 26, 27]. Maëc duø CTX-M ngaøy caøng trôû neân phoå bieán ôû caùc vi khuaån ñöôøng ruoät, nhöng coâng boá veà CTX-M ôû Shigella spp. coøn raát ít. Phaùt hieän ñaàu tieân veà CTX- M ôû S. sonnei laø CTX-M-2 trong chuûng phaân laäp ñöôïc taïi Argentina vaøo naêm 2001 [18]. Cho ñeán nay, söï hieän dieän cuûa CTX-M treân Shigella chæ ñöôïc phaùt hieän ôû moät soá nöôùc nhö Haøn Quoác, Thoå Nhó Kì, Hoàng Koâng, Trung Quoác, Bangladesh, Ireland vaø gaàn ñaây nhaát laø Coäng hoøa Seùc [3, 9, 12, 29, 30]. Taïi Vieät Nam, chöa coù moät baùo caùo naøo veà vi khuaån Shigella spp. mang CTX-M. Nhö vaäy, nghieân cöùu naøy laàn ñaàu tieân chöùng minh coù söï hieän dieän cuûa CTX-M-14 vaø CTX-M-15 ôû Shigella sonnei ôû Vieät Nam. Ngoaøi ra, ñaây cuõng laø laàn ñaàu tieân coâng boá coù söï hieän dieän cuûa enzyme ESBL CTX-M-15 ôû Vieät Nam, vaø CTX-M- 15 laø ESBL phoå bieán trong nhöõng chuûng S. sonnei CroR phaân laäp ñöôïc töø caùc maãu beänh phaåm taïo HTD vaø beänh vieän Ñoàng Thaùp. 3.7 Keát quaû chuyeån plasmid mang gen maõ hoùa ESBL töø S. sonnei khaùng ceftriaxone sang E. coli J53AzR baèng tieáp hôïp Plasmid töø S. sonnei khaùng ceftriaxone ñöôïc chuyeån sang E. coli J53AzR baèng tieáp hôïp. E. coli J53AzR sau khi nhaän plasmid ñöôïc choïn loïc treân moâi tröôøng LB-Sodium azide-ceftriaxone (LB-SA-Cro). Caùc chuûng moïc ñöôïc treân moâi tröôøng naøy ñöôïc taùch chieát plasmid theo phöông phaùp cuûa Kado-Liu, vaø so saùnh vôùi chuûng hoang daïi. Keát quaû theå hieän trong hình 3.9 Hình 3.9 Caùc plasmid cuûa chuûng E. coli J53AzR tieáp hôïp (1) vaø chuûng S. sonnei CroR hoang daïi (2)ø. Ladder: chuûng E. coli 39R861, J53: chuûng E. coli J53AzR, töø DE611 – EG424: maõ caùc chuûng thöïc hieän tieáp hôïp. Töø keát quaû cuûa thí nghieäm, chuùng toâi nhaän thaáy plasmid mang gen ESBL cuûa S. sonnei CroR coù theå chuyeån deã daøng sang vi khuaån E. coli J53AzR. Ñieàu naøy daãn ñeán söï lo ngaïi plasmid mang gen ESBL coù theå chuyeån deã daøng qua caùc loaøi vi khuaån ñöôøng ruoät khaùc, vaø daãn ñeán vieäc lan truyeàn tính khaùng khaùng sinh qua caùc vi khuaån naøy. Soá löôïng cuûa caùc plasmid coù theå chuyeån töø S. sonnei CroR sang E. coli thay ñoåi. Trong ñoù, chuûng DE611, EG187 vaø EG356 chæ chuyeån ñöôïc 1 plasmid, coøn caùc chuûng khaùc chuyeån ñöôïc töø 2 ñeán 4 plasmid. Vì vaäy, ñeå xaùc ñònh chính xaùc plasmid mang gen khaùng ceftriaxone, chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän phöông phaùp lai Southern blotting. 3.8 Keát quaû lai Southern Blot Tieán haønh lai southern blot plasmid cuûa S. sonnei CroR vôùi maãu doø laø caùc saûn phaåm PCR vôùi caùc caëp moài ñaëc hieäu cho CTX-M-1 vaø CTX-M-9. Keát quaû theå hieän trong hình 3.10 vaø 3.11 A B Hình 3.10 Keát quaû Southern Blotting vôùi maãu doø laø saûn phaåm khueách ñaïi vôùi caëp moài CTX-M-9. (A): baûn gel tröôùc khi lai Southern Blotting; (B) baûn phim sau khi lai Southern Blotting. L: chuûng E. coli 39R861, 1 – 3: S. sonnei khaùng ceftriaxone (döông tính vôùi caëp moài CTX-M-9), 4: chöùng döông (saûn phaåm khueách ñaïi cuûa caëp moài CTX-M-9). L 1 2 3 4 A B Hình 3.11 Keát quaû Southern Blotting vôùi maãu doø laø saûn phaåm khueách ñaïi vôùi caëp moài CTX-M-1. (A): baûn gel tröôùc khi lai Southern Blotting; (B) baûn phim sau khi lai Southern Blotting. L: chuûng E. coli 39R861, 1: chöùng döông (saûn phaåm khueách ñaïi cuûa caëp moài CTX-M-1), 2 – 14: S. sonnei khaùng ceftriaxone (döông tính vôùi caëp moài CTX-M-1). Nhö vaäy, gen khaùng ceftriaxone ôû S. sonnei haàu nhö naèm treân plasmid lôùn nhaát coù kích thöôùc naèm trong khoaûng 63 kb – 147 kb. ÔÛ nhöõng chuûng coù 2 plasmid naèm trong khoaûng kích thöôùc naøy, plasmid mang gen khaùng laø plasmid lôùn thöù hai.