Luận văn Xây dưng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi bằng phương pháp sinh học phân tử

iện tích trồng bƣởi không tăng. Mặt khác, giống bƣởi năng suất và phẩm chất rất tốt là cây Bƣởi Đƣờng Da Láng lại giảm rõ rệt. Nguyên nhân chính là do bị nhiễm bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây nên. Vi khuẩn không ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng quả nhƣng gây nên những vết sần sùi trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trƣờng. Ngoài ra, vi khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây. Không chỉ gây hại trên cây bƣởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại hầu hết các loại cây có múi từ mức độ nhẹ đến nặng. Để xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng pháp sinh học phân tử”. Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phƣơng pháp phòng và trị bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bƣởi Đƣờng Da Láng mang lại hiệu quả kinh tế cao. 1.2. Mục đích - Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có muối (cây bƣởi). - Phân loại tính độc của chủng gây bệnh. 2 1.3. Yêu cầu - Thành thạo các thao tác phân lập, nuôi cấy, chủng bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm. - Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn. - Thành thạo phƣơng pháp ly trích DNA vi khuẩn. - Tính toán, thiết lập đƣợc phản ứng PCR, hạn chế tối đa tạp nhiễm. 1.4. Giới hạn của đề tài - Chỉ xác định đƣợc chủng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam là Xanthomonas sp. - Chƣa giải đƣợc trình tự sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS, chƣa thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên hrpW để định danh chính xác chủng vi khuẩn gây bệnh ở mức độ loài. 3 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi Cây có múi hiện đang trồng ở nhiều nƣớc trên thế giới đều có nguồn gốc từ các nƣớc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á. Đƣờng ranh giới của vùng xuất xứ cây ăn quả có múi nằm ở dãy chân núi Himalaya, phía đông Ấn Độ qua miền nam Trung Quốc, về phía nam đƣờng ranh giới vùng đi qua Australia (theo Taraka, 1971). Lịch sử trồng cây có múi ở nƣớc ta xuất hiện từ rất lâu đời cách đây 3000-4000 năm (Đƣờng Hồng Dật). Ngày nay, cây có múi đƣợc trồng trên khắp đất nƣớc ta từ Lào Cai đến Cà Mau, từ Quảng Ninh đến Lai Châu. Đặt biệt là bƣởi với nhiều giống đƣợc trồng ở nƣớc ta: bƣởi Da Láng, bƣởi Năm Roi, bƣởi Lông Cổ Cò, bƣởi Đƣờng Cam, bƣởi Da Xanh, bƣởi Lông Hồng.Các vùng trồng bƣởi nổi tiếng ở nƣớc ta nhƣ Đồng Nai và các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. 2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc Cây ăn quả có múi nhƣ cam, quýt, bƣởi là một trong những loại quả cao cấp đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng và đƣợc sản xuất ở nhiều nƣớc trên thế giới. Giá trị dinh dƣỡng cây ăn quả có múi rất cao. Trong thành phần thịt quả có chứa 6-12% đƣờng, chủ yếu là sacaroza. Hàm lƣợng vitamin C trong quả là 40-90% mg/100g tƣơi. Các loại axit hữu cơ chứa trong thịt quả là 0,4-1,2%, trong đó có nhiều axit có hoạt tính sinh học cao. Trong quả còn chứa các chất khoáng và dầu thơm. Tinh dầu đƣợc cất từ vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng trong công nghiệp thực phẩm. Đặc biệt là chanh yên, một tấn quả có thể đạt đƣợc 67 lít tinh dầu, tinh dầu ca quýt có giá trị khá cao trên thị trƣờng quốc tế. Ở nhiều nƣớc trên thế giới, từ những thời xa xƣa, ngƣời ta đã biết dùng các thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh. Ở thế kỷ thứ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dƣới da. Ở nƣớc ta ngƣời dân đã dùng cây, lá, hoa, quả các loại cây ăn có múi để phòng và chữa bệnh từ thời xa xƣa. Lê Quý Đôn vết trong sách “ Vân đài loại ngữ” “Quýt 4 vàng là thƣợng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát là hạ phẩn, vỏ quýt có tính khoan trung hạ khí”, vỏ quýt có tên dƣợc liệu là “ trần bì” đƣợc sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cổ truyền. Giá trị kinh tế, cây ăn quả có múi là cây lâu năm chóng cho thu hoạch, cây cam quýt có thể sống và chóng cho thu hoạch quả trong vòng 25-30 năm vẫn cho năng suất cao, đạt từ 100-250 kg quả/1cây trong một vụ.(Đƣờng Hồng Dật, 2000). 2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam Theo thống kê của ngành nông nghiệp thì đến năm 1993 diện tích trồng cam quýt ở nƣớc ta là 27.640 ha, tăng hơn năm 1989 năm là trên 10.000 ha (năm 1989- 17.205ha). Những năm gần đây diện tích trồng cam quýt ở một số nơi, nhất là ở một số tỉnh ĐBSCL tăng nhiều, trong khi một số tỉnh miền trung nhƣ Nghệ An, Hà Tỉnh, Quảng Bình, diện tích trồng cam quýt bị giảm xuống, năm 1999 cả nƣớc có vào khoảng trên dƣới 30.000 ha. Sản lƣợng cam quýt ở nƣớc ta năm 1993 đƣợc thống kê là 163.778 tấn, tăng khoảng 63.000 tấn so với năm 1989 (100.998 tấn). Năm 1999 ƣớc tính sản lƣợng cây có múi trong cả nƣớc là 300.000 tấn. Điều kiện đất đai và khí hậu nƣớc ta phù hợp cho phát triển cây ăn quả có múi. Tuy nhiên, quá trình tăng chậm và quá trình phát triển cây ăn quả có múi diễn biến thất thƣờng ở từng vùng sản xuất. Ở một số vùng trồng cam nổi tiếng trƣớc đây nhƣ vùng cam Bố Hạ (Bắc Giang), vùng cam Xã Đoài (Nghệ An), không những diện tích không tăng lên mà còn giảm xuống. (theo Đƣờng Hồng Dật, 2000). Năm 1995, diện tích trồng cây ăn quả trong cả nƣớc là 346.400 ha trong đó ĐBSCL 175.000 ha (50,7%), trung du miền núi Bắc Bộ 47.600 ha (13,7%), ĐBSH 33.800 ha (9,8%), miền Đông Nam Bộ 32.700 ha (9,5%), khu IV cũ 27.400 (7,9%), duyên hải miền Trung 20.600 ha (6,9%), Tây Nguyên 8.600 ha (2,5%). Theo Tổng cục thống kê năm 1996, vùng ĐBSCL đứng đầu về sản lƣợng cũng đứng hàng đầu chiếm tỷ trọng 49, 05%. (Trần Thế Tục, 1998). 2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới Trong những năm nửa sau thế kỷ XX, sản xuất cam quýt trên thế giới tăng nhanh. Theo tài liệu của Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp của Liên hợp quốc (FAO) 5 trong vòng 20 năm (từ năm 1975 đến năm 1995), sản lƣợng cam quýt trên thế giới tăng từ 22 triệu tấn lên đến 48 triệu tấn, tăng cao nhất là cam, quýt đỏ rồi đến chanh yên, bƣởi chùm và chanh. Trong vòng 15 năm tính từ năm 1970 đến năm 1984, sản lƣợng cam tăng bình quân là 51%, quýt 7,5%, chanh 4,7%, bƣởi chùm là 4,3%/ năm. Tổng sản lƣợng cam quýt trên thế giới trong những thập niên 90 của thế kỷ XX bình quân hàng năm là 60-70 triệu tấn với tổng diện tích là 2,5 triệu ha, tập trung ở các nƣớc có khí hậu á nhiệt đới và một phần nhiệt đới ở các vĩ độ cao hơn 20-22oC bắc và nam bán cầu. Hiện nay có 75 nƣớc trồng cam quýt trên thế giới đƣợc chia thành 4 khu vực : Châu Mỹ, các nƣớc Địa Trung Hải, các nƣớc Châu Phi và các nƣớc Châu Á. Những nƣớc trồng nhiều cam quýt nhất là Mỹ 9,6 triệu tấn /năm, Braxin 7,2 triệu tấn/ năm, Tây Ban Nha 1,7 triệu tấn / năm. Nhật Bản cung cấp10% sản lƣợng cam quýt trên thế giới với 2,7 triệu tấn vào những năm 20 của thế kỷ XX, trong đó chủ yếu là quýt Unshiu, loại quýt này chiếm 49,2% tổng sản lƣợng quả cam quýt của Nhật. (Đƣờng Hồng Dật, 2000). Thống kê năm 1967 của FAO cho biết tổng sản lƣợng về trái có múi là 28.902.000 tấn, trong đó cam và quýt chiếm 23.434.000 tấn tức 81% và bƣởi (cộng với bƣởi chùm ) chỉ có 2.286.000 tấn tức 7,9% chƣa bằng 1/10 cam, quýt. Dẫn chứng là Mỹ chỉ sản xuất bƣởi chùm (Citrus paradis ), không sản xuất bƣởi (Citrus grandis) đã chiếm tới 1.161.000 tấn tức 70,7% tổng số bƣởi và bƣởi chùm. Trong khi cả châu Á trong đó có hai nƣớc lớn nhất là Ấn Độ và Philippin, trong cả bƣởi và bƣởi chùm chỉ sản xuất 59.000 tấn tức 2,6%. Hiện nay, sản lƣợng trái có múi cả thế giới đã vƣợt quá 50 triệu tấn, gần gấp đôi năm 1967, song tỷ lệ trên đây không thay đổi nhiều và phần của bƣởi còn thấp hơn nữa.(Vũ Công Hậu, 1996). 2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) 2.2.1. Triệu chứng bệnh Bệnh loét hại cam quýt ở tất cả các bộ phận của cây trên mặt đất, làm rụng lá, quả, cây cằn cọc chóng bị tàn. Ở vƣờn ƣơm, khi bị bệnh nặng cây con dễ chết. Quả bị bệnh có phẩm chất kém không thể xuất khẩu và cất trữ đƣợc. Nhiều nƣớc trồng cam, quýt trên thế giới đã cấm nhập những cây, mắt ghép, quả bị bệnh. Bệnh phá hoại ở 6 nhiều nƣớc và đã phát triển thành dịch ở khắp vùng châu Á nhiệt đới-Thái Bình Dƣơng. Bệnh còn thấy ở các nƣớc châu Mỹ, châu Phi. Ở nƣớc ta bệnh hầu nhƣ phá hại ở tất cả các vùng trồng cam quýt, gây thiệt hại đáng kể làm ảnh hƣởng tới nguồn hàng xuất khẩu và tiêu dùng trong nƣớc. Bệnh thƣờng bắt đầu xuất hiện ở lá non. Ban đầu vết bệnh là những chấm nhỏ có đƣờng kính dƣới 1mm màu trắng vàng thƣờng thấy ở mặt dƣới lá. Sau đó vết bệnh mở rộng hơn phá vỡ biểu bì mặt dƣới lá. Xung quanh vết bệnh có vầng tròn dạng giọt dầu màu nâu hoặc xanh tối. Sau 2-3 tuần vết bệnh phát triển thành loét hình tròn màu nâu xám. Khi vết loét già hóa gỗ rắn lại hình dạng vẫn còn hoặc không định hình. Trên cây bƣởi vết bệnh khoảng 8mm. Ở quả vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá.Vết bệnh rắn xù xì màu nâu ở giữa lõm, mép ngoài nổi gờ lên, ở giữa vết bệnh mô chết rạn nứt. Toàn thể chiều dày của vỏ quả có thể bị loét nhƣng không bao giờ vết loét ăn sâu vào ruột quả, bệnh nặng có thể làm cho quả biến dạng ít nhiều. Hình 2.1 Triệu chứng bệnh loét trên lá bƣởi Da Láng Hình 2.2 Triệu chứng bệnh loét trên trái bƣởi Da Láng 7 Ở cành vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá nhƣng sùi lên tƣơng đối rõ ràng, ở giữa vết bệnh không lõm xuống hoặc lõm xuống không rõ rệt. Vết bệnh còn xuất hiện ở gai cũng giống nhƣ ở cành cây. . 2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri) Vi khuẩn có hình gậy ngắn, kích thƣớc khoảng 1,5-2 x 0,5-0,75µm, hai đầu tròn có một lông roi ở đầu, có thể nối liền thành chuỗi, có vỏ nhờn nhuộm gram âm, háo khí. Độ dài genome khoảng 5 Mbp. Sinh trƣởng dễ dàng trên môi trƣờng agar – glucose –peptone, khuẩn lạc hình tròn, sáng, bóng, màu vàng sáp. Đặc trƣng để phân biệt vi khuẩn Xanthomonas sp. với loại vi khuẩn màu vàng khác là nó có thể sinh trƣởng thành khuẩn lạc màu vàng sáp trên miếng lát cắt củ khoai tây. Phạm vi nhiệt độ phát triển là 5-35oC, thích hợp 20-30oC. Ở nhiệt độ 52oC trong10 phút vi khuẩn chết. Vi khuẩn phát triển và hoạt động trong phạm vi pH 6,1- 8,8, thích hợp ở pH 6,6. Vi khuẩn có khả năng chịu hạn ở nhiệt cao, trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể tồn tại 130 ngày. Bệnh loét cam, bƣởi là bệnh hại có tính nhiệt đới, vi khuẩn gây bệnh phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ƣớt, sức chống hạn và lạnh cao. Vi khuẩn tồn tại trong vết lá, cành bệnh từ năm này qua năm khác. Theo Wolf (1916) vi khuẩn bệnh loét cam có thể tồn tại qua đông trong đất, nhƣng Pltier và Frederich lại cho rằng vi khuẩn không thể tồn tại qua đông ở trong đất hoặc trong lá rụng. Lee (1920) và Fulton (1925) cho rằng vi khuẩn bệnh loét cam không đấu tranh đƣợc với tập đoàn vi khuẩn khác nên dễ dàng chết trong đất. Loucks Hình 2.3 Triệu chứng bệnh loét trên cành bƣởi Da Láng 8 (1930) đã chứng minh rằng vi khuẩn ở trong đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 6-13 ngày nhƣng trong đất vô trùng có thể tồn tại đƣợc 150 ngày. Theo Rao và Hingorant ở đất vô trùng, vi khuẩn sống đƣợc 52 ngày còn ở đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 17 ngày. Cũng từ hai tác giả trên thời gian sống của vi khuẩn ở những lá cây chết rụng xuống đất khoảng 6 tháng. (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Vào mùa mƣa trời ẩm ƣớt vi khuẩn từ trong vết bệnh cũ hoạt động, truyền lan đi trong mƣa, gió hoặc côn trùng, chim. Vi khuẩn cũng có thể truyền dễ dàng qua quần áo, nông cụ. Vi khuẩn rơi trên quả, lá, cành sẽ xâm nhập qua vết thƣơng, khí khổng. Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh: bệnh phát sinh do 3 yếu tố cơ bản tác động lẫn nhau quyết định là “cây ký chủ- vi khuẩn gây bệnh-điều kiện ngoại cảnh môi trƣờng” (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Dựa triệu chứng bệnh và sự biến chủng của vi khuẩn có các loại bệnh loét sau: - Loại Asiatic (Canker A), do Xanthomonas axonopodis pv.citri, bắt nguồn từ châu Á, phân bố rộng, khả năng gây bệnh rất mạnh. - Loại B, do Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii , bắt nguồn từ Nam Mỹ, gây bệnh chủ yếu trên chanh nhỏ, cam chua, bƣởi. - Loại C, cũng do Xanthomonasdis axonopodis pv. aurantifolii nhƣng gây bệnh trên chanh nhỏ và cam chua. - Loại A* đƣợc phát hiện ở Oman, Saudi Arabia, Iran và Idian chỉ gây bệnh trên chanh. ( 2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS 2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA Những gen mã hóa rRNA đƣợc tìm thấy trong vùng rDNA. Sản phẩm của những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom có chức năng tổng hợp protein. Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình tự của gen này thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn. Gene rDNA đƣợc tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và 9 prion). Các thành phần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau đƣợc đánh dấu giống nhau. Điều này có nghĩa, trình tự của những sinh vật thân cận đã đƣợc sắp xếp chính xác, làm cho những khác biệt dễ dàng để đánh giá. Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gene rDNA từ bất cứ loài vi khuẩn nào. Trình tự của rDNA 16S đã đƣợc xác định cho nhiều loài. Sự thật, không có bất kỳ gen nào khác đặc trƣng cho nhiều loài nhƣ vậy. Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA đƣợc cho rằng là vùng tiến hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer đƣợc thiết kế từ những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thƣớc nhỏ (600 – 700 bp) dễ dàng đƣợc khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30000 bản trong mỗi tế bào (Dubouzet and Shinoda, 1999) của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng ITS trở thành một đề tài đƣợc quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa và phát sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng nhƣ các nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993; Hsiao và ctv., 1994; Dubouzet và Shinoda, 1999). (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005). 2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. Phân tích mối quan hệ loài dựa trên vùng 16s-23s rDNA bằng cách thiết kế cặp primer Xan1330 và Xan332 dựa trên vùng gen 16s-23s rDNA ở Xanthomonas sp. Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1 kb và đƣợc xác định là Xanthomonas sp. (Edmilson R Gonealves và Yoko. B. Rosato, 2002). (Hình 2.3, Hình 2.4) 2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen Sự tƣơng tác giữa ký sinh với ký chủ phụ thuộc vào hệ thống protein . Đặc biệt đối với tƣơng tác vi khuẩn gram âm gây bệnh thực vật với cây ký chủ. Loại protein này đƣợc mã hóa bởi hrp gen. Trên Xanthomonas axonopodis pv.citri ngƣời ta xác định các loại hrp gen: hrpG, hpaA, hpaB, hrcV, hrpB1, hrpD6, hrpB2, hrcU, hrcW, hrpB4, hrcN. Trên X. a. pv.citri các hrp gen này nằm thành cụm trừ hrpW. (Marcos C. Alergria và ctv, 2004). Dựa vào đặc tính của hrp gen là đặc trƣng cho từng loài gây bệnh nên ngƣời ta thiết kế primer chuyên biệt cho phản ứng PCR phát hiện nhanh, 10 chính xác loài gây bệnh. Phƣơng pháp phát hiện nhanh bằng primer chuyên biệt này nhanh, chính xác hơn các phƣơng pháp nuôi cấy. Hình 2.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng Xanthomonas sp. dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS (Edmilson R Gonealves và ctv, 2002). Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS của Xanthomonas sp. Trình tự primer Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên vùng 16s-23s (Edmilson R Gonealves và ctv, 2002). Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’ Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’ 11 Ngƣời ta dựa vào trình tự hrpW gen của X. a. pv. citri (Genbank Accession No. AE008923) thiết kế cặp primer XACR, XACF chuyên biệt phát hiện nhanh chính nó. Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 561 bp (Dong Suk Park và ctv, 2006) XACR 5’CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’ XACF 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’ 2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam 2.5.1. Trên Thế Giới Năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền giữa 17 loài Xanthomonas sp. bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự sản phẩm PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS. Năm 2003, C. J. Vernière và ctv đã nghiên cứu sự phát triển và biểu hiện triệu chứng bệnh của X. a. pv. citri trên cây có múi. C. J. Vernière và cộng sự đã kết luận rằng để giảm bệnh loét nhà nông phải hạn chế tạo vết thƣơng cho cây, sự tăng trƣởng quá nhiều chồi non và sự tăng trƣởng của quần thể X. a. pv. citri. Hệ thống chắn gió là biện pháp hạn chế sự lan tràn bệnh hiệu quả nhất. Các tác nhân sinh học khác nhƣ ấu trùng của côn trùng chít hút cũng là phƣơng tiện truyền bệnh nguy hiểm. Khả năng nhiễm bệnh của ký chủ có liên quan đến giai đoạn phát triển của cây. Năm 2003, Jung-Gun- Kim và ctv, đã mô tả đặc tính của vùng gây bệnh hrp của X. a. pv. glycines Vùng này gồm vùng hrp gen, vùng hcr gen và vùng hca gen.Trong đó vùng hrp và hcr mã hóa cho loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn X. a. pv. glycine. Đặc tính của vùng hrp gen này là chứa nhiều gen độc, thành phần G+C thấp. Năm 2006, Dong Suk Park và ctv, đã thực hiện thành công phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt trên hrpW gen để phát hiện nhanh và chính xác X. a. pv.citri, là loài gây bệnh loét trên cây có múi tại châu Á. 2.5.2. Tại Việt Nam Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Cúc -Phạm Thị Hoàng Oanh, trƣờng Đại Học Cần Thơ, có nghiên cứu về dịch hại trên cam, quít, chanh, bƣởi. Nghiên cứu này tập hợp 12 hầu hết các thông tin về dịch hại phổ biến tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, tổng cộng có trên 30 loài côn trùng và 15 loại bệnh phổ biến trên nhóm cam, quít, chanh, bƣởi đã đƣợc trình bày và mô tả qua các phần nhƣ đặc điểm hình thái, sinh học, sinh thái, sự gây hại, triệu chứng và các biện pháp đối phó. Năm 2005, Vi Thị Thanh Hƣờng, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu các tác nhân và biện pháp phòng trừ biện pháp phòng trừ bệnh loét trên bƣởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu - tỉnh Đồng Nai. Tác giả đã phân lập đƣợc một số dòng vi khuẩn gây bệnh nhƣng chƣa định danh đƣợc. Đồng thời, tác giả cũng xác định một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh loét. 2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. . 2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa 1. Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập dòng gây bệnh (Bảng 2.1) 2. Xác định dựa vào sắc tố vàng Xanthomonadin. (Phƣơng pháp thực hiện sẽ nêu ở phần 3.4.3 phƣơng pháp và vật liệu) 3. Thực hiện thí nghiệm sinh hóa và quan sát hình thái (Bảng 2.2) a) Khả năng phát triển trong môi trƣờng YS ở 35oC trong 10-12 ngày. b) Kiểm tra sự tạo nhầy, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trƣờng GYCA hoặc YDC trong 2-3 ngày. c) Kiểm tra khả năng phân hủy protein: là thử nghiệm khả năng phân hủy casein trong dịch sữa có chứa chất chỉ thị bromcresol purple đã khử trùng. Dịch sữa và khuẩn đƣợc ủ 27oC quan sát phản ứng phân hủy. d) Kiểm tra thủy phân asculin: phản ứng dƣơng tính khi dịch đổi màu nâu tối (môi trƣờngYS lỏng + ferric ammonium citrate 0,05% và asculin 0,1%, pH 6,8). e) Kiểm tra khả năng thủy phân gelatin. f) Kiểm tra khả năng tạo urease. g) Kiểm tra tạo axit từ carbohydrates. 13 4. Kiểm tra tính gây bệnh Khẳng định độc tính dòng phân lập đƣợc bằng cách chủng nhân tạo. Ký chủ đƣợc chủng hoàn toàn là cây sạch bệnh. Tạo vết thƣơng trên cây ký chủ. Sau đó nhỏ dòng vi khuẩn đã kiểm tra các bƣớc trên lên vết thƣơng. Đặt cây ký chủ đã chủng vào điều kiện tối ƣu cho bệnh phát triển. Thông thƣờng thì ở nhiệt độ 27oC-30oC, trong vòng 7 ngày sau khi chủng thì thấy triệu chứng bệnh. 2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử Dựa trên quy trình định danh bằng phƣơng pháp nuôi cấy và kiểm tra sinh hóa nhƣng bổ sung thêm một số phƣơng pháp sinh học phân tử để định danh chính xác ở mức loài. Quy trình gồm các bƣớc sau: 1. Phân lập và kiểm tra hình thái, sinh hoá trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ NA, YGA, YDC, KB. 2. Tiến hành kiểm tra dòng phân lập đƣợc bằng phản ứng ELISA để kiểm tra và phân loại dựa trên độc tính gây bệnh. 3. Kiểm tra sự oxy hóa nguồn cacbon (khả năng tạo axit từ đƣờng cacbon). 4. Kiểm tra khả năng gây bệnh của dòng phân lập bằng phƣơng pháp chủng nhân tạo. 5. Thực hiên phản ứng PCR với cặp primer đƣợc thiết kế trên vùng 16s-23s rDNA ITS. 6. Tiến hành cắt bằng enzyme giới hạn nghiên cứu sự đa dạng di truyền. 7. Đọc trình tự sản phẩm PCR trên vùng 16s-23s sẽ định danh đƣợc dòng vi khuẩn gây bệnh ở mức loài. (M. H. R Khoodoo và ctv, 2005). 14 Bảng 2.1. Môi trƣờng sử dụng phân lập một số loài X. campestris Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của Xanthomonas sp. Loài Môi trƣờng campestris carotae translucens phaseoli vesicatoria fragaria SX, SM, NSCAA* XCS* XTS MXP Tween, XCS, XTS SX, SM Phản ứng kiểm tra X. cam _pestris X.raga_ riae X.albili _neans X.axono _podis X. ampelina Tạo nhầy trên GYCA/YDC + + _ _ _ Sinh trƣởng ở 35oC + _ + + _ Thủy phân asculin + _ + + _ Phân hủy gelatin V + v _ _ Phân hủy protein + _ _ _ _ Khả năng tạo Urease _ _ _ _ + Tạo axit từ: Arabinose Glucose Mannose + + + _ + + _ + + _ + _ + _ _ Ghi chú: * thƣờng sử dụng phân lập từ hạt 15 2.7 Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học phân học phân tử, do Karl Mullis và những cộng sự phát minh năm 1985 và đã liên tục hoàn thiện và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA mong muốn lên nhiều lần để phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp PCR chủ yếu dựa vào khả năng tự nhân đôi, biến tính và hồi tính của DNA. *Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự phát hiện ra enzyme Taq- polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), ngƣời ta thiết lập đƣợc hàng loạt các phản ứng nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc bắt cặp bổ sung với 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Nhƣ vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA đƣợc lập lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu đƣợc một lƣợng khuếch đại rất lớn DNA cần nghiên cứu. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ đƣợc nâng lên 93- 100oC. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều đƣợc tách ra. - Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy-Tm của các mồi (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40- 70 oC, tuỳ thuộc vào Tm của các mồi mà thời gian từ 30 -60 giây. - Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ đƣợc nhân lên 68-72 oC. Ở nhiệt độ này Taq-polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 mồi đƣợc tổng hợp. Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra 2 DNA mới. Và sau mỗi lần lập lại sẽ làm tăng gấp đôi lƣợng DNA mẫu của lần trƣớc (theo cấp số nhân). Tổng số DNA đƣợc khuếch đại sau phản ứng PCR đƣợc tính theo công thức: Tổng số DNA khuếch đại = m x 2n Với m là số bản sao ban đầu của DNA mẫu, n là số chu kỳ. 16 PH ẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ 06/02/06 đến 06/08/06 Địa điểm: Tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật- Trƣờng Đại Học Nông Lâm T.P Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập, nuôi cấy, xác định dòng vi khuẩn gây bệnh là gram âm hay gram dƣơng, quan sát hình thái trên môi trƣờng PGA, YDC. 2. Chủng bệnh nhân tạo xác định dòng vi khuẩn phân lập đƣợc là dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên ký chủ là cây bƣởi. Dựa trên kết quả chủng bệnh khẳng định đặc tính gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập. 3. Thực hiện sắc ký bản mỏng để định danh Xanthomonas.sp (dựa vào sắc tố vàng Xanthomodin đặc trƣng). 4. Nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 5. Dùng phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332 để kiểm tra phƣơng pháp định danh đã thực hiện. Đồng thời tiến tới giải trình tự sản phẩm PCR định danh ở mức độ loài. 6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri. 3.3 Vật liệu nghiên cứu Tiến hành thu thập mẫu bệnh cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam tại huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại vƣờn, trữ trong thùng mát, mang về phòng, tiến hành phân lập. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định Gram âm hay Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi  Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất và vật liệu - Autoclave - Đƣờng glucose - Bếp điện - CaCO3 17 - Tủ cấy vô trùng - Yeast extract - Đĩa peitri - Khoai tây - Becher 100ml - Agar - Cồn 96%, và cồn 70% - Que cấy - Đèn cồn  Phân lập vi khuẩn gây bệnh, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định Gram âm hay Gram dƣơng 1. Thu thập mẫu bệnh, lá, trái bị bệnh. 2. Cắt nhỏ thành mẫu hay đoạn ngắn. 3. Khử trùng bề mặt bằng cách nhúng mô bệnh trong nƣớc cất vô trùng 1 phút, tiếp tục rửa bằng cồn 70% trong 15- 30 giây, sau đó rửa sạch trong nƣớc cất vô trùng. 4. Để khô mẫu sau đó cấy lên môi trƣờng PGA. 5. Nuôi cấy thuần khiết dòng vi khuẩn: từ đĩa petri phân lập vi khuẩn, chọn một khuẩn lạc, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cấy truyền vi khuẩn sang đĩa petri mới. Đặt đĩa Petri đã cấy truyền ở nhiệt độ thích hợp (28 oC) từ 1-3 ngày cho đến khi các khuẩn lạc mới mọc ra. Từ đó cấy truyền lại lần thứ 2 khi các khuẩn lạc đều đồng nhất về hình dạng, kích thƣớc, độ nhờn, cuối cùng khuẩn lạc đồng nhất nói trên đƣợc trữ trong LB tăng sinh (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mẫn 1999 và có chỉnh sửa, 1999). 6. Cấy các khuẩn lạc đã đồng dạng này cấy tiếp tục lên môi trƣờng YDC quan sát hình thái màu sắc đậm trƣng. 7. Xác định Gram âm hay Gram dƣơng: Nhỏ một giọt dung dịch KOH3% ra miếng lam. Sau đó, dùng que tăm lấy một vi khuẩn cần xác định khuấy đều trong giọt dung dịch. Kéo que tăm lên thấy dung dịch kéo sợi thì đó là Gram âm, còn không kéo sợi đó là Gram dƣơng. 18 - Cách đặt tên cho các dòng vi khuẩn phân lập được Dựa trên cây ký chủ thu thập mẫu lá và trái. Ví dụ: dòng vi khuẩn XBDL1 đƣợc hiểu là dòng Xanthomonas sp., BDL là tên ký chủ bƣởi Da Láng, số 1 là dòng vi khuẩn trên lá, số 2 là dòng trên cành, số 3 là dòng vi khuẩn trên trái. 3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo Chủng bệnh nhân tạo trong phòng: hái lá, quả bƣởi không bị nhiễm bệnh, rữa thật sạch dƣới vòi nƣớc chảy. Khi lá, quả bƣởi ráo nƣớc ta tiến hành chủng bệnh. Dùng kim nhọn gây vết thƣơng dƣới lá, sau đó dùng pipet hút dịch khuẩn (khuẩn lạc đặc trƣng pha với nƣớc cất vô trùng) nhỏ lên vết thƣơng. Giữ lá trong hộp nhựa đủ độ ẩm. 3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn  Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất và vật liệu - Bình hút ẩm - Methanol 100% - Epffendorf 1,5 ml - Nutrient - Micropipette 1000µl - Agar - Bếp điện - Tấm sắc ký - Máy ly tâm  Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng Nhiều vi khuẩn có sắc tố vàng thƣờng đƣợc phân lập từ cây hoặc đất. Xanthomonas cũng có sắc tố vàng. Do đó, việc dựa vào màu khuẩn lạc trên môi trƣờng để xác định đó là Xanthomonas thì khó. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn có thể xác định đƣợc Xanthomonas dựa vào phƣơng pháp sắc ký bản mỏng. Các bƣớc tiến hành: 1. Cấy khuẩn lạc trên môi trƣờng nutrient agar (môi trƣờng không có cacbonhydrate vì sẽ tạo chất nhầy cản trở quá trình sắc ký). 19 (b) 2. Sau 48 giờ phát triển ở nhiệt độ phòng, cạo sinh khối vi khuẩn cho vào ống típ, thêm 3ml methanol sao cho độ đục của vi khuẩn trong methanol khoảng 10 10 CFU/ml. 3. Đặt ống típ vào nƣớc đang sôi, cho đến khi màu vàng xuất hiện. 4. Ly tâm 1000 vòng/15 phút loại mảnh vỡ tế bào. 5. Thu dịch nổi, đồng thời làm bay hơi methanol trong dung dịch trong nƣớc ấm 50-60 oC cho đến khi mật độ quang học của dịch chiết sắc tố khoảng 0.4 ở 443nm. 6. Nhỏ dịch chiết sắc tố này lên tấm bản mỏng đo sắc tố. Mỗi dòng vi khuẩn là một giếng. mỗi giếng là 25µl (hình 3.1). 7. Đặt tấm sắc ký bản mỏng đã nhỏ sắc tố vào dung dịch methanol. Để cho methanol thẩm thấu lên tấm sắc ký này (hình 3.2). 8. Phát thảo vệt sắc tố màu vàng hiện lên tấm sắc ký. Vệt sắc tố màu vàng có Rf khoảng 0.45 chứng tỏ đó là Xanthomonas. Hình 3.1 (a) Tấm sắc ký vừa nhỏ Xanthomodin dung dịch sắc tố, (b) Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm. 3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn  Hóa chất và vật liệu - Hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform: izoamyl alcohol (24:1) - Isopropanol Vệt sắc tố sau khi nhỏ lên tấm sắc ký (a) 20 - Ethanol 100 % và 70 % - Dung dịch đệm ly trích DNA Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : tạo phức Mg++, gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % : phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác - 10g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) - 100ml NaCl 0,5 M Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8 Bảng 3.1. Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ stock Nồng độ Thể tích Tris (pH 8.0) 1 M 10 mM 0,5ml EDTA 0,5 M 0,5 mM 0,1ml Nƣớc cất 49,4ml Tổng cộng 50,0ml  Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để ly trích DNA - Epffendorf 1,5 ml - Micropipette các loại - Đầu típ các loại - Bồn ủ nhiệt - Máy vortex - Máy ly tâm lạnh - Giấy thấm - Tủ 4oC và - 20oC  Quy trình ly trích DNA tổng số 1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC. Rửa sinh khối vi khuẩn đƣợc với 1ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex. 21 2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30µl dung dịch SDS10%, đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37 oC khoảng 1-2 h. 3. Cho thêm vào 100µl dung dịch NaCl5M hòa tan thật kỹ bằng vortex. 3. Thêm 80µl dung dịch CTAB/NaCl, pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65oC trong 10 phút. 4. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1).Hòa hỗn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4oC. 5. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. 6. Thêm 780µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4 oC. 7. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol, ủ -20 oC/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10 phút/4 oC. Lấy kết tủa sau ly tâm. 8. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20 oC, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4 oC. Đổ cồn ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. 9. Hòa tan kết tủa trong 40µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4 oC trong suốt thời gian thử nghiệm. (Sambrook và ctv, 2001 đã có cải tiến) 3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen  Các hóa chất đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR - Dung dịch đệm PCR 10X (Bio-rad) - MgCl2 50 mM (Bio-rad) - dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Bio-rad) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Bio-rad) - Primer: Xan1330 và Xan332, XACR và XACF Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng thực hiện phản ứng PCR - Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2ml 22 - Micropipette 10µl, 100µl và các loại đầu típ tƣơng ứng - Máy luân nhiệt - Tủ vô trùng 3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005) Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’ Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’ Bảng 3.2. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR. Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR.cc 3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi XACF và XACR Sử dụng bặp mồi XACR, XACF khuếch đại vùng hrpW gen trên Xanthomonas axonopodis pv.citri có kích thƣớc 561bp. Đây là trình tự mồi chuyên biệt để xác định Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ sau phản ứng Thể tích (µl) PCR buffer 10X 1X 2,5 dNTPs 25mM 0,2mM 0,2 MgCl2 25 mM 0,75mM 0,75 Primer 20pmol/µl 1,25pmol/µl 1 Taq polymera se 5unit/1µl 2unit/1µl 0,4 DNA <=100ng <=50ng 1 H2O 18,05 Tổng cộng 25 Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (25 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ và bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 o C 94 o C 58 o C 72 o C 72 o C 3 phút 1phút 45 giây 1 phút 7phút 23 chính xác 4 dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas axonopodis pv.citri . (theo Dong Suk Park và ctv, 2005). XACF 5’ CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’ XACR 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’ Bảng 3.4. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR. Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR  Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất - Cân kĩ thuật 4 số, ống đong - Agarose - Lò viba - TAE 0,5X - Khay đổ gel - Loading dye 6X - Bồn và máy điện di - Ethidium bromide - Máy chụp hình gel (Gel doc) Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ sau phản ứng Thể tích (µl) PCR buffer 10X 1X 2,5 dNTPs 25mM 0,2mM 0,2 MgCl2 25 mM 1,5mM 1,5 Primer 100pM 10pM 0,25 Taq polymera se 5unit/1µl 2unit/1µl 0,4 DNA <=100ng <=50ng 1 H2O 19,25 Tổng cộng 25 Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (25 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ và bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 o C 94 o C 60 o C 72 o C 72 o C 5 phút 15giây 30giây 30giây 7phút 24 Bảng 3.6. Thành phần dung dịch TAE 50X Thành phần Thể tích 1 lít Tris base 2M 242 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml  Quy trình thực hiện 1. Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA - Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di. - Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X. - Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nhiều nƣớc thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu. - Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 550C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lƣợc. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. - Sau khi gel cứng, di chuyển lƣợc ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí. 2. Tiến hành chạy điện di -Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l). Cho thêm 5 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di. -Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 250 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng). -Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV thông qua phần mềm Quantity on. 25 XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bƣởi da láng và bƣởi đƣờng cam Chúng tôi đã tiến hành phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn trên các cây ký chủ khác nhau và bằng dung dịch KOH 3% đã xác định đƣợc tât cả là gram âm. Bảng 4.1. Kết quả phân lập và xác đinh gram Địa điểm thu mẫu Cây ký chủ Dòng vi khuẩn Đặc tính Tỉnh Đồng Nai Bƣởi Da Láng XBDL1 XBDL2 XBDL3 Gram âm Gram âm Gram âm Bƣởi đƣờng Cam XBĐC3 Gram âm 4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trƣờng PGA và YDC Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và Đƣờng Cam Dòng vi khuẩn PGA YDC XBDL1 Vàng, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL2 Vàng lợt, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL3 Vàng, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBĐC3 Vàng đậm, sáp, tròn vun Vàng chanh, sáp, tròn vun 26 XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3 Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng PGA ở nhiệt độ 28oC sau 48 giờ. Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YDC ở nhiệt độ 28oC sau 48 giờ. Dựa vào hình thái của khuẩn lạc có thể thấy rõ 4 dòng vi khuẩn có thể chia 2 nhóm: nhóm XBDL1, XBDL2, XBDL3 có màu sữa trên môi trƣờng YDC và nhóm có màu vàng chanh là XBĐC3. Trên môi trƣờng PGA cũng có sự phân biệt về màu sắc tƣơng tự nhƣng chƣa rõ rệt. 4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo Tiến hành chủng bốn dòng vi khuẩn trên lá Da Láng. Kết quả là cả bốn dòng đều tạo vết bệnh. (Bảng 4.3) Dựa trên kết quả chủng bệnh, có thể kết luận: -Dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 khi chủng trên lá Da Láng tạo vết bệnh rõ chứng tỏ dòng vi khuẩn phân lập đƣợc là dòng có khả năng gây bệnh. -Dòng vi khuẩn phân lập trên trái bƣởi Đƣờng Cam khi chủng trên lá Da Láng vẫn có khả năng gây bệnh. Nhƣ vậy, ký sinh và ký chủ chƣa có tính chuyên biệt cao. Để khẳng định chính xác đặc tính này cần phải tiến hành chủng nhân tạo trên nhiều ký chủ khác nhau. - Khi so sánh vết bệnh chủng trên lá Da Láng giữa hai dòng XBDL2 và XBDL3 dƣới kính hiển vi, độ phóng đại 40 lần nhận thấy có sự khác biệt rõ rệt. Dòng XBDL2 gây vết bệnh phồng, mọng nƣớc, viền xanh (hình 4.3.(c)) trong khi dòng XBDL3 không phồng, hơi lõm, viền xanh đậm lan ra, gờ nhẹ (hình 4.3.(d)). Điều này chứng tỏ tính độc khi gây bệnh của hai dòng này khác nhau. Để xác định rõ đặc tính này, tiến hành tiếp các thí nghiệm mức sinh học phân tử để tìm ra sự khác biệt này. (hình 4.3) 27 Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng vi khuẩn: XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 trên lá da láng. Giống Thời gian xuất hiện bệnh Tổng số đốm bệnh/ Tổng số vết thƣơng Mô tả triệu chứng bằng mắt thƣờng Triệu chứng bệnh qua kính hiển vi (độ phóng đại 4x10) XBDL1 3 ngày 96% Gờ nhẹ Viền màu xanh, mọng nƣớc, bên trong sùi nhẹ. XBDL2 2 ngày 95% Gờ nhẹ Viền màu xanh đậm, mọng nƣớc, bên trong vết bệnh sùi lên cao. XBDL3 3 ngày 98% Gờ nhẹ Vết bệnh lan rộng, xung quanh viền màu xanh đậm, bên trong không sùi. XBĐC3 3 ngày 90% Gờ nhẹ Vết bệnh phồng nhẹ, viền màu xanh, bên trong không sùi. Hình.4.3. Các triệu chứng bệnh sau khi chủng vi khuẩn lên lá non bƣởi Da Láng (a) không chủng vi khuẩn; (b) chủng dòng XBDL1, (c) chủng dòng (e) (d) (c) (a) (b) 28 XBDL2; (d) chủng dòng XBDL3; (e) chủng dòng XBĐC3. Tổng số vết thương là 50 ix 4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh Tiến hành sắc ký bản mỏng trên các dòng: XBDL1, XBDL2, XBDL3, XTĐC3 và một dòng đối chứng âm là Erwinia sp. Mục đích của chạy sắc ký bản mỏng là để khẳng định các dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas sp. Kết quả khi chƣa chụp UV: đối chứng âm không ra, dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 đều có vệt màu vàng. Kết quả khi chụp UV: chỉ có một dòng XBDL1 phát sáng rõ rệt nhất, các dòng XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chỉ có vệt mờ nhƣng giá trị Rf >0.45 theo mục 3.4.3 Rf=0.45 mới khẳng định đƣợc đó là Xanthomonas sp. Nhƣ vậy, dựa vào kết quả sắc ký không thể kết luận dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 là Xanthomonas sp. Để có thể định danh đƣợc bốn dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chúng tôi thực hiện khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005). Hình 4.4. Kết quả sắc ký : (a) không chụp UV ; (b) chụp UV. (-) dòng Erwinia sp;1 dòng XBDL3;2 dòng XBĐC3; 3 dòng XBDL1; 4 dòngXBDL2 4.4 Ly trích DNA tổng số Tiến hành ly trích DNA từ 4 dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 đã đƣợc nhân sinh khối. Mỗi dòng tiến hành ly trích 2 lần, kết quả thể hiện ở hình 4.5 Rf=0.5 (a) (-) 1 2 3 4 (b) (-) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 DNA tổng số x Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.4.4 (Sambrook và ctv, 2001 đã có cải tiến). Ghi chú: 1 dòng XBDL1, 2 dòng XBDL2, 3 dòng XBDL3, 4 dòng XBĐC. Nhận xét: Qua hình 4.5 cho thấy quy trình ly trích theo mục 3.4.4 (Sambrook và ctv, 2001 đã có cải tiến) đã ổn định, nhƣng kết quả chƣa sạch. Ngoài DNA tổng số còn có DNA bị gãy, phần tạp nhiễm trong quá trình ly trích tạo thành vệt sáng cuối giếng. Các dòng XBDL1, XBDL3 là bị tạp nhiễm nhiều nhất. Để thực hiện phản ứng PCR, DNA tổng số phải đƣợc pha loãng xuống. 4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS Tiến hành phản ứng PCR theo 3.4.5.1 thu đƣợc kết quả nhƣ hình 4.6 Hình 4.6.cho thấy sản phẩm PCR của 4 dòng phân lập đƣợc có cùng kích thƣớc với dòng Xanthomonas sp đã đƣợc phân lập và định danh trên cây cải ngọt. Dòng 1.1kb 1 2 3 4 5 Hình 4.6. Sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS Ghi chú: 1- sản phẩm PCR của Xanthomonas sp đã được định danh. sử dụng sản phẩm này như đối chứng dương; 2- sản phẩm PCR của dòng XBDL1 3-sản phẩm PCR của dòng XBDL2 4-sản phẩm PCR của dòng XBDL3 5-sản phẩm PCR của dòng XBĐC3 xi Xanthomonas sp này đã đƣợc định danh chính xác là Xanthomonas campestris pv.citri cùng thời gian thực hiện đề tài. Để xác định rõ loài của 4 dòng gây bệnh có 2 phƣơng pháp là giải trình tự hoặc tiếp tục thực hiện phản ứng PCR trên đoạn primer chuyên biệt. Với điều kiện hiện có, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng PCR trên hrpW gen với cặp primer chuyên biệt là XACR và XACF ( Dong Suk Park và ctv). 4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen Thực hiện phản ứng theo mục 3.4.5.2 nhƣng kết quả không thành công. Tiếp tục thực hiện phản ứng đồng thời thay đổi nồng độ thành phần nhƣng kết quả vẫn không ra. Do đó, chƣa thể khẳng định 4 dòng phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và bƣởi Đƣờng Cam tại Đồng Nai là Xanthomonas. axonopodis pv. citri. Nhận xét lý do kết quả không thực hiện đƣợc: -Chất lƣợng DNA mẫu chƣa tốt, còn tạp nhiều. -Nguồn vi khuẩn phân lập còn ít.  Dựa vào kết quả đạt đƣợc có thể rút ra thảo luận: phƣơng pháp sinh học phân tử có thể hổ trợ cho phƣơng pháp định danh bằng nuôi cấy, thử nghiệm sinh hóa. Phƣơng pháp sinh học phân tử cụ thể là phƣơng pháp PCR, giải trình tự có thể định danh ở mức loài, tìm ra loài mới, nghiên cứu đƣợc sự đa dạng di truyền: năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền giữa 17 loài Xanthomonas.sp bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự sản phẩm PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS. Dựa trên kết quả phân tích và thực hiện các thí nghiệm có thể đƣa ra những bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có múi dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Các bƣớc cơ bản đó là :(Hình 4.7) xii (5b) (5a) (4) (3b) Phân lập, nuôi cấy, quan sát hình thái đặc trƣng trên các môi trƣờng khác nhau, xác định gram (N.W. Schaad và ctv, không rõ năm ) Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập đƣợc ( N.W. Schaad và ctv, không rõ năm ) Kiểm tra sinh hóa (N.W. Schaad và R. E. Stall, không rõ năm ) Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trƣng để nhận biết dòng Xanthomonas.sp (N.W. Schaad và R. E. Stall, không rõ năm ) Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s r DNA ITS với cặp primer Xan1330, Xan332 (M. H. R. Khoodoo và ctv, 2005) Giải trình tự sản phẩm PCR, đối chiếu kết quả trên http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Tiến hành PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Dong Suk Park và ctv, 2006) Hình 4.7. Các bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có múi dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. (1) (2) (3a) xiii Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Đã phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn gây bệnh theo mục 3.4.1. - Phƣơng pháp chủng bệnh nhân tạo theo mục 3.4.2 thể hiện tất cả các dòng phân lập đƣợc đều có khả năng gây bệnh, có thể sử dụng trên các đối tƣợng là cây có múi. - Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng theo quy trình 3.4.3. Tuy nhiên, kết quả không nhƣ mong muốn chƣa thể khẳng định các dòng đƣợc phân lập là Xanthomonas sp. Nhƣng sản phẩm PCR trên vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 (theo M. H. R Khoodoo và ctv, 2005) cho thấy 4 dòng đều có băng sản phẩm bằng nhau và bằng sản phẩm PCR của dòng Xanthomonas campestrispv.citri đã đƣợc định danh trên cùng cặp mồi. - Quy trình ly trích theo mục 3.4.4 đã ổn định. - Quy trình thực hiện phản ứng PCR trên đoạn 16s-23s rDNA ITS theo mục 3.4.5.1 cho kết quả ổn định. * Nhƣ vậy, dựa trên kết quả các bƣớc tiến hành chỉ kết luận đƣợc rằng dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam ở huyện Vĩnh Cữu, tỉnh Đồng Nai là do Xanthomonas sp. . 5.2 Đề nghị - Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR trên đoạn 16s-23s rDNA để định danh rõ loài vi khuẩn gây bệnh. -Tiến hành phân lập nhiều dòng gây bệnh trên nhiều đối tƣợng cây có múi, ở nhiều nơi khác nhau. Tiến đến phân tích đa dạng di truyền, tìm và định danh loài mới. -Tiến hành tinh sạch DNA ly trích trƣớc khi thực hiện phản ứng PCR trên hrp gen. xiv Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập1. NXB Nông Thôn, Việt Nam. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục. 4. Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự da dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, luận văn tốt nghiệp bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm tp.HCM 5. GS.TS Trần Thế Tục, 1998. Giáo trình cây ăn quả, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 6. Vi Thị Thanh Hƣờng, 2005. Nghiên cứu tác nhân và biện pháp phòng trừ bệnh loét trên cây bưởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu -tỉnh Đồng Nai, luận văn tốt nghiệp khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm tp.HCM. 7. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. . Tiếng Anh 8. Dong Suk Park, Jae Wook Hyun, Young Jin Park, Jung Sun Kim, Hee Wan Kang, Jang Ho Hahn, Seung Joo Go, 2006, Sensitive and specific detection of Xanthomonas axonopodis pv.citri by PCR using pathovar specific primers based on hrpW gene sequences; Microbiological Research 161:145-149. xv 9. Elmilson .R. Goncalves and Yoko B. Rosato, 2002. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S r DNA intergenic spacer sequences, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52: 355-361. 10. Marcos C Alegria, Cassia Docena, Leticia Khater, Carlos H.I. Ramos. Ana C.R. da Silva and Chuck S.Farah, 2004, Identified for the regulatory and structural components and substrates of the Type III secretion system of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pathovar citri, 186(18):6186-6197. 11. M.H.R.Khoodoo, F. Sahin, M.F. Donmez, Y. Jaufeerally Fakim, 2005. Molecular characterization of Xanthomonas strains isolated from aroids in Mauritius. Systematic and Applied Microbiolog 28: 366-380. 12. Jung Gun Kim, Byoung Keun Park, Chang Hyun Yoo, Eun Kyung Jeon, Jonghe e Oh and Ingyu Huang, 2003. Characterization of the Xanthomonas axon -opodis pv. glycines hrp pathogenicity Island. American Society for Microbiology 185(10):3155-3166. 13. Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Volume 1. 3 rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Trang web. "" xvi Phần 7. PHỤ LỤC 1. Môi trƣờng PGA (Potato Glucose Agar) Trong 1lit Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 18-20g 2. Môi trƣờng YDC (Yeast extract Dextrose Calcium carbonate) Yeast extract 10g Dextrose 20g Calcium carbonate 20g Agar 15g 3. Môi trƣờng SX Tinh bột (khoai tây) 10g Beef extract 1.0g Ammonium chloride 5.0g Dipotassium phosphate 2.0g Methyl violet 2B 2ml Agar 15.0g Sau khi hấp khử trùng thêm Cycloheximide 5ml 4. Môi trƣờng SM KH2 PO4 1.0g Na2HPO4 2.6g NH4Cl 1.0g NaCl 2.0g MgSO4.7H2O 0.2g CaCl2.2H2O 67.0ml xvii Glucose 1.0g L-Methionine 0.2g Khoai tây 10g Methyl violet 2B 1.0ml Methyl green 2.0ml Trace element solution 1.0ml Triphenyltetrazolium chloride1.0ml Cycloheximide 50.0 mg Agar 20.0g 5. Môi trƣờng NSCAA Nutrient aga r 23.0g Tinh bột 15.0g Aga r 15.0g Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào: Cycloheximide 5ml Nitrofurantin 1.0ml Vancomycin 1.0ml 6. Môi trƣờng XTS Nutrient aga r 23.0g Gluco se 5.0g Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Cycloheximide 2.0ml Gentamycin 0.5ml Cephalexin 1.0ml 7. Môi trƣờng MD-5 D-cellobiose 10.0g* K2 HPO4 3.0g xviii Na2H2PO4 1.0ml NH4Cl 1.0g MgSO4.7H2O 0.3g Cycloheximide 0.2g* Agar 15.0g Thêm* vào sau khi hấp tiệt trùng. 8. Môi trƣờng XCS agar Lactose 10.0g D (+) trehalose 4.0g K2 HPO4 0.8g KH2PO4 0.8g NH4Cl 1.0g Yeast extract 0.5g Agar 15.0g Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Tobramycin 1.0ml Ampicillin 0.5ml Vancomycin 0.5ml Cycloheximide 5.0ml 9. M ôi tr ƣ ờng TWEEN Pepton 10.0g Potassium bromide 10.0g Calcium cloride 250.0mg Aga r 15.0g Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Tween 80 10.0g Cephalexin 25.0mg 5-Fluorouracil 6.0mg xix Tob ramycin 0.4mg Cyclohexinmide 75.0mg