Nghiên cứu chế tạo oligochitosan từ vỏ tôm và mai mực bằng chiếu xạ gamma co - 60

Journal of Science – 2014, Vol. 4 (3), 1 – 5 An Giang University 1 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN TỪ VỎ TÔM VÀ MAI MỰC BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA Co-60 Bùi Phước Phúc 1 , Hà Thúc Huy 2 , Nguyễn Quốc Hiến 3 1 ThS. Khoa Sư phạm, Trường Đại học An Giang 2 PGS.TS. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh 3 PGS.TS. Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Viện NLNT Việt Nam Thông tin chung: Ngày nhận bài: 06/04/14 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 28/08/14 Ngày chấp nhận đăng: 22/10/14 Title: A study on preparation of Oligochitosan from shrimp shell and squid pens by gamma Co-60 irradiation Từ khóa: Chitosan, oligochitosan, chiếu xạ gamma Co-60, hiệu suất cắt mạch bức xạ Keywords: Chitosan, oligochitosan, gamma Co-60 irradiation, radiation degradation yields ABSTRACT Chitosan (CTS) was prepared from shrimp shell (-chitosan) and from squid pens (-chitosan). Degradation of chitosan in solution to prepare oligochitosan by gamma Co-60 irradiation was studied. Structure of oligochitosan was investigated by FT-IR spectra and UV-Vis spectra. The results showed that cacbonyl group appeared and unsaturated double bonds C=C at the end of chain in the irradiated products. The radiation degradation yields in solution (Gs) were obtained to be 0,584  10-7and 2,32  10-7 mol/J for -chitosan and -chitosan. -chitosan was degraded by irradiation in solution more readily than -chitosan. TÓM TẮT Chitosan (CTS) được chế tạo từ vỏ tôm (-chitosan) và mai mực (-chitosan). Cắt mạch dung dịch chitosan để chế tạo oligochitosan bằng chiếu xạ gamma Co- 60 được nghiên cứu. Cấu trúc của oligochitosan được khảo sát bằng phổ FT-IR và phổ UV-Vis. Kết quả cho thấy đã xuất hiện nhóm cacbonyl và liên kết đôi chưa bão hòa C=C ở cuối mạch trong các sản phẩm chiếu xạ. Hiệu suất cắt mạch bức xạ dung dịch (Gs) thu được là 0,584  10-7 và 2,32  10-7 mol/J cho - chitosan và -chitosan. -chitosan được cắt mạch bằng chiếu xạ dung dịch dễ hơn -chitosan. 1. MỞ ĐẦU Oligochitosan là sản phẩm từ CTS được cắt mạch và có khối lượng phân tử trung bình khoảng 20 kDa. Trong đó phần oligochitosan tan ở pH 7 có khối lượng phân tử thường nhỏ hơn 5 kDa (Nguyen Thi Hieu Ha & Đang Van Luyen, 1999). Oligochitosan thể hiện một số hoạt tính sinh học như tính chống oxi hóa, kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm bệnh đối với vật nuôi, cây trồng (Jeon, Park, & Kim, 2001; Ueno, Yamaguchi, Sakairi, & Nishi, 1997). Oligochitosan có khả năng tan trong nước, kìm hãm quá trình sinh sản của vi sinh vật gây bệnh và nấm độc nên được sử dụng để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản thực phẩm, hoa quả, rau tươi (Hirano, 1996; Shahidi, Arachchi, & Jeon, 1999). Đặc biệt trong y dược dùng làm thuốc điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư (Huang & cs., 2007; Luo, Cai, He, Xue, Wu, & Cao, 2009; Suzuki, 1996; Yin, Zhao, & Du, 2010). Ngoài ra oligochitosan còn được dùng làm vật liệu y sinh như con ngươi nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da, mô cấy ghép. Phương pháp dùng bức xạ cắt mạch CTS thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả do hiệu suất cắt mạch cao, hầu như không làm thay đổi độ deaxetyl cũng như thân thiện với môi trường. Gamma Co-60 được xem là cho hiệu suất cắt mạch cao nhất (Wasikiewicz, Yoshii, Nagasawa, Wach, & Mitomo, 2005). Trong công trình này chúng tôi nghiên cứu cắt mạch dung dịch CTS bằng chiếu Journal of Science – 2014, Vol. 4 (3), 1 – 5 An Giang University 2 xạ gamma Co-60 để chế tạo oligochitosan. Khảo sát một số đặc trưng tính chất trên cơ sở đo GPC, phổ FT-IR và phổ UV-Vis. Qua đó chúng tôi đề nghị cơ chế cắt mạch tạo liên kết C=O và C=C trong sản phẩm chiếu xạ dung dịch CTS. 2. THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu và hóa chất Mẫu -chitosan từ vỏ tôm kí hiệu C70 có độ deaxetyl (DD%) 70,3, Mw0 = 1,2  10 5 Da và mẫu -chitosan từ mai mực mềm kí hiệu C70 có DD% 70,4, Mw0 = 91.500 Da từ Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ. Etanol tuyệt đối độ tinh khiết 99,7% của Trung Quốc. Axit lactic dạng tinh khiết của Trung Quốc. NH4OH độ tinh khiết 99,5% của Trung Quốc. Các hóa chất khác được dùng ở dạng tinh khiết hóa học. Nước sử dụng là nước đã được khử ion. 2.2 Thiết bị Bức xạ gamma từ nguồn SVST-Co-60/B tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ Tp. Hồ Chí Minh; Sắc ký gel: HP-GPC 1100, detector RI, hãng Agilent (Mỹ); Phổ FT-IR được đo trên máy EQUINOX 55, của hãng BRUCKER (Mỹ); Đo phổ UV-Vis trên máy CARRY 50 CNC của hãng VARIAN (Mỹ); Tủ sấy quạt gió, máy li tâm của Trung tâm VINAGAMMA. 2.3 Chế tạo oligochitosan - Hòa tan 50g C70 trong 1L dung dịch axit lactic 3%, pH 3,7. CTS 5% đem chiếu xạ trong khoảng liều từ 0 - 48 kGy, suất liều 1,33 kGy/giờ để chế tạo -oligochitosan. - Hòa tan 50g C70 trong 1L dung dịch axit lactic 3%, pH 3,7. CTS 5% đem chiếu xạ trong khoảng liều từ 0 - 40 kGy, suất liều 1,33 kGy/giờ để chế tạo -oligochitosan. 2.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình khối (Mw) và khối lượng phân tử trung bình số (Mn) bằng đo GPC Mw và Mn của chitosan được xác định bằng phương pháp sắc ký gel đo trên máy HP-GPC 1100 của hãng Agilent (Mỹ) dùng cột Ultrahydrogel 250, 500, hãng Waters (Mỹ) và dùng mẫu chuẩn Pullulan có Mw từ 780 - 380.000 Da. Đầu dò Refractive Index, hãng Agligen (Mỹ) dùng ghi sắc ký đồ. Mẫu được đưa vào cột với tốc độ bơm 1 mL/phút, nồng độ 0,4%, dung môi là hỗn hợp CH3COOH 0,25 M/CH3COONa 0,25 M (Knaul, Kasaai, Bui V. Tam, & Creber, 1998). 2.5 Khảo sát các thành phần oligochitosan bằng đo GPC - Oligochitosan (hỗn hợp): Thu được từ kết tủa dung dịch chitosan chiếu xạ bằng etanol tuyệt đối với tỉ lệ thể tích 1/10, trợ đông tụ bằng NH4OH 2,5%. Lọc kết tủa bằng vải cotton, rửa bằng etanol tuyệt đối 3 lần, sấy khô kết tủa trong tủ sấy quạt gió ở 60 o C. - Tách phần oligochitosan tan và không tan: Trung hòa dung dịch CTS chiếu xạ bằng NaOH 2 M đến pH 7, tách, tinh chế và sấy khô phần kết tủa thu được phần oligochitosan không tan. Phần oligochitosan tan được tủa lại bằng etanol tuyệt đối với tỉ lệ thể tích 1/5, trợ đông tụ bằng NH4OH 2,5%. Lọc kết tủa bằng vải cotton, rửa bằng etanol tuyệt đối 3 lần, sấy khô kết tủa trong tủ sấy quạt gió ở 60 o C. Mw, Mn của các thành phần của oligochitosan (hỗn hợp, phần không tan và tan) được xác định bằng đo GPC. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Cắt mạch chitosan dạng dung dịch bằng chiếu xạ Hình 1. Sự phụ thuộc Mw của C70 theo liều xạ Kết quả Hình 1 cho thấy αC70 được cắt mạch bằng bức xạ có Mw giảm dần từ 1,2  105 Da (mẫu ban đầu) xuống còn 0,26  105 Da (48 kGy). Hình 2. Sự phụ thuộc Mw của C70 theo liều xạ Kết quả hình 2 cho thấy C70 có Mw giảm dần từ 91,5  103 Da (mẫu ban đầu) xuống còn 8,9  103 Da (40 kGy). Kết quả Hình 1 - 2 đều cho thấy khối lượng phân M w  1 0 3 Liều xạ, kGy Liều xạ, kGy M w  1 0 3 Journal of Science – 2014, Vol. 4 (3), 1 – 5 An Giang University 3 tử trung bình Mw của CTS giảm khi tăng liều xạ. Wasikiewicz và cs. (2005) nhận thấy Mw của CTS giảm dần từ 6,66  104 Da xuống còn 968 Da khi cắt mạch bằng bức xạ gamma Co-60 liều từ 0,5 - 200 kGy, suất liều 10 kGy/giờ, còn khi cắt mạch bằng bức xạ tử ngoại Mw còn 873 Da. Sự giảm Mw khá nhanh do Wasikiewicz và cs. (2005) đã sử dụng liều và suất liều hấp thụ cao hơn so với nghiên cứu của chúng tôi. Trong môi trường axit, CTS có thể được cắt mạch chiếu xạ theo cơ chế như sau (Ulan’ski & Rosiak, 1992; Ulan’ski & Von Sonntag, 2000): H2OH2O2, H2, OH . , H . , H + , OH - , e - aq, H3O + (1) e - aq + H +  H. (2) R-H + H .  R.(C1-C6) + H2 (3) R-H + OH .  R.(C1-C6) + H2O (4) R.(C1,C4)  F . 1 + F2 (cắt mạch) (5) R-H: kí hiệu của CTS Trong hệ chiếu xạ dung dịch phản ứng cắt mạch chủ yếu do tác nhân gốc tự do OH . vì gốc này chiếm đa số và tốc độ phản ứng của gốc OH . nhanh hơn rất nhiều so với H . (Ulan’ski & Von Sonntag, 2000). Từ kết quả Hình 1 - 2 xác định hiệu suất cắt mạch bức xạ Gs (mol/J) theo công thức (6) (Wasikiewicz và cs., 2005): (1/Mw - 1/Mw0) = Gs  D  d  1000/2C (6) Trong đó Mw0 và Mw là khối lượng phân tử trung bình khối của CTS ban đầu và tại các liều xạ khác nhau, D: liều hấp thụ (kGy), d: tỷ trọng dung dịch (g/cm3), C: nồng độ dung dịch (g/L). Bảng 1. Giá trị Gs thu được từ chiếu xạ dung dịch CTS tương ứng Ký hiệu mẫu C70 C70 DD% 70,3 70,4 Gs (10-7 mol/J) 0,584 2,32 - Các giá trị hiệu suất cắt mạch bức xạ dung dịch Gs: 0,584  10-7 và 2,32  10-7 mol/J lần lượt của C70 và C70. Gs khi chiếu xạ dung dịch C70 lớn gấp 3,97 lần so với Gs của C70. Kết quả cắt mạch dung dịch CTS bằng bức xạ cho thấy -chitosan dễ cắt mạch hơn -chitosan. Điều này được giải thích là do -chitosan được chế tạo từ deaxetyl -chitin mai mực có ái lực và khả năng hoạt động hóa học mạnh hơn -chitosan được chế tạo từ deaxetyl -chitin vỏ tôm (Kurita, Tomita, Tada, Ishii, Nishimura, & Shimoda, 1993). - Tahtat, Mahlous, Benamer, Khodja, và Youcef (2012) cắt mạch chiếu xạ -chitosan với các khối lượng phân tử là 471, 207 và 100 kDa thu được Gs ở dạng rắn lần lượt là 0,74  10-8; 2,8  10-8 và 3,8  10-8 mol/J và ở dạng dung dịch với các giá trị Gs là 1  10-8; 4,42  10-8 và 6,08  10-8 mol/J. Các kết quả này thấp hơn so với hiệu suất cắt mạch C70 chúng tôi nghiên cứu. - Wasikiewicz và cs. (2005) cắt mạch CTS (DD 100%) thu được hiệu suất Gs = 3,53  10-7 mol/J cao hơn so với hiệu suất cắt mạch C70 và C70 của chúng tôi nghiên cứu. Sự khác biệt này là do Waisikiewicz và cs. (2005) thực hiện cắt mạch chitosan ở nồng độ 2% thấp hơn nồng độ của chitosan của chúng tôi đang nghiên cứu 5%. Mặt khác Waisikiewicz và cs. (2005) cắt mạch chitosan ở liều xạ (đến 200 kGy), suất liều (10 kGy/giờ) và DD% của chitosan cao hơn (100%). Còn chúng tôi sử dụng ở liều xạ thấp hơn (48 kGy) và suất liều thấp hơn (1,33 kGy/giờ), DD% của chitosan cũng thấp hơn (70%). 3.2 Phổ FT-IR và UV-Vis Hình 3. Phổ FT-IR: a. C70, b. C70-16kGy, c. C70- 24kGy, d. C70-48kGy Phổ FT-IR cho thấy đã xuất hiện vân mới ở 1728 cm-1 trong các sản phẩm CTS được chiếu xạ so với CTS ban đầu, chứng tỏ quá trình chiếu xạ dung dịch CTS đã làm xuất hiện nhóm cacbonyl trong sản phẩm chiếu xạ. Hình 4. Phổ UV-Vis: a. C70, b. C70-16kGy, c. C70-24kGy, d. C70-40kGy và e. C70-48kGy. 0 0.4 0.8 1.2 230 280 330 380 A b so r b a n c e a b d c e Wavelength (nm) Wavenumber, cm- 1 A b so rb a n c e Journal of Science – 2014, Vol. 4 (3), 1 – 5 An Giang University 4 O CH2OH H OH H H NHCOCH3 H O H1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H H O O CH2OH OH H H NHCOCH3 H O H H 1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H O O CH2OH H OH H H NHCOCH3 H O H1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H O O CH2OH OH H H NHCOCH3 H O H1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H H O O CH2OH H OH H H NHCOCH3 H O H1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H O O CH2OH OH H H NHCOCH3 H O H H 1 23 4 5 6 O CH2OH OH H H NHCOCH3 H O H 1 23 4 5 6 O CH2OH OH H H NHCOCH3 H O H1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H H O O CH2OH OH H H NHCOCH3 H O H O 1 23 4 5 6 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H H 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H H 1 H2O 1 23 4 5 6 O CH2OH H OH H H NH3 H OH H H OH H2O OH H2O 1b 1a 2a 1a 2b 2b 3 1b b4 4 a a4 5 Hình 4 cho thấy phổ UV-Vis của oligochitosan xuất hiện các đỉnh tại   235 nm, 270 nm với cường độ tăng theo liều xạ chứng tỏ xuất hiện các liên kết tương ứng lần lượt là C=C và C=O trong cấu trúc oligochitosan. Từ những kết quả nhận được, chúng tôi có thể đề nghị cơ chế tạo liên kết C=O và C=C trong sản phẩm cắt mạch dung dịch CTS bằng bức xạ (Hình 5) như sau: Trước tiên OH . (được hình thành từ phản ứng (1), mục 3.1) sẽ ưu tiên tấn công bắt H ở vị trí C1 và C4 (tạo thành H2O) và hình thành gốc tự do đại phân tử chitosan ở vị trí C1 (1a) và ở vị trí C4 (1b). Các gốc tự do này không bền dẫn đến quá trình cắt mạch xảy ra ở liên kết β-1,4-glucozit C-O-C: (1a) sẽ dẫn đến sự hình thành sản phẩm cắt mạch có nhóm cacbonyl ở C1 (2a) và hình thành gốc tự do ở C4 (2b); (2b) sẽ bị dehydro do sự tấn công tiếp tục của OH . và hình thành hợp chất không bão hòa với liên kết đôi ở C4 và C5 (3); (1b) được cắt mạch dẫn đến sự hình thành gốc tự do ở C1 (4a) và sản phẩm cắt mạch có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 (4b). Tiếp theo gốc tự do (4a) dưới tác dụng của H2O sẽ tạo sản phẩm (5) và đồng thời H . sẽ được giải phóng từ H2O. Hình 5. Đề nghị cơ chế cắt mạch chitosan dạng dung dịch bằng chiếu xạ tạo liên kết C=O và C=C Journal of Science – 2014, Vol. 4 (3), 1 – 5 An Giang University 5 3.3 Khảo sát các thành phần của oligochitosan Bảng 2. Kết quả đo GPC xác định Mw, Mn và độ đa phân tán (Mw/Mn) các phần oligochitosan Các phần -oligochitosan-48kGy (C70-48kGy) -oligochitosan-40kGy (C70-40kGy) Mw (Da) Mn (Da) Mw/Mn Mw (Da) Mn (Da) Mw/Mn Hỗn hợp toàn phần 25.800 6.400 4,03 8.900 4.300 2,07 Phần không tan 39.100 9.600 4,07 15.800 5.200 3,04 Phần tan 3.100 1.800 1,72 2.800 1.600 1,75 Từ kết quả Bảng 2 cho thấy độ đa phân tán của các phần oligochitosan cả dạng  cũng như dạng  giảm dần theo chiều giảm của khối lượng phân tử trung bình Mw của các phần oligochitosan. 4. KẾT LUẬN ● Đã nghiên cứu cắt mạch dung dịch CTS bằng chiếu xạ gamma Co-60 để chế tạo oligochitosan. ● Kết quả cho thấy khối lượng phân tử trung bình của CTS giảm khi tăng liều xạ. Hiệu suất cắt mạch dung dịch CTS bằng bức xạ dạng  cao hơn  chứng tỏ -chitosan dễ cắt mạch hơn - chitosan. ● Phổ FT-IR và UV-Vis chứng tỏ xuất hiện nhóm cacbonyl và liên kết đôi chưa bão hòa C=C ở cuối mạch trong cấu trúc của oligochitosan. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyen Thi Hieu Ha., & Đang Van Luyen. (1999). Preparation of chitosan oligomers by sodium nitrite. Tap chi Hoa hoc, 37(1), 82-85. Hirano, S. (1996). Chitin biotechnology applications. Biotechnology Annual Review, 2, 237-258. Huang, R. L., Deng, Z. Y., Yang, C. B., Yin, Y. L., Xie, M. Y., Wu, G. Y., ... Guo, Y. M. (2007). Dietary oligochitosan supplementation enhances immune status of broilers. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, 153-159. Jeon, Y., Park, P., & Kim, S. (2001). Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor. Carbohydr. Polym., 44, 71-76. Knaul, J. Z., Kasaai, M. R., Bui V. Tam., & Creber, K. A. M. (1998). Characterization of deacetylated chitosan and chitosan molecular weight review. CAN. J. CHEM., 76(11), 1699-1706. Kurita, K., Tomita, K., Tada, T., Ishii, S., Nishimura, S. I., & Shimoda, K. (1993). Squid chitin as a potential alternative chitin source: Deacetylation behaviour and characteristic properties. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem., 31, 485-491. Luo, L., Cai, X., He, C., Xue, M., Wu, X., & Cao, H. (2009). Immune response, stress resistance and bacterial challenge in juvenile rainbow trouts Oncorhynchus mykiss fed diets containing chitosanoligosaccharides. Cur Zool, 56, 416-422. Shahidi, F., Arachchi, J. K. V., & Jeon, Y. J. (1999). Food applications of chitin and chitosans. Trends in Food Sci. Technol., 10, 37-51. Suzuki, S. (1996). Studies on biological effects of water soluble lower homologous oligosacharrides of chitin and chitosan. Fragrance Journal, 15, 61-68. Tahtat, D., Mahlous, M., Benamer, S., Khodja, A. N., & Youcef, S. L. (2012). Effect of molecular weight on radiation chemical degradation yield of chain scission of γ-irradiated chitosan in solid state and in aqueous solution. Radiation Physics and Chemistry, 81(6), 659-665. Ueno, K., Yamaguchi, T., Sakairi, N., & Nishi, N. (1997). Antimicrobial activity by fractionated chitosan oligomers. In Advances in Chitin Science, 2, Lyon, France, 156-161. Ulan’ski, P., & Rosiak, J. M. (1992). Preliminary studies on radiation-induced changes in chitosan. International Journal of Radiation Applications and Instrumentation, Part C, Radiation Physics and Chemistry, 39(1), 53-57. Ulan’ski, P., & Von Sonntag, C. (2000). OH-radical induced chain scission of chitosan in the absence and presence of dioxygen. Journal of Chemical Society, Perkin Trans 2, 2022-2028. Wasikiewicz, J. M., Yoshii, F., Nagasawa, N., Wach, R. A., & Mitomo, H. (2005). Degradation of chitosan and sodium alginate by gamma radiation, sonochemical and ultraviolet methods. Radiation Physics and Chemistry, 73(5), 287-295. Yin, H., Zhao, X., & Du, Y. (2010). Oligochitosan: A plant diseases vaccine-A review. Carbohydrate Polymers, 82(1), 1-8.