Nghiên cứu phát triển điện cực đĩa than thủy tinh đƣợc biến tính với l–cystein và vàngnano cho phƣơng pháp von–ampe hòa tan anot xung vi phânxác định axit uric - Nguyễn Hải Phong

51 Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 19, Số 3/2014 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN ĐIỆN CỰC ĐĨA THAN THỦY TINH ĐƢỢC BIẾN TÍNH VỚI L–CYSTEIN VÀ VÀNGNANO CHO PHƢƠNG PHÁP VON–AMPE HÒA TAN ANOT XUNG VI PHÂNXÁC ĐỊNH AXIT URIC Đến tòa soạn 21 - 1 – 2014 Nguyễn Hải Phong, Lê Thị Lành, Hoàng Thị Lệ Hiền, Trần Thị Phƣơng Diệp, Nguyễn Văn Hợp Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Trần Thị Tố Loan Trường Trung học Phổ thông số 4 - Bố Trạch, Tỉnh Quảng Bình SUMMARY STUDY ON DEVELOMENT OF GLASSY CARBON DISK ELECTRODE MODIFIED WITH L–CYSTEIN AND NANOPARTICLES–GOLD FOR DIFFERENTIAL PULSE ANODIC STRIPPING VOLTAMMETRIC DETERMINATION OF URIC ACID A new gold nanoparticles-modified electrode was fabricated by self-assembling gold nanoparticles to the surface of the L-cysteine-modified glassy carbon electrode (GC/L-cys/Au-nano). The modified electrode showed an excellent characteristicsfor differential pulse anodic stripping voltammetric (DP-ASV) determination of uric acid (UA) in 0.1 mol L −1 phosphate buffer solution (PBS) (pH = 4.1). The anodic currents of UA on the modified electrode were 12-fold to that of the bare GC. Kinetic parameters of the UA electrode process such as electron transfer coefficient () and electron transfer rate constant (Ks) were calculated. Influences of the factors such as pH, concentration of L-cysteine (L-cys), deposition potential (Edep) and time (tdep) on stripping current of UA were investigated. The DP-ASV with the modified electrode gained high sensitivity (1.49 A/M), low detection limit (2.7 M at Edep = +200 mV and tdep = 20 s) and good linerrange in the UA concentration of 2.0 –40M.The proposed method was successfully applied for the detection of UA in human urine and serum samples(without the samples treatment)with satisfactory results: good accuracy with recovery of 108 – 126% and good repeatability with relative standard deviation (RSD) of 1.2 – 2.7% (n = 3). Keywords: Uric acid, DP-ASV, Gold nanoparticles, L-cysteine. 52 1. MỞ ĐẦU Axit uric (2, 6, 8,-trihydroxypurine, UA) là sản phẩm cuối cùng và cũng là sản phẩm chính của quá trình chuyển hóa purin trong cơ thể con ngƣời. Đối với một ngƣời khỏe mạnh, nồng độ bình thƣờng của UA là 0,24–0,52 mM trong huyết thanh và 1,4 – 4,4 mM trong nƣớc tiểu. Sự thay đổi bất thƣờng của UA trong huyết thanh và nƣớc tiểu có thể dẫn đến một số bệnh nhƣ bệnh gút, viêm phổi, suy thận, bệnh tim mạch và hội chứng Lesch - Nyhan [1], [2], [3]. Chính vì vậy, việc xác định hàm lƣợng UA trong các mẫu sinh học nhƣ nƣớc tiểu và huyết thanh sẽ cung cấp các thông tin quan trọng về các bệnh liên quan đến UA[4]. Trong nhiều năm qua, để xác định UA, ngƣời ta sử dụng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phƣơng pháp phân tích trắc quang, sắc ký lỏng, enzyme, điện hóa, Phƣơng pháp trắc quang bị ảnh hƣởng mạnh của axit ascorbic[2]; Phƣơng pháp enzimecó độ chọn lọc cao, những khá đắt tiền. Phƣơng pháp phân tích điện hóa đạt đƣợc độ chọn lọc tốt, chi phí phân tích rẻ và tốn ít thời gian hơn nên đƣợc quan tâm nhiều [5].Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã phát triển điện cực biến tính với kim loại kích thƣớc nano để xác định thành công UA trong các mẫu sinh học nhƣ vàng nano[2], [6], đồng nano [7], paladi nano [8], bạc naono [9].Một hƣớng nghiên cứu khác là phát triển các điện cực làm việc đƣợc biến tính với các chất vô cơ và hữu cơ của kim loại kích thƣớc nano nhƣ ruteni oxit [10], holmi florua [11], bạc hecxacyano ferat(III) [3], Mặt khác, các điện cực làm việc đƣợc biến tính với các polyme hữu cơ bằng phƣơng pháp điện hóa cũng đƣợc phát triển để xác định UA nhƣ biến tính điện cực than thủy tinh bằng axit poly-4- aminobutyric [12], biến tính điện cực vàng bằng L-cysteine (L-cys)[14]. Trong bài báo này, chúng tôi thông báo các kết quả nghiên cứu chế tạo điện cực đĩa than thủy tinh (GC)đƣợc biến tính với L-cys và vàng nano (Au-nano) để xác định UA trong các mẫu nƣớc tiểu và huyết thanh bằng phƣơng pháp von- ampe hòa tan. 2. THỰC NGHỆM 2.1. Thiết bị và hóa chất - Máy phân tích điện hóa 693 VA Proccessor kèm hệ điện cực 694 VA- Stand và máy 797 VA Computracecủa hãng Metrohm, Thụy Sĩ. Hệ điện cực gồm: điện cực làm việc là điện cực GC có đƣờng kính 2,8 0,1 mm; điện cực so sánh bạc – bạc clorua (KCl 3 M) và điện cực đối là Pt; - Máy cất nƣớc hai lần Aquatron của hãng Bibby Sterilin, Anh. - Máy đo pH ký hiệu pH55 của hãng Martini, Rumani. - Dung dịch đệm photphat (PBS) đƣợc pha từ KH2PO4 và K2HPO4tinh khiết của Kanto, Nhật Bản. - Dung dịch L–cystein đƣợc pha từ L– cystein của Merck, Đức. - Dung dịch chuẩn axit uric đƣợc pha hàng ngày từ hóa chất tinh khiết của Merck, Đức và đƣợc bảo quản ở –4oC. - Nƣớc sạch để pha hóa chất là nƣớc cất 2 lần. 53 2.2.Chuẩn bị điện cực làm việc Điện cực GC đƣợc mài với bột Al2O3 kích thƣớc 0,05 m đến bóng rồi tia rửa bằng nƣớc sạch; Tiếp theo, ngâm diện cực GC trong dung dịch KOH 2 M trong 10 phút; Rửa bằng nƣớc sạch và ngâm rửa trong bể siêu âm chứa dung dịch H2SO4 2 M trong 15 phút. Lấy điên cực ra và tia rửa bằng nƣớc sạch. Sau đó làm sạch bằng cách quét von- ampe vòng (CV) từ 0 mV đến 1000 mV trong dung dịch PBS 0,5 M, pH = 7,0 với tốc độ quét thế (v) là 100 mV/s. Sau đó lấy điện cực ra và tia rửa bằngnƣớc sạch. Tiến hành biến tính điện cực GC bằng cách phủ màng L-cys lên bề mặt điện cực bằng cách quét von-ampe vòng (CV) trong khoảng thế từ –1500 mV đến +2500 mV trong dung dịch chứa PBS 0,1 M, pH = 7,0 và L-cys 1,0.10 -3 M với v = 100 mV/s (quét 20 vòng); Lấy điện cực ra, tia rửa bằng nƣớc sạch, rồi ngâm điện cực trong dung dịch vàng nano trong 12 giờ ở 40C. Dung dịch vàng nano có kích thƣớc hạt vàng từ 5 đến 15 nm đƣợc các tác giả [15] tạo ra bằng cách sử dụng chitosan và chitosanoligosacarit làm chất khử và chất ổn định. Lấy điện cực ra và tia rửa bằng nƣớc sạch. Lúc này trên bề mặt điện cực GC đã đƣợc phủ một lớp L-cys và vàng nano.Đây là điện cực làm việc cho các nghiên cứu. Sau mỗi lần làm việc điện cực đƣợc bảo quản trong PBS 0,1 M (pH = 7,0). 2.3. Tiến trình phân tích UA Tiến hành xác định UA theo phƣơng pháp von-ampe hòa tan anot xung vi phân (DP-ASV), điện cực làm việc là điện cực chế tạo nhƣ ở mục 2.2.Tiến trình phân tích nhƣ sau: mẫu nƣớc tiểu hoặc mẫu huyết thanh đƣợc đƣa vào bình điện phân với 3 điện cực chứa PBS 0,1 M, pH = 4,1.Tiến hành làm giàu UA lên bề mặt điện cực làm việc ở thế điện phân làm giàu (Edep) +200mV và thời gian điện phân làm giàu (tdep) 20 s, dung dịch đƣợc khuấy với tốc độ không đổi  là 2000 vòng/phút; Sau khi làm giàu ngừng quay điện cực và nghỉ 10 s (trest). Tiếp theo ghi đƣờng von-ampe hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe xung vi phân: Quét thế anot (Erange) từ +200 mV đến +800 mV, biên độ xung (E) 80 mV, thời gian sống của xung (tpulse) 40 ms, bƣớc thế (Ustep) 6 mV và thời gian mỗi bƣớc thế (tstep) 0,3 s (tốc độ quét thế v = 20mV/s).Đƣờng von-ampe hòa tan có dạng đỉnh. Định lƣợng UA bằng phƣơng pháp thêm chuẩn với 3 – 4 lần thêm. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc tính điện hóa của UA trên điện cực làm việc Khảo sát đặc tính điện hóa của UA trên 3 loại điện cực làm việc: i) điện cực GC; ii) điện cực GC đƣợc biến tính với vàng nano (đƣợc ký hiệu làGC/Au- nano); iii) điện cực GC đƣợc biến tính với L-cys và vàng nano (đƣợc ký hiệu làGC/L-cys/Au-nano) bằng phƣơng pháp DP-ASV và phƣơng pháp CV, nhƣng trƣớc khi quét CV tiến hành làm giàu UA lên bề mặt điện cực làm việc ở Edep = +200 mV và tdep = 60 s. Kết quả khảo sát đƣờng CV trong khoảng thế từ –200 mV đến +800 mV 54 với v = 100 mV/s cho thấy, đối với cả 3 kiểu điện cực, đều xuất hiện đỉnh anot (hay đỉnh oxy hóa UA), không xuất hiện đỉnh catot. Có thể cho rằng quá trình điện hóa của UA trên bề mặt điện cực làm việc là quá trình bất thuận nghịch. Kết quả ở hình 1 cho thấy: điện cƣc GC/Au-nano cho cƣờng độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) nhỏ nhất và độ lặp lại của Ip kém với độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD)là 5,6% (n = 4); So với điện cực GC không biến tính, điện cực GC/L- cys/Au-nano có Iplớn gấp 12 lần và Ip có độ lặp lại tốt với RSD là 2,8% (n =4). Nhƣ vậy có thể xác định UA bằng phƣơng pháp DP-ASV sử dụng điện cực GC/L-cys/Au-nano. 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ L-cys và số vòng qu t CV để tạo màng L-cys Ip của UA phụ thuộc vào nồng độ của L-cys và số vòng quétCV (nCV) để tạo màng L-cys trên bề mặt điện cực GC [14], [16]. Kết quả khảo sát trong khoảng nồng độ L-cys 0,5 mM –8,0 mM cho thấy, nồng độ L-cysthích hợp là 1,0.10–3 mM. Ở nồng độ đó, Iptrung bình (Ip, TB) của UA sau 4 phép đo lặp lại là 23,5 A với RSD là 2,3%. Ip của UA với nCVtrong khoảng từ 20 đến 60 vòng là giảm dần. Giá trị nCVbằng20 vòngđƣợc lựa chọn để biến tính điện cực GC với L-cys. 3.3. Ảnh hƣởng của pH Trong dung dịch PBS 0,1 M (pH = 2,2), Ip của UA lớn nhất, nhƣng độ lặp lại kém nhất với RSD là 18,6% (n = 4) (hình 2). Trong khoảng pH = 3,2 – 4,8, Ip thay đổi không đáng kể, nhƣng khi pH lớn hơn 4,8 thì Ip giảm mạnh. Giá trị pH =3,0–5,0 là thích hợp; pH =4,1 đƣợc chọn cho các thí nghiệm sau. Về lý thuyết, giữa giá trị thế đỉnh hòa tan (Ep) và pH của dung dịch có quan hệ theo phƣơng trình Nernst nhƣ sau [11], [14]: Ep = E 0’– 0,0591 p n p (1) Trong đó, n và p là số điện tử và số proton trao đổi của UA, Eo’ là thế oxy hóa khử tiêu chuẩn điều kiện của cặp oxy hóa khử của UA. Nhƣ vậy, từ hệ số góc của phƣơng trình nêu ở hình 2 (chấp nhận n = 2 [9], [11], [14]) và phƣơng trình (1) dễ dàng suy ra số proton trao đổi của UA trên điện cực GC/L-cys/Au-naono là 2. Điều này cũng phù hợp với kết quả đƣợc thông báo ở [16]. 55 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 Ep (V) E p ( V ) pH E p = (0,860 ± 0,053) + (-0,068 ± 0,009) pH; r = 0,9920 0 5 10 15 20 25 30 35 I p (  A ) I p (A) Hình 1.Các đường DP-ASV của UA 30 M trong PBS 0,1 M (pH = 4,1) trên 3 loại điện cực: A) GC/Au-nano;B) GC và C) GC/L- cys/Au-nano. ĐKTN: như ở mục 2.3 (thay mẫu thật là dung dịch UA) Hình 2.Sự phụ thuộc của Ep và Ip(n = 4) của UA vào pH trong PBS 0,1 M trên điện cực GC/L-cys/Au-nano(điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1 M). ĐKTN: CUA = 30 M, các ĐKTN khác như ở hình 1 3.4. Ảnh hƣởng của tốc độ quét thế Giữa Ip và căn bậc hai của tốc độ quét thế (v 1/2) có tƣơng quan tuyến tính tốt với r = 0,9993 trong khoảng v= 20–120 mV/s (hình 3)theo phƣơng trình. Ip = (–3,67  1,35) + (3,33  0,16) v 1/2 (2) Mặt khác, giữa Ep và ln(v)cũng có tƣơng quan tuyến tính tốt với r = 0,9814 theo phƣơng trình. Ep= (0,587±0,020) +(0,020±0,005)ln(v) (3) Theo Laviron E. [17], đối với một hệ bất thuận nghịch, giữa Ep và ln(v) có tƣơng quan tuyến tính với hệ số góc là RT/(1 – α)nF nhƣ ở phƣơng trình. Ep=E 0 RT (1-α)nF ln RTKs (1-α)nF + RT (1-α)nF lnv (4) Trong đó, Eo là thế oxy hóa khử tiêu chuẩn của cặp oxy hóa khử liên hợp, R = 8,314 J/molK, T = 298K (25 o C), F = 96500 C.mol -1 , n là số điện tử trao đổi và  là hệ số chuyển điện tử. Từ (3) và (4), có RT/(1 – α)nF = 0,020. Nhƣ đề cập ở trên, số điện tử mà một phân tử UA trao đổi là 2 (n = 2), suy ra hệ số chuyển điện tử () là 0,358. Cũng có thể thấy rằng, giữa Ep và v cũng có tƣơng quan tuyến tính tốt (r = 0,9806) theo phƣơng trình. Ep = (0,643 ± 0,007) + (0,0004 ± 0,0001)v (5) Theo Yang S. [18], giá trị Eo trong phƣơng trình (4) bằng đoạn cắt trên trục tung trong phƣơng trình (5) và bằng 0,643 V. So sánh (3) và (4), suy ra: Hình 3. Các đường DP-ASV của UA ở tốc độ quét thế từ 20 – 120 mV/s. ĐKTN như ở hình 2; pH = 4,1 0,587= 0,643 RT (1-α)nF ln RTKs (1-α)nF (6) A) B) C) 0,2 A 4 A 40 A I / A 400 500 600 700 800 U / mV 40 mV/s 60 mV/s 80 mV/s 100 mV/s 120 mV/s 20 mV/s 56 Trong đó, Ks là hằng số tốc độ chuyển điện tử. Từ phƣơng trình (6) với các giá trị R, T, F, n và đã biết, tính đƣợc Ks = 861 s -1 . 3.5. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác Thếvàthờigianđiệnphânlàm giàu (Edep và tdep): Ip của UA tăng khi tăng Edep= –800 – +200mV, sau đó giảm dần từ +200 đến +800 mV.Mặt khác, Ip của UA tăng tuyến tính với tdep trong khoảng tdep từ 5 đến 20 s (r = 0,9983) và sau đó hầu nhƣ không thay đổi. Edep = +200 mV và tdep = 20 s là thích hợp. Biên độ xung (E) và tốc độ quay điên cực (): Ip của UA tăng tuyến tính với E = 10– 100 mV (r = 0,9991).Mặt khác, Ip của UA thay đổi không nhiều khi = 400– 3000 vòng/phút. Giá trị E và  đƣợc chọn tƣơng ứng là 80 mV và 2000 vòng/phút. 3.6. Độ tin cậy của phƣơng pháp DP-ASV 3.6.1. Độ lặp lại của dòng đỉnh hòa tan Độ lặp lại của Ipđƣợc đánh giá qua RSD của Ip ở 3 nồng độ khác nhau của UA. Kết quả ở bảng 1 cho thấy,đối với cả 3 nồng độ, Ip của UA đạt đƣợc độ lặp lại tốt với RSD đều nhỏ hơn 4% (n = 9). 3.6.2. Khoảng tuyến tính, độ nhạy và giới hạn phát hiện Kết quả từ 3 thí nghiệm song song cho thấy, giữa Ip và nồng độ của UA có tƣơng quan tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ từ 2,0 đến 40 M (r = 0,9983) với độ nhạy là 1,49  0,10 A/M và giới hạn phát hiện là 2,7  0,3 M. 3.7. Áp dụng thực tế Phƣơng pháp DP-ASV dùng điện cực GC/L-Cys/Au-nano đƣợc áp dụng để xác định trực tiếp UA (tức là không qua giai đoạn xử lý mẫu) trong 03 mẫu nƣớc tiểu và 03 mẫu huyết thanh (thu đƣợc bằng cách ly tâm mẫu máu) đƣợc lấy ngẫu nhiên từ3 ngƣời có sức khỏe bình thƣờng ở Thành phố Huế. Định lƣợng UA bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Kết quả ở bảng 2 và hình 4 cho thấy: - Phƣơng pháp đạt đƣợc độ đúng tốt với độ thu hồi (Rev) dao động trong khoảng 108% đến 126% và độ lặp lại tốt với RSD nhỏ hơn 2,7% (n = 3). - Nồng độ của UA trong các mẫu nƣớc tiểu và huyết thanh đều ở mức bình thƣờng. Riêng nồng độ của UA trong 01 mẫu (mẫu HT1) ở mức cảnh báo [1], [2], [3]. Bảng 1. Các giá trị Ip,TB và RSD ở các nồng độ UA khác nhau Thông số Nồng độ UA (μM) 6 20 40 Ip, TB (n = 9) 4,97 19,0 40,9 RSDTN (%) 3,6 2,1 0,9 ĐKTN: PBS 0,1 M (pH = 4,1); phƣơng pháp DP-ASV dùng GC/L-Cys/Au- nano; Edep = +200 mV; tdep = 20 s; E = 80 mV;  = 2000 vòng/phút; v = 20 mV/s. 57 Hình 4. Các đường DP-ASV của mẫu thực tế và 3 lần thêm chuẩn (mỗi lần thêm 6 M UA): (A) –mẫu nước tiểu (NT1); (B)–mẫu huyết thanh (HT1). ĐKTN: như ở bảng 1 Bảng 2. Kết quả xác định nồng độ UA trong mẫu nước tiểu(NT) và mẫu huyết thanh (HT) (n = 3) Mẫu Nồng độUA trong mẫu (mM)(a) Nồng độ UA thêm vào mẫu (mM) Nồng độ UA tìm thấy (mM) Rev (%) RSD (%) NT1 1,51 ± 0,07 1,20 2,81 108 1,9 NT2 2,43 ± 0,08 1,20 3,94 126 2,7 NT3 2,96±0,06 1,20 4,31 113 2,0 HT1 0,61 ±0,02 0,60 1,34 121 2,4 HT2 0,40±0,03 0,60 1,11 119 1,2 HT3 0,51±0,02 0,60 1,22 118,0 2,03 (a) : Các giá trị trong cột là giá trị trung bình độ lêch chuẩn (n = 3).ĐKTN: như ở bảng 1 4. KẾT LUẬN Điện cực GC/L-Cys/Au-nano có thể dùng cho phƣơng pháp DP-ASV để xác định nhạy và trực tiếp UA trong nƣớc tiểu và huyết thanh mà không cần phân hủy mẫu trƣớc khi phân tích. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế, Các xét nghiệm thƣờng quy áp dụng trong thực hành lâm sàng,Nhà XB Y học, Hà Nội (2012). 2. Kannan P., John S. A., Analytical Biochemistry, Vol. 386, pp. 65– 72(2009). 3. Noroozifar M., Motlagh M.K., Taheri A., Talanta, Vol. 80, pp. 1657– 1664(2010). 4. Wang M. Y., Xu X. Y., Yang ., Zhang S. Y., Yang X. J., Journal of Applied Electrochemistry, Vol. 38, pp. 1269 – 1274(2008). 5. Tang H., Hu G., Jiang S.,Liu X., Journal of Applied Electrochemistry, Vol. 39 pp. 2323 - 2328(2009). 6. Wang C., Yuan R., Chai Y., Chen (xem tiếp tr.85) Mẫu 6 M 12 M 18 M (A) Mẫu 6 M 12 M 18 M (B)