Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

MỞ ĐẦU Virút Cúm là tác nhân quan trọng gây bệnh Cúm cho người trên toàn cầu và lây truyền chủ yếu qua đường hô hấp. Trong các dịch Cúm hàng năm, 5-15% dân số bị ảnh hưởng do lây nhiễm bằng đường hô hấp trên. Các trường hợp nhập viện và tử vong chủ yếu xảy ra ở những nhóm có nguy cơ cao , như người cao tuổi và người ốm mạn tính. Mặc dù khó có thể đánh giá đầy đủ, nhưng các số liệu thống kê cho thấy những dịch Cúm này gây ra từ 3 đến 5 triệu ca bệnh và khoảng 250.000 đến 500.000 ca tử vong mỗi năm trên toàn cầu. Nguy cơ mắc bệnh nặng và tử vong cao nhất trong số các bệnh nhân lớn hơn 65 tuổi, trẻ nhỏ dưới 2 tuổi, và những người có nguy cơ mắc thêm các biến chứng từ Cúm. Theo số liệu của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng (The Center for Disease Control and Prevention - CDC, Atlanta, Mỹ) mỗi năm ở Mỹ có hơn 200.000 ca nhập viện vì biến chứng của Cúm và 36.000 trường hợp chết. Bệnh Cúm lan rộng nhanh chóng trên toàn thế giới trong những mùa dịch và gây ra gánh nặng đáng kể cho kinh tế và y học. Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất đối với dịch Cúm là tiêm phòng vắc xin. Vắc xin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên người trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng nguyên vắc xin phù hợp với chủng virút Cúm đang lưu hành. Dựa trên thông tin thu thập được từ mạng lưới giám sát bệnh Cúm toàn cầu của WHO, hàng năm WHO đưa ra khuyến cáo thành phần kháng nguyên của vắc xin tập trung vào 3 chủng phổ biến nhất đang lưu hành. Hiện tại các virút Cúm đang lưu hành gây bệnh cho người được phân chia thành hai nhóm A và B. Cúm A có 2 phân týp quan trọng nhất đối với người là A/H3N2 và A/H1N1, liên quan đến những đại dịch có số người tử vong nhiều nhất. Hiện nay, tất cả các nhà sản xuất vắc xin Cúm trên thế giới đã và đang sử dụng công nghệ truyền thống là sản xuất trên trứng gà có phôi không mang các tác nhân gây bệnh đặc hiệu. Tuy nhiên, đây là một hệ thống cồng kềnh với nhiều điểm bất lợi như: chi phí cao, có thể lẫn các tạp chất gây dị ứng. Virút Cúm người sinh trưởng trên trứng có thể dẫn đến sự chọn lọc những biến đổi trong các kháng nguyên đặc hiệu từ chủng virút gốc (14) và nguồn cung cấp trứng không đảm bảo được thời gian, ảnh hưởng đến tính sẵn sàng cho việc đối phó với bệnh dịch (29). Việc nuôi cấy virút Cúm trên tế bào là rất khả thi trong việc sản xuất vắc xin với những lợi thế so với trên trứng gà có phôi như: cho năng suất cao và sạch do không lẫn những tạp chất như trên trứng, virút nhân lên trên tế bào vẫn giữ đặc tính kháng nguyên như ở chủng virút gốc. Xuất phát từ thực tế đó, nhằm nghiên cứu sản xuất vắc xin Cúm mùa bất hoạt có hiệu lực cao với giá thành hạ, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau". Đề tài được thực hiện nhằm 2 mục tiêu: 1. Đánh giá khả năng thích ứng của 3 chủng virút Cúm mùa H1N1, H3N2 và B trên các dòng tế bào thận khỉ tiên phát (PMKc), thận khỉ xanh châu Phi thường trực (Vero) và thận chó Madin-Darby thường trực (MDCK). 2. Nghiên cứu cấy truyền các chủng virút Cúm mùa trên dòng tế bào thích hợp nhằm nâng cao hiệu giá.

doc59 trang | Chia sẻ: thanhnguyen | Ngày: 03/01/2013 | Lượt xem: 1518 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Më ®Çu Virót Cóm lµ t¸c nh©n quan träng g©y bÖnh Cóm cho ng­êi trªn toµn cÇu vµ l©y truyÒn chñ yÕu qua ®­êng h« hÊp. Trong c¸c dÞch Cóm hµng n¨m, 5-15% d©n sè bÞ ¶nh h­ëng do l©y nhiÔm b»ng ®­êng h« hÊp trªn. C¸c tr­êng hîp nhËp viÖn vµ tö vong chñ yÕu x¶y ra ë nh÷ng nhãm cã nguy c¬ cao , nh­ ng­êi cao tuæi vµ ng­êi èm m¹n tÝnh. MÆc dï khã cã thÓ ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ, nh­ng c¸c sè liÖu thèng kª cho thÊy nh÷ng dÞch Cóm nµy g©y ra tõ 3 ®Õn 5 triÖu ca bÖnh vµ kho¶ng 250.000 ®Õn 500.000 ca tö vong mçi n¨m trªn toµn cÇu. Nguy c¬ m¾c bÖnh nÆng vµ tö vong cao nhÊt trong sè c¸c bÖnh nh©n lín h¬n 65 tuæi, trÎ nhá d­íi 2 tuæi, vµ nh÷ng ng­êi cã nguy c¬ m¾c thªm c¸c biÕn chøng tõ Cóm. Theo sè liÖu cña Trung t©m KiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng (The Center for Disease Control and Prevention - CDC, Atlanta, Mü) mçi n¨m ë Mü cã h¬n 200.000 ca nhËp viÖn v× biÕn chøng cña Cóm vµ 36.000 tr­êng hîp chÕt. BÖnh Cóm lan réng nhanh chãng trªn toµn thÕ giíi trong nh÷ng mïa dÞch vµ g©y ra g¸nh nÆng ®¸ng kÓ cho kinh tÕ vµ y häc. BiÖn ph¸p phßng chèng h÷u hiÖu nhÊt ®èi víi dÞch Cóm lµ tiªm phßng v¾c xin. V¾c xin Cóm cã hiÖu qu¶ b¶o vÖ 70-90% trªn ng­êi trÎ tuæi m¹nh kháe nÕu kh¸ng nguyªn v¾c xin phï hîp víi chñng virót Cóm ®ang l­u hµnh. Dùa trªn th«ng tin thu thËp ®­îc tõ m¹ng l­íi gi¸m s¸t bÖnh Cóm toµn cÇu cña WHO, hµng n¨m WHO ®­a ra khuyÕn c¸o thµnh phÇn kh¸ng nguyªn cña v¾c xin tËp trung vµo 3 chñng phæ biÕn nhÊt ®ang l­u hµnh. HiÖn t¹i c¸c virót Cóm ®ang l­u hµnh g©y bÖnh cho ng­êi ®­îc ph©n chia thµnh hai nhãm A vµ B. Cóm A cã 2 ph©n týp quan träng nhÊt ®èi víi ng­êi lµ A/H3N2 vµ A/H1N1, liªn quan ®Õn nh÷ng ®¹i dÞch cã sè ng­êi tö vong nhiÒu nhÊt. HiÖn nay, tÊt c¶ c¸c nhµ s¶n xuÊt v¾c xin Cóm trªn thÕ giíi ®· vµ ®ang sö dông c«ng nghÖ truyÒn thèng lµ s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i kh«ng mang c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh ®Æc hiÖu. Tuy nhiªn, ®©y lµ mét hÖ thèng cång kÒnh víi nhiÒu ®iÓm bÊt lîi nh­: chi phÝ cao, cã thÓ lÉn c¸c t¹p chÊt g©y dÞ øng. Virót Cóm ng­êi sinh tr­ëng trªn trøng cã thÓ dÉn ®Õn sù chän läc nh÷ng biÕn ®æi trong c¸c kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu tõ chñng virót gèc (14) vµ nguån cung cÊp trøng kh«ng ®¶m b¶o ®­îc thêi gian, ¶nh h­ëng ®Õn tÝnh s½n sµng cho viÖc ®èi phã víi bÖnh dÞch (29). ViÖc nu«i cÊy virót Cóm trªn tÕ bµo lµ rÊt kh¶ thi trong viÖc s¶n xuÊt v¾c xin víi nh÷ng lîi thÕ so víi trªn trøng gµ cã ph«i nh­: cho n¨ng suÊt cao vµ s¹ch do kh«ng lÉn nh÷ng t¹p chÊt nh­ trªn trøng, virót nh©n lªn trªn tÕ bµo vÉn gi÷ ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn nh­ ë chñng virót gèc. XuÊt ph¸t tõ thùc tÕ ®ã, nh»m nghiªn cøu s¶n xuÊt v¾c xin Cóm mïa bÊt ho¹t cã hiÖu lùc cao víi gi¸ thµnh h¹, chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: "Nghiªn cøu thÝch øng chñng virót Cóm mïa trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau". §Ò tµi ®­îc thùc hiÖn nh»m 2 môc tiªu: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng thÝch øng cña 3 chñng virót Cóm mïa H1N1, H3N2 vµ B trªn c¸c dßng tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t (PMKc), thËn khØ xanh ch©u Phi th­êng trùc (Vero) vµ thËn chã Madin-Darby th­êng trùc (MDCK). Nghiªn cøu cÊy truyÒn c¸c chñng virót Cóm mïa trªn dßng tÕ bµo thÝch hîp nh»m n©ng cao hiÖu gi¸. Ch­¬ng 1 TæNG QUAN Virót Cóm N¨m 1931, Shope vµ céng sù ®· lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®­îc virót Cóm tõ lîn bÞ nhiÔm bÖnh.  H×nh 1. H×nh ¶nh virót Cóm A d­íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua. Nguån: Public Health Image Library (CDC), ID: #8160. §é phãng ®¹i 100.000 lÇn LÞch sö N¨m 1918, dÞch Cóm T©y Ban Nha ®· lµm tö vong 50 triÖu ng­êi, do virót ph©n nhãm H1N1 g©y ra, th­êng ®­îc coi lµ chñng g©y Cóm lîn nh­ng cã kh¶ n¨ng truyÒn nhiÔm. N¨m 1957 vµ 1958, H2N2 g©y nªn dÞch Cóm ch©u ¸ vµo ®· lµm chÕt kho¶ng 1 triÖu ng­êi trªn thÕ giíi. N¨m 1968, 1969 H3N2 ph¸t triÓn tõ chñng H2N2 do biÕn ®æi di truyÒn vµ g©y nªn dÞch Cóm Hång K«ng ®· g©y tö vong 750,000 ng­êi. §©y lµ ®¹i dÞch g©y tö vong lín nhÊt thÕ kû 20. N¨m 2002, víi sù bïng ph¸t ph©n nhãm H7N2 trong gia cÇm, 44 ng­êi ®· ®­îc ph¸t hiÖn lµ bÞ nhiÔm virót t¹i bang Virginia, Mü. Th¸ng 2 n¨m 2004, ë B¾c Mü, ng­êi ta ®· ph¸t hiÖn chñng virót Cóm gµ H7N3 t¹i mét sè trang tr¹i gia cÇm t¹i British Columbia. N¨m 2003 ë Hµ Lan, 89 ng­êi ®· ®­îc chÈn ®o¸n lµ nhiÔm virót Cóm H7N7 sau mét ®ît dÞch Cóm gia cÇm tõ mét sè trang tr¹i l©n cËn. Mét tr­êng hîp ®· tö vong. N¨m 2005, cã 3 tr­êng hîp ph¸t hiÖn nhiÔm H9N2 ë Trung Quèc vµ Hång K«ng cho thÊy bÞ nhiÔm virót vµ tÊt c¶ ®Òu ®· qua khái. Lo¹i virót nµy ®· ®­îc nghiªn cøu cho thÊy chØ lµ d¹ng "g©y nhiÔm thÊp". Tõ n¨m 1997, sù bïng ph¸t cña virót H5N1 ®· lµm nhiÔm bÖnh vµ chÕt hµng chôc triÖu gia cÇm. H5N1 ®­îc coi lµ t©m ®iÓm cña sù chó ý vµ c¶nh b¸o r»ng mét biÕn chñng tõ ph©n nhãm H5N1 cã thÓ tù biÕn ®æi (hoÆc t¸i tæ hîp) ®Ó t¹o thµnh mét chñng virót cã kh¶ n¨ng g©y ®¹i dÞch Cóm toµn cÇu. T×nh h×nh hiÖn nay Tõ th¸ng 2 ®Õn th¸ng 9 - 2008, ho¹t ®éng cña virót Cóm ®­îc b¸o c¸o ë ch©u Phi, ch©u Mü, ch©u ¸, ch©u ¢u vµ ch©u §¹i D­¬ng. Nh×n chung, virót Cóm ho¹t ®éng ë møc võa ph¶i (42). ë phÝa B¾c b¸n cÇu, virót Cóm tiÕp tôc l­u hµnh vµ g©y ra nh÷ng vô bïng ph¸t dÞch ë ch©u ¸, ch©u ¢u vµ B¾c Mü. Ho¹t ®éng cña virót Cóm gi¶m xuèng trong th¸ng 3 ë ch©u ¢u vµ th¸ng 4 ë ch©u ¸ vµ B¾c Mü. Virót Cóm A/H1N1 l­u hµnh réng r·i vµ chiÕm ­u thÕ ë nhiÒu quèc gia. Virót Cóm A/H3N2 chiÕm ­u thÕ ë Mü vµ l­u hµnh Ýt h¬n ë ch©u ¸ vµ §«ng ¢u. Virót Cóm B l­u hµnh ®ång thêi vµ cã nh÷ng vô bïng ph¸t ë mét vµi n­íc. ë phÝa Nam b¸n cÇu, ho¹t ®éng cña virót Cóm b¾t ®Çu vµo th¸ng 3 vµ t¨ng lªn trong th¸ng 4 ë B¾c Mü, trong khi ë ch©u Phi vµ ch©u §¹i D­¬ng, ho¹t ®éng b¾t ®Çu trong th¸ng 5 vµ t¨ng lªn ë th¸ng 6. Nh×n chung, ho¹t ®éng gi¶m xuèng trong th¸ng 8 ngo¹i trõ ë Australia, Braxin vµ New Zealand. ë ch©u Phi, virót Cóm A/H1N1 chiÕm ­u thÕ vµ g©y ra nh÷ng vô bïng ph¸t. ë Nam Mü, virót Cóm A/H1N1 vµ virót Cóm B cïng l­u hµnh vµ liªn quan ®Õn nh÷ng vô dÞch. ë ch©u §¹i D­¬ng, cã b¸o c¸o vÒ nh÷ng vô bïng ph¸t do virót Cóm A/H3N2 vµ Cóm B cïng l­u hµnh g©y ra. Sau 3 n¨m nghiªn cøu vÒ dÞch tÔ bÖnh Cóm t¹i Hµ Néi, tõ n¨m 2001 ®Õn 2003, c¸c nhµ khoa häc ®· thu thËp tæng céng 4078 mÉu dÞch tôy hÇu (nasopharyngeal swab) tõ bÖnh nh©n èm gièng Cóm (ILI) tr­íc khi dÞch Cóm gia cÇm A/H5N1 bïng ph¸t (10). B»ng c¸ch ph©n lËp virót Cóm, ®· ph¸t hiÖn 119 mÉu (2,5%) d­¬ng tÝnh. Virót Cóm ®­îc ph¸t hiÖn thÊy ë hÇu hÕt c¸c th¸ng trong n¨m víi ®Ønh lµ vµo th¸ng 6 ®Õn th¸ng 8 trong suèt mïa m­a, mét ®Ønh kh¸c r¬i vµo th¸ng 12 ®Õn th¸ng 1 trong suèt mïa ®«ng ë Hµ Néi. Virót Cóm B chiÕm ­u thÕ trong n¨m 2001, tiÕp theo lµ Cóm A/H3N2 trong n¨m 2002, vµ trong n¨m 2003, c¶ 3 ph©n nhãm Cóm A/H3N2, A/H1N1 vµ B cïng l­u hµnh. Kh«ng cã tr­êng hîp nµo nhiÔm virót Cóm A/H5N1 trong c¸c mÉu bÖnh phÈm nµy. Theo kÕt qu¶ cña sù gi¸m s¸t c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm quèc gia thùc hiÖn bëi Bé Y tÕ ViÖt Nam, trong giai ®o¹n 2001-2003, trung b×nh sè tr­êng hîp m¾c bÖnh mçi n¨m trªn toµn quèc lµ 2054,2/100.000 d©n vµ lµ bÖnh ®­îc xÕp h¹ng cao nhÊt trong 24 bÖnh truyÒn nhiÔm. Mçi vïng cã tÝnh mïa vµ sè ca ILI kh¸c nhau. MiÒn B¾c cã 2725,8 ca/100.000 d©n mçi n¨m, vµ thÓ hiÖn tÝnh mïa víi ®Ønh cao tõ th¸ng 5 ®Õn th¸ng 9. Trung b×nh sè ca ILI cao nhÊt ë vïng nói T©y B¾c víi 3670,6 ca/100.000 d©n víi møc ®Ønh ë th¸ng 8 vµ th¸ng 9. MiÒn Trung vµ miÒn Nam kh«ng thÓ hiÖn tÝnh mïa râ rµng, vµ c¸c ca ILI còng thÊp h¬n c¸c vïng kh¸c. Còng nh­ nh÷ng b¸o c¸o tr­íc ®©y ë quèc gia nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi ë ch©u ¸ nh­ Th¸i Lan, Indonesia, Myanma, Singapo vµ mét phÇn miÒn nam cña Trung Quèc gåm c¶ §µi Loan (9, 19), nh÷ng kÕt qu¶ nµy chØ ra r»ng virót Cóm l­u hµnh trong c¶ n¨m ë Hµ Néi víi 2 ®Ønh cao, mét trong mïa m­a vµ mét trong mïa ®«ng l¹nh. Tuy nhiªn, th«ng tin tõ nh÷ng khu vùc nµy vÉn cßn h¹n chÕ, cã thÓ do thiÕu nh÷ng m¹ng l­íi gi¸m s¸t Cóm quèc gia, ph­¬ng tiÖn vµ nh©n viªn cã ®ñ kü n¨ng trong c¸c phßng thÝ nghiÖm vµ nguån tµi chÝnh cÇn thiÕt (31). Theo c¸c b¸o c¸o cña WHO vµ c¸c trung t©m hîp t¸c vÒ sù ho¹t ®éng cña virót Cóm, nh÷ng týp/ph©n týp chiÕm ­u thÕ ë §«ng Nam ¸ vµ ch©u §¹i D­¬ng lµ sù trén lÉn cña A/H1N1, H3N2 vµ B trong suèt n¨m 2001 vµ 2002, ®Õn n¨m 2003 th× Cóm A/H3N2 chiÕm ­u thÕ (38-40). Trong nghiªn cøu nµy, nh÷ng týp/ph©n týp virót Cóm l­u hµnh ë Hµ Néi qua thêi gian 3 n¨m cã sù kh¸c nhau Ýt h¬n so víi ë c¸c khu vùc xung quanh ë ch©u ¸, song nh÷ng ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn lµ t­¬ng tù (38-41). KÕt qu¶ thu thËp ®­îc cho phÐp nhãm t¸c gi¶ kÕt luËn r»ng nh÷ng chñng virót ë Hµ Néi kh¸ phï hîp víi nh÷ng chñng v¾c xin toµn cÇu. Ph©n lo¹i C¸c virót Cóm thuéc hä Orthomyxoviridae, lµ nh÷ng chñng virót cã hÖ gen d¹ng sîi ®¬n ARN (-) gåm 8 ph©n ®o¹n lÇn l­ît m· hãa cho 8 lo¹i protein kh¸c nhau cña virót (Cóm A, B). Hä Orthomyxoviridae gåm 4 gièng: Virót Cóm A, virót Cóm B, virót Cóm C vµ Thogovirót. Virót Cóm B vµ C th­êng chØ g©y nhiÔm cho ng­êi trong khi phÇn lín virót Cóm A g©y nhiÔm trªn gia cÇm vµ chØ cã mét vµi ph©n týp g©y nhiÔm cho ng­êi vµ c¸c ®éng vËt kh¸c nh­ lîn, ngùa. Virót Cóm A, B vµ C kh¸c nhau vÒ tÝnh kh¸ng nguyªn cña nucleocapsit vµ neuramidaza glycoprotein. Virót Cóm A ®­îc chia c¸c ph©n týp dùa trªn tÝnh kh¸ng nguyªn cña c¸c ph©n tö HA vµ NA cña chóng. HiÖn nay, c¸c nhµ khoa häc ®· t×m ra 16 lo¹i HA (H1-H16) vµ 9 lo¹i NA (N1-N9). Gia cÇm thñy sinh lµ æ chøa tù nhiªn cña tÊt c¶ c¸c lo¹i virót Cóm. Chñng virót Cóm ®­îc ®Æt tªn theo nguån gèc ph©n lËp, vïng ®Þa lý ph©n lËp, sè chñng, n¨m ph©n lËp. Tõ n¨m 1983 ®Õn nay, kh«ng cã thªm ph©n týp míi nµo ®­îc ph¸t hiÖn, ®iÒu nµy cho thÊy cã mét sè giíi h¹n vÒ sù biÕn chñng cña virót Cóm A. H×nh th¸i vµ cÊu tróc cña virót Cóm Virót Cóm A vµ B cã cÊu tróc gièng nhau trong khi virót Cóm C cã cÊu tróc kh¸c biÖt víi c¸c gai glycoprotein s¾p xÕp theo h×nh 6 c¹nh. Virót Cóm A vµ B nu«i cÊy trªn tÕ bµo hoÆc trøng cã h×nh d¹ng th«ng th­êng ®­êng kÝnh 80-120nm. Ng­îc l¹i, virót Cóm ph©n lËp tõ ng­êi vµ ®éng vËt sau ®ã ®­îc cÊy truyÒn mét lÇn trªn tÕ bµo th­êng cã h×nh th¸i kh¸c biÖt vµ ®a d¹ng. H×nh th¸i virót Cóm A lµ mét kiÓu gen riªng biÖt nh­ng phô thuéc rÊt nhiÒu vµo lo¹i tÕ bµo chñ khi virót nh©n lªn. §Æc ®iÓm h×nh th¸i næi bËt cña virót Cóm A lµ líp bao gåm 500 gai (10-14nm) xße ra phÝa ngoµi líp lipit. Cã 2 lo¹i gai kh¸c nhau: gai h×nh gËy lµ kh¸ng nguyªn HA vµ gai h×nh nÊm lµ kh¸ng nguyªn NA. Tû lÖ HA:NA th­êng dao ®éng nh­ng th«ng th­êng tõ 4:1 ®Õn 5:1. Protein matrix M1 ®­îc cho lµ n»m d­íi líp lipit kÐp vµ liªn kÕt víi Ribonucleoprotein (RNP) lâi cña virót. M1 lµ protein cã nhiÒu nhÊt trong virion.  H×nh 2. Virion cña virót Cóm A vµ c¸c protein. Nguån: www.influenzareport.com B»ng ph­¬ng ph¸p c¾t líp máng tiªu b¶n cã c¸c h¹t virót hoÆc ph¸ vì h¹t, cÊu tróc RNP cã thÓ ®­îc chia thµnh nhiÒu líp cã kÝch th­íc kh¸c nhau vµ chøa 8 ®o¹n gen cña ARN ®¬n. C¸c RNP cã chøa 4 lo¹i protein vµ ARN. NP lµ protein tiÓu ®¬n vÞ næi tréi cña nucleocapsit vµ bao quanh ARN, cã kho¶ng 20 nucleotit trong 1 tiÓu ®¬n vÞ NP. Liªn kÕt víi RNP lµ phøc hîp ARN polymeraza phô thuéc - ARN bao gåm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA vµ chØ cã mÆt tõ 20-30 b¶n sao trong mét virion. Thµnh phÇn cña c¸c virót trong hä Orthomyxoviridae bao gåm 1% ARN, 70% protein, 20% lipit vµ 5 ®Õn 8% carbonhydrat. Axit nucleic vµ protein Virót Cóm chøa 7 ®Õn 8 ®o¹n ARN sîi ®¬n, ©m. Tæng chiÒu dµi genom lµ 12000-15000 nucleotit, ®o¹n lín nhÊt dµi 2300-2500 nucleotit, nhá nhÊt lµ 800-900 nucleotit. Tr×nh tù genome cã c¸c tr×nh tù lÆp tËn cïng, ë c¶ hai ®Çu. C¸c tr×nh tù lÆp ë ®Çu 5’ dµi 12-13 nucleotit. Tr×nh tù nucleotit cña ®Çu 3’ gièng hÖt ®Çu 5’ ë hÇu hÕt c¸c ®o¹n ARN vµ nh­ nhau trong cïng mét gièng cña cïng mét hä. Nh÷ng tr×nh tù lÆp l¹i dµi 9-11 nucleotit. Lipit Líp mµng lipit cña virót Cóm ®­îc t¹o thµnh tõ mµng bµo t­¬ng cña tÕ bµo chñ n¬i virót nh©n lªn. ¶nh h­ëng cña c¸c t¸c nh©n vËt lý vµ hãa häc Virót Cóm gia cÇm vÉn cã thÓ tån t¹i trong n­íc cÊt h¬n 102 ngµy ë 28OC vµ 207 ngµy ë 17OC vµ thêi gian tån t¹i cña virót ë 4OC ®­îc ­íc l­îng lµ h¬n 1300 ngµy (32). Nghiªn cøu kh¸c ®· chøng minh r»ng ph©n týp cña virót Cóm gia cÇm H7N3 trong n­íc peptone (pH 7.0) vÉn gi÷ ®­îc kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña nã khi ñ ë 4, 30 vµ 37OC trong 35 ngµy. Kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña virót vÉn tån t¹i sau khi chÞu t¸c ®éng cña nhiÖt ®é 56OC trong 30 phót nh­ng sÏ mÊt kh¶ n¨ng nµy sau khi chÞu t¸c ®éng ë 56OC trong vßng 60 phót. Virót cã thÓ gi÷ ë nhiÖt ®é d­íi -50OC trong vßng nhiÒu n¨m. Othomyxoviridae ®­îc xem lµ rÊt dÔ bÞ ¶nh h­ëng bëi ®é pH trong acid. §é pH thÊp t¹o ra sù thÝch nghi vµ sù thay ®æi kh¸ng nguyªn trong protein HA, cho phÐp liªn kÕt víi mµng cña c¸c tÕ bµo ký sinh. ë pH 2, nhiÖt ®é 56OC vµ trong dung dÞch 70% etanol hoÆc mét chÊt tÈy ®Æc hiÖu, ho¹t tÝnh cña virót Cóm bÞ bÊt ho¹t trong thêi gian d­íi 30 phót (20). C¸c lo¹i kh¸ng nguyªn HA Tªn gäi cña protein HA (hemagglutinin) xuÊt ph¸t tõ kh¶ n¨ng ng­ng kÕt hång cÇu cña virót b»ng c¸ch g¾n víi c¸c thô thÓ ®Æc biÖt cã chøa axit sialic. HA cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh sao chÐp virót. §Çu tiªn HA g¾n víi thô thÓ cã chøa axit sialic trªn bÒ mÆt tÕ bµo vµ t¹o thµnh sù g¾n kÕt gi÷a virót vµ tÕ bµo. TiÕp ®ã HA chÞu tr¸ch nhiÖm cho sù x©m nhËp cña virót vµo tÕ bµo b»ng c¸ch gi¸n tiÕp t¹o nªn sù hßa mµng endocytosed cña virót vµ mµng néi bµo lµm cho nucleocapsit virót gi¶i phãng vµo trong bµo t­¬ng. HA lµ kh¸ng nguyªn chÝnh cña virót Cóm, bao gåm c¸c vÞ trÝ kh¸ng nguyªn lµ A, B (mang vÞ trÝ g¾n thô thÓ), C, D vµ E. C¸c vÞ trÝ nµy n»m ë phÇn ®Çu ph©n tö HA, trong khi phÇn cuèi ®­îc g¾n vµo trong líp lipid. Khi bÞ nhiÔm virót Cóm, c¬ thÓ ®¸p øng miÔn dÞch víi kh¸ng nguyªn HA b»ng c¸ch sinh ra c¸c kh¸ng thÓ trung hßa. Nh÷ng thay ®æi ë c¸c vÞ trÝ kh¸ng nguyªn lµm gi¶m hay øc chÕ sù g¾n kÕt cña c¸c kh¸ng thÓ trung hßa, do ®ã cho phÐp mét ph©n týp míi lan réng trong quÇn thÓ kh«ng cã kh¶ n¨ng miÔn dÞch. HiÖn t­îng nµy gäi lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn chËm (antigenic drift). §ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh (antigenic shift) xuÊt hiÖn khi HA bÞ thay ®æi trong mét virót, ch¼ng h¹n H1 thay thÕ bëi H5 dÉn tíi sù h×nh thµnh mét chñng virót Cóm míi. §iÒu nµy cã thÓ x¶y ra khi mét tÕ bµo nhiÔm bëi 2 chñng virót Cóm kh¸c nhau vµ trao ®æi c¸c ®o¹n genome cña chóng trong qu¸ tr×nh nh©n lªn. Nh­ vËy HA lµ kh¸ng nguyªn chÝnh t¹o nªn kh¸ng thÓ trung hßa vµ c¸c vô dÞch Cóm ®Òu liªn quan ®Õn thay ®æi cÊu tróc kh¸ng nguyªn. NP NP lµ protein cÊu tróc chÝnh phèi hîp víi c¸c ®o¹n ARN t¹o thµnh RNP. NP cßn lµ kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu týp, kh¸c nhau gi÷a virót Cóm A, B vµ C. MÆc dï lµ mét protein ®Æc hiÖu týp nh­ng NP cña virót Cóm A vÉn biÓu hiÖn sù biÕn ®æi kh¸ng nguyªn. NP cã Ýt nhÊt 3 vïng liªn kÕt kh¸ng thÓ kh«ng chång lªn nhau, mét trong sè nµy cã tÝnh b¶o thñ cao. Kh¸ng thÓ ®¬n dßng g¾n vµo vÞ trÝ nµy g©y øc chÕ phiªn m· ARN virót trong phßng thÝ nghiÖm. NP cã mét vµi quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu tÕ bµo T ®­îc b¶o tån trong sè c¸c virót Cóm A ë ng­êi. NA NA lµ glycoprotein thø hai ®Æc hiÖu cho ph©n týp cña virót Cóm A, B. NA do ®o¹n gen ARN thø 6 m· hãa vµ lµ mét homotetramer. NA quan träng do ho¹t tÝnh sinh häc lo¹i bá axit sialic tõ glycoprotein. NA cã thÓ cho phÐp vËn chuyÓn virót qua mµng mucin ë trªn ®­êng h« hÊp, gióp hç trî virót tÊn c«ng tÕ bµo biÓu m« ®Ých. NA cña virót Cóm A cã 4 vÞ trÝ kh¸ng nguyªn, mçi vÞ trÝ bao gåm nhiÒu quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn (epitop). Nh÷ng cÊu tróc kh¸ng nguyªn cña N9 NA ®­îc nghiªn cøu nhiÒu nhÊt. Ph©n tÝch cÊu tróc cña phøc hîp N9 NA tõ chñng A/tern/Australia/G75 víi m¶nh Fab cña kh¸ng thÓ ®¬n dßng NC41 (34) cho thÊy r»ng kh¸ng thÓ tiÕp xóc NA qua mét bÒ mÆt cã diÖn tÝch 900Ǻ2, bao gåm 19 axit amin n»m trªn 5 vßng polypeptit bao quanh vÞ trÝ ho¹t ®éng cña enzym. Trong sè nµy, chØ cã mét vµi axit amin cung cÊp nh÷ng ®iÓm tiÕp xóc quyÕt ®Þnh cÇn cho sù nhËn diÖn cña kh¸ng thÓ (24). Trong sù l©y nhiÔm tù nhiªn, miÔn dÞch ®èi víi NA chØ cã vai trß kh«ng ®¸ng kÓ b¶o vÖ con ng­êi khái nhiÔm Cóm. Cã thÓ lÊy vÝ dô minh häa tõ ®¹i dÞch 1968, khi ®ã t¸c nh©n g©y bÖnh cã NA tõ mét virót Cóm ng­êi l­u hµnh tr­íc ®ã, sù miÔn dÞch ®èi víi NA ®· kh«ng thÓ ng¨n con ng­êi khái ®¹i dÞch Cóm. Ngoµi c¸c kh¸ng nguyªn chñ yÕu trªn, virót Cóm cßn cã c¸c kh¸ng nguyªn protein polymeraza (PB1, PB2, PA), M1, M2, NS1 vµ NS2 ®­îc nhËn diÖn bëi c¸c tÕ bµo T trong c¬ thÓ ng­êi nhiÔm virót Cóm. Sù t¸i tæ hîp cña virót Cóm Virót Cóm A, B, C cã thÓ t¸i tæ hîp trong tù nhiªn gi÷a c¸c thµnh viªn cïng týp nh­ng kh«ng x¶y ra gi÷a c¸c týp kh¸c nhau. Sù xuÊt hiÖn cña chñng ®¹i dÞch lµ hËu qu¶ cña viÖc t¸i tæ hîp t¹o ra chñng ph©n týp míi cã NA hoÆc HA kh¸c h¼n víi chñng l­u hµnh tr­íc ®ã. Virót Cóm B kh¸c víi virót Cóm A lµ kh«ng cã æ chøa ®éng vËt. MÆc dï virót Cóm B nguyªn thñy thÝch øng trªn ng­êi dÔ dµng h¬n virót Cóm A nh­ng tû lÖ ®ét biÕn vµ thay ®æi chØ b»ng mét nöa virót Cóm A (43). Cã nhiÒu b»ng chóng cho r»ng virót Cóm trong loµi thñy cÇm l©y truyÒn cho lîn, ngùa, gia cÇm vµ ®éng vËt cã vó ë biÓn; g©y nªn nh÷ng vô dÞch nghiªm träng (36). Virót Cóm gia cÇm kh«ng lan truyÒn trªn quÇn thÓ ng­êi vµ ng­îc l¹i, virót cña ng­êi kh«ng l©y truyÒn sang quÇn thÓ chim, ®iÒu nµy cho thÊy hµng rµo gi÷a chim vµ ng­êi rÊt chÆt chÏ. Tuy nhiªn, nhiÒu b»ng chøng cho thÊy loµi lîn cã thÓ c¶m nhiÔm dÔ dµng víi c¶ hai lo¹i virót Cóm ng­êi hoÆc gia cÇm (12) vµ hµng rµo loµi gi÷a lîn vµ gia cÇm hoÆc gi÷a lîn vµ ng­êi láng lÎo h¬n nhiÒu, v× vËy lîn cã thÓ ®ãng vai trß nh­ lµ vËt chñ trung gian ®Ó t¹o ra gièng virót Cóm míi trªn ng­êi (6). Virót Cóm H3N2 ®· ®­îc ph©n lËp trªn lîn ë kh¾p thÕ giíi. Nh÷ng virót nµy cã ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn vµ gen gièng nh­ nh÷ng chñng ®· l­u hµnh trªn ng­êi tr­íc khi ph©n lËp ë lîn (23). Sù t¸i tæ hîp cña ®o¹n ARN virót trong khi nhiÔm trïng kÐp víi hai chñng Cóm ng­êi vµ gia cÇm lµ c¬ chÕ ®Ó t¹o ra chñng míi. QuÇn thÓ ng­êi kh«ng cã kh¸ng thÓ trung hßa víi kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót míi t¹o ra do ®ã kh«ng ®­îc b¶o vÖ. Virót míi cã thÓ lan truyÒn dÔ dµng g©y ra ®¹i dÞch. §¸p øng miÔn dÞch víi virót Cóm  H×nh 3. §¸p øng miÔn dÞch thÓ dÞch vµ qua trung gian tÕ bµo khi nhiÔm virót Cóm. Nguån: www.influenzareport.com Nh¸nh thÓ dÞch cña hÖ thèng miÔn dÞch bao gåm c¸c tÕ bµo lympho B (tr¸i), sau khi t­¬ng t¸c víi virót Cóm sÏ biÖt ho¸ thµnh c¸c tÕ bµo plasma s¶n xuÊt kh¸ng thÓ. §¸p øng qua trung gian tÕ bµo (ph¶i) b¾t ®Çu víi tr×nh diÖn KN th«ng qua c¸c ph©n tö MHC I (mµu ®en) vµ II (mµu xanh) bëi c¸c tÕ bµo tua, lµ tÕ bµo sau ®ã sÏ dÉn tíi sù ho¹t ho¸, t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ c¸c tÕ bµo T ®Æc hiÖu kh¸ng nguyªn (CD4 hoÆc CD8). Nh÷ng tÕ bµo nµy cã chøc n¨ng gióp tÕ bµo xö lý (effector cell) qua phãng thÝch trùc tiÕp c¸c cytokin hoÆc trung gian tÝnh ®éc tÕ bµo sau khi ®· nhËn diÖn kh¸ng nguyªn. §¸p øng miÔn dÞch dÞch thÓ C¸c kh¸ng thÓ ®­îc c¸c tÕ bµo plasma s¶n xuÊt, n»m trong giai ®o¹n cuèi cïng cña sù ph¸t sinh tÕ bµo B, ®ßi hái tÕ bµo B ph¶i nhËn diÖn ®­îc kh¸ng nguyªn vµ ®­îc tÕ bµo T CD4 vµ c¸c cytokin ph¸t sinh tõ tÕ bµo T. Kh«ng gièng nh­ tÕ bµo T, tÕ bµo B cã thÓ nhËn ra kh¸ng nguyªn d­íi d¹ng tù nhiªn cña chóng. TÝnh ®Æc hiÖu cña kh¸ng nguyªn lµ do sù t¸i s¾p xÕp ngÉu nhiªn c¸c gen m· ho¸ cho vïng siªu biÕn cña c¸c Ig trong tÕ bµo khi tÕ bµo cßn n»m trong tuû x­¬ng. C¸c tÕ bµo B non (naive B cell) sau ®ã ®i vµo hÖ tuÇn hoµn råi theo m¸u vµ h¹ch b¹ch huyÕt ®Õn c¸c m« vµ c¬ quan lymph«. T¹i c¸c h¹ch lymph«, tÕ bµo B non sÏ nhËn diÖn kh¸ng nguyªn, sau ®ã tÕ bµo B ®­îc ho¹t ho¸, chuyÓn s¶n xuÊt tõ Ig M sang IgG, lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu vµ ¸i lùc cña globuline miÔn dÞch vµ biÖt ho¸ thµnh c¸c tÕ bµo plasma hoÆc tÕ bµo B nhí khi tÕ bµo tiÕp tôc ph©n chia d­íi sù hiÖn diÖn cña c¸c cytokin. Trong lóc Ig A ®­îc vËn chuyÓn xuyªn qua líp biÓu m« cña ®­êng h« hÊp trªn, lµ n¬i IgA sÏ trung hoµ vµ lo¹i trõ virót g©y nhiÔm, th× IgG chñ yÕu chØ cã vai trß b¶o vÖ ®­êng h« hÊp d­íi. Khi nhiÔm virót Cóm, c¬ thÓ sÏ t¹o ra c¸c kh¸ng thÓ ®èi víi c¶ 2 glycoprotein HA vµ NA, còng nh­ protein M vµ NP. HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao nhÊt vµo gi÷a tuÇn thø 4-7 sau khi nhiÔm, vµ sau ®ã gi¶m dÇn. Kh¸ng thÓ vÉn cßn cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc nhiÒu n¨m sau ®ã dï kh«ng bÞ t¸i ph¬i nhiÔm. C¸c hiÖu gi¸ øc chÕ HA huyÕt thanh tõ 1/40 trë lªn, hoÆc hiÖu gi¸ trung hoµ huyÕt thanh tõ 1/8 trë lªn ®­îc coi nh­ cã kh¶ n¨ng b¶o vÖ. ë ng­êi giµ, ®Ó ®­îc b¶o vÖ hoµn toµn, cÇn ph¶i cã møc kh¸ng thÓ cao h¬n. Ng­îc l¹i víi kh¸ng thÓ kh¸ng HA, kh¸ng thÓ kh¸ng NA kh«ng trung hoµ ®­îc tÝnh g©y nhiÔm cña virót, nh­ng thay vµo ®ã kh¸ng thÓ nµy sÏ ng¨n kh«ng cho c¸c tÕ bµo bÞ nhiÔm phãng thÝch virót ra ngoµi. §ã lµ do t¸c dông ph©n c¾t acid sialic cña NA n»m trªn thô thÓ tÕ bµo. Kh¸ng thÓ kh¸ng NA cã thÓ b¶o vÖ c¬ thÓ khái tr¸nh nhiÔm bÖnh vµ lµm gi¶m sù th¶i tiÕt virót còng nh­ møc ®é trÇm träng cña c¸c triÖu chøng. §¸p øng miÔn dÞch mµng niªm chèng l¹i virót Cóm, c¨n cø theo l­îng dÞch tiÕt ë mòi, cã sù hiÖn diÖn cña IgA vµ IgG1 chèng l¹i HA. C¸c nghiªn cøu cho thÊy r»ng sù ®Ò kh¸ng t¸i nhiÔm chñ yÕu ®­îc trung gian qua IgA, mÆc dï IgG còng cã phÇn liªn quan. Trong miÔn dÞch, kh¸ng thÓ t¸c ®éng chèng l¹i virót Cóm b»ng c¸ch trung hoµ virót hoÆc ly gi¶i tÕ bµo bÞ nhiÔm th«ng qua bæ thÓ hoÆc tÝnh ®éc tÕ bµo phô thuéc vµo kh¸ng thÓ. §¸p øng miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo Ng­êi ta ®· chøng minh c¸c tÕ bµo tua ®ãng vai trß trung t©m trong viÖc khëi ®Çu vµ thóc ®Èy c¸c ®¸p øng tÕ bµo T. §©y lµ nhãm b¹ch cÇu ph¸t sinh tõ tuû x­¬ng, di ®éng, ph©n bè th­a thít, chuyªn tr¸ch viÖc thu nhËn, vËn chuyÓn, xö lý vµ tr×nh diÖn kh¸ng nguyªn cho tÕ bµo T. Khu«n mÉu c¬ b¶n cho lo¹i tÕ bµo nµy lµ c¸c tÕ bµo tua n»m ë phæi b¾t gi÷ kh¸ng nguyªn tõ t¸c nh©n g©y bÖnh bªn ngoµi x©m nhËp vµo, ho¹t ho¸ vµ sau ®ã tËp trung vÒ c¸c h¹ch lymph«. Kh¸ng nguyªn sau ®ã ®uîc xö lý vµ g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo tua d­íi d¹ng c¸c peptit, c¸c peptit nµy ®­îc c¸c ph©n tö MHC. T¹i c¸c h¹ch lymph«, c¸c tÕ bµo tua lóc nµy sÏ khëi ®éng mét ®¸p øng miÔn dÞch bëi bÊt cø tÕ bµo T nµo cã thô thÓ ®Æc hiÖu cho phøc hîp MHC n»m trªn bÒ mÆt tÕ bµo tua. C¸c tÕ bµo T võa míi ®­îc kÝch ho¹t sÏ di chuyÓn tíi vÞ trÝ bÞ nhiÔm virót n»m ë phæi, n¬i mµ c¸c tÕ bµo nµy sÏ lµm trung gian cho c¸c ho¹t ®éng chèng virót. §¸p øng tÕ bµo T ë ng­êi ®¹t ®Õn ®Ønh vµo kho¶ng ngµy 14 sau khi nhiÔm vµ ë ng­êi lín, l­îng tÕ bµo T ®éc ®Æc tr­ng cho virót Cóm t­¬ng øng víi møc ®é sao chÐp cña virót gi¶m dÇn qua thêi gian. C¸c tÕ bµo T nhí CD8 nhí cã thÓ ®ãng vai trß lµm gi¶m nhÑ møc ®é trÇm träng cña bÖnh vµ lµm cho sù håi phôc nhanh h¬n khi bÞ nhiÔm l¹i. §iÒu quan träng lµ, nh÷ng tÕ bµo nµy cã kh¶ n¨ng ®¸p øng l¹i c¸c tÝn hiÖu ®Çu tiªn khi bÞ nhiÔm víi l­îng virót x©m nhËp ë møc rÊt thÊp. Trong khi kh«ng thÓ t¨ng sinh ®Ó ®¸p øng víi t×nh tr¹ng nhiÔm trïng, c¸c tÕ bµo nµy cã thÓ s¶n xuÊt ra c¸c cytokin ®Ó lµm k×m h·m kh«ng cho virót sao chÐp vµ lan réng trªn biÓu m«. Giai ®o¹n 2 cña ®¸p øng qua trung gian tÕ bµo T nhí lµ c¸c tÕ bµo nµy tËp trung nhanh chãng ë ®­êng h« hÊp trong mét vµi ngµy ®Çu tiªn cña ®¸p øng. Giai ®o¹n 3 lµ sù më réng c¸c tÕ bµo T nhí d­íi t¸c ®éng cña kh¸ng nguyªn x¶y ra ë c¸c c¬ quan lymph« thø cÊp. Sù nh©n lªn cña virót Cóm Virót Cóm còng gièng nh­ c¸c virót kh¸c, nã b¾t buéc ph¶i nh©n lªn trong tÕ bµo c¶m thô. Trong c¬ thÓ sèng, virót Cóm g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo biÓu m« trong phæi vµ cæ häng, tuy nhiªn trong nu«i cÊy tÕ bµo virót Cóm g©y nhiÔm vµ nh©n lªn kh«ng ph¶i lµ tÕ bµo biÓu m«. Sù l©y nhiÔm virót Cóm b¾t ®Çu khi HA virót g¾n víi c¸c thô thÓ ®Æc biÖt cã chøa axit sialic trªn tÕ bµo chñ (b­íc 1). Ng­êi ta thÊy r»ng nh÷ng virót Cóm ph©n lËp tõ ng­êi vµ lîn ­u tiªn g¾n víi vÞ trÝ SA-α2,6-Gal, trong khi ®ã nh÷ng virót ph©n lËp tõ chim vµ ngùa l¹i g¾n tèt h¬n vµo vÞ trÝ SA-α2,3-Gal (2, 5). Sù g¾n ®Æc hiÖu cña HA lµ mét trong nh÷ng yÕu tè quyÕt ®Þnh ®Õn qu¸ tr×nh x©m nhËp vµo vËt chñ cña virót (16, 18). §Ó virót cã thÓ x©m nhËp ®­îc vµo tÕ bµo, HAO ph¶i ®­îc ph©n c¾t bëi mét serine proteinaza nh­ trypsin ë mét vÞ trÞ ®Æc hiÖu, ®­îc m· hãa bëi mét axit amin ®¬n c¬ b¶n (th­êng lµ arginin), t¹o thµnh hai tiÓu ®¬n vÞ HA1 (khèi l­îng ph©n tö 36 kDa) vµ HA2 (khèi l­îng ph©n tö 27 kDa) g¾n víi nhau b»ng liªn kÕt céng hãa trÞ bëi cÇu disulfide. Sù ph©n c¾t HA lµ ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cho sù l©y nhiÔm cña virót nh»m ®Ó lé ra ®Çu amin kþ n­íc cña HA2 lµm trung gian cho sù hßa mµng cña vá ngoµi virót vµ mµng néi bµo (37). Virót ®i vµo tÕ bµo b»ng c¬ chÕ nhËp bµo. Trong thÓ néi bµo cã tÝnh axit, mét phÇn protein HA hßa tan mµng virót víi mµng kh«ng bµo, gi¶i phãng c¸c ph©n tö vARN, c¸c protein phô vµ enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN vµo tÕ bµo chÊt (b­íc 2). Nh÷ng protein nµy vµ vARN t¹o thµnh mét phøc hîp ®­îc vËn chuyÓn vµo nh©n tÕ bµo, n¬i enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN b¾t ®Çu phiªn m· sîi vARN d­¬ng bæ sung (b­íc 3a vµ 3b). vARN hoÆc ®­îc vËn chuyÓn vµo trong tÕ bµo chÊt vµ dÞch m· (b­íc 4), hoÆc vÉn ë l¹i trong nh©n. C¸c protein virót míi ®­îc tæng hîp hoÆc ®­îc ®­a ra bÒ mÆt tÕ bµo th«ng qua bé m¸y Golgi (trong tr­êng hîp cña HA vµ NA, b­íc 5b) hoÆc vËn chuyÓn trë l¹i vµo trong nh©n ®Ó g¾n víi vARN vµ t¹o thµnh nh÷ng h¹t genome cña virót míi. C¸c protein kh¸c cña virót thùc hiÖn nhiÒu c«ng viÖc trong tÕ bµo chñ, bao gåm ph©n hñy mARN cña tÕ bµo vµ sö dông c¸c nucleotit ®­îc gi¶i phãng ®Ó tæng hîp vARN vµ øc chÕ dÞch m· mARN cña tÕ bµo chñ. vARN ©m t¹o nªn genome cña virót t­¬ng lai, cïng víi enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN vµ c¸c protein kh¸c cña virót ®­îc l¾p r¸p vµo trong mét virion. C¸c ph©n tö HA vµ NA tËp hîp l¹i thµnh mét chç låi ra trong mµng tÕ bµo. vARN vµ c¸c protein virót chñ yÕu rêi nh©n vµ ®i vµo trong phÇn nh« lªn nµy cña mµng (b­íc 6). Virót tr­ëng thµnh n¶y chåi ra khái tÕ bµo trong mét khèi cÇu cña mµng photpholipit, cã c¸c ph©n tö HA vµ NA trªn líp ¸o mµng nµy (b­íc 7). Sau khi gi¶i phãng virót Cóm míi, tÕ bµo chñ sÏ chÕt ®i.  H×nh 4. Chu tr×nh nh©n lªn cña virót Cóm. Nguån: en.wikipedia.org Sù ph¸t triÓn cña virót trªn tÕ bµo Virót cóm ®Çu tiªn ®­îc nu«i trªn trøng gµ cã ph«i. Sau nµy, c¸c virót cóm cã thÓ ®­îc nu«i cÊy trªn trøng gµ cã ph«i hoÆc trong mét sè hÖ nu«i cÊy tÕ bµo tiªn ph¸t. ViÖc nu«i cÊy virót trªn trøng gµ cã ph«i vÉn ®­îc lùa chän lµm quy tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin cóm trªn thÕ giíi. HiÖn nay, c¸c hÖ nu«i cÊy tÕ bµo nh­ thËn khØ tiªn ph¸t hay thËn chã th­êng dïng ®Ó ph©n lËp virót cóm tõ mÉu bÖnh phÈm cña ng­êi. Sù ph¸t triÓn cña virót trªn nu«i cÊy tÕ bµo g©y ra sù hñy ho¹i tÕ bµo vµ t¹o ra c¸c ®¸m ho¹i tö trong mét sè dßng tÕ bµo nh­ tÕ bµo thËn khØ, thËn bª, thËn chuét ®ång, thËn gµ. Ngoµi ra nÕu sö dông c¸c dßng tÕ bµo th­êng trùc th× trypsin ph¶i ®­îc bæ sung ®Ó ho¹t hãa c¸c ph©n tö protein HA trong qu¸ tr×nh x©m nhËp vµo tÕ bµo chñ cña virót. Sinh bÖnh häc C¸c nghiªn cøu ®· ®­a ra nh÷ng b»ng chøng chøng minh r»ng sinh bÖnh häc cña virót Cóm lµ tÝnh tr¹ng ®a gen. §iÒu nµy cã nghÜa lµ s¶n phÈm cña tÊt c¶ c¸c gen cña virót ®Òu tham gia vµo qu¸ tr×nh nhËn d¹ng tÕ bµo vËt chñ vµ g©y ®éc tÝnh trong qu¸ tr×nh x©m nhËp ph¸ vì tÕ bµo. Trong ®ã gen HA ®ãng vai trß trung t©m vÒ tÝnh ®éc cña virót gåm 2 ph©n týp H5, H7, cã ®éc tÝnh m¹nh nªn g©y tû lÖ chÕt cao. Protein HA cña c¸c virót nµy kh¸c c¸c HA cña c¸c ph©n nhãm kh¸c lµ cã mét tr×nh tù nhiÒu axit amin ë ®Çu carboxyl cña HA1. §iÒu nµy cho phÐp c¸c enzyme proteaza cña tÕ bµo nhËn biÕt tr×nh tù ®ã ®Ó c¾t HA thµnh HA1 vµ HA2, lµ giai ®o¹n cÇn thiÕt cho virót x©m nhËp tÕ bµo vµ ph¸t triÓn lan ra. §©y còng lµ c¬ së gi¶i thÝch tÝnh g©y ®éc cña virót Cóm ë ng­êi. DÞch tÔ häc Sù l©y truyÒn vµ sù thay ®æi theo mïa BÖnh Cóm chñ yÕu ®­îc l©y truyÒn tõ ng­êi sang ng­êi qua nh÷ng h¹t nhá (®­êng kÝnh > 5 µm) tõ mòi vµ häng khi ng­êi bÞ nhiÔm khi ho vµ h¾t h¬i. C¸c sol khÝ nµy kh«ng l¬ löng trong kh«ng khÝ vµ cÇn ph¶i cã tiÕp xóc gÇn ®Ó cã thÓ lan truyÒn ®­îc (tõ 1-2 mÐt). Sù l©y truyÒn còng cã thÓ x¶y ra qua tiÕp xóc ngoµi da trùc tiÕp hoÆc tiÕp xóc gi¸n tiÕp víi dÞch tiÕt h« hÊp (tay ch¹m vµo c¸c bÒ mÆt bÞ nhiÔm sau ®ã sê lªn m¾t, mòi hoÆc miÖng). Ng­êi nhiÔm Cóm cã thÓ ph¸t t¸n virót tõ 2 ngµy tr­íc ®Õn 5 ngµy sau khi cã triÖu chøng. TrÎ em cã thÓ l©y lan virót ®Õn 10 ngµy hoÆc l©u h¬n. BÖnh Cóm l©y lan m¹nh nhÊt vµo mïa ®«ng vµ bëi phÝa B¾c vµ Nam b¸n cÇu cã mïa ®«ng ë nh÷ng thêi ®iÓm kh¸c nhau trong n¨m nªn trong thùc tÕ cã hai mïa Cóm kh¸c nhau mçi n¨m. §iÒu nµy gi¶i thÝch t¹i sao WHO ®­a ra nh÷ng khuyÕn c¸o ®èi víi s¶n xuÊt hai lo¹i v¾c xin kh¸c nhau mçi n¨m, mét cho phÝa B¾c, vµ mét cho phÝa Nam b¸n cÇu. Cã nhiÒu lý do ®Ó gi¶i thÝch t¹i sao bÖnh Cóm th­êng bïng ph¸t vµo mïa ®«ng nh­ ®é Èm vµ nhiÖt ®é t­¬ng ®èi thÊp gióp virót Cóm cã thÓ sèng l©u h¬n, mäi ng­êi th­êng xuyªn ë trong nhµ dÉn ®Õn sù tiÕp xóc gÇn gòi h¬n t¹o ®iÒu kiÖn virót l©y lan. Mét gi¶ thiÕt kh¸c lµ do l­îng vitamin D trong c¬ thÓ xuèng thÊp trong mïa l¹nh còng lµm cho con ng­êi dÔ m¾c Cóm h¬n. Tuy nhiªn, nh÷ng thay ®æi theo mïa trong c­êng ®é l©y nhiÔm virót Cóm còng x¶y ra ë nh÷ng vïng nhiÖt ®íi, sù l©y lan cao nhÊt chñ yÕu diÔn ra trong suèt mïa m­a. DÞch vµ ®¹i dÞch Mçi n¨m, c¸c vô dÞch Cóm g©y ra 3-5 triÖu ca bÖnh vµ tõ 300.000-500.000 tö vong trªn toµn cÇu. Nguy c¬ m¾c bÖnh nÆng vµ tö vong cao nhÊt trong sè c¸c bÖnh nh©n lín h¬n 65 tuæi, trÎ nhá d­íi 2 tuæi, vµ nh÷ng ng­êi cã nguy c¬ m¾c thªm c¸c biÕn chøng tõ Cóm. Nh÷ng virót Cóm míi lu«n lu«n ®­îc sinh ra do ®ét biÕn hay t¸i s¾p xÕp vËt liÖu di truyÒn. Nh÷ng ®ét biÕn cã thÓ g©y ra nh÷ng thay ®æi nhá trong c¸c kh¸ng nguyªn HA vµ NA trªn bÒ mÆt virót. §ã lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn chËm, t¹o ra nhiÒu chñng Cóm qua thêi gian cho tíi khi mét trong nh÷ng biÕn thÓ ®¹t tíi sù thÝch øng cao h¬n vµ l©y lan nhanh chãng trong céng ®ång, g©y ra bÖnh dÞch. Ng­îc l¹i, khi c¸c virót Cóm ®­îc sinh ra cã nh÷ng kh¸ng nguyªn míi hoµn toµn, ch¼ng h¹n sù t¸i s¾p xÕp vËt liÖu di truyÒn gi÷a c¸c chñng Cóm gia cÇm vµ c¸c chñng Cóm ng­êi; ®ã lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh. NÕu mét chñng virót Cóm ng­êi cã c¸c kh¸ng nguyªn míi hoµn toµn xuÊt hiÖn, tÊt c¶ mäi ng­êi sÏ bÞ c¶m nhiÔm vµ virót Cóm míi sÏ lan trµn kh«ng thÓ kiÓm so¸t, g©y ra ®¹i dÞch. Ng­îc l¹i víi vô dÞch, ®¹i dÞch lµ nh÷ng biÕn cè Ýt gÆp, x¶y ra cø mçi 10 hoÆc 50 n¨m. Nh÷ng ®¹i dÞch ®· ®­îc ghi nhËn tõ thÕ kû thø 16, vµ trong vßng 400 n¨m trë l¹i ®©y, ®· cã 3 ®¹i dÞch Cóm x¶y ra (b¶ng1). ThiÖt h¹i vÒ ng­êi cña c¸c ®¹i dÞch nµy thay ®æi tõ møc tµn ph¸ sang võa hoÆc nhÑ. B¶ng 1. §ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh vµ c¸c ®¹i dÞch (11, 25) N¨m  Tªn chñng virót  Møc ®é  Sè ng­êi chÕt   1889  H3N2  Võa ph¶i  1 triÖu   1918  H1N1 ("Spanish")  Nghiªm träng  40 - 100 triÖu   1957  H2N2 ("Asian")  Võa ph¶i  1 - 1,5 triÖu   1968  H3N2("Hong kong")  NhÑ  0,75 - 1 triÖu   ?            C¸c ®¹i dÞch Cóm lu©n chuyÓn trªn toµn cÇu theo nhiÒu ®ît kÕ tiÕp nhau, vµ kh«ng cã c¸ch nµo ®Ó ng¨n ngõa sù lan réng cña mét virót g©y ®¹i dÞch Cóm míi. Mét ®Æc ®iÓm cña Cóm trong ®¹i dÞch lµ sè tö vong chuyÓn sang nhãm tuæi trÎ h¬n. Mét nöa sè tö vong cã liªn quan ®Õn Cóm trong ®¹i dÞch 1968 vµ phÇn lín nh÷ng ca tö vong liªn quan ®Õn Cóm trong c¸c ®¹i dÞch 1957 vµ 1918, ®Òu x¶y ra ë ng­êi < 65 tuæi. Kinh nghiÖm trong qu¸ khø chØ ra r»ng kh«ng cã quy t¾c chung cho c¸c ®¹i dÞch vµ còng kh«ng cã c¬ së tin cËy nµo ®Ó dù ®o¸n thêi gian vµ n¬i ®¹i dÞch cã thÓ xuÊt hiÖn. Trong suèt thÕ kû 20, c¸c ®¹i dÞch x¶y ra ë nh÷ng kho¶ng thêi gian t­¬ng ®èi dµi vµ kh«ng thÓ dù ®o¸n tr­íc ®­îc, tõ 9 ®Õn 39 n¨m trong suèt c¸c ®¹i dÞch 1918 (H1N1), 1957 (H2H2), 1968 (H3N2) vµ 1977 víi quy m« nhá h¬n. Trong n¨m 1957, virót H2N2 ®· thay thÕ hoµn toµn virót H1N1 tr­íc ®ã, vµ trong n¨m 1968, H3N2 thay thÕ H2N2. Sù t¸i xuÊt hiÖn cña H1N1 n¨m 1977 kh«ng g©y ra mét ®¹i dÞch thËt sù, bëi nhiÒu ng­êi sinh tr­íc n¨m 1957 ®· ®­îc miÔn nhiÔm mét phÇn. H¬n thÕ n÷a, virót H1N1 kh«ng thay thÕ H3N2. Tõ n¨m 1968, c¶ hai ph©n týp H1N1 vµ H3N2 l­u hµnh ®ång thêi víi virót Cóm B g©y ra nh÷ng vô dÞch bïng ph¸t trªn ng­êi trong giai ®o¹n tiÒn ®¹i dÞch. Dù phßng vµ kiÓm so¸t BiÖn ph¸p phßng chèng h÷u hiÖu nhÊt ®èi víi dÞch Cóm lµ tiªm phßng v¾c xin. V¾c xin Cóm cã hiÖu qu¶ b¶o vÖ 70-90% trªn ng­êi trÎ tuæi m¹nh kháe nÕu kh¸ng nguyªn v¾c xin phï hîp víi chñng virót Cóm ®ang l­u hµnh. Tuy nhiªn, hiÖu qu¶ phßng bÖnh cña v¾c xin kh«ng cao ®èi víi trÎ em vµ ng­êi giµ. Víi nh÷ng giíi h¹n cña v¾c xin hiÖn cã, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ph¸t triÓn nh÷ng t¸ chÊt tèt h¬n ®Ó t¨ng c­êng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾c xin Cóm còng nh­ ph¸t triÓn v¾c xin sèng gi¶m ®éc lùc. Mét trong nh÷ng b­íc tiÕn høa hÑn lµ ph¸t triÓn v¾c xin sèng gi¶m ®éc lùc b»ng thÝch øng nhiÖt ®é l¹nh. Tuy nhiªn, mÆc dï v¾c xin nµy cã hiÖu qu¶ ë trÎ em vµ ng­êi trÎ tuæi th× l¹i qu¸ gi¶m ®éc lùc ®Ó kÝch thÝch sinh kh¸ng thÓ b¶o vÖ ë ng­êi giµ (8). Sù ph¸t triÓn cña kü thuËt di truyÒn ng­îc sö dông hÖ thèng chuyÓn nhiÔm ribonucleoprotein (RNP) cho phÐp thay thÕ c¸c gen cña virót Cóm vµ t¹o thµnh ph©n tö ARN t¸i tæ hîp in vitro. Mét sè t¸ chÊt kh¸c nhau còng ®· ®­îc sö dông ®Ó t¨ng c­êng kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾c xin Cóm. V¾c xin Cóm bÊt ho¹t b»ng formaldehyt hoÆc v¾c xin chøa glycoprotein bÒ mÆt tinh khiÕt ®­îc s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i ph¶i thay ®æi chñng s¶n xuÊt hµng n¨m ®Ó ®¸p øng víi tÝnh ®a d¹ng cña virót. Chñng virót lµ mét trong nh÷ng thµnh phÇn quan träng nhÊt cña s¶n xuÊt v¾c xin Cóm. Chñng virót ph¶i kh«ng cã c¸c yÕu tè ngo¹i lai, cã chøa thµnh phÇn HA vµ NA phï hîp víi chñng g©y dÞch trong n¨m vµ ph¶i cã kh¶ n¨ng nh©n lªn tèt. Dùa trªn th«ng tin tõ m¹ng l­íi gi¸m s¸t Cóm toµn cÇu, hµng n¨m vµo th¸ng Hai, Tæ chøc Y tÕ ThÕ Giíi (WHO) ®· xem xÐt 2 lÇn trong mét n¨m t×nh h×nh dÞch tÔ vÒ Cóm trªn toµn thÕ giíi, khuyÕn c¸o sö dông c¸c chñng virót Cóm míi. Theo khuyÕn c¸o cña WHO th× th­êng xuyªn cÇn thiÕt ph¶i ph¸t triÓn c¸c chñng virót v¾c xin chuÈn cã c¸c tÝnh chÊt kh¸ng nguyªn cña loµi chñng mµ WHO khuyÕn c¸o, vµ cã kh¶ n¨ng nh©n lªn tèt ®Ó viÖc s¶n xuÊt v¾c xin cã hiÖu qu¶. HiÖn t¹i, ®èi víi Cóm mïa, v¾c xin ®­îc cÊp phÐp trªn toµn thÕ giíi ph¶i chøa 2 ph©n týp Cóm A ®ang l­u hµnh lµ H3N2, H1N1 vµ mét chñng Cóm B (42). HiÖn nay trªn thÕ giíi còng ®· rÊt nhiÒu n­íc nh­ Mü, Ph¸p, NhËt B¶n, Trung Quèc, Hungaria víi c¸c h­íng c«ng nghÖ ®ang ®­îc c¸c nhµ s¶n xuÊt lùa chän hiÖn nay bao gåm: 1/ Tõ trøng gµ cã ph«i SPF (Specific Pathogen Free); 2/ Trªn c¸c dßng tÕ bµo ®éng vËt (MDCK); 3/ Sèng gi¶m ®éc lùc vµ 4/ Trªn tÕ bµo Vero (dïng chñng ®éc lùc hoang d¹i). ThÝch øng cña chñng Cóm mïa trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau TÕ bµo Vero Mét trong nh÷ng dßng tÕ bµo ®· ®­îc nghiªn cøu kh¸ kÜ lµ dßng tÕ bµo Vero, thÝch hîp cho viÖc s¶n xuÊt c¸c v¾c xin virót ë ng­êi, nh­ c¸c v¾c xin phßng bÖnh b¹i liÖt vµ bÖnh d¹i (21). Tr­íc ®©y, chØ cã dßng tÕ bµo tiªn ph¸t vµ tÕ bµo l­ìng béi ®­îc sö dông s¶n xuÊt c¸c lo¹i v¾c xin cho ng­êi lµ ®­îc cÊp phÐp. Dßng tÕ bµo th­êng trùc kh«ng ®­îc sö dông bëi nh÷ng lo ng¹i liªn quan ®Õn kh¶ n¨ng lµm xuÊt hiÖn c¸c khèi u vµ sù l©y nhiÔm virót cña nh÷ng dßng tÕ bµo nµy. TÕ bµo Vero, dßng tÕ bµo thËn khØ xanh ch©u Phi th­êng trùc, ®· ®­îc kiÓm nghiÖm trong khÝa c¹nh nµy vµ ng­êi ta còng ®· x©y dùng mét ng©n hµng tÕ bµo Vero ®­îc chÊp thuËn bëi WHO (21). §iÒu nµy chøng minh kh«ng cã t¸c nh©n cña virót vµ kh«ng cã kh¶ n¨ng g©y khèi u ë nh÷ng ®êi cÊy truyÒn trªn dßng tÕ bµo nµy (4, 13, 35). TÕ bµo Vero mÉn c¶m víi mét phæ virót réng nh­ng ë nh÷ng lÇn thö nghiÖm ®Çu tiªn, virót Cóm kh«ng ph¸t triÓn thµnh c«ng trªn tÕ bµo nµy (17, 22). Tuy nhiªn, nh÷ng nghiªn cøu sau ®ã ®· chøng minh r»ng thªm trypsin nhiÒu l©n vµo m«i tr­êng nu«i cÊy cña tÕ bµo Vero ®· nhiÔm virót Cóm phôc håi kiÓu nh©n lªn nhiÒu lÇn cña virót Cóm A vµ B (7, 15). Nghiªn cøu cña Govorkova vµ céng sù cho thÊy dßng tÕ bµo Vero lµ mét hÖ thèng vËt chñ thÝch hîp ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy c¸c virót Cóm A (7). HiÖu qu¶ ph©n lËp nh÷ng chñng ®ang l­u hµnh hiÖn nay A/H3N2 lµ t­¬ng tù ë tÕ bµo Vero vµ MDCK. Trong 72 chñng thÝch øng trªn trøng, 90,3% ®­îc ph¸t hiÖn cã hiÖu gi¸ HA trªn tÕ bµo Vero sau lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn vµ 51,4% sau lÇn thø hai. Nh÷ng tr×nh tù axit amin cña vïng HA1 cña c¸c virót Cóm A ®­îc ph©n lËp vµ cÊy truyÒn trªn tÕ bµo Vero gièng hÖt nh­ c¸c virót sinh tr­ëng trªn tÕ bµo MDCK. ë nång ®é g©y nhiÔm thÊp, ng­êi ta thu ®­îc s¶n l­îng virót cao b»ng c¸ch thªm nhiÒu lÇn trypsin vµo m«i tr­êng. Sau 20 lÇn cÊy truyÒn chñng A/H1N1, ng­êi ta thu ®­îc l­îng protein cña virót cao nh­ trªn tÕ bµo MDCK. Nh÷ng nghiªn cøu ban ®Çu víi mét sè l­îng chñng giíi h¹n ®· cho thÊy tÕ bµo Vero hç trî tèt cho sù ph©n lËp vµ nh©n lªn cña c¸c chñng virót Cóm A . Nhãm t¸c gi¶ nµy còng ®· chØ ra Vero lµ mét tÕ bµo chñ thÝch hîp ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy c¸c chñng virót Cóm B vµ x¸c ®Þnh nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh häc vµ di truyÒn häc cña c¶ virót Cóm A vµ B trªn tÕ bµo Vero. §ång thêi m« t¶ ®Æc ®iÓm c¸c thô thÓ trªn tÕ bµo Vero so víi nh÷ng thô thÓ nµy trªn tÕ bµo MDCK. Ph©n tÝch tr×nh tù ®· kh¼ng ®Þnh HA cña virót Cóm B trªn tÕ bµo Vero gièng hÖt víi HA trªn tÕ bµo MDCK, nh­ng kh¸c víi virót sinh tr­ëng trªn trøng ë c¸c vÞ trÝ axit amin 196 ®Õn 198. TÕ bµo MDCK TÕ bµo thËn chã Madin Darby ®­îc ph©n lËp lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1958 vµ ®· ®­îc sö dông réng r·i trong s¶n xuÊt v¾c xin thó y. Chóng cã thÓ s¶n sinh ra khèi l­îng lín virót Cóm (33). Còng nh­ tÕ bµo Vero, MDCK lµ dßng tÕ bµo b¸m dÝnh vµ cã thÓ nu«i cÊy trong m«i tr­êng kh«ng cã serum. MDCK lµ dßng tÕ bµo ®­îc WHO khuyÕn c¸o sö dông ®Ó ph©n lËp virót Cóm A tõ mÉu bÖnh phÈm cña c¸c tr­êng nghi ngê m¾c Cóm. Reina vµ céng sù b¸o c¸o mét b¶n nghiªn cøu so s¸nh cña c¸c dßng tÕ bµo MDCK, Vero vµ MRC-5 trong sù ph©n lËp virót Cóm A. Trong 746 mÉu nghiªn cøu mÉu cã 60 virót Cóm A ®­îc ph©n lËp. Dßng tÕ bµo MDCK thÓ hiÖn sù nh¹y c¶m víi virót Cóm lµ 100%, dßng tÕ bµo Vero lµ 71,4% vµ dßng tÕ bµo MRC-5 lµ 57,1% (26). Qua thèng kª, tÕ bµo MDCK ®· tá râ sù kh¸c nhau ®¸ng kÓ ®èi víi Vero vµ MRC-5. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng chØ ra dßng tÕ bµo MDCK nh¹y c¶m h¬n h¼n nh÷ng dßng tÕ bµo kh¸c. Cã vÎ nh­ dßng tÕ bµo MDCK vÉn lµ mét trong nh÷ng dßng tÕ bµo tèt nhÊt ®­îc khuyÕn c¸o ®Ó ph©n lËp virót Cóm A tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm ®­êng h« hÊp. Mét nghiªn cøu kh¸c vÒ tr×nh tù axit amin vµ nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh häc cña HA cña ba biÕn thÓ cña chñng virót Cóm X-31 (H3N2) khi nu«i cÊy trªn tÕ bµo MDCK. Trong hai biÕn thÓ, cã 2 vÞ trÝ axit amin thay ®æi ë HA1 lµ c¸c axit amin ë vÞ trÝ thø 8 vµ 144 lÇn l­ît t­¬ng øng víi mÊt vÞ trÝ glycosin hãa vµ nh÷ng thay ®æi ®Æc biÖt trong tÝnh kh¸ng nguyªn. Nh­ c¸c virót thÝch øng trªn trøng kh¸c cña ph©n týp H3, virót Cóm X-31 còng nh©n lªn kÐm trªn tÕ bµo. Khi kh«ng cã trypsin, c¸c ®¸m ho¹i tö hÇu nh­ kh«ng thÓ nh×n thÊy vµ rÊt khã cã thÓ ®Õm ®­îc. Khi cã trypsin, c¸c ®¸m ho¹i tö thÊy ®­îc râ rµng cã ®­êng kÝnh tõ 1 ®Õn 2 mm. Trong ®iÒu kiÖn nµy, sè l­îng ®¸m ho¹i tö ®· t¨ng lªn Ýt nhÊt 100 lÇn (27). TÕ bµo PMKc ViÖc sö dông tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ®Ó trong s¶n xuÊt v¾c xin phßng virót Cóm lµ mét c«ng nghÖ míi víi c¶ thÕ giíi, ViÖt Nam còng kh«ng ph¶i ngo¹i lÖ. HiÖn nay, thÕ giíi chñ yÕu ®ang sö dông c«ng nghÖ v¾c xin truyÒn thèng lµ s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i. Tuy nhiªn c¸c nhµ khoa häc cña C«ng ty V¾c xin vµ Sinh phÈm sã 1 ®· s¶n xuÊt v¾c xin Cóm A/H5N1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t. Qu¸ tr×nh thÝch øng chñng rgH5N1 cã hiÖu qu¶ trªn tÕ bµo PMKc vµ nghiªn cøu ph¸t triÓn v¾c xin Cóm A/H5N1 trªn dßng tÕ bµo nµy ®· cã nh÷ng thµnh c«ng nhÊt ®Þnh (1). KÕt qu¶ nµy còng ®ång thêi còng høa hÑn kh¶ n¨ng thÝch øng tèt nh÷ng chñng virót Cóm mïa trªn dßng tÕ bµo nµy. Ch­¬ng 2 VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU VËT LIÖU CHUNG PhiÕn 24 giÕng (Nunc - §an M¹ch) Chai 25cm2 vµ 75cm2 (Nunc - §an M¹ch) Tñ Êm 37oC (Memmert - §øc) Tñ Êm CO2 (Sanyo - NhËt) Hèt v« trïng (Biosyt - Ph¸p) KÝnh hiÓn vi lén ng­îc (Olympus - NhËt) TÕ bµo TÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t mét líp (Do Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt v¾c xin vµ sinh phÈm y tÕ cung cÊp. TÕ bµo nµy ®­îc chuÈn bÞ tõ nguån khØ s¹ch ®· ®­îc kiÓm tra kh«ng cã c¸c t¸c nh©n ngo¹i lai nh­: SV40, SFV, SIV, virót B, M. tuberculosis) TÕ bµo MDCK (Do Ng©n hµng tÕ bµo Ch©u ©u cung cÊp) TÕ bµo Vero (Do Ng©n hµng tÕ bµo Ch©u ©u cung cÊp) Chñng virót Chñng virót Cóm A H1N1 A/New Caledonia 20/99 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) Chñng virót Cóm A H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) Chñng virót Cóm B B/Malaysia/ 2506/2004 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) M«i tr­êng vµ hãa chÊt MEM (Gibco) FBS (Gibco) PBS (-) (Gibco) Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco) Trypsin-TPCK (Sigma) Hank’s (Gibco) Ph­¬ng ph¸p chuÈn bÞ tÕ bµo LÊy tÕ bµo tõ nit¬ láng ChuÈn bÞ chai nu«i tÕ bµo 75 cm2 hoÆc 25 cm2 (tuú môc ®Ých sö dông) ®· cã s½n m«i tr­êng nu«i (vÝ dô: MEM 10% FBS) ë 37oC hoÆc ë nhiÖt ®é phßng. TiÕn hµnh lÊy èng tÕ bµo khái nit¬ láng, lµm ®«ng tan. V« trïng èng tÕ bµo tr­íc khi më n¾p èng. Hót dÞch tÕ bµo tõ èng (cßn l¹nh) chuyÓn sang chai nu«i ®· cã s½n m«i tr­êng. L¸ng nhÑ ®Ó tÕ bµo ph©n bè ®Òu trong dÞch m«i tr­êng. Nu«i tÕ bµo trong 37oC trong 6-8h hoÆc qua ®ªm ®Ó tÕ bµo b¸m vµo bÒ mÆt chai. Thay m«i tr­êng cho tÕ bµo b»ng m«i tr­êng nu«i sau 24h (tuú thuéc dßng tÕ bµo vµ môc ®Ých thÝ nghiÖm, vÝ dô: MEM 5% FBS cho tÕ bµo MDCK ). T¸ch tÕ bµo Nu«i tÕ bµo kÝn mét líp. Hót bá m«i tr­êng trong chai nu«i tÕ bµo. Röa tÕ bµo b»ng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vµo chai, l¸ng ®Òu. §Ó chai tÕ bµo ë 370C kho¶ng 20-30 phót ®Õn khi tÕ bµo bong khái thµnh chai. Cho MEM 5% FBS vµo chai, hót lªn hót xuèng vµi lÇn. Ph©n chia ra c¸c chai míi tïy thuéc tû lÖ t¸ch. Thªm vµo mçi chai cho ®ñ l­îng m«i tr­êng MEM 10% FBS. ñ ë 370C cho ®Õn khi tÕ bµo kÝn mét líp. Ph­¬ng ph¸p g©y nhiÔm virót Cóm Pha lo·ng virót b»ng Hank’s ®Õn nång ®é cÇn g©y nhiÔm (vÝ dô 0,01PFU/tÕ bµo). Hót bá m«i tr­êng trong chai nu«i tÕ bµo. Röa tÕ bµo b»ng Hank’s. G©y nhiÔm hçn dÞch virót ®· pha lo·ng vµo chai nu«i tÕ bµo, chai cßn l¹i lµm chøng (-) cho Hank’s. L¸ng nhÑ cho hçn dÞch dµn ®Òu trªn bÒ mÆt tÕ bµo. HÊp phô virót ë nhiÖt ®é phßng trong 1h, cø 20 phót l¸ng 1 lÇn. ChuÈn bÞ m«i tr­êng nu«i cÊy virót: pha TPCK-trypsin trong m«i tr­êng MEM. Nu«i virót ë 37oC trong 72-96h. Theo dâi møc ®é hñy ho¹i cña virót hµng ngµy. Ph­¬ng ph¸p gÆt virót Sau 72-96h g©y nhiÔm, thu lÊy hçn dÞch virót trong èng eppendorf v« trïng. Ly t©m 8000 vßng/phót trong 5 phót, 4oC ®Ó lo¹i bá x¸c tÕ bµo, thu n­íc næi. B¶o qu¶n virót ë -80oC PH¶N øNG NG¦NG KÕT HåNG CÇU ChuÈn bÞ hång cÇu LÊy 1ml m¸u gµ vµo èng falcon chøa dung dÞch b¶o qu¶n Alsever. Ly t©m 2500 vßng/phót trong 5 phót ë 250C. Hót n­íc næi, thªm 5ml PBS (-) vµo èng. TiÕp tôc ly t©m 2500 vßng/phót trong 5 phót ë 250C, lÆp ®i lÆp l¹i 4 lÇn. Pha dung dÞch 0,5% hång cÇu gµ trong PBS (-). TiÕn hµnh HiÖu gi¸ virót sau khi gÆt sÏ ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu (HA). LÊy phiÕn thö, viÕt tªn mÉu theo thø tù: (-), (+) vµ c¸c mÉu thö. Cho vµo mçi giÕng 50µl PBS (-). Hót 50µl mÉu vµo c¸c giÕng ®Çu tiªn, giÕng (-) cho 50µl PBS (-). Pha lo·ng mÉu b»ng c¸ch hót 50µl mÉu tõ giÕng ®Çu tiªn chuyÓn sang giÕng tiÕp theo, ®Õn giÕng cuèi cïng còng hót bá 50µl vµ bá ®Çu c«n. Mçi giÕng hót lªn hót xuèng 5 lÇn. Thªm vµo mçi giÕng 50µl dung dÞch 0,5% hång cÇu gµ. Vç nhÑ vµo phiÕn vµ ®Ëy n¾p. §Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 30 phót vµ ®äc kÕt qu¶. KÕt qu¶ HiÖu gi¸ HA lµ nång ®é pha lo·ng thÊp nhÊt cña mÉu cßn cã kh¶ n¨ng ng­ng kÕt hång cÇu. C¸c giÕng cã kh¶ n¨ng ng­ng kÕt HA lµ c¸c giÕng khi nghiªng, hång cÇu ch¶y xuèng cã h×nh giät lÖ. C¨n cø vµo chøng (-) vµ (+) ®Ó ®¸nh gi¸ thö nghiÖm. QUY TR×NH CHUÈN §é HIÖU GI¸ Virót Cóm VËt liÖu TÕ bµo MDCK. M«i tr­êng Hank’s: pH 6,8 - 7,2 Dung dÞch Trypsin 0,25% Trypsin (Gibco - Mü) 2,5g EDTA (BDH - Anh) 1g PBS d¹ng bét (Sigma - Mü) 1 gãi N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1000 ml M«i tr­êng nu«i cÊy MEM (Gibco) M«i tr­êng MEM 2X MEM d¹ng bét (Gibco - Mü) 1 gãi Sodium bicarbonate (Gibco - Mü) 20 ml Aminoacid (Gibco - Mü) 10 ml L - Glutamin 200 mM/ml (Gibco - Mü) 5 ml Gentamicin 10 mg/ml 2 ml Fungizone 250 µg/ml (Gibco - Mü) 0,5 ml N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 500 ml M«i tr­êng phñ th¹ch MEM 2X 10 ml MgCl2.6H20 4.1M/1 (Wako - NhËt) 0,2 ml Agarose 1,2% (Seakem - Mü) 10 ml FBS (Sigma - Mü) 0,4 ml Thuèc nhuém Crystal violet Crystal violet (Merck - §øc) 0,325 g Isopropyl alcohol (Amresco - Mü) 12,5 ml Formaldehyde (BDH - Anh) 75 ml N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1000 ml Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh ChuÈn bÞ tÕ bµo MDCK M«i tr­êng EMEM 2X ChuÈn bÞ tÕ bµo MDCK ra phiÕn 24 giÕng: Hót hÕt m«i tr­êng trong chai . Röa tÕ bµo b»ng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vµo chai, l¸ng ®Òu. §Ó chai tÕ bµo ë 37oC kho¶ng 20-30 phót ®Õn khi tÕ bµo bong khái thµnh chai. Cho 5ml MEM 10% FBS vµo chai hót lªn hót xuèng nhiÒu lÇn. Cho thªm 30ml MEM 10% FBS vµo chai, trén ®Òu. Cho vµo 3 phiÕn, mçi phiÕn 12ml, 0,5ml/giÕng. Cho vµo tñ CO2, 37oC. ChuÈn bÞ m«i tr­êng phñ th¹ch: cho 1 phiÕn EMEM 2X 10ml DW 3,8ml 1% DEAE-dextran 0,2ml Trypsin 1,2(l Agarose 2% 6ml 2.9.2.2. TiÕn hµnh MÉu thö ®­îc pha lo·ng bËc 10 ë 8 nång ®é g©y nhiÔm tõ 10-1 ®Õn 10-8 b»ng Hank’s. LÊy phiÕn ra khái tñ Êm, viÕt tªn vµ ®é pha lo·ng trªn n¾p giÕng. Hót bá m«i tr­êng theo c¹nh giÕng. Röa c¸c giÕng tÕ bµo b»ng c¸ch cho 0,5ml Hank’s vµo tÊt c¶ c¸c giÕng, l¸ng ®Òu Hank’s trªn bÒ mÆt tÕ bµo. L¾c qua l¾c l¹i nhÑ nhµng ®Ó lo¹i bá tÕ bµo chÕt. Hót hÕt Hank’s ë trong giÕng tÕ bµo. Cho 200µl Hank’s vµo giÕng tÕ bµo chøng vµ 100µl Hank’s vµo c¸c giÕng g©y nhiÔm. Hót 100µl dung dÞch ë c¸c ®é pha lo·ng vµo c¸c giÕng g©y nhiÔm theo s¬ ®å phiÕn thö S¬ ®å phiÕn thö:  1  2  3  4  5  6   A  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   B  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   C  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   D  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   §Ëy kÝn phiÕn tÕ bµo ®· g©y nhiÔm, ®Ó hÊp phô 2 giê trong tñ Êm 5% CO2, nhiÖt ®é 37oC. Lo¹i bá n­íc næi trong c¸c giÕng. Cho vµo mçi giÕng 0,6ml dung dÞch phñ th¹ch. §Ó vµo tñ Êm CO2/37oC trong 3 ngµy. Nhuém th¹ch b»ng thuèc nhuém Crystal violet, 400µl/giÕng. ñ ë tñ Êm 37oC. Sau 3-4h röa líp th¹ch phñ, ®äc kÕt qu¶. C¸ch tÝnh kÕt qu¶ C¸c ®¸m ho¹i tö lµ nh÷ng ®èm tr¾ng cã thÓ nh×n thÊy b»ng m¾t th­êng n»m ë mÆt ®¸y cña c¸c giÕng khi soi trªn ®Ìn. §Õm c¸c ®¸m ho¹i tö ë mçi giÕng råi ghi l¹i. HiÖu gi¸ virót Cóm = sè ®¸m ho¹i tö (PFU)/ ml C«ng thøc tÝnh hiÖu gi¸ cña virót Cóm:  Ch­¬ng 3 KÕT QU¶ Vµ BµN LUËN ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng thÝch øng cña virót Cóm a/h1n1, a/h3n2 vµ b trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau Sù nh©n lªn cña virót Cóm trªn tÕ bµo Vero TÕ bµo Vero ®­îc g©y nhiÔm víi ba chñng virót Cóm mïa A/H1N1, A/H3N2 vµ Cóm B. Quan s¸t sù nh©n lªn cña virót trong khi nu«i cÊy b»ng d­íi kÝnh hiÓn vi ®Ó kiÓm tra møc ®é hñy ho¹i (CPE) vµ ®¸nh gi¸ nhanh hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn virót th«ng qua ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu (HA) t¹i nh÷ng thêi ®iÓm: 24 giê, 48 giê, 72 giê vµ 96 giê sau khi g©y nhiÔm.           H×nh 5. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 24 giê g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). B¶ng 2. Møc ®é hñy ho¹i (% CPE) trªn tÕ bµo Vero qua c¸c lÇn cÊy truyÒn LÇn cÊy truyÒn (Vn)  Møc ®é hñy ho¹i (%CPE)    H1N1  H3N2  B    24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h   V1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V2  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V3  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V5  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V6  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V7  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V8  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V9  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V10  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0             H×nh 6. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 48 giê g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm).           H×nh 7. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 72h g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). .           H×nh 8. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 96h g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). ¶nh chôp cho thÊy tÕ bµo Vero ®­îc g©y nhiÔm vµ tÕ bµo chøng kh«ng cã sù kh¸c biÖt. TÕ bµo vÉn mäc kh¸ dµy vµ kh«ng thÊy sù ph¸t triÓn cña virót. KÕt qu¶ thu ®­îc cho thÊy virót gÇn nh­ kh«ng hñy ho¹i tÕ bµo Vero tõ nh÷ng lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn ®Õn nh÷ng lÇn cÊy truyÒn cuèi cïng. Do ®ã thö nghiÖm HA cña virót gi¶i phãng vµo n­íc næi còng kh«ng ®em l¹i kÕt qu¶ (b¶ng 3). B¶ng 3. So s¸nh hiÖu gi¸ HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo Vero LÇn cÊy truyÒn (Vn)  HiÖu gi¸ HA    H1N1  H3N2  B    24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h   V1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V2  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V3  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V5  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V6  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V7  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V8  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V9  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V10  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   Nh­ vËy sau 10 ®êi nu«i cÊy, cã thÓ rót ra kÕt luËn c¶ 3 chñng virót Cóm mïa ®Òu kh«ng thÝch øng ®­îc trªn tÕ bµo Vero.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • dockhoa luan.doc