Thành phần hóa học, hoạt tính kháng khuẩn và khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu lá và vỏ tắc - Bùi Thị Như Quỳnh

THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA TINH DẦU LÁ VÀ VỎ TẮC Bùi Thị Như Quỳnh(1), Võ Thị Kim Thư(1) (1) Trường Đại học Thủ Dầu Một Ngày nhận bài 08/05/2018; Ngày gửi phản biện 31/05/2018; Chấp nhận đăng 10/07/2018 Email: thuvtk@tdmu.edu.vn Tóm tắt Tắc hay còn gọi là quất, hạnh, họ cam quít (Rutaceae), được trồng rất phổ biến ở Việt Nam. Đề tài này tiến hành khảo sát tinh dầu vỏ trái và lá, trên nhiều lĩnh vực: chỉ số vật lý và hoá học, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và khả năng kháng oxy hóa. Sự ly trích tinh dầu được thực hiện theo phương pháp chưng cất hơi nước đun nóng cổ điển. Thành phần hóa học tinh dầu được xác định bằng phương pháp GC-MS cho thấy tinh dầu vỏ trái tắc có cấu phần chính là limonen (96%) và myrcen (1,8%), trong tinh dầu lá tắc lại là linalol (11,3%), 1,1,3a,7-tetrametyl-1,2,3,3,4,5,6,7-octahydro-h-cyclopropa[a]naphthalen (12%), β-pinen (22,3%), α-selinen (14,7%). Từ khóa: thành phần hóa học, chỉ số lý - hóa, hoạt tính sinh học Abstract CHEMICAL COMPOSITION, ACTIVITY OF BACTERIA, ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE ESSENTIAL OILS OF PEEL AND LEAF OF FORTUNELLA JAPONICA THUMB Fortunella japonica (Thumb) is very popular in Vietnam. This study investigated the peel and leaf oils in a variety of fields: physical and chemical indexes, chemical compositions, biological activity and antioxidant activity. Essential oils were isolated by using clasical heating hydrodistillation. The chemical composition was determined by GC-MS method. The main components of peel oils are limonene (96%) and myrcenes (1.8%). The main components of leaf oils are linalool (11.3%), 1,1,3a, 7-tetramethyl- 1,2,3,3,4,5,6,7-octahydro-h-cyclopropa [a] naphthalene (12%), β-pinene (22.3%), α-selinene (14.7%). 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Tắc có tên khoa học Fortunella japonica (Thumb), là cây tiểu mộc nhỏ, cao 1-5m, có gai. Lá có phiến bầu dục, không lông, bìa có răng nằm, cuốn có cánh rất nhỏ, có đốt ở đầu. Hoa 1-2 ở nách lá, không lông, rất thơm, cánh hoa dài 10-12 mm. Trái vàng to từ 1,5-3,5 cm, nạc thịt và chua dịu [1]. Cây được trồng từ Bắc đến Nam, chủ yếu làm cảnh, trang trí vào dịp Tết Nguyên Đán và làm mứt, nước giải khát[2]. Trong nước và trên thế giới hiện nay có nhiều nghiên cứu về tinh dầu vỏ tắc [3-10]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát một cách toàn diện hơn về tinh dầu của vỏ và lá tắc được trồng ở miền Nam Việt Nam, nhằm góp phần so sánh rõ hơn giữa các giống tắc. 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu Lá tắc và vỏ tắc được thu hái tại ấp Trung an, xã Trung Lương, huyện Củ Chi, TP.HCM. Lá và vỏ đều được xoay nhuyễn trước khi ly trích. Hàm lượng tinh dầu tính trên lá tươi. 2.2. Phương pháp Chưng cất lôi cuốn hơi nước: Sử dụng bộ chưng cất Clevenger 5000ml. Kích hoạt bằng đun nóng cổ điển trong bếp đun bình cầu. Xác định thành phần hóa học: Thành phần hóa học trong tinh dầu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID) kết hợp sắc ký khí ghép phổ khối lượng (GC-MS). Phân tích GC-FID: được tiến hành trên máy GC Agilent 6890N với đầu dò ion hoá ngọn lửa (FID) với cột mao quản Phenomenex 7HG-G010-11 Zebron ZB-5(30,0 m x 0,32 mm x 0,25 μm). Khí mang sử dụng là nitrogen hoạt động ở chế độ đẳng áp 9,32 psi. Nhiệt độ đầu là 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC. Đầu dò FID hoạt động ở 250 oC. Mẫu tiêm vào được hoá hơi ở 250oC và không chia dòng (splitless). Thể tích dung dịch mẫu được nạp vào là 0,1 μl. Phân tích GC-MSD: Để định danh các cấu phần có trong tinh dầu lá tắc và vỏ tắc, chúng tôi tiến hành trên máy GC Agilent 7890A ghép đầu dò phổ khối lượng (MSD) 5975C VL Triple-Axis với cột mao quản không phân cực Phenomenex 7HG-G010-11 Zebron ZB-5MS (30,0 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Khí mang helium với chế độ đẳng áp ở 10,604 psi. Nhiệt độ đầu nạp và đầu dò được thiết lập ở 250 oC. Thể tích mẫu nạp vào là 0,1 μl với chế độ chia dòng (split) 25:1. Chương trình nhiệt được thiết lập với nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC. Việc định danh các cấu phần tinh dầu được thực hiện bằng cách so sánh phổ khối lượng của chúng với các hợp chất tham khảo được công bố bởi Adams và hệ thống dữ liệu MS từng hợp chất từ thư viện phổ MS Wiley 8th kết hợp NIST 2008 [11]. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật: Hoạt tính kháng vi sinh vật được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Thực hiện trên 5 chủng vi khuẩn: - Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus là vi khuẩn gây mụn nhọt, áp xe, viêm mũi, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm. - Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli là vi khuẩn gây rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy cấp tính. Salmonella typhi: là vi khuẩn gây bệnh thương hàn. Shigella flexnery: là tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn ở các loài linh trưởng (như người và khỉ đột) và đặc biệt là ở người; nhưng không gặp ở các loài động vật có vú khác. Shigella được cho là loại vi khuẩn đứng hàng đầu gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn thế giới. Vibrio cholerae: là vi khuẩn gây bệnh tả ở người. Khảo sát khả năng kháng oxy hóa: Hoạt tính kháng oxy hóa được thực hiện bằng phương pháp bắt gốc tự do (DPPH) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ly trích tinh dầu Lá tắc: Dùng 1kg nguyên liệu, xay nhuyễn và 3000ml nước (dùng tỉ lệ 1:3 đối với lá và nước) vào bình cầu 5000ml, ráp hệ thống chưng cất. Tiến hành chưng cất trong khoảng thời gian xác định, để nguội, trích lấy tinh dầu. Làm khan bằng muối Na2SO4 khan, ta thu được tinh dầu tinh khiết. Cứ 1kg lá tắc và 3000ml nước cho khoảng 4g tinh dầu tinh khiết. Vỏ tắc Cho 1kg nguyên liệu, xay nhuyễn và 3000ml nước vào bình cầu 5000ml, ráp hệ thống chưng cất. Tiến hành chưng cất trong những khoảng thời gian xác định, để nguội, trích lấy tinh dầu. Làm khan bằng muối Na2SO4 khan, ta thu được tinh dầu tinh khiết. 1kg vỏ tắc và 3000ml nước cho ra 12g tinh dầu tinh khiết. 3.2. Chỉ số vật lý và hóa học Bảng 1. Chỉ số vật lý tinh dầu lá và vỏ tắc Bộ phận lấy tinh dầu Tỉ trọng Góc quay cực Chỉ số khúc xạ Lá tắc d=0,9003 -9,416 1,6304 Vỏ tắc d=0,8435 -86,207 1,6303 Đa số trong tinh dầu lá và vỏ tắc là các hợp chất hidrocarbon nên tinh dầu lá và vỏ tắc thu được là loại tinh dầu nhẹ, có tỷ trọng nhỏ hơn nước nên khi chưng cất tinh dầu nổi trên mặt nước trong ống gạn, điều này phù hợp với kết quả quan sát thực nghiệm, lớp tinh dầu nằm trên, lớp nước nằm dưới trong ống gạn. Kết quả đo góc quay cực cho thấy tinh dầu lá tắc và tinh dầu vỏ tắc thuộc loại tả triền. Chỉ số khúc xạ của tinh dầu lá tắc và tinh dầu vỏ tắc đều nằm trong khoảng chỉ số khúc xạ của tinh dầu (từ 1,4000 đến 1,7000). Bảng 2. Chỉ số hóa học tinh dầu lá và vỏ tắc Bộ phận lấy tinh dầu Chỉ số acid (IA) Chỉ số savon hóa (IS) Chỉ số ester hóa (IE) Lá tắc 1,032 25,245 24,213 Vỏ tắc 2,064 33,66 31,514 Tinh dầu lá và vỏ tắc có chỉ số acid (IA) thấp có lẽ do thành phần trong tinh dầu là các hợp chất hidrocarbon. 3.3. Thành phần hóa học Bảng 3. Thành phần hóa học tinh dầu vỏ tắc STT RT (phút) (GC-MS) Tên hợp chất Hàm lượng (%) 1 5,629 a-Pinen 0,5012 2 6,770 Cis-sabinen 0,1253 3 6,926 b-Pinen 0,3241 4 7,288 Myrcen 1,8073 5 8,869 Limonen 96,0890 6 21,941 a-Terpinen 0,0523 7 28,265 Germacren D 0,5959 Hợp chất oxygen 0 Hợp chất hidrocacbon 99,4952 Tổng cộng 99,4952 Bảng 4. Thành phần hóa học tinh dầu lá tắc STT RT (phút) GC/MS Cấu phần Hàm lượng (%) 1 5.629 a-Pinen 0,1714 2 6.104 Camphen 1,9229 3 6.785 a-Phellandren 5,4171 4 6.962 b-Pinen 22,3279 5 8.692 Limonen 0,5938 6 8.798 1,8-Cineol 1,9886 7 9.351 (E)-b-ocimen 1,4867 8 11.549 Linalol 11,2690 9 15,008 Terpinen-4-ol 0,5541 10 21.949 d-Elemen 0,8766 11 24.040 b-Cubeben 0,3637 12 24.366 b-Elemen 1,2390 13 25.621 (E)-Caryophyllen 1,9269 14 26.096 g-Elemen 0,1538 15 27.159 a-Humulen 0,4760 16 28.343 Germacren D 6,1736 17 28.634 a-Selinen 14,7331 18 34.414 Spatulenol 3,2094 19 34,545 b-cadinen 1,9790 20 35,452 1,1,3a,7-tetrametyl- 1,2,3,3,4,5,6,7-octahydro-h-cyclopropa[a]naphthalen 11,9880 21 35,898 g-Selinen 0,6681 Hợp chất oxigen 14,4784 Hợp chất hidrocacbon 75,0404 Tổng cộng 89,5189 Bảng 5. So sánh thành phần chính trong tinh dầu vỏ tắc và lá tắc với các nghiên cứu trước STT Thành phần chính Hàm lượng (%) Củ Chi Tiền Giang[4] Vỏ Lá Vỏ Lá 1 a-Pinen 0,50 0,5 - - 2 b-Pinen 0,32 22,33 0,47 7,98 3 Myrcen 1,81 - - - 4 Limonen 96,09 0,59 92,62 1,45 5 Germacren D 0,59 6,17 - - 6 a-Phellandren - 5,42 - - 7 Linalol - 11,27 - - 8 a-Selinen - 14,73 - - 9 Spatulenol - 3,21 - - 10 1,1,3a,7-tetrametyl- 1,2,3,3,4,5,6,7-octahydro-h-cyclopropa[a]naphthalen - 11,99 - - 11 Camphen 1,92 - - 12 β-Elemen - 1,24 - - 13 Epi-biciclosesquiphelandren - - - 16,64 14 Elemol - - 0,12 17,72 15 Guaien - - - 6,57 16 β-Eudesmol - - 0,24 16,65 Đối với vỏ tắc và lá tắc thu hái tại Củ Chi, cấu phần chính trong tinh dầu vỏ tắc là limonen và myrcen; trong tinh dầu lá tắc là linalol, 1,1,3a,7-tetrametyl- 1,2,3,3,4,5,6,7-octahydro-h-cyclopropa[a]naphthalen, a-selinen, b-pinen. Đối với lá tắc và vỏ tắc thu hái tại Tiền Giang, cấu phần chính trong tinh dầu vỏ tắc là limonen, trong tinh dầu lá tắc là epi-biciclosesquiphelandren, elemol, β-eudesmol. Thành phần hóa học chính của tinh dầu tắc ở Củ Chi so với vùng Tiền Giang có sự khác nhau khá lớn. Tinh dầu vỏ tắc ở hai vùng có cùng thành phần chính là limonen, và hàm lượng (%) của chúng cũng tương đương nhau. 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn Bảng 6. Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu lá tắc và vỏ tắc ở các nồng độ khác nhau Vi khuẩn thử nghiệm Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Lá tắc Vỏ tắc 100 10-1 10-2 10-3 100 10-1 10-2 10-3 Gram (+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 9 8 6 6 6 6 6 6 Gram (-) Escherichia coli ATCC 25922 6 6 6 6 6 6 6 6 Salmonella Typhi Ty 2 6 6 6 6 6 6 6 6 Shigella flexnery NCDC 2747-71 6 6 6 6 6 6 6 6 Vibrio cholerae A1450 7 6 6 6 6 6 6 6 Ở nồng độ 100 tinh dầu lá tắc xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Staphylococcus aureus ATCC 25923 và Vibrio cholerae A1450 và không có vòng vô khuẩn trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm khác. Tinh dầu vỏ tắc không thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng nào. Ở nồng độ 10-1, tinh dầu lá tắc chỉ xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng Staphylococcus aureus ATCC 25923 và không có vòng vô khuẩn trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm khác. Đối với mẫu tinh dầu vỏ tắc không thấy xuất hiện vòng vô khuẩn trên chủng nào. Ở nồng độ 10-2, 10-3 cả hai loại tinh dầu đều không xuất hiện vòng vô khuẩn trên các chủng thử nghiệm. Nhận xét: Tinh dầu tắc có hoạt tính kháng khuẩn rất thấp, tinh dầu lá tắc có hoạt tính kháng khuẩn tương đối tốt hơn so với tinh dầu vỏ tắc. Bảng 7. So sánh hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tắc với các nghiên cứu trước[6] Vi sinh vật Tinh dầu Đường kính vòng vô khuẩn Nồng độ tinh dầu 100 10-1 10-2 Củ Chi Tiền Giang Củ Chi Tiền Giang Củ Chi Tiền Giang Bacilus subtilis Vỏ - 18,5 - 6 - 6 Lá - 20 - 10,5 - 9 Escherichia coli ATCC 25922 Vỏ 6 9 6 6 6 6 Lá 6 6 6 6 6 6 Staphylococus aureus ATCC 25923 Vỏ 6 12 6 6 6 6 Lá 9 19 8 12 6 8,5 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Vỏ - 6 - 6 - 6 Lá - 11,5 - 10 - 6 Candida albicans Vỏ - 12 - 8,5 - 6 Lá - 11,5 - 10,5 - 9 Salmonella Typhi Ty 2 Vỏ 6 - 6 - 6 - Lá 6 - 6 - 6 - Shigella flexnery NCDC 2747-71 Vỏ 6 - 6 - 6 - Lá 6 - 6 - 6 - Vibrio cholerae A1450 Vỏ 6 - 6 - 6 - Lá 6 - 6 - 6 - Tinh dầu lá tắc và vỏ tắc của Củ Chi có hoạt tính kháng khuẩn kém hơn rất nhiều so với vùng Tiền Giang. Có sự khác nhau trên có thể là do khí hậu, thổ nhưỡng hoặc phương pháp ly trích tinh dầu có sự khác nhau. 3.5. Khả năng kháng oxy hóa Bảng 8. Tỷ lệ (%) bắt gốc tự do DPPH ở nồng độ 5mg/mL Mẫu Nồng độ (mg/mL) Phần trăm bắt gốc DPPH (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB + ĐLC Tinh dầu lá tắc 5 47,65 47,78 44,46 46,63 ± 1,88 Tinh dầu vỏ tắc 5 2,43 2,70 4,91 3,34 ± 1,36 Nhận xét: hoạt tính kháng oxy hóa của các thành phần tạo hương trong tinh dầu lá tắc là 46,63 ± 1,88 % và trong tinh dầu vỏ tắc là 3,34 ± 1,36 %. Vì thế tinh dầu lá tắc có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với vỏ. 4. KẾT LUẬN Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước truyền thống đưa đến kết quả có nhiều ưu điểm như: hiệu suất tinh dầu cao, tinh dầu thu được vẫn giữ được màu sắc, vị cay và mùi thơm đặc trưng. Phương pháp GC-MS và GC-FID đã xác định được thành phần hóa học chính trong tinh dầu vỏ tắc là limonen (96%) và myrcen (1,8%), trong tinh dầu lá tắc lại là linalol (11,3%), 1h-cyclopropa[a]naphthalen-octahydro-1,1,3a,7-tetramethyl (12%), b-Pinen (22,3%), a-Selinen (14,7%), đây là những thành phần tạo nên màu sắc, mùi thơm đặc trưng riêng của 2 loại tinh dầu. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học trong tinh dầu “lá tắc” và “vỏ tắc” của Củ Chi được so sánh với kết quả của một nghiên cứu tương tự được thực hiện ở Châu Thành (Tiền Giang, Việt Nam) và các nước trên thế giới có sự khác biệt rất nhiều về thành phần hóa học và hàm lượng của mỗi thành phần. Có sự khác nhau trên có thể là do khí hậu, thổ nhưỡng hoặc phương pháp ly trích tinh dầu. Tinh dầu lá tắc có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn tinh dầu vỏ tắc, đặc biệt tinh dầu lá tắc có hoạt tính kháng khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 và Vibrio cholerae A1450, đây là cơ sở giúp ứng dụng tinh dầu lá tắc như một loại kháng sinh được chiết xuất từ thiên nhiên. - Bằng phương pháp DPPH đã xác định được hoạt tính chống oxy hóa của các thành phần tạo hương trong tinh dầu lá tắc là 46,63 ± 1,88 % và trong tinh dầu vỏ tắc là 3,34 ± 1,36 %. Vì thế tinh dầu lá tắc có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với vỏ. Điều này có ý nghĩa rất lớn khi bổ sung tinh dầu vào thực phẩm, vừa có tác dụng tạo hương cho thực phẩm đồng thời vừa có khả năng chống oxy hóa cho thực phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Hoàng Hộ (2003). Cây cỏ Việt Nam. Quyển 2. NXB Trẻ. Lê Ngọc Thạch (2003). Tinh dầu. NXB Đại học Quốc gia TP.HCM. M. S. Mokbel, F. Hashinaga (2006). Evaluation of the antioxidant activity of extracts from buntan (Citrus grandis Osbeck) fruit tissues. Food. Chemistry, 94, 529-534. Trịnh Hoàng Hiếu, Nguyễn Thị Thảo Trân, Lê Ngọc Thạch (2009). Khảo sát tinh dầu vỏ trái và lá tắc Fortunella japonica Thumb. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, Tập 12, số 10. Nguyễn Thị Lý, Lê Thị Đề Oanh, Phan Thị Bảo Vy, Huỳnh Mai Thảo (2016). Tách tinh dầu và alkaloid từ quả quất (Citrus japonica Thumb), Hội nghị Khoa học và Công nghệ lần 9. Sadek ES, Makris DP, Kefalas P. Polyphenolic (2009). Composition and Antioxidant Characteristics of Kumquat (Fortunella margarita) peel fractions. Plant Foods Human Nutrition, 64 (4), 297-302 Yong-Wei Wang, Wei-Cai Zeng, Pei-Yu Xu, Ya-Jia Lan, Rui-Xue Zhu, Kai Zhong, Yi-Na Huang, Hong Gao (2012). Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oil of Kumquat (Fortunella crassifolia Swingle) Peel. Int J Mol Sci, 13(3), 3382-3393. P. Satyal, P. Paudel, K. Limu and W. N. Setzer (2012). Leaf Essential Oil Composition of Citrus japonicafrom Nepal. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 15(3), 357-359. Phan Thị Mỹ Loan (2012). Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu từ vỏ quả Quất (Citrus Japonica Thumb) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Trường Đại học Nha Trang. A. Nouri, A. Shafaghatlonbar (2015). Chemical constituents and antioxidant activity of essential oil and organic extract from the peel and kernel parts of Citrus japonica Thunb. (kumquat). Natural Product Research, 30 (9), 1093-1107. R. P. Adams (2007). Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/ Mass Spectrometry, 4th Edition. Allured Publishing, Carol Stream, 6, 10-29.