Xây dựng quy trình định lượng falcarindiol trong đinh lăng (polyscias fructicosa (l.) - Nguyễn Thị Ngọc Đan

Journal of Science and Technology 54 (2C) (2016) 425-431 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FALCARINDIOL TRONG ĐINH LĂNG (Polyscias fructicosa (L.) Harms) Nguyễn Thị Ngọc Đan1, Trần Công Luận1, 2, *, Lê Việt Tiến3 1Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, Tp.HCM 2Trường Đại học Tây Đô, 68 Trần Chiên, Phường Lê Bình, Quận Cái Răng, Tp. Cần Thơ 3Trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp.HCM, 227 Nguyễn Văn Cừ, Phường 4, Quận 5, Tp.HCM *Email: congluan53@gmail.com Đến Toà soạn: 15/6/2016; Chấp nhận đăng: 28/10/2016 TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu này là xây dựng được quy trình định lượng falcarindiol trong dược liệu Đinh lăng. Sử dụng hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), cột Ascentis C18 column (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), hệ pha động methanol – nước, tốc độ dòng 1,2 ml/phút và ở bước sóng 205 nm. Quy trình định lượng đã được thẩm định về độ lặp lại và độ đúng phù hợp để định lượng falcarindiol trong mẫu dược liệu. Hàm lượng falcarindiol trong Đinh lăng được xác định nằm trong 0,00031 %. Quy trình đơn giản, nhanh, ít tốn kém, kết quả có độ lặp lại cao và độ đúng đáng tin cậy. Với các ưu điểm trên, quy trình này có thể được áp dụng rộng rãi trong điều kiện thí nghiệm ở Việt Nam. Kết qủa cũng góp phần xây dựng chỉ tiêu định lượng hoạt chất falcarindiol trong Đinh lăng. Ngoài ra còn có thể áp dụng quy trình này để định lượng hoạt chất falcarindiol trong các dược liệu khác. Từ khoá: falcarindiol, Polyscias fructicosa, phân tích định lượng. 1. MỞ ĐẦU Polyacetylen là hợp chất có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết ba trong phân tử và cấu thành một nhóm chuyên biệt. Trong họ Nhân sâm (Araliaceae), hợp chất này được phát hiện trong sâm Triều Tiên vào những năm 60 nhưng chỉ được quan tâm nghiên cứu nhiều khi các nhà khoa học Hàn Quốc thông báo khả năng kháng tế bào ung thư in vitro mạnh từ những năm 80 cho đến nay. Bên cạnh đó, polyacetylen còn có hoạt tính kháng khuẩn, khánh virus, kháng viêm và kháng ngưng tập tiểu cầu...[1 - 4] Theo những nghiên cứu gần đây, để nghiên cứu hợp chất polyacetylen trong các dược liệu trong họ Nhân sâm, các nhà khoa học chủ yếu sử dụng các polyacetylen được phân lập từ Nhân sâm, đây là nguồn nguyên liệu quý hiếm và đắt tiền. Trong khi polyacetylen cũng đã được tìm thấy trong nguồn nguyên liệu tương đối rẻ tiền, dễ trồng hơn như Đinh lăng [2, 5]. Đồng thời, việc nghiên cứu hợp chất polyacetylen trong Đinh lăng ở nước ta vẫn chưa được quan tâm nhiều về mặt định lượng. Nguyễn Thị Ngọc Đan, Trần Công Luận, Lê Việt Tiến 426 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms), 3 năm tuổi được thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang. Mẫu được định danh và lưu giữ tại Bộ môn Tài nguyên - Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM. Mẫu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô, xay nhỏ để sử dụng cho nghiên cứu. Falcarindiol phân lập từ rễ Đinh lăng, có độ tinh khiết đạt trên 90,0% (tính theo phần trăm diện tích pic HPLC) được dùng làm chất đối chiếu. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Hệ thống HPLC Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: Bơm LC-20AT, bộ tiêm mẫu tự động SIL- 20AHT, detector UV-vis, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC. Phần mềm Excel (Microsoft Office) được sử dụng để tính toán kết quả. 2.2.2. Điều kiện sắc kí Cột sắc kí C18 Supelco (25 cm × 4,6 mm, 5 µm), thể tích tiêm mẫu 20 μl, pha động là Methanol - nước (80:20), tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phân tích 205 nm. 2.2.3. Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: Cân chính xác 5,0 mg chất chuẩn falcarindiol, hòa tan trong 5 ml methanol. Các dung dịch chuẩn falcarindiol có nồng độ nhỏ hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch trên bằng methanol. Mẫu thử: Cân khối lượng 5 g bột rễ Đinh lăng đã được nghiền mịn, chiết siêu âm với dichloromethan (50 ml × 4 lần) trong vòng 10 phút, lọc lấy dịch chiết. Dịch lọc được gom lại và đem cô quay dưới áp suất giảm cho đên cắn. Hòa tan cắn bằng MeOH, chuyển toàn bộ dịch MeOH vào bình định mức 5 ml, thêm MeOH cho đến vạch. Lọc dịch qua màng lọc 0,45 μm thu được dung dịch tiến hành phân tích sắc kí. 2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích Khảo sát độ đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thẩm định quy trình phân tích 3.1.1. Khảo sát độ đặc hiệu Xây dựng quy trình định lượng falcarindiol trong Đinh lăng (Polyscias fructicosa (L.) Harms) 427 Hình 1. Sắc kí đồ mẫu trắng. Hình 2. Sắc kí đồ mẫu chuẩn. Hình 3. Sắc kí đồ mẫu thử. Hình 4.Sắc kí đồ mẫu thử thêm chuẩn. Nhận xét: Từ Hình 1 cho thấy sắc kí đồ mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu tương ứng của chất chuẩn. Hình 2 và Hình 3 cho thấy sắc kí đồ mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn. Trên sắc kí đồ mẫu thử còn xuất hiện thêm các pic khác. Từ Hình 4 cho thấy khi thêm chuẩn vào mẫu, thử diện tích đỉnh của chất chuẩn trong mẫu thử tăng lên rõ rệt so với lúc chưa thêm chất chuẩn. Như vậy, quy trình có tính chọn lọc. 3.1.2. Khảo sát tính tuyến tính Bảng 1. Kết quả xác định khoảng tuyến tính. Nồng độ chuẩn (μg/ml) Diện tích pic trung bình 2,5 42087 5 59263 20 283136 40 578326 60 923764,5 80 1187764,5 100 1536657 Phương trình hồi quy: y = 15341x-15199 Hệ số xác định R2 = 0,999 Hình 1. Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ. Nhận xét: Kết quả ở Bảng 1 và Hình 5 cho thấy hệ số xác định R2 = 0,999 nên quy trình định lượng falcarindiol có khoảng xác định từ 2,5 μg/ml đến 100 μg/ml. 3.1.3. Tính thích hợp của hệ thống Nguyễn Thị Ngọc Đan, Trần Công Luận, Lê Việt Tiến 428 Bảng 2.Kết quả phân tích tính thích hợp hệ thống. Lần phân tích Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Hệ số đối xứng Số đĩa lý thuyết 1 8,461 285899 1,051 6638 2 8,488 281221 1,074 6622 3 8,592 293374 1,075 6443 4 8,635 289115 1,04 6429 5 8,602 294570 1,059 6359 6 8,659 285051 1,023 6413 Trung bình 8,573 288205 1,054 6484 Độ lệch chuẩn 0,08 5140,07 0,02 116,84 Độ lệch chuẩn tương đối 0,93 1,78 1,90 1,80 Nhận xét: Dựa vào kết quả ở Bảng 2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của các thông số sắc kí đều ≤ 2 % nên quy trình định lượng falcarindiol đạt tính thích hợp hệ thống. 3.1.4. Độ lặp lại của phương pháp Bảng 3. Kết quả độ lặp lại. Mẫu Khối lượng cân (g) Độ ẩm (%) Diện tích pic Nồng độ phân tích (μg/ml) Hàm lượng phần trăm (%) 1 5,0064 7,14 52013 3,39 0,00033 2 5,0041 49039 3,20 0,00031 3 5,0026 48295 3,15 0,00031 4 5,0045 49278 3,21 0,00031 5 5,0038 48941 3,19 0,00031 6 5,0005 47571 3,10 0,00030 Trung bình 0,00031 Độ lệch chuẩn 0,00001 Độ lệch chuẩn tương đối 3,15 Nhận xét: Dựa vào kết quả ở Bảng 3 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng phần trăm trong mẫu 3,15 ≤ 11 % nên quy trình định lượng falcarindiol đạt yêu cầu về độ lặp lại. 3.1.5. Độ đúng Xây dựng quy trình định lượng falcarindiol trong Đinh lăng (Polyscias fructicosa (L.) Harms) 429 Bảng 4. Kết quả xác định độ đúng. Mẫu 80-1 80-2 80-3 100-1 100-2 100-3 120-1 120-2 120-3 Khối lượng cân (g) 5,0024 5,0031 5,0056 5,0001 5,0084 5,0067 5,0040 5,0049 5,0066 Lượng chất thêm vào 12,8 12,8 12,8 16,0 16,0 16,0 19,2 19,2 19,2 Diện tích pic 101704 100669 101025 107037 108992 109348 116381 119902 117348 Lượng chất tìm lại 13,91 13,61 13,71 15,48 16,06 16,16 18,23 19,26 18,51 Hiệu suất thu hồi (%) 108,69 106,31 107,13 96,76 100,35 101,00 94,94 100,34 96,43 Trung bình 107,38 99,37 97,24 Độ lệch chuẩn 1,21 2,29 2,79 Độ lệch chuẩn tương đối 1,13 2,30 2,87 Nhận xét: Dựa vào kết quả ở Bảng 4 cho thấy độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 80 % đến 110 %. Vậy quy trình định lượng falcarindiol trong Đinh lăng đạt yêu cầu về độ đúng. 3.2. Ứng dụng quy trình Quy trình sau khi thẫm định đã được ứng dụng để xác định lượng hàm lượng falcarindiol trong rễ Đinh lăng Bảng 5. Kết quả định lượng falcarindiol trong rễ Đinh lăng. Mẫu Khối lượng cân (g) Độ ẩm (%) Diện tích pic Nồng độ phân tích (µg/ml) Hàm lượng phần trăm (%) 1 5,0026 48295 3,15 0,00031 2 5,0045 7,14 49278 3,21 0,00031 3 5,0005 47571 3,10 0,00030 Trung bình 0,00031 Độ lệch chuẩn 5,77 x 10-6 Độ lệch chuẩn tương đối 1,88 Nhận xét: Dựa vào kết quả ở Bảng 5 cho thấy hàm lượng falcarindiol trong mẫu rễ Đinh lăng rất thấp (0,00031 %). Kết quả này cho thấy hàm lượng hợp chất polyacetylen trong các cây thuộc họ Nhân sâm nói chung và trong Đinh lăng nói riêng rất ít, phù hợp với các công bố trước Nguyễn Thị Ngọc Đan, Trần Công Luận, Lê Việt Tiến 430 đây như hàm lượng của heptadeca-1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol trong rễ Sâm Việt Nam là 0,0038% và rễ Đinh lăng là 0,003 % [5, 6]. 4. KẾT LUẬN Lần đầu tiên quy trình định lượng falcarindiol trong rễ Đinh lăng bằng kỹ thuật HPLC cột pha đảo C18 với đầu dò UV đã được xây dựng và thẩm định. Quy trình đơn giản, nhanh, ít tốn kém, kết quả có độ lặp lại cao và độ đúng đáng tin cậy. Với các ưu điểm trên, quy trình này có thể được áp dụng rộng rãi trong điều kiện thí nghiệm ở Việt Nam. Kết qủa cũng góp phần xây dựng chỉ tiêu định lượng hoạt chất falcarindiol trong Đinh lăng. Ngoài ra còn có thể áp dụng quy trình này để định lượng hoạt chất falcarindiol trong các dược liệu khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lutomski J., Luan T. C. - Polyacetylene in the Araliaceae family, Part IV, The antibacterial and antifugal activities of two main polyacetylene from Panax vietnamensis Ha et Grushv. and Polysciasfructicosa (L.) Harms, Herba Polonica 38 (2) (1992) 137-140. 2. Trần Công Luận, Hồ T. T. L., Phạm T. X. T., Nguyễn T. N., Nguyễn T. D. - Hợp chất polyacetylen trong lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms – Araliaceae) trong “Công trình nghiên cứu khoa học (1987 – 2000) – Viện Dược liệu”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 2001, pp. 238 – 240. 3. Monika W. H., Joseph S. and Teresa K. - Thin Layer Chromatography in Phytochemistry, Taylor & Francis 99 (2008) 757 - 816. 4. Monika W. H and Joseph S. - High Performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, Taylor & Francis 102 (2010) 807 -901 5. Nguyễn Thượng Dong, Trần C. L., Nguyễn T. T. H. - Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, Hà Nội, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, 2007, tr. 144. 6. Lutomski J. and Luan T. C. - Polyacetylenes in the Araliaceae family, Part III, The qualitative and quantitative determination of the polyacetylenes from the crude extracts of Panax vietnamensis Ha et Grushv. and Polyscias fruticosa (L.) Harms by thin layer chromatography and spectrophotometry, Herba Polonica 38 (2) (1992) 55- 61. ABSTRACT QUANTITATIVE ANALYSIS OF FALCARINDIOL IN THE MEDICINAL PLANT Polyscias fructicosa Nguyen Thi Ngoc Dan1, Tran Cong Luan1, 2, *, Le Viet Tien3 1Research Center of Ginseng and Medicinal Materials HCM City, 41 Dinh Tien Hoang St, District 1, HCM City 2Tay Do University, 68 Tran Chien St., Le Binh Ward, Cai Rang District, Can Tho City University of Science HCM City, 227 Nguyen Van Cu St., Ward 4, District 5, HCM City *Email: congluan53@gmail.com Xây dựng quy trình định lượng falcarindiol trong Đinh lăng (Polyscias fructicosa (L.) Harms) 431 The study introduced a HPLC method for quantitative analysis of falcarindiol in Polyscias fruticosa roots. Assay was conducted using a Supelco C18 column (5 µm, 4.6 × 250 mm) under isocratic elution with methanol - water (80:20) at flow rate of 1.2 ml/min and detected using UV detector at 205 nm. The analytical method was validated for linearity, precision and accuracy. The standard solution of falcarindiol showed the linearity in the range of 2.5–100 µg/ml (R2 = 0.999). The relative standard deviations (RSD %) of the retention time (tR), peak square and precision were 0.93 %, 1.78 % and 3.15 %, respectively. The analytical method was proven to be reliable for the first time. Keywords: falcarindiol, Polyscias fructicosa, quantitative analysis.