Khảo sát mô học và độ vững ổn của cấy ghép Implant thực nghiệm trên thỏ sau 2 tháng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 1 KHẢO SÁT MÔ HỌC VÀ ĐỘ VỮNG ỔN CỦA CẤY GHÉP IMPLANT THỰC NGHIỆM TRÊN THỎ SAU 2 THÁNG. Võ Chí Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu cấy ghép implant thực nghiệm trên thỏ nhằm đánh giá các mục tiêu sau: (1) khảo sát hình ảnh mô học sau cấy ghép implant trên thỏ, (2) xác định độ vững ổn của implant trên thỏ sau cấy ghép 1 và 2 tháng. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu thực hiện trên 8 con thỏ không thuần chủng, từ 10 đến 12 tháng tuổi, có cân nặng từ 3kg trở lên. Thử nghiệm đặt 2 implant ở 8 con thỏ có và không có sử dụng vật liệu ghép calcium phosphate và calcium sulfate. Đo độ vững ổn của implant sau khi đặt và ở thời điểm lấy mẫu (1 và 2 tháng), làm tiêu bản khảo sát mô học. Kết quả: Nghiên cứu bước đầu đã xác định được độ vững ổn của implant sau cấy ghép trên thỏ và các hình ảnh mô học cho thấy có sự hiện diện của các tạo cốt bào, cốt bào kế cận vùng implant. Kết luận: Nghiên cứu cấy ghép implant trên thỏ có độ vững ổn ban đầu của implant thường đạt ở mức cao (56-66 theo thang đo của máy Osstell). Hình ảnh mô học cho thấy có sự hiện diện của các loại tế bào trong thời kỳ lành thương ở cả 1 và 2 tháng. Từ khóa: Cấy ghép implant, vật liệu ghép, độ ổn định của implant. ABSTRACT THE HISTOLOGY AND STABILITY OF IMPLANT EXPERIMENT ON RABBIT AFTER TWO MONTHS Vo Chi Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 1 - 7 Objectives: This experimental study of implant on rabbit was to evaluate the histology and implant stability after implanting on rabbit 1 and 2 months. Materials and methods: The study was conducted on 8 rabbits, aged from 10 to 12 months, weighting over 3kg. The placement with 2 implants on each rabbit with and without calcium phosphate and calcium sulfate graft. The implant stability was evaluated right after the procedure, one month and 2 months later; and histological study were done after one and two months also. Results: The study initiatively confirmed the stability of implant on rabbits, the histology showed the present of osteoblasts, osteocytes surrounding implants. Conclusion: High primary stability of implants was observed (56-66 according to Osstell). The histology showed many kind of cells presenting during healing time after one and two months. Key words: Implant, graft material, implants stability. MỞ ĐẦU Trong các thử nghiệm về vật liệu cũng như các kỹ thuật mới, hầu hết đều sử dụng súc vật thí nghiệm để đánh giá các tính chất của vật liệu như độc tính, khả năng tương hợp sinh học, các tính chất vật lý hóa học và khả năng ứng dụng của kỹ thuật trước khi sử dụng trên người(3,4,8). Nghiên cứu về cấy ghép nha khoa cũng tương tự nhằm chứng minh các đặc tính vật lý và hóa học của vật liệu, tìm ra những bằng chứng mô học thuyết phục để khẳng định việc * Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Tp.HCM Tác giả liên lạc:ThS. Võ Chí Hùng ĐT: 0903873819 Email: drchihung@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 2 có nên sử dụng vật liệu hay kỹ thuật cụ thể trên người hay không(1,2,9). Đối với kỹ thuật cấy ghép nha khoa ngày nay, tuy không còn là loại kỹ thuật điều trị quá mới mẻ và khó thực hiện, nhưng để chứng minh loại vật liệu sử dụng trong ghép xương, thiết kế kiểu dáng implant phù hợp cần có chứng minh về mô học cụ thể(5,6,7). Do đó, nghiên cứu cấy ghép implant thực nghiệm trên thỏ nhằm đánh giá các mục tiêu sau: (1) khảo sát hình ảnh mô học sau cấy ghép implant trên thỏ, (2) xác định độ vững ổn của implant trên thỏ sau cấy ghép. ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang mô tả so sánh từng nhóm thực nghiệm có nhóm chứng. Các tiêu chuẩn đánh giá Đánh giá độ vững ổn của implant bằng máy đo độ vững ổn (hiệu Osstell). Khảo sát mô học ở thời điểm 1 và 2 tháng. Dụng cụ và vật liệu Dụng cụ Bộ dụng cụ phẫu thuật răng miệng cơ bản, bộ mũi khoan phẫu thuật C1 (MIS – Israel). Máy phẫu thuật implant (Nobel Biocare – Sweden). Máy đo độ vững ổn của Implant (Hiệu Osstell). Máy đánh giá độ vững ổn của implant dựa trên kỹ thuật phân tích tần số cộng hưởng từ (RFA: Resonance Frequency Analysis). Mức ổn định của implant (ISQ: Implant Stability Quotient) là thang đánh giá trong phạm vi từ 1-100. Dụng cụ làm tiêu bản mô học, kính hiển vi quang học máy BX51 của hãng Olympus. Máy chụp phim X quang kỹ thuật số. Vật liệu Thuốc mê Zoletil 50: Thuốc mê thú y, có thành phần gồm Tiletamine 125mg, Zolazepam 125mg và tá dược. Thuốc có thể dùng để tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp, được trình bày dưới dạng hai chai, gồm (1) chai thuốc dạng bột và (2) chai thuốc nước chứa 5ml. Khi sử dụng, cho phần nước của chai (2) vào chai (1), lắc đều cho đến khi tan hết bột và dung dịch trở thành trong suốt. Implant C1 (MIS – Israel): 16 cái. Vật liệu ghép: Thí nghiệm sử dụng 2 loại vật liệu ghép gồm 4Bone (calcium phosphate - MIS – Israel) và BondBone (calcium sulfate - MIS – Israel). Thuốc tê Lidocaine 2% có thuốc co mạch 1/100.000 Epinephrine, kim khâu, chỉ tự tiêu Catgut 4/0 và chỉ Silk 3/0. Đối tượng 8 con thỏ đực không thuần chủng (để tránh việc sinh sản trong thời gian thí nghiệm), cân nặng trên 3kg, trên 10 tháng tuổi. Tiến trình thực hiện - Các dụng cụ và trang thiết bị sử dụng cho phẫu thuật đều được vô trùng. Mã số thỏ được ghi trên da tai thỏ. Sát trùng bằng betadine vị trí chích thuốc mê. Gây mê bằng cách tiêm bắp vào mặt trong đùi trước của thỏ 0,8-1ml dung dịch Zoletil 50 (tương đương 6mg/kg cân nặng). Khoảng 5 phút sau khi tiêm thuốc mê, thỏ đã qua trạng thái tiền mê dùng kéo cắt lông sát da ở mặt ngoài xương đùi sau của thỏ tại vùng dự định phẫu thuật. Sát trùng vùng da bằng Betadine, xác định đường rạch ngoài da bằng cách sờ nắn tìm khoảng tiếp xúc giữa 2 bó cơ đùi. Gây tê tại chỗ với 2ml Lidocaine 2% có chứa thuốc co mạch (để giảm thiểu nguy cơ chảy máu). - Dùng dao mổ số 11 tạo đường rạch đầu tiên qua lớp da và màng da che phủ cơ khoảng 2- 2,5cm, bóc tách giữa 2 bó cơ, bộc lộ màng xương đùi, rạch và bóc tách màng xương. Ước lượng chiều dài của xương đùi và 2 vị trí đặt implant bằng cây đo túi nha chu sao cho các điểm đặt không được quá gần các khớp trên và dưới của xương đùi (vì dễ gãy xương đùi sau phẫu thuật) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 3 khoảng cách tối thiểu từ lỗ khoan đánh dấu đến điểm tiếp xúc khớp xương là 12mm. - Dùng mũi khoan thăm dò có bơm rửa với nước muối sinh lý để tránh hoại tử xương (mũi pilot drill trong bộ mũi khoan phẫu thuật implant C1) để định vị và tạo đường vào ở 2 vị trí dự tính đặt implant, khoảng cách giữa hai implant là 12mm. - Tiếp tục mở rộng đường vào lỗ xương thứ nhất bằng mũi khoan có đường kính 2,8mm; 3,2mm và mũi khoan sau cùng tương ứng với kích thước implant được đặt 3,75mm (Final drill), sử dụng thêm mũi khoan 4,2mm để tạo đường vào cho vật liệu ghép. Đặt implant vào xương đùi thỏ có và không ghép calcium phosphate hoặc/và calcium sulfate. Khâu đóng 3 lớp cho kín miệng sang thương: lớp màng xương và lớp màng cơ khâu mũi đơn bằng chỉ tiêu Cagut 4.0; lớp da: chỉ silk 3.0 và cắt chỉ sau 7 ngày. - Ghi nhận mức ổn định của implant bằng cách gắn SmartPeg (là một chốt có gắn thanh nam châm trên đầu của chốt để tạo ra từ trường) vào implant bằng tay với lực nhẹ khoảng từ 4-6 Ncm. Hướng đầu dò của máy vào gần đầu nam châm của SmartPeg, không chạm vào SmartPeg, sau khi máy ghi nhận được mức độ (phát ra tiếng “Bip”) đọc giá trị ISQ ghi nhận được. Sau đó, đo ở góc độ vuông góc (90 độ) so với góc đo lần đầu và thực hiện phép đo này tại thời điểm lấy mẫu. - Làm tiêu bản khảo sát mô học hình ảnh của xương tân tạo, sự hiện diện của các tế bào trung mô, nguyên bào sợi, nguyên bào xương, tạo cốt bào, cốt bào, hủy cốt bào, nguyên bào sụn, mô sụn, hiện tượng viêm, hiện tượng sung huyết, xuất huyết để đánh giá các qui trình. Thực hiện ở mỗi vị trí 2 lát cắt. Làm tiêu bản mô học Được thực hiện tại bộ môn Mô Phôi Khoa Y, ĐHYD TP. Hồ Chí Minh. Cố định đoạn xương đùi thỏ chứa implant trong Formalin 10% (2 giờ). Khử canxi bằng dung dịch axit nitric 7% trong thời gian từ 3 đến 7 ngày tùy mẫu lớn nhỏ cho đến khi có thể cắt mẫu bằng dao phẫu thuật. (Dung dịch axit nitric 7% được thay mỗi ngày). Cắt đôi đoạn xương đùi chứa vật liệu cấy ghép (mỗi mẫu dài 2 đến 3cm) và đánh số thứ tự. Xử lý mẫu mô bằng máy Microm STP 120 của hãng Thermo Scientific Shandon. Vùi trong parafine (đúc khối) bằng máy Histostar của hãng Thermo Scientific Shandon. Cắt mỏng mẫu, mỗi lát cắt có độ dày 5 µm bằng máy HM 325 của hãng Thermo Scientific Shandon. Đặt mẫu lên bàn sấy. Khử parafin bằng cách cho tiêu bản qua 3 lọ Toluen, mỗi lọ 5 phút. Khử Toluen bằng cách cho tiêu bản qua 3 lọ Alcool 100, mỗi lọ 3 phút. Khử Alcool bằng nước. Nhuộm vào Hematoxylin (nhuộm nhân tế bào) trong 5 phút, ngâm tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Nhúng qua dung dịch axit alcool, dung dịch NH3 để làm sáng màu nhân, sau đó rửa nước. Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương) trong 3 phút. Sau đó cho tiêu bản qua 3 lọ Alcool, lau sạch lam, dán lamen có độ dày 0,17mm. Toàn bộ tiêu bản được khảo sát hình ảnh vi thể theo phương pháp mù đơn (do 2 giảng viên của ĐHYK Phạm Ngọc Thạch phụ trách). Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi quang học bằng máy BX51 của hãng Olympus (có gắn kèm máy camera DP72 12.5Mp của hãng Olympus và truyền qua màn hình vi tính). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ vững ổn của implant Nghiên cứu độ vững ổn trong thời gian phẫu thuật cấy ghép implant vào xương đùi thỏ đạt mức độ tương đối cao và không có sự khác biệt tại các vị trí ghép calcium phosphate (4Bone), calcium sulfate (BondBone) hoặc ở vị trí không ghép vật liệu và không có sự khác biệt nhiều ở Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 4 những hướng đo khác nhau (trên-dưới, trước- sau) trên cùng một vị trí (Bảng 1). Bảng 1: Độ vững ổn của Implant tại thời điểm phẫu thuật. Stt Mã số thỏ Vật liệu ghép Độ vững ổn (1) 4 Bone (2) Bond Bone (3) Không Ngoài - Trong (NT) Gần - Xa (GX) (1) (2) (3) (1) (2) (3) 1 19 x x 65 61 65 63 2 21 x x 56 67 56 61 3 22 x x 66 69 68 68 4 22A x x 70 70 68 63 5 24 x x 66 59 65 61 6 25 x x 74 59 70 53 7 26 x x 69 49 59 48 8 27 x x 62 62 52 53 Trung bình 66 64,5 58,3 62,6 60,8 56,7 Bảng 2: Độ vững ổn của Implant tại thời điểm phẫu thuật và khi thu thập mẫu. Mã số Độ ổn định Implant 1 (4 Bone) Implant 2 (BondBone) Implant (không ghép) NT GX NT GX NT GX 19 Sơ khởi 65 65 61 63 Sau 2 tháng 70 68 66 64 21 Sơ khởi 56 56 67 61 Sau 2 tháng 62 60 73 65 22 Sơ khởi 66 68 69 68 Sau 2 tháng 74 74 77 75 22A Sơ khởi 70 68 70 63 Sau 2 tháng 79 76 80 71 24 Sơ khởi 66 65 59 61 Sau 1 tháng 68 68 64 63 25 Sơ khởi 74 70 59 53 Sau 1 tháng 77 72 62 55 26 Sơ khởi 49 48 69 59 Sau 1 tháng 54 52 73 62 27 Sơ khởi 62 62 52 53 Sau 1 tháng 66 64 56 56 Độ vững ổn của implant sau thời gian 1 và 2 tháng có gia tăng ở tất cả các nhóm có ghép vật liệu cũng như không ghép vật liệu và tăng nhiều nhất là theo chiều ngoài-trong, nhưng không có sự khác biệt ở các vị trí đo (Bảng 2). Hình ảnh mô học Hình ảnh mô học sau 1 tháng * Cấy ghép implant có ghép vật liệu calcium phosphate sau 1 tháng Quan sát tiêu bản vị trí cấy ghép implant có vùng mô bị hoại tử, đó là vùng mô đồng nhất, ái toan, không còn thấy tế bào nữa, bênh cạnh đó còn có nhiều vật liệu ghép. Trong vùng lành thương vật liệu ghép còn tồn tại cùng với vùng tế bào trung mô dày đặc. Hình 1: Vùng lành thương được lấp đầy mô liên kết sợi và vật liệu ghép (HE x 100). Qua quá trình biệt hóa các tế bào trung mô ở dạng tiền nguyên bào xương tăng sinh biệt hóa thành tạo cốt bào, biểu hiện qua sự tăng sinh các Hình 2: Vùng lành thương với vật liệu ghép và tế bào viêm (HE x 400). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 5 nguyên bào sợi trong các hốc tủy và vùng liên quan đến sang thương (Hình 1, 2). Cấy ghép implant vật liệu calcium sulfate sau 1 tháng Hình 3: Hiện diện nhiều tạo cốt bào và một số cốt bào tại vùng lành thương (HEx100). Hình 4: Các bè xương tân tạo bắt đầu xuất hiện bao quanh xương ghép (HEx200). Vùng lành thương có hiện diện các loại tạo cốt bào và bè xương tân tạo đã hình thành quanh mô ghép (Hình 3, 4). Cấy ghép implant không ghép vật liệu sau 1 tháng. Vùng lành thương thấy có các tế bào trung mô (dạng nguyên bào sợi) bao quanh cấu trúc mạch máu. Tại mô mới sinh ngay sát bề mặt implant các khối tế bào nằm trong lưới sợi, ít tế bào viêm. Xa hơn, tại trung tâm vùng lành thương, nhiều tế bào viêm bao quanh các cấu trúc mạch máu trong mô mềm mới tạo ra (Hình 5, 6). Hình 5: Hình thành xương hướng về phía trung tâm (HE x 100). Hình 6: Tế bào trung mô, tế bào viêm trong vùng lành thương (HE x 400). Hình ảnh mô học sau 2 tháng * Cấy ghép implant có ghép vật liệu calcium phosphate sau 2 tháng Vật liệu ghép đã tích hợp và được bao quanh mô xương mới hình thành, có những vùng vật liệu ghép tiếp xúc sát với mô xương. Mô tủy được lấp đầy mô liên kết quanh vật liệu ghép và xương tân tạo đồng thời có sự tăng sinh mạch máu nuôi. Mô xương mới hình thành dạng xương bè, đã có hình thành hốc tủy. Bên cạnh đó cũng thấy xuất hiện nhiều tế bào viêm cạnh mảnh ghép. Khảo sát vùng ren implant đã có sự tích hợp xương hoàn toàn ở vùng lành thương sát với implant tuy nhiên chưa hoàn chỉnh, tế bào trung mô dày đặc, kích thích biệt hóa thành nguyên bào sợi, nguyên bào xương, tạo cốt bào, cốt bào (Hình 7, 8). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 6 Hình 7: Vùng lành thương với xương tân tạo (HEx100). Hình 8: Xương tân tạo cạnh vật liệu ghép (HEx400). * Cấy ghép implant vật liệu calcium sulfate sau 2 tháng Hình 9: Vùng tiếp giáp giữa implant và hốc tủy (HEx100). Hình 10: Tạo cốt bào và cốt bào trong vùng lành thương (HEx400). Quan sát trên tiêu bản cấy ghép implant phối hợp với vật liệu calcium sulfate cho thấy có sự lành thương xương nhiều hơn ở thời điểm một tháng, có sự hiện diện của cốt bào nhiều hơn. Quá trình lành thương (hay tích hợp xương) vẫn còn tiếp diễn do có sự hiện diện của nhiều tạo cốt bào ở vùng lành thương (Hình 9, 10). * Cấy ghép implant không ghép vật liệu sau 2 tháng Quan sát trên tiêu bản đặt implant nhưng không ghép vật liệu cho thấy có sự hiện diện dày đặc các tế bào trung mô ở hốc tủy và ở vùng sang thương cũng như sự hiện diện của các tạo cốt bào, cốt bào nằm trên bề mặt và trong xương tân tạo là bằng chứng rõ rệt của hiện tượng lành xương trực tiếp thông qua quá trình dẫn tạo xương. Các tế bào trung mô xuất hiện dày đặc trong hốc tủy chuẩn bị cho một quá trình di chuyển và biệt hóa thành nguyên bào sợi, nguyên bào xương, tạo cốt bào, cốt bào để tạo xương mới, có cả sự tân sinh mạch máu tân tạo (Hình 11, 12). Hình 11: Vùng tiếp giáp giữa implant và hốc tủy (HEx100). Hình 12: Tủy xương có vùng xuất huyết và xương tân tạo (HEx200) Vùng Xương tân Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 7 KẾT LUẬN Thực nghiệm cấy ghép implant vào xương đùi sau của thỏ là một phẫu thuật có thể thực hiện được vì độ vững ổn ban đầu đạt ở mức tương đối cao, từ 56-66 theo thang đo của máy Osstell. Sau cấy ghép 1 và 2 tháng cho thấy độ vững ổn có chiều hướng gia tăng ở tất cả các vị trí và không bị ảnh hưởng bởi có hay không có vật liệu ghép. Hình ảnh mô học cho thấy có sự thay đổi rõ rệt giữa hai thời điểm khảo sát (1 và 2 tháng) cho thấy sự lành thương xương tiến triển và vẫn chưa kết thúc tại thời điểm 2 tháng ở tất cả các nhóm được đặt implant phối hợp ghép calcium phosphate, calcium sulfate và không ghép vật liệu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Araujo M, Liljenberg B, Lindhe J (2010). Beta-tricalcium phosphate of socket healing: an experimental study in the dog. Clinical Oral Implants Research, 21: 445-454. 2. Berglundh A (2003). The new alveolar bone formation adjacent to endosseous implant- A model study in the dog. Clinical Oral Implants Research, 14(3): 251. 3. Calvo-Guirado JL, Delgado-Ruiz RA, Ramírez-Fernández MP (2012). Histomorphometric and mineral degradation study of Ossceram: a novel biphasic B- tricalcium phosphate, in critical size defects in rabbits. Clin Oral Implants Res, 23(6): 667-675. 4. Calixto RF, Téofilo JM, Brentegani LG, Lamano-Carvalho TL (2007). Alveolar wound healing after implantation with a pool of commercially available Bovine Bone Morphogenetic proteins (BMPs): a histometric study in rats. Braz Dent J, 18(1): 29-33. 5. Carmagnola D, Abati S, Celestino S, Chiapasco M, Bosshardt D, Lang NP (2008). Oral implants placed in bone defects treated with Bio-Oss®, Ostim®, Paste or Perio Glas: an experimental study in the rabbit tibiae. Clin Oral Impl Res, 19: 1246-1253. 6. Cormack DH (1987). Ham’s histology, Chapter VI: Mechanism of healing of a simple fracture of a long bone, ninth edition. JB Lippincott company, 312-323. 7. Garg AK (2010). Implant Dentistry A Practical Approach, Second edition, Chapter 16: Bone biology, osseointegration, and bone grafting. 8. Pjetursson BE, Tan K, Lang NP, Bragger U, Egger M, Zwahlen M (2004). A systematic review of the survival and complication rates offixed partial dentures (FPDs) after an observation period of at least 5 years. I. Implant supported FPDs clinical Oral Implant Research 15: 625-642. 9. Toh CG (2001). Peri-implant bone reaction to immediately loaded implants: An experimental study in monkey. Journal of Periodontology, 72(4): 506-511. Ngày nhận bài báo: 08/02/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/02/2014 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2014