Khóa luận Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa (catharanthus roseus) in vitro

Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro MỤC LỤC CHưƠNG TRANG Trang tựa .i Lời cảm ơn .iii Tóm tắt .iv Summary vi Mục lục .vii Danh sách các bảng .xi Danh sách các hình và sơ đồ .xiii Danh sách các chữ viết tắt xv CHưƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu .2 1.3. Yêu cầu .2 CHưƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây .3 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp .3 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp .4 2.2. Alkaloid .4 2.3. Sơ lược đặc điểm về cây Trường xuân hoa Catharanthus roseus 7 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa .7 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa .8 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa 9 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa 13 2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa . 13 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh 14 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp .15 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng . 15 2.4.2. Nguồn đạm 16 2.4.3. Nguồn cacbon 16 2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen 16 2.4.5. Các chất khác 16 2.5. Các phương pháp chiết xuất alkaloid 17 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất 17 2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ 17 2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước . 18 2.6. Các phương pháp định tính sự hiện diện của alkaloid 18 2.6.1. Phản ứng tạo tủa 19 2.6.2. Phản ứng tạo màu 19 2.7. Các phương pháp định lượng alkaloid .20 2.7.1. Phương pháp cân .20 2.7.2. Phương pháp trung hòa 20 2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan .21 2.7.4. Phương pháp so màu .21 2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 22 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp .22 2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản 22 2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp .23 2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao 24 2.8.2. Xử lý với Elicitor 24 2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 24 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất 24 2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học .25 CHưƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu 26 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .26 3.3.1. Vật liệu 26 3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .26 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ .26 3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy .26 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu .27 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA .27 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27 3.3.4. Phương pháp tiến hành 29 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA 29 3.4.1. Vật liệu .29 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra 29 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29 3.4.1.3. Hóa chất .30 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu .30 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 30 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trường xuân hoa 31 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo .31 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE .32 3.4.3. Phương pháp tiến hành 32 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa 32 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa 32 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE 34 CHưƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 CHưƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1. Kết luận .56 5.2. Đề nghị .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây 13 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28 Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .35 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36 Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy .37 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy .38 N1 N3 N2 I2 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 41 Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 43 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 46 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE .50 Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE 53 Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy .54 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa 7 Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa .8 Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine . 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline 10 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine . 11 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất 12 Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy .39 Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày 42 Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA .42 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA .44 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 45 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitrotrên môi trường có chứa NAA 46 Hình 4.7:Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitrotrên môi trường có chứa IAA 47 Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l 48 Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo tươi 49 Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo khô 50 Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro

pdf92 trang | Chia sẻ: maiphuongtl | Ngày: 27/05/2013 | Lượt xem: 1719 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khóa luận Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa (catharanthus roseus) in vitro, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
sung NAA 0,5 mg/l. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên). 43 Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết alkaloid từ mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro 28 ngày tuổi trên các môi trường có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau, để chọn nồng độ phù hợp kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid nhất. Kết quả trình bày ở bảng 4.7. Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy Chất kích thích sinh trƣởng Nồng độ (mg/l) Phản ứng màu với thuốc thử Wagner NAA 0 dung dịch đục, tạo tủa vừa 0,1 dung dịch đục mờ, không lắng 0,5 dung dịch tạo tủa nhiều 1 dung dịch đục, tạo tủa vừa 5 dung dịch tạo tủa ít 10 dung dịch tạo tủa ít IAA 0,1 dung dịch tạo tủa ít 0,5 dung dịch đục mờ, không lắng 1 dung dịch đục, tạo tủa vừa 5 dung dịch đục mờ, không lắng 10 dung dịch tạo tủa ít Khi cho phản ứng với thuốc thử,ở các mẫu trên môi trường có bổ sung NAA cho kết tủa nhiều hơn so với các mẫu trên môi trường chứa IAA. Có nghĩa là lượng alkaloid được tạo ra nhiều trong cây nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA. Điều này có thể giải thích là do IAA là chất kích thích tăng trưởng có nguồn gốc từ thực vật nên việc sử dụng IAA như chất cảm ứng để kích thích khả năng tổng hợp alkaloid không có hiệu quả như khi sử dụng chất có nguồn gốc hóa học như NAA. 44 Trong số các nồng độ NAA sử dụng thì thấy mẫu cây trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l tạo kết tủa nhiều nhất khi phản ứng với thuốc thử. Ở nồng độ 1 mg/l, 5 mg/l và 10 mg/l cho phản ứng tạo tủa vừa, dung dịch đục còn ở 0,1 mg/l thì dung dịch đục và tạo kết tủa rất ít. Như vậy, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l cây sản xuất được nhiều alkaloid nhất (Hình 4.4). Các mẫu cây nuôi trên môi trường chứa IAA khi cho phản ứng với thuốc thử thì thấy dung dịch đục mờ ít lắng, điều này có thể là do lượng alkaloid toàn phần trong cây trên môi trường này được tạo ra ít. Trong các nồng độ thí nghiệm thì khi dùng IAA 1mg/l cho hiện tượng tạo kết tủa rõ ràng nhất, ở các nồng độ còn lại có thể do lượng alkaloid trong mẫu ít nên không quan sát thấy kết tủa, chỉ thấy dung dịch vẫn đục (Hình 4.5). 1 2 3 4 5 6 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau,1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l. 45 . Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một lượng auxin thích hợp (NAA 0,5 mg/l hay IAA 1 mg/l) thì kích thích khả năng tạo alkaloid ở cây Trường xuân hoa. Tuy nhiên, xét về mặt kinh tế, sử dụng NAA 0,5 mg/l có hiệu quả hơn.  Định tính alkaloid trong rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner Tiến hành ly trích alkaloid của rễ cây Trường xuân hoa 28 ngày tuổi trên các môi trường khác nhau trong acid H2SO4 loãng sau đó nhận diện alkaloid bằng thuốc thử Wagner. 1 2 3 4 5 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l. 46 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau Chất kích thích sinh trƣởng Nồng độ (mg/l) Phản ứng màu với thuốc thử Wagner NAA 0 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) 0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++++) 1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) 10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) IAA 0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+) 0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+) 1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) +: nhạt màu, ++ : đậm vừa, +++ : đậm, ++++ : đậm màu nhất 1 2 3 4 5 6 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau, 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l, phản ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên). 47 Kết quả ở hình 4.6 và 4.7 cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm đều phản ứng với thuốc thử tạo vòng nhẫn màu nâu đỏ (giống mẫu đối chứng), điều này chứng tỏ tất cả các mẫu rễ đều có chứa alkaloid. Vì alkaloid phân bố khác nhau ở thân, lá và rễ (2.3.3) nên khi nhận biết bằng thuốc thử ở các mẫu rễ ta không thấy sự xuất hiện kết tủa như ở mẫu thân lá. Khi cho cùng lượng thuốc thử vào các mẫu, quan sát thấy mẫu được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo vòng nhẫn đậm màu hơn so với các mẫu cây được nuôi trên môi trường có chứa IAA. Trong tất cả các nồng độ NAA đã thí nghiệm, mẫu cây được nuôi trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l cho kết quả tạo màu đậm nhất. Việc sử dụng NAA ở nồng độ cao (5 mg/l, 10 mg/l) tạo vòng nhẫn mờ và dễ bị hòa tan có thể là do ở nồng độ này cây thích hợp cho việc tạo mô sẹo chứ không kích thích lên sự phát triển của rễ. Ngược lại các mẫu trên môi trường có bổ sung IAA vòng nhẫn đậm màu ở mẫu 3, 4, đậm vừa ở mẫu 5 và nhạt màu ở mẫu 1 và 2, điều này có nghĩa là việc sử 1 2 3 4 5 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l. ường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau, 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l, phản ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên). 48 dụng IAA ở nồng độ 1 mg/l và 5 mg/l có thể kích thích lên sự sản sinh alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro. Như vậy việc sử dụng auxin ở nồng độ thích hợp (NAA 0,5 mg/l; IAA 1 mg/l) có thể tác động đến sự tích lũy alkaloid ở rễ. Tóm lại khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l cây Trường xuân hoa in vitro có thể đạt được hàm lượng alkaloid cao. Trong đó lượng alkaloid tập trung nhiều ở thân lá. 4.5. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm quy trình ly trích alkaloid Trƣờng xuân hoa Tiến hành ly trích mẫu theo hai quy trình khác nhau: + Quy trình 1: ly trích alkaloid từ vật liệu tươi (trang 33) + Quy trình 2: ly trích alkaloid từ vật liệu khô (trang 34) Dịch chiết alkaloid sau khi ly trích được phân tích bằng CE Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l (A), vindoline 20 mg/l (B), Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10 kV; bơm 3 s ở 25 mbar; nhiệt độ 25oC 49 Khi phân tích dịch chiết alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa tươi và khô bằng CE đều nhận thấy có sự hiện diện của catharanthine và vindoline trong mẫu. Khi tiến hành ly trích từ mẫu tươi, kết quả trên hình 4.9 cho thấy nhiều hợp chất trong cây được nhận diện (mỗi pic đại diện cho một chất) nhưng theo kết quả tính toán các dịch alkaloid ly trích từ mẫu tươi (quy trình 1) có hàm lượng cathẩnthine và vindoline thấp hơn so với các dịch alkaloid ly trích bằng mẫu khô (quy trình 2) ( xem bảng 4.9). 2 a b Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng tươi. a) Catharanthine, b) vindoline. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10. kV; nhiệt độ 25oC 50 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE Hàm lượng Catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng Vindoline (mg/100mg vật liệu khô) Quy trình 1 0,00348 0,02704 Quy trình 2 0,02087 0,05216 b a Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng khô, a) Catharanthine, b) vindoline.. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC 51 Kết quả phân tích ở hình 4.9 và 4.10 cho thấy sự phân tách alkaloid ở mẫu khô tốt hơn so với mẫu tươi, vì khi ly trích bằng vật liệu tươi, mẫu có độ nhớt cao hơn sẽ làm cản trở quá trình phân tách các chất dẫn đến có píc đôi. Hơn nữa, theo quy trình ly trích 1 thì mẫu phải trải qua nhiều giai đoạn tiếp xúc với dung môi nên lượng alkaloid bị hao hụt và thời gian để chuẩn bị mẫu lâu hơn so với quy trình 2, có thể lượng alkaloid đã bị ảnh hưởng một phần bởi ánh sáng do mẫu để lâu ngoài môi trường. Hàm lượng catharanthine ly trích theo quy trình 2 cao 4 lần so với lượng catharanthine thu được sau khi ly trích theo quy trình 1, còn lượng vindoline thì cao gấp 2 lần (Biểu đồ 4.1). Như vậy việc sử dụng quy trình ly trích từ mẫu khô cho kết quả tốt hơn. 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 QT1 QT 2 Quy trình ly trích in do l a lk al oi d (% ch ất k hô ) Catharanthine vindoline Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2. Qua thí nghiệm này cho thấy quy trình ly trích bằng mẫu khô cho kết quả phân tích alkaloid tốt hơn, vì quy trình ly trích mẫu tươi khá phức tạp và tốn nhiều thời gian, mẫu phải được ly trích ngay khi thu hoạch, không bảo quản được lâu như 52 mẫu khô nên không thuận lợi khi thực hiện nghiên cứu. Trong khi đó, mẫu vật liệu được bảo quản dễ dàng, chỉ cần trữ mẫu nơi khô ráo, tránh hút ẩm. 4.6. Thí nghiệm 4: Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo Trước khi tiến hành phân tích một mẫu, máy CE được luyện cột với dung dịch đệm và chạy chuẩn alkaloid của Trường xuân hoa. Ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro theo quy trình 2, sau đó đem phân tích alkaloid bằng CE, kết quả thu được như sau: Catharanthin e Catharanthine Vindolin e Vindolin e Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi, cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC. 53 Kết quả trình bày ở hình 4.11 và 4.12 cho thấy trong mẫu Trường xuân hoa in vitro và in vivo đều có chứa catharanthine và vindoline khi so với catharanthine và vindolin chuẩn. Nhưng hàm lượng các chất này trong cây in vitro cao hơn so với cây in vivo (Bảng 4.10). Bảng 4.10. Hàm lượng Catharanthine và Vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo Quan sát biểu đồ 4.2 nhận thấy ở cùng một thời điểm thu hoạch nhưng các cây Trường xuân hoa in vitro có thể sản xuất lượng catharanthine và vindoline cao Hàm lượng Catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng Vindoline (mg/100mg vật liệu khô) Cây in vitro 0,02149 0,03642 Cây in vivo 0,01969 0,01744 54 hơn so với cây in vi vo, như vậy việc sử dụng các cây Trường xuân hoa in vitro làm nguồn sản xuất các indol alkaloid là có thể thực hiện được. Điều này rất có ích cho việc sản xuất các indol alkaloid trên quy mô công nghiệp vì có thể kiểm soát được quá trình nuôi cấy và kích thích cây sản xuất các hợp chất mong muốn. Hơn nữa ngoài việc nhân nhanh các cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất alkaloid với hàm lượng cao, nuôi cấy in vitro còn có lợi điểm là giảm không gian sử dụng và giảm chi phí so với nhân giống in vivo. Việc này có thể góp phần làm giảm giá thành các alkaloid. 4.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng hệ thống điện di mao quản Xác định hàm lượng của catharanthine và vindoline trong mẫu cây Trường xuân hoa ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi trên môi trường có NAA 0,5 mg/l thu được kết quả như sau: Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy Trong các mẫu phân tích, hàm lượng catharanthine cao nhất thu được từ cây nuôi cấy mô ở giai đoạn 28 ngày (0,0394 %). Điều này có thể giải thích là do catharanthine được sản xuất ở rễ và khi so sánh với kết quả nuôi cấy mô nhận thấy cây có khả năng phát triển rễ mạnh nhất sau 28 ngày trên môi trường bổ sung NAA. Trong khi đó, hàm lượng vindoline cao nhất là ở 7 ngày tuổi và giảm dần sau 35 Ngày Hàm lượng catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng vindoline (mg/100mg vật liệu khô) 7 0,0326 0,0371 14 0,0342 0,0112 21 0,0141 0 28 0,0394 0,0274 35 0,0291 0,0224 55 ngày tuổi. Riêng ở giai đoạn 21 ngày không phát hiện được vindoline trong cây, có thể vì ở giai đoạn này vindoline không cần thiết cho cây nên không được tổng hợp hoặc được tổng hợp với hàm lượng thấp và bị loại bỏ trong bớt trong quá trình ly trích nên không phát hiện được khi phân tích bằng CE. Điều này chứng tỏ mỗi loại alkaloid đạt được hàm lượng cao ở những giai đoạn khác nhau. Do đó việc xác định được thời điểm cây sản xuất các hợp chất quan tâm là rất quan trọng. Thí nghiệm này xác định được giai đoạn nuôi cấy thích hợp của cây Trường xuân hoa, trên môi trường bổ sung NAA để thu nhận vindoline là 7 ngày tuổi và catharanthine là 28 ngày tuổi 56 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu được có thể đưa ra một số kết luận sau  Sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa Việc bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy chỉ ảnh hưởng lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Nồng độ thích hợp cho sự phát triển rễ của cây là 0,5 mg/l khi sử dụng NAA và 1mg/l đối với IAA.  Định tính alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng bằng thuốc thử Wagner: Có sự hiện diện của alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa. Lượng alkaloid khác nhau tùy theo thời gian nuôi cấy. Giai đoạn cây in vitro tạo nhiều alkaloid nhất là sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Lượng alkaloid được phát hiện nhiều nhất ở mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.  Thử nghiệm ly trích alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa Quy trình ly trích alkaloid từ mẫu khô cho kết quả phân tích trên máy CE tốt hơn so với quy trình ly trích alkaloid từ mẫu tươi, hơn nữa mẫu được bảo quản dễ dàng với phương pháp ly trích bằng vật liệu khô và phương pháp này có thể định danh được alkaloid nếu dựa vào píc alkaloid chuẩn.  Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây in vivo Hàm lượng alkaloid ở mẫu cây ngoài đồng thu được thấp hơn so với mẫu cây nuôi cấy mô, đặc biệt là các tiền chất quan trọng như catharanthine và vindoline. 57 Việc nuôi cấy cây in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng bước đầu thể hiện khả năng tăng sinh tổng hợp alkaloid ở cây Trường xuân hoa.  Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng kĩ thuật điện di mao quản Lượng vindoline cao nhất thu được trong cây Trường xuân hoa ở 7 ngày tuổi và lượng catharanthine cao nhất thu được ở cây 28 ngày tuổi. 5.2. Đề nghị Trường xuân hoa là một giống cây dược liệu có thể sản sinh các các alkaloid quý có tác dụng trị liệu cao. Nên việc tìm hiểu các kĩ thuật nuôi cấy nhanh và tạo ra một lượng lớn cây in vitro có khả năng tích lũy alkaloid cao rất có ý nghĩa do đó tôi xin đề nghị một số hướng nghiên cứu tiếp theo: Cần tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid trong từng bộ phận của cây, từ đó xác định bộ phận sản xuất lượng alkaloid nhiều. Khảo sát khả năng cảm ứng hình thành alkaloid bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các yếu tố sinh học và hóa học có khả năng ảnh hưởng đến sự tăng sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp như chất kích thích sinh trưởng IAA, methyle jasmonat, nấm Trichoderma… 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Vương Văn Ánh, Nguyễn Minh Đức, Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Võ Văn Lẹo, Bùi Mỹ Linh, Ngô Thị Xuân Mai, Phạm Đông Phương, Phạm Thanh Tâm, Hùynh Ngọc Thụy, Võ Thị Bạch Tuyết, 2006. Giáo trình thực tập dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa dược, Đại học Y dược, TP. Hồ Chí Minh, tr50 - 72. 2. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ. Bài giảng chiết xuất dược liệu, trường đại học Y dược, TP. Hồ chí Minh, trang10. 3. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học. 4. Nguyễn Ngọc Hồng, 2004. Bước đầu khảo sát hợp chất trao đổi bậc hai bằng kĩ thuật nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây dừa cạn Catharanthus roeus. Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh, 2002. Bài giảng dược liệu, tập 2. Nhà xuất bản y học Hà Nội. 6. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 7. Trần Thị Lệ Minh, 2006. Giáo trình hoạt chất thứ cấp thực vật. Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm. TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000. Các phương pháp nhận danh trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Học phần cao học chuyên ngành hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, Việt Nam. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 9. Aniszewski Tadeusz, 2007. Alkaloids - Secrets of life. Alkaloid Chemistry, Biological Significance. Applications and Ecological Role, 335 pages 10. Facchini J. Peter, 2001. Alkaloid biosynthesis in plants: Biochemistry, Cell Biology, Molecular Regulation, and Metabolic Engineering Applications. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: p29 – 66. 59 11. Inhou Chu, Bodnar A. Joy, White L. Earl, Bowman N. Robert, 1996. Quantification of vincristine and vinblastine in Catharanthus roseus plants by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A, p281- 288. 12. Jian Zhao, Wei-Hua Zhu, Qiu Hu, 2001. Enhanced cathanthine production in Catharanthus roseus cell culture by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors. Enzyme and Microbial Technology 28: p673 – 681. 13. Jorgenson J.W. and Lukacs K.D, 1981. High resolution separation based on Electrophoresis and Electroosmosis. J Chromatogr 218 : p209 - 216. 14. Klocke A. J., Balandrin F. M., Wurtele E. S., Bollinger W. H., 1985. Natural Plant Chemicals: Sources of Industrial and Medicinal Materials. Science 228: p1154-1160. 15. Kutchan Toni M., 1995. Alkaloid Biosynthesis -The Basis for Metabolic Engineering of Medicinal Plants. The Plant Cell, Vol. 7, p1059 - 1070. 16. Luijendijk J. C. Tues, ed Van Der Meijden, and Rob Verpoorte, 1996. Involvement of strictosidine as a defensive chemical in Catharanthus roeus. Journal of Chemical Ecology, Vol. 22, No. 8: p1356 – 1366. 17. Milesi S., Bourgaud F., Gravot A., Gontier E., 2001. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: p839 – 851. 18. Marmont M. A. and Damasio E. E., 1967. The Effects of Two Alkaloids Derived from Vinca Rosea on the Malignant Cells of Hodgkin’s Disease, Lymphosarcoma and Acute Leukemia in Vivo. The Journal of Hematology 29: p1- 21 19. Tran Thi Le Minh, 2006. Etude de la croissance et la mise en place de la methode de dosage des alcaloides indolique chez le. Laboratoire d’Agronomie et Environnement. Thèse, 20 pages. 20. Tikhomiroff C., Jolicoeur M., 2002. Screening of Catharanthus roseus secondary metabolites by high – performance liquid chromatography. Journal of Chromatography: p87 – 93. 21. Zenk, Eds. Barz, W., Reinhard, E., M.H., 1977. Plant Tissue Culture and Its Bio-technological Application, p. 27. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 60 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 22. 23. 24. 25. 26. Masanaru Misawa, Plant tissue culture: an alternative for production of useful metabolite. Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome,1994. 27. www.uic.edu/pharmacy/courses/phar331/PHAR331.00.doc Dr. A. D. Kinghorn, PHAR331 - Fundamentals of Drug Action I- Lectures on Natural Products 28. Molecular structure of Vinblastine and vincristine 29. Vinblastine, Cancerquest, Emory University 30. 31. jY0NDAmZ3JvdXBpZD0yOSZraW5kPSZrZXl3b3JkPQ==&page=4 32. Wang Miao * , LI Qiu-Rong,Transient Expression of strictosidine Synthase in Tobaco leaves by Vacumm infiltration. Institute of Applied Ecology, the Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China. 33. Classification: Catharanthus roseus (L.) G. Don PHỤ LỤC 1 Thành phần môi trƣờng MS ( Murashige và Skoog, 1962) Agar 7,5 g/l pH môi trƣờng ( trước khi hấp) 5,8 Nguyên tố Nồng độ (mg/l) Nguyên tố đa lƣợng CaCl2 332,02 KNO3 1900,00 KH2PO4 170,00 NH4NO3 1650,00 MgSO4.7H2O 180,54 Nguyên tố vi lƣợng CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 H3BO3 6,20 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 Na2MoO4.H2O 0,25 ZnSO4.H2O 8,60 Vitamine & aminoacid Glycine 2,00 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10 FeNaEDTA 36,70 PHỤ LỤC 2 1.Kết quả thống kê chiều cao cây Trƣờng xuân hoa in vitro 7 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 16.66667 1 16.666667 .893 .3590 Within groups 970.14815 52 18.656695 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 986.81481 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for 7NGAY.DAITHAN by 7NGAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 27.407407 .8256212 .8312573 26.227656 28.587159 2 27 26.296296 .8368555 .8312573 25.116545 27.476048 -------------------------------------------------------------------------------- Total 54 26.851852 .5877877 .5877877 26.017642 27.686062 Multiple range analysis for 7NGAY.DAITHAN by 7NGAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 27 26.296296 X 1 27 27.407407 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 1.11111 2.35950 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 14 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 121.5000 1 121.50000 2.875 .0960 Within groups 2197.9259 52 42.26781 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2319.4259 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC14NGAY.DAITHAN by DC14NGAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 40.037037 1.1391523 1.2511892 38.261303 41.812771 2 27 37.037037 1.3539869 1.2511892 35.261303 38.812771 -------------------------------------------------------------------------------- Total 54 38.537037 .8847243 .8847243 37.281403 39.792671 Multiple range analysis for DC14NGAY.DAITHAN by DC14NGAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 27 37.037037 X 1 27 40.037037 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 3.00000 3.55147 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 21 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 3.6296 1 3.629630 .128 .7257 Within groups 1474.0741 52 28.347578 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 1477.7037 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC21DAY.DAITHAN by DC21DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 45.185185 .9168213 1.0246513 43.730962 46.639409 2 27 44.666667 1.1221672 1.0246513 43.212443 46.120890 -------------------------------------------------------------------------------- Total 54 44.925926 .7245379 .7245379 43.897635 45.954217 Multiple range analysis for DC21DAY.DAITHAN by DC21DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 27 44.666667 X 1 27 45.185185 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.51852 2.90845 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 28 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .0185 1 .018519 .000 .9841 Within groups 2332.0741 52 44.847578 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2332.0926 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC28DAY.DAITHAN by DC28DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 47.111111 1.3891453 1.2888062 45.281989 48.940233 2 27 47.148148 1.1799654 1.2888062 45.319026 48.977270 -------------------------------------------------------------------------------- Total 54 47.129630 .9113236 .9113236 45.836245 48.423014 Multiple range analysis for DC28DAY.DAITHAN by DC28DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 47.111111 X 2 27 47.148148 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.03704 3.65824 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 35 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 29.6296 1 29.629630 .725 .4075 Within groups 2125.4074 52 40.873219 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2155.0370 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC35DAY.DAITHAN by DC35DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 49.666667 1.3888034 1.2303751 47.920472 51.412861 2 27 51.148148 1.0482705 1.2303751 49.401954 52.894342 -------------------------------------------------------------------------------- Total 54 50.407407 .8700066 .8700066 49.172662 51.642153 Multiple range analysis for DC35DAY.DAITHAN by DC35DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 49.666667 X 2 27 51.148148 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.48148 3.49239 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 2. Kết quả thống kê số rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro 14 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 12.518519 1 12.518519 44.161 .0000 Within groups 14.740741 52 .283476 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 27.259259 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR14DAY.SORE by SR14DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 2.2222222 X 2 27 3.1851852 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.96296 0.29084 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 21 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 20.166667 1 20.166667 16.734 .0001 Within groups 62.666667 52 1.205128 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 82.833333 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR21DAY.SORE by SR21DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 3.0000000 X 2 27 4.2222222 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.22222 0.59968 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference 28 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 25.351852 1 25.351852 47.332 .0000 Within groups 27.851852 52 .535613 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 53.203704 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR28DAY.SORE by SR28DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 4.7407407 X 2 27 6.1111111 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.37037 0.39979 * -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference 35 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 71.185185 1 71.185185 105.873 .0000 Within groups 34.962963 52 .672365 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 106.14815 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR35DAY.sore by SR35DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 27 6.0370370 X 1 27 8.3333333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 2.29630 0.44793 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 3. Kết quả thống kê chiều dài rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro 14 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 389.35185 1 389.35185 1333.293 .0000 Within groups 15.18519 52 .29202 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 404.53704 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for DR14DAY.DAIRE by DR14DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 2.2222222 X 2 27 7.5925926 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -5.37037 0.29520 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 21 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.166667 1 4.1666667 7.927 .0069 Within groups 27.333333 52 .5256410 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 31.500000 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for DR21DAY.DAIRE by DR21DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5.2222222 X 2 27 5.7777778 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.55556 0.39605 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 28 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 266.66667 1 266.66667 216.166 .0000 Within groups 64.14815 52 1.23362 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 330.81481 53 0 missing value(s) have been excluded Multiple range analysis for DR28DAY.DAIRE by DR28DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5.629630 X 2 27 10.074074 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -4.44444 0.60673 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 35 ngày Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 317.79630 1 317.79630 157.108 .0000 Within groups 105.18519 52 2.02279 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 422.98148 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for DR35DAY.daire by DR35DAY.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 7.592593 X 2 27 12.444444 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -4.85185 0.77692 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4. XỬ LÝ SỐ LIỆU CÂY TRUỜNG XUÂN HOA IN VITRO TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỨA NAA CAO CÂY TRÊN MOI TRUƠNG CÓ NAA Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1124.938 5 224.98765 2.785 .0194 Within groups 12603.704 156 80.79297 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 13728.642 161 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for CCNAA.Caocay by CCNAA.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 49.296296 X 5 27 49.518519 X 2 27 51.814815 XX 1 27 51.851852 XX 3 27 55.666667 X 4 27 55.925926 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.03704 4.83333 1 - 3 -3.81481 4.83333 1 - 4 -4.07407 4.83333 1 - 5 2.33333 4.83333 1 - 6 2.55556 4.83333 2 - 3 -3.85185 4.83333 2 - 4 -4.11111 4.83333 2 - 5 2.29630 4.83333 2 - 6 2.51852 4.83333 3 - 4 -0.25926 4.83333 3 - 5 6.14815 4.83333 * 3 - 6 6.37037 4.83333 * 4 - 5 6.40741 4.83333 * 4 - 6 6.62963 4.83333 * 5 - 6 0.22222 4.83333 * denotes a statistically significant difference. SỐ RỄ TRÊN MOI TRUƠNG CÓ NAA Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 216.27160 5 43.254321 147.401 .0000 Within groups 45.77778 156 .293447 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 262.04938 161 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SRNÁA.SORE by SRNAA.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 .6666667 X 5 27 1.9259259 X 1 27 2.9259259 X 2 27 3.0000000 X 4 27 3.6666667 X 3 27 4.1851852 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.07407 0.29129 1 - 3 -1.25926 0.29129 * 1 - 4 -0.74074 0.29129 * 1 - 5 1.00000 0.29129 * 1 - 6 2.25926 0.29129 * 2 - 3 -1.18519 0.29129 * 2 - 4 -0.66667 0.29129 * 2 - 5 1.07407 0.29129 * 2 - 6 2.33333 0.29129 * 3 - 4 0.51852 0.29129 * 3 - 5 2.25926 0.29129 * 3 - 6 3.51852 0.29129 * 4 - 5 1.74074 0.29129 * 4 - 6 3.00000 0.29129 * 5 - 6 1.25926 0.29129 * * denotes a statistically significant difference. . DÀI RỄ TRÊN MOI TRUỜNG CÓ NAA Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 462.86420 5 92.572840 187.280 .0000 Within groups 77.11111 156 .494302 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 539.97531 161 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for DRNAA.DAIRE by DRNAA.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 1.1111111 X 5 27 2.4444444 X 1 27 4.1851852 X 2 27 5.2222222 X 3 27 5.4814815 XX 4 27 5.6296296 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -1.03704 0.37806 * 1 - 3 -1.29630 0.37806 * 1 - 4 -1.44444 0.37806 * 1 - 5 1.74074 0.37806 * 1 - 6 3.07407 0.37806 * 2 - 3 -0.25926 0.37806 2 - 4 -0.40741 0.37806 * 2 - 5 2.77778 0.37806 * 2 - 6 4.11111 0.37806 * 3 - 4 -0.14815 0.37806 3 - 5 3.03704 0.37806 * 3 - 6 4.37037 0.37806 * 4 - 5 3.18519 0.37806 * 4 - 6 4.51852 0.37806 * 5 - 6 1.33333 0.37806 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. . 5. XỬ LÝ SỐ LIỆU CÂY TRUỜNG XUÂN HOA IN VITRO TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỨA IAA CAO CÂY TRÊN MOI TRUƠNG CÓ IAA Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 560.9938 5 112.19877 2.637 .0256 Within groups 6638.3704 156 42.55366 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 7199.3642 161 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for CCIAA.CAOCAY by CCIAA.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 46.333333 X 5 27 48.740741 XX 4 27 49.407407 XX 3 27 50.407407 X 2 27 51.518519 X 1 27 51.851852 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 2.44444 3.50775 1 - 3 1.44444 3.50775 1 - 4 0.33333 3.50775 1 - 5 3.11111 3.50775 1 - 6 5.51852 3.50775 * 2 - 3 -1.00000 3.50775 2 - 4 -2.11111 3.50775 2 - 5 0.66667 3.50775 2 - 6 3.07407 3.50775 3 - 4 -1.11111 3.50775 3 - 5 1.66667 3.50775 3 - 6 4.07407 3.50775 * 4 - 5 2.77778 3.50775 4 - 6 5.18519 3.50775 * 5 - 6 2.40741 3.50775 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference * denotes a statistically significant difference. SỐ RỄ TRÊN MOI TRUƠNG CÓ IAA One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: SRIAA.SORE Level codes: SRIAA.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 191.30864 5 38.261728 104.242 .0000 Within groups 57.25926 156 .367047 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 248.56790 161 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SRIAA.SORE by SRIAA.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 2.5925926 X 5 27 2.6666667 XX 1 27 2.9259259 X 3 27 4.0370370 X 2 27 4.2962963 X 4 27 5.6296296 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.37037 0.32578 * 1 - 3 -1.11111 0.32578 * 1 - 4 -2.70370 0.32578 * 1 - 5 0.25926 0.32578 1 - 6 0.33333 0.32578 * 2 - 3 0.25926 0.32578 2 - 4 -1.33333 0.32578 * 2 - 5 1.62963 0.32578 * 2 - 6 1.70370 0.32578 * 3 - 4 -1.59259 0.32578 * 3 - 5 1.37037 0.32578 * 3 - 6 1.44444 0.32578 * 4 - 5 2.96296 0.32578 * 4 - 6 3.03704 0.32578 * 5 - 6 0.07407 0.32578 * denotes a statistically significant difference. DÀI RỄ TRÊN MOI TRUỜNG CÓ IAA Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 88.938272 5 17.787654 41.902 .0000 Within groups 66.222222 156 .424501 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 155.16049 161 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for DRIAA.DAIRE by DRIAA.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 3.7777778 X 1 27 4.1851852 X 5 27 4.6666667 X 2 27 4.8148148 X 3 27 5.6666667 X 4 27 5.8518519 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.62963 0.35035 * 1 - 3 -1.48148 0.35035 * 1 - 4 -1.66667 0.35035 * 1 - 5 -0.48148 0.35035 * 1 - 6 0.40741 0.35035 * 2 - 3 -0.85185 0.35035 * 2 - 4 -1.03704 0.35035 * 2 - 5 0.14815 0.35035 2 - 6 1.03704 0.35035 * 3 - 4 -0.18519 0.35035 3 - 5 1.00000 0.35035 * 3 - 6 1.88889 0.35035 * 4 - 5 1.18519 0.35035 * 4 - 6 2.07407 0.35035 * 5 - 6 0.88889 0.35035 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. PHỤ LỤC 3 Khối lƣợng của cây Trƣờng xuân hoa trƣớc và sau khi đông khô Hàm lượng nước trong mẫu cây tươi = (0,683 - 0,088)*100/0,683 =87,1% 0,6 g vật liệu tươi = 0,6*(100 – 87,1)/100 = 0,0774 (g) =77,4 (mg) chất khô x (mg) alkaloid/ 0,6 (g) vật liệu tươi = x*100/ 77,4(mg) alkaloid/100 mg chất khô PHỤ LỤC 4 1. Kết quả chất chuẩn catharanthine (20mg/l) khi phân tích bằng CE Trọng lượng tươi Trọng lượng khô 0,5287 0,0673 0,5202 0,1117 0,4794 0,0589 0,5394 0,0645 0,4653 0,0558 0,471 0,064 1,043 0,1259 0,8399 0,1006 0,7234 0,0937 0,5919 0,0797 0,8955 0,1154 1,10151 0,119 Trung bình 0,6832675 0,088041667 2. Kết quả chất chuẩn vindoline (20mg/l) khi phân tích bằng CE 3. Kết quả của mẫu Trƣờng xuân hoa khô khi phân tích bằng CE 4. Kết quả CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa tƣơi 5. Kết quả CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa in vitro 6. Kết quả CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa in vivo 7. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 7 ngày tuổi 8. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 14 ngày tuổi 9. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 21 ngày tuổi 10. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 28 ngày tuổi 11. Sắc kí đồ CE phân tích mẫu Trƣờng xuân hoa 35 ngày tuổi

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfCAO THI THANH LOAN.pdf
Tài liệu liên quan