Khóa luận Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR

ment protein (Jeong- Ki Kim và cs, 2005). Bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta phát hiện những tiểu phần của virus hiện diện trong những khoang nhỏ. Kháng nguyên virus có thể phát hiện ngay 6 giờ sau gây nhiễm (Dea, 2000; Pol, 1997). Virus PRRS đƣợc lắp ráp khi nucleocapsid xuất hiện trong khoang của lƣới nội chất không hạt hay vùng Golgi hoặc cả hai. Robison và cs (1997) đã tìm thấy trong tế bào gây nhiễm MARC-145 protein M định vị tại bộ Golgi và protein N thì định vị quanh nhân và hạch nhân. Lớp vỏ bọc ngoài (envelope) chủ yếu đƣợc hình thành trong khoang của lƣới nội chất và cũng là nguyên nhân làm cho bào quan này phình to ra (Dea và cs, 1995; Mardassi và cs, 1994; Pol, 1997). Sau khi hình thành, virion đƣợc tập hợp lại và di chuyển ra màng bào tƣơng để giải phóng virus (Meulenberg, 2000). Theo Pol và Wagenaar, 1992; 15 Pol, 1997, sau khi nuôi cấy 9-12 giờ, các tế bào bị xâm nhiễm sẽ vỡ ra và giải phóng các hạt virus hoàn chỉnh (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006). Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm PRRSV (Nguồn: ) Virus PRRS mã hoá các sản phẩm gen mà chúng có thể gây ra apoptosis, một kiểu chết phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng nội tại và loại bỏ những tế bào tổn thƣơng và già cỗi. Tuy nhiên cơ chế của hiện tƣợng này chƣa đƣợc biết rõ. Ngƣời ta xác định đƣợc protein GP5 của virus là tác nhân gây ra apoptosis (Meulenberg, 2000). Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh (Suarez, 2000). Virus đạt đỉnh cao lúc 24- 48 giờ và có thể duy trì tới 60- 70 giờ sau nuôi cấy (Meng và cs, 1996). Theo Kim và cs (1993), trong quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MA- 104 (MARC-145), hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48- 72 giờ nuôi cấy. Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhƣng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon và cs, 1992). Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra nhƣ: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy. Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày. Kết quả cũng tƣơng tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm virus PRRS (Pol và 16 Wagenaar, 1992; Wensvoort, 1992; Pol, 1997) (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006). Các dòng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM. Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC-145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung và cs, 2002). Một nghiên cứu khác của Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào. Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Yoon, 2003). 2.3.2.4. Sức đề kháng Virus PRRS tồn tại đƣợc trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhƣng khoảng 90% khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40C. khả năng hồi phục của virus đã đƣợc báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 37 0C và 6 ngày ở 210C. Virus bền vững ở pH từ 6,5 -7,5 nhƣng chết nhanh khi pH 7,65 (Benfield và cs, 1999). Nhƣ vậy, virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và các chất tan dầu mỡ nhƣ chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh). 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS 2.3.3.1. Loài mắc bệnh Loài heo, cả heo nhà lẫn heo rừng đƣợc cho là loài mắc bệnh duy nhất. Tuy nhiên, vịt trời bài thải virus qua phân khi gây nhiễm thực nghiệm với virus PRRS bằng nƣớc uống, chứng tỏ vịt trời cũng mẫn cảm với virus PRRS (Ausvetplan, 2004). 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan - Trực tiếp: do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe từ mũi- mũi, qua giao phối, thú mẹ truyền virus cho thú con qua tử cung. Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn giữa thai kỳ trở đi. Lợn trƣởng thành có thể bài thải virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai có thể bài thải virus trong1-2 tháng. 17 - Gián tiếp: qua chất bài tiết nhƣ dịch mũi, phân hoặc qua những giọt khí dung. Theo Hoàng Văn Năm (2001), ngoài việc vận chuyển heo bệnh vào đàn cảm nhiễm và lây lan qua không khí thì ít có bằng chứng nói về cách truyền lây khác. Tuy nhiên, ngƣời ta còn thấy việc lây lan trong đàn giống còn theo con đƣờng truyền tinh dịch. Ở những nọc nhiễm bệnh, tinh dịch trong thời kỳ virus huyết có thể gây bệnh cho đàn chƣa có miễn dịch với mức độ biểu hiện tuỳ thuộc vào kích cỡ đàn, mật độ nuôi và tình trạng vệ sinh. Nhƣ vậy, heo nọc là đối tƣợng truyền lây virus quan trọng trong đàn. 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập Virus xâm nhập qua đƣờng hô hấp, gieo tinh, tiêu hoá (Ausvetplan, 2004), chất chứa mầm bệnh. Virus có nhiều ở chất tiết dịch mũi, tinh dịch và phân của heo bệnh. Sau cảm nhiễm, heo bệnh có thể chứa virus trong huyết thanh đến 210 ngày, trong tinh dịch 92 ngày, trong dịch mũi 21 ngày và trong dịch hầu họng đến 157 ngày. Trong đó, tinh dịch và dịch mũi là hai nguồn lây nhiễm đáng quan tâm (dẫn liệu Trần Thị Bích Huyền, 2005). 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên trong đại thực bào ở tiểu phế nang và trong tế bào nội mô của hệ thống lƣới võng nội. Tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS. Quá trình virus nhân lên và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tế bào nội mô của tĩnh mạch, giảm hàm lƣợng protein huyết tƣơng đến các mô và tạo các cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau. Những biểu hiện khác nhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bào nội mô và tế bào lympho (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên heo con, làm giảm khả năng đề kháng của vật chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc xâm nhập của các virus khác. Hầu hết sự nhiễm kế phát đƣợc quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đƣờng hô 18 hấp. Rõ ràng là nếu những tế bào bảo vệ đầu tiên nhƣ PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn và virus gây bệnh (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Theo Trần Thanh Phong (1996), do gây suy giảm miễn dịch, bệnh PRRS mở đƣờng cho những vi sinh vật cơ hội nhƣ: Pasteurella multosida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, A. pleuropneumoniae, Chlamydia psittaci, Leptospira interrogans, virus giả dại, virus cúm, Enterovirus, Parvovirus… Trên nái mang thai, virus ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào bạch cầu, tế bào đơn nhân trong dòng máu để đến cơ quan sinh sản. Cảm nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình mang thai nhƣng biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào lớn vào giai đoạn nhiễm trùng của bào thai và độc lực của chủng virus gây bệnh. Nhiễm trùng ở giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của kỳ mang thai không có hay chỉ có tác động nhẹ so với cảm nhiễm ở giai đoạn sau. Cảm nhiễm xảy ra trong thời kỳ phôi thƣờng có mức độ biểu hiện bệnh rất thấp vì tế bào phôi chƣa biệt hoá, không thích hợp cho sự nhân lên của virus. Mặt khác, lúc này trứng thụ tinh chƣa gắn chặt chẽ với nội mạc tử cung nên sự truyền virus từ mẹ sang phôi bị hạn chế. Trong khi ở giai đoạn sau của kỳ có mang, nhau thai và mạch máu nuôi thai rất phát triển, nhau thai trở thành bộ phận trao đổi chất cần thiết, đồng thời là cầu nối truyền virus và kháng thể chống virus từ mẹ sang thai. Virus có thể qua nhau ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào khác của thú mẹ. Nhiễm trùng giai đoạn này tạo ra nhiều vết bong tróc nhỏ trên tế bào biểu mô nhau thai và bệnh tích hoại tử động mạch cuống rốn, từ đó làm cho bào thai bị thiếu dƣỡng chất, thiếu O2, gây sảy thai kỳ cuối, heo con sinh ra yếu ớt, dị tật và tăng tỷ lệ thai chết tƣơi khi sanh (Prieto và cs, 2000; dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Nhiễm bệnh dai dẳng cũng là một đặc trƣng của Arterivirus, sự tồn tại dai dẳng gây ra nhiễm bệnh âm ỉ, virus hiện diện ở mức độ thấp trong cơ thể thú và giảm dần theo thời gian (Trần Đức Minh). Theo R.Allende và cs (2000) vào ngày 150 sau gây nhiễm thực nghiệm không phân lập đƣợc virus bằng nuôi cấy tế bào và không phát hiện đƣợc RNA của virus bằng phƣơng pháp RT-PCR. 19 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS (Nguồn:Rosssow, 1998) Virus PRRS Lây lan trực tiếp qua đƣờng tiêu hoá, gieo tinh và hô hấp Nhân lên trong màng nhày phổi hoặc đại thực bào Virus tấn công vào hạch lâm ba Vào máu gây virus huyết Phân bố đến các hệ thống của cơ thể và tới các tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào Biểu hiện lâm sàng Nái : Sảy thai Phối không đậu Heo sơ sinh Khó thở, dấu hiệu thần kinh và tỷ lệ chết cao Heo sau cai sữa Gia tăng tỷ lệ chết, có biểu hiện hô hấp Heo thịt Sốt, ăn ít Nọc Ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh 20 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ƣớc tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng. Lý do cho việc này vẫn chƣa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dƣơng tính nhƣng không có biểu hiện lâm sàng (phòng Dịch tễ, Cục Thú y). Theo Trần Đức Minh thì mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lƣợng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao để tái sản hữu hiệu hơn trong cơ thể ký chủ. Bệnh tích  Bệnh tích đại thể: - Da có thể xuất huyết, thâm tím do chảy máu trong mô. - Phổi tụ huyết, viêm phổi thuỳ trƣớc với những ổ viêm đốm màu xám, có nhiều dịch ở phổi và màng bao tim. - Có những ổ hoại tử trên nhau thai của nái bệnh.  Bệnh tích vi thể: - Viêm phổi hoại tử. - Có sự thoái hoá các đại thực bào ở tiểu phế nang. Hình 2.4. Triệu chứng tai xanh Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: và 2.3.5. Chẩn đoán 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 21 Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thƣờng thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS. Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi: Tỷ lệ chết lúc sinh >20% Tỷ lệ sảy thai >8% Tỷ lệ heo con chết trƣớc khi cai sữa >26% Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vƣợt quá 25%. Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phƣơng pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 2.3.5.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay) Đây là phản ứng đầu tiên đƣợc sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS đƣợc gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ đƣợc gây nhiễm với PRRSV và đƣợc ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và đƣợc cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30-50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong 30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA đƣợc sử dụng nhiều ở châu âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, ngƣời ta thƣờng sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lƣợng kháng thể bảo vệ. 2.3.5.2.1.2. Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay) 22 Giống nhƣ trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang. sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn. 2.3.5.2.1.3. Phản ứng SN (Serum Neutralizing) Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, đƣợc sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhƣợc điểm của phản ứng này là đắc tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 và dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 2.3.5.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phƣơng pháp này là dễ cho kết quả dƣơng tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả đƣợc ghi nhận là dƣơng tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nƣớc Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên Phƣơng pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể đƣợc sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô. 23  Phƣơng pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phƣơng pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần đƣợc lấy và làm lạnh nhanh.  Phƣơng pháp IHC cũng đƣợc thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phƣơng pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã đƣợc cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhƣng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phƣơng pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR đƣợc sử dụng, hầu hết chúng đƣợc sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung và cs (2002) đã sử dụng phƣơng pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) . Fun in wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thƣơng phẩm và trong tinh dịch con đực. Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chƣa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải đƣợc thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau. 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào Trong phân lập virus, cũng nhƣ các phƣơng pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách). 24 Trong số đó thì dịch phế nang và huyết thanh đƣợc đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhƣng đối với thú già thì lại có nhiều PRRSV trong mô hơn trong máu. Đối với các trƣờng hợp sảy thai ở thời kỳ cuối hay sinh sớm thì nên lấy mẫu ở những heo con sinh ra yếu, trƣớc khi cho bú hơn là thai khô, thai chết lƣu. Việc phân lập virus đối với những thú nhiễm bệnh mãn tính thì hạch amiđan, dịch rữa khí quản là những mẫu có khả năng nuôi cấy tốt hơn so với mẫu huyết thanh và phổi. Một điểm quan trọng khác cần chú ý là nhiệt độ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển và phân lập virus. Các mẫu bệnh phẩm cần phải đƣợc bảo quản ở 40C hay thấp hơn trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm và thời gian giữ mẫu ở nhiệt độ này tốt nhất là không quá 48 giờ. Những mẫu bệnh phẩm lƣu giữ trong một thời gian dài bắt buộc phải đƣợc bảo quản ở -700C, không đƣợc đông và rã đông mẫu nhiều lần. Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621). Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu đƣợc dùng là huyết thanh. Còn Han-Kook Chung và cs (2002) cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145, ngƣợc lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM. 25 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ 3/2007 đến 8/2007 3.1.2. Địa điểm  Địa điểm lấy mẫu: một số trại heo tại TP HCM và các vùng lân cận.  Địa điểm xét nghiệm: - Phòng nuôi cấy tế bào, Bộ Môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi- Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM. - Trung Tâm Phân Tích Hoá Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM. 3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu 3.2.1. Đối tƣợng Heo nái rối loạn sinh sản, thai chết sau khi sinh và heo sau cai sữa có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh. 3.2.2. Số lƣợng mẫu 11 mẫu gồm: - 6 mẫu huyết thanh. - 3 mẫu phổi. - 2 mẫu hạch phổi. 3.3. Nội dung nghiên cứu  Xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên loại lọ nuôi cấy 25cm2 với những lƣợng tế bào là 7.105 và 106. 26  Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng MARC-145 từ các loại mẫu: huyết thanh, phổi, hạch phổi của đối tƣợng lấy mẫu.  Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào MARC- 145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT- PCR. 3.4. Vật liệu và dụng cụ 3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus PRRS Các dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, bình đá… Tủ cấy; tủ ấm CO2. Kính hiển vi soi ngƣợc. Máy ly tâm.Ống ly tâm vô trùng. Lọ nuôi cấy tế bào 25cm2. Pipette. 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC- 145  Dòng tế bào và gốc virus chuẩn do AAHL (Australian Animal Health Laboratory) cung cấp.  Môi trƣờng phát triển: trong 100ml môi trƣờng gồm: - EMEM (Egle Minimun Essential Medium): 86,25 ml - Huyết thanh thai bò (FBS): 8ml. - Glutamine 2,92%: 1ml. - Na Pyruvate 100mM: 1ml. - LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml. - Sodium Bicarbonate 7%: 1ml. - Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 40000UI Penicillin, 40000µg Streptomycin): 0,25ml. - Kháng nấm (trong 1ml có 500µg Amphotericin B): 0,5ml  Môi trƣờng duy trì: giống môi trƣờng phát triển nhƣng chỉ dùng 2% huyết thanh thai bò.  PBSA (Phosphate buffer saline solution A).  Trypsin 1X. 27  Thuốc nhuộm Trypan Blue 0,22%. 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR - Tủ cấy vô trùng. - Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C). - Tủ -700C (Sanyo Ultra Low). - Tủ -200C (CFC Free Sanyo Brandt) - Tủ lạnh. - Máy vi sóng (Electrolux). - Máy chụp gel (Biorad). - Máy PCR (Biorad). - Máy Vortex. - Bộ nguồn và bồn điện di. - Micropipet, đầu tuýp và eppendorf. 3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA Vật liệu và hoá chất trong phƣơng pháp không sử dụng TRIzol - Dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2-mercaptoethanol, pH 7.0). - Phenolchloroform. - Isopropanol. - Ethanol 75%. - RNAse - free water. 3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR - Nƣớc không có Rnase. - Tfl DNA Polymerase (Promega). - dNTPs (Promega). - Cặp mồi. - RNA mẫu chuẩn. - RNA thu đƣợc từ mẫu ly trích. - AMV reverse transcriptase (Promega). 28 - MgSO4 (Promega). - AMV/Tfl reaction buffer (Promega). 3.4.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR - Agarose (Biorad). - TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, nƣớc cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng). - Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE). - Ladder 100bp. - Ethidium bromide. 3.5. Phƣơng pháp tiến hành 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Huyết thanh: cố định heo, lấy máu khoảng 4- 5ml tại tĩnh mạch cổ (heo cai sữa), tĩnh mạch tai (heo nái). Sau đó cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và chắt lấy huyết thanh vào eppendorf vô trùng. Hạch phổi, phổi (chỉ lấy ở heo chết sau khi sinh và heo sau cai sữa): lấy mẫu hạch phổi, phổi cho vào bao nylon sạch, buộc chặt và cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu sau khi lấy đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm và đƣợc xử lý tiến hành phân lập virus ngay. Nếu mẫu chƣa đƣợc phân lập ngay sẽ đem bảo quản ở -700C tại Trung Tâm Phân Tích Hoá Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM. 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145 3.5.2.1. Hồi phục tế bào Tế bào đƣợc trữ dƣới dạng đông lạnh ở trong nitơ lỏng, khi muốn sử dụng thì phải hồi phục lại tế bào. Các bƣớc hồi phục tế bào: Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nƣớc ấm 370C, chờ đến khi nƣớc đá tan hết thì lấy ra. Dùng pipette chuyển lƣợng tế bào bên trong lọ sang ống ly tâm. Cho thêm 10ml môi trƣờng phát triển vào, chầm chậm từng giọt một. Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa đều với nhau. 29 Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó bỏ phần nƣớc trên, búng đều vào đáy lọ ly tâm để các tế bào tách rời nhau. Cho 3ml môi trƣờng phát triển vào, dùng pipette trộn đều rồi hút khoảng 0,1ml ra để đếm. Cho tế bào vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 8-10ml môi trƣờng phát triển. Đƣa lọ tế bào vào tủ ấm ở 370C có bổ sung 5% CO2. Sau 24 giờ thì thay đổi môi trƣờng. 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào Khi tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành cấy chuyển.  Tách tế bào ra khỏi lọ Rút bỏ môi trƣờng trong lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào bằng 8-10ml PBSA, rồi rút bỏ. Cho vào 3ml trypsin, để trong tủ ấm 5 phút sau đó cho một tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay kia để đảm bảo tách ra thành những tế bào riêng lẻ. Bất hoạt trypsin bằng 3ml môi trƣờng phát triển, rồi rút cho vào ống ly tâm (loại 15ml). Dùng thêm 7ml môi trƣờng phát triển để rửa lại lọ nuôi cấy rồi hút cho vào ống ly tâm. Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó đổ phần nƣớc trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho các tế bào rời nhau. Cho vào ống ly tâm 3ml môi trƣờng phát triển, trộn đều bằng pipette rồi lấy ra 0,1ml để đếm tế bào.  Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ▫ Cách tiến hành Trộn 100µl huyễn dịch tế bào và 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha là 1/10). Đƣa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella. 30 Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L). Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer ▫ Cách tính kết quả Trong đó: C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng.  Cho lƣợng tế bào cần cấy chuyển vào trong lọ nuôi cấy mới đã có 8-10 ml môi trƣờng phát triển.  Đƣa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2.  Theo dõi cứ 3 giờ một lần sự phát triển của tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm 2 với những lƣợng tế bào 7.105 và 106. Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm staTGraphics Ver. 7,0. 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus Virus PRRS đƣợc phân lập theo sơ đồ 3.1. Số tế bào trong 1ml: C = n*d*10 4 4 31 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS. (ĐC: đối chứng. US: chủng Châu Mỹ. EU: chủng Châu Âu) Mẫu (huyết thanh, phổi, hạch phổi) xử lý mẫu Gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. … ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hàng ngày trong 7 ngày. Gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. … ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu Thu hoạch dịch tế bào Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày trong 7 ngày RT-PCR RT-PCR Ghi nhận kết quả gây nhiễm lần một Có bệnh tích tế bào. Bệnh tích tế bào nghi ngờ hoặc không có bệnh tích Thu hoạch dịch tế bào. Nhận định kết quả. Ghi nhận kết quả gây nhiễm lần hai 32  Phƣơng pháp xử lý mẫu để phân lập virus Mẫu hạch phổi, phổi đƣợc nghiền trong dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm nghiền trong 5ml PBS). Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vòng/phút trong 15 phút. Hút phần nƣớc trong cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản trong tủ -700C. Huyết thanh và mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ lọc qua lƣới lọc 0,2µm trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng tế bào.  Phƣơng pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất với các mẫu đã xử lý Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt lọ nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào. - Lấy lọ tế bào ra, thay môi trƣờng phát triển bằng môi trƣờng duy trì. - Gây nhiễm tế bào bằng mẫu huyết thanh, phổi, hạch phổi đã đƣợc xử lý với thể tích là 1ml. Lƣu ý khi đƣa mẫu vào môi trƣờng tế bào cần đƣa vào bề mặt khác bề mặt tế bào tăng trƣởng trong lọ nuôi cấy. - Cho lọ tế bào đã đƣợc gây nhiễm vào tủ ấm 370C có 5%CO2. Sau 24 giờ thay môi trƣờng duy trì. - Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày. Sau 7 ngày thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy.  Phƣơng pháp thu hoạch dịch tế bào - Để lọ tế bào sau khi gây nhiễm 7 ngày vào ngăn đá tủ lạnh cho đến khi tế bào và môi trƣờng đông thành đá, sau đó lấy ra đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong ra hết rồi để ở nhiệt độ phòng để rã đông tế bào và môi trƣờng. Lặp lại động tác trên thêm 2 lần nữa. - Hút toàn bộ môi trƣờng trong lọ tế bào vào một ống ly tâm. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy phần nƣớc bên trên cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -700C.  Phƣơng pháp gây nhiễm lần hai bằng dịch tế bào đã thu hoạch Các bƣớc thực hiện giống nhƣ gây nhiễm lần thứ nhất nhƣng thay mẫu huyết thanh, phổi và hạch phổi bằng dịch tế bào đã thu hoạch. 33 Xử lý mẫu  Phƣơng pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT- PCR đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.2 với các mẫu thu hoạch đƣợc sau hai lần gây nhiễm. Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR Để thực hiện phản ứng phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngƣợc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR một bƣớc nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Mẫu (Dịch tế bào) Ly trích RNA virus Kỹ thuật RT-PCR một bƣớc Điện di sản phẩm RT-PCR Nhuộm gel Quan sát kết quả điện di (dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad) 34 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong suốt thời gian tiến hành đề tài, kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc nhƣ sau 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 Để khảo sát đặc điểm phát triển của tế bào MARC-145 hiện có, chúng tôi ghi nhận thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) với hai mức tế bào ban đầu đƣa vào môi trƣờng là 7. 105 và 106, khảo sát đƣợc lặp lại 2 lần. Thời gian một lần cấy chuyển không những giúp xác định tính ổn định của tế bào mà còn có thể chủ động về thời gian phân lập virus. Trong quá trình thực hiện nuôi cấy tế bào MARC-145 ở bình flash 25 cm2, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 Lƣợng tế bào (tế bào/ml) Thời gian phát triển đầy bề mặt nuôi cấy (giờ) Lần 1 Lần 2 Trung bình 7.10 5 72.75 72 72.56 10 6 46.25 45.75 46 Qua bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy, khi thực hiện cấy chuyển tế bào MARC- 145 trên bình 25cm2, với lƣợng tế bào 7.105 thì trung bình sau 72,56 giờ tế bào sẽ phát triển đầy bề mặt nuôi cấy. Khi lƣợng tế bào là 106 thì thời gian tế bào tạo thành một lớp ngắn hơn, trung bình là 46 giờ. Kết quả này tƣơng đối phù hợp với kết quả của Hoàng Thanh Hải (2005) (70,5 giờ và 43,5 giờ) và của Võ Thị Đan Thanh (2006) với lƣợng tế bào 7.105 và 106 thì thời gian một lần cấy chuyển trung bình là 71 giờ và 45.5 giờ. Nhƣ vậy, sự phát triển của dòng tế bào MARC-145 chúng tôi đang sử dụng tƣơng đối ổn định có thể dùng để phân lập virus PRRS. 35 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 Với 11 mẫu (gồm 6 mẫu huyết thanh, 3 mẫu phổi và 2 mẫu hạch phổi) đƣợc lấy từ thai chết tƣơi và heo con yếu có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm virus PRRS, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Sau khi gây nhiễm, chúng tôi so sánh biểu hiện bệnh tích trên môi trƣờng tế bào đã đƣợc gây nhiễm với các mẫu đối chứng dƣơng và đối chứng âm bằng việc đánh giá tế bào chết sau khi gây nhiễm. Kết quả gây nhiễm lần một đƣợc ghi nhận ở bảng 4.2. Chúng tôi nhận thấy: Sau khi gây nhiễm 2 ngày, 1 mẫu hạch phổi trong số 5 mẫu phổi và hạch phổi đã có biểu hiện bệnh tích tế bào. Bệnh tích chủ yếu tế bào co tròn, chết và bong lên khỏi bề mặt nuôi cấy. Tỷ lệ tế bào chết tăng dần đến ngày thứ 7 là 85%. Kết quả của chúng tôi tƣơng tự nhƣ nhận xét của Võ Thị Đan Thanh (2006) về kiểu bệnh tích trên môi trƣờng tế bào. Tuy nhiên về thời gian và tỷ lệ tế bào chết khác nhau, điều này có thể do nhiều yếu tố ảnh hƣởng nhƣ địa điểm, thời gian và đời của tế bào MARC-145 chúng tôi sử dụng. Hai mẫu khác (1 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi) đƣợc chúng tôi xếp vào nhóm mẫu có biểu hện bệnh tích nghi ngờ sau lần gây nhiễm đầu tiên do tỷ lệ tế bào chết thấp (5-20%) và thời gian xuất hiện bệnh tích lâu (sau 5 ngày nuôi cấy). Toàn bộ 6 mẫu huyết thanh đều có kết quả giống đối chứng âm. Nhƣ vậy, trong tổng số 11 mẫu gây nhiễm lần đầu tiên, có 1 mẫu hạch phổi có biểu hiện bệnh tích tế bào, 1 mẫu phổi và 1 mẫu hạch phổi khác có bệnh tích ở dạng nghi ngờ, các mẫu còn lại đều giống đối chứng âm. Khi phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm hoặc không gây bệnh tích tế bào ở lần gây nhiễm đầu tiên, nhƣng ở lần gây nhiễm tiếp theo (passage) có thể xuất hiện bệnh tích (Murphy và cs, dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). Do đó, chúng tôi thu hoạch dịch tế bào và gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. 36 Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Loại mẫu Tỷ lệ tế bào hƣ họai sau khi gây nhiễm (%) Kết quả CPE 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày HT1 0 0 0 0 0 0 0 - HT2 0 0 0 0 0 0 0 - HT3 0 0 0 0 0 0 0 - HT4 0 0 0 0 0 0 0 - HT5 0 0 0 0 0 0 0 - HT6 0 0 0 0 0 0 0 - P1 0 0 0 0 0 0 0 P2 0 0 0 0 5 10 20 ± P3 0 0 0 0 0 0 0 - HP1 0 10 30 50 65 80 85 + HP2 0 0 0 0 5 10 15 ± HT: huyết thanh P: phổi HP: Hạch phổi CPE: Cytopathogenic effect: bệnh tích tế bào +: có bệnh tích tế bào -: không bệnh tích ±: bệnh tích nghi ngờ 37 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 10 mẫu dịch tế bào thu hoạch trong lần gây nhiễm đầu đƣợc chúng tôi thực hiện gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 Loại mẫu Tỷ lệ tế bào hƣ họai sau khi gây nhiễm (%) Kết quả C.P.E 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày DTBHT1 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT2 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT3 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT4 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT5 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT6 0 0 0 0 0 0 0 - DTBP1 0 0 0 0 0 0 0 - DTBP2 0 0 0 8 15 20 25 ± DTBP3 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHP2 0 0 0 5 10 15 20 ± CPE: Cytopathic effect (bệnh tích tế bào) +: có bệnh tích tế bào HP: hạch phổi ±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HT: huyết thanh : không có bệnh tích tế bào P: phổi DTB: dịch tế bào Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy: các mẫu có kết quả nghi ngờ ở lần gây nhiễm thứ nhất, sau khi gây nhiễm lần hai có biểu hiện bệnh tích tế bào sớm hơn (lúc 4 ngày) nhƣng tỷ lệ tế bào chết không tăng nhiều. Tỷ lệ tế bào chết vào ngày thứ 7 là 20-25 %. Do đó, chúng tôi vẫn xếp 2 mẫu này vào nhóm mẫu có bệnh tích nghi ngờ. 38 Nhƣ vậy, sau 2 lần gây nhiễm trên môi trƣờng tế bào MARC-145, có 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi. Một số hình ảnh về phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC-145: Hình 4.1. Đối chứng âm (độ phóng đại 100 lần) Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào (độ phóng đại 100 lần) 39 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng (độ phóng đại 100 lần) Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP. (độ phóng đại 100 lần) 40 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2. (độ phóng đại 100 lần) 4.4. Kết quả RT-PCR Sau hai lần gây nhiễm, chúng tôi tiến hành thu hoạch dịch tế bào và thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định sự hiện diện của virus PRRS trong môi trƣờng tế bào. Chúng tôi chỉ tiến hành chạy PCR trên những mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào vì điều kiện thiếu hoá chất. Tuy nhiên do một số hạn chế trong thời gian chúng tôi đang tiến hành kỹ thuật này nhƣ hoá chất, máy đọc gel bị trục trặc,... nên chúng tôi gởi mẫu đi xác định bằng kỹ thuật RT-PCR. 41 Bảng 4.4 Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm CPE: cytopathic effect (bệnh tích tế bào) HT: huyết thanh +: có bệnh tích tế bào P: phổi ±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HP: hạch phổi -: không bệnh tích tế bào DTB: dịch tế bào KTH: không thực hiện Loại mẫu Gây nhiễm lần một Gây nhiễm lần hai Kết quả CPE Kết quả RT-PCR Kết quả CPE Kết quả RT-PCR DTB HT 1 KTH KTH DTB HT 2 KTH KTH DTB HT 3 KTH KTH DTB HT 4 KTH KTH DTB HT 5 KTH KTH DTB HT 6 KTH KTH DTB P 1 KTH KTH DTB P 2 ± KTH ± DTB P 3 KTH KTH DTB HP1 + + KTH DTB HP2 ± KTH ± 42 Việc gây bệnh tích tế bào và kết quả RT-PCR dƣơng tính dã xác định sự hiện diện của virus trong mẫu xét nghiệm. Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thực hiện thành công việc phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 từ mẫu hạch phổi. Điều này cũng cho thấy môi trƣờng tế bào MARC-145 là môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển của virus PRRS và có thể sử dụng cho phân lập. Kết quả của chúng tôi phù hợp với sự nhận định của Jeong-Ki Kim và cs (2005): tế bào MARC-145 là dòng tế bào nhạy cảm với virus PRRS nên thích hợp cho việc phân lập virus này. Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào USA: chủng Châu Mỹ EU: chủng Châu Âu Lad: thang chuẩn Giếng 1: mẫu DTB HP từ kết quả CPE lần một. Giếng 2: mẫu DTB P2 từ kết quả CPE lần hai. Giếng 3: mẫu DTB HP2 từ kết quả CPE lần hai. 1 2 3 Lad USA EU Band 200bp 43 Trong tổng số 11 mẫu phân lập, chúng tôi đã ghi nhận đƣợc có 3 mẫu có bệnh tích tế bào khi gây nhiễm trong đó có 2 mẫu cho kết quả nghi ngờ. Các mẫu cho bệnh tích trên tế bào MARC-145 là mẫu phổi và hạch phổi của heo sau cai sữa có biểu hiện bệnh lý hô hấp. Bằng kỹ thuật RT-PCR xác định đƣợc 1 mẫu dịch tế bào từ hạch phổi có sự hiện diện virus PRRS, chiếm tỷ lệ 50% (1/2 hạch phổi). Kết quả của chúng tôi khác với Hoàng Thanh Hải (2005), tác giả chƣa thành công trong việc phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 từ các loại mẫu đƣợc lấy từ lò mổ nhƣ: huyết thanh, máu, hạch phổi và dich rữa khí quản. Sự khác nhau này theo chúng tôi có thể tác giả chỉ dựa trên kết quả ELISA dƣơng tính. Mặt khác, không thể loại trừ các yếu tố có thể ảnh hƣởng đến kết quả phân lập nhƣ đối tƣợng lấy mẫu, cách bảo quản, xử lý mẫu và đời của tế bào MARC-145 khi sử dụng. So với kết quả của Võ Thị Đan thanh (2006), chúng tôi đã thành công trong việc phân lập virus từ hạch phổi. Vậy ngoài hai loại mẫu thƣờng đƣợc sử dụng để phân lập virus PRRS là huyết thanh và hạch amiđan thì mẫu hạch phổi cũng cho kết quả khả thi khi phân lập virus này. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Thời gian tế bào MARC-145 phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp với lƣợng tế bào 7.105 và 106 là 72,565 giờ và 46 giờ. Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 với 4 loại mẫu chúng tôi có đƣợc: hạch amiđan, huyết thanh, phổi, hạch phổi. Có 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào trong tổng số 11 mẫu chúng tôi có đƣợc chiếm tỷ lệ 27,27%. Biểu hiện bệnh tích tế bào xuất hiện từ ngày thứ hai sau gây nhiễm và tăng nhanh vào những ngày tiếp theo ở mẫu hạch phổi. Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm 33,33% trên mẫu xét nghiệm. 5.2. Tồn tại Chƣa xác định đƣợc liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50 - Tissue culture infected dose 50). Chƣa xác định đƣợc chủng Châu Âu hay chủng Châu Mỹ. Số lƣợng mẫu còn hạn chế nên không thể kết luận đƣợc mẫu nào là tốt nhất cho phân lập virus PRRS khả thi. Chƣa xác định sự hiện diện virus PRRS trên các mẫu không có bệnh tích tế bào. 5.3. Đề nghị Tiếp tục phân lập virus với số lƣợng mẫu nhiều hơn. Xác định chủng virus phân lập. Cần xác định bằng kỹ thuật RT-PCR đối với những mẫu không có bệnh tích. Xác định TCID50. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, Tp. HCM. 2. Hoàng Thanh Hải, 2005. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào MARC-145, ứng dụng kỹ thuật ELISA và nuôi cấy tế bào để chẩn đoán bệnh do virus PRRS trên heo. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3. Hoàng Văn Năm, 2001. Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (bài dịch tổng hợp). Tạp chí khoa học thú y. Số 1/2002. Tr. 74- 87. 4. Hoàng Văn Năm, 2001. Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (bài dịch tổng hợp). Tạp chí khoa học thú y. Số 2/2001. Tr. 65- 75. 5. Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông Nghiệp, Tp.HCM. 6. Phòng Dịch tễ-Cục Thú y. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. 7. Thanh Thuận, 2002. Bệnh hô hấp của lợn - Tổng quan (bài dịch từ báo cáo tại International Pig Health Conference- Bangkok 3/2001). Tạp chí khoa học thú y số 1/2002. Tr76. 8. Trần Đức Minh. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Bài dịch từ “Theriogenology 66 (2006): 655-662”). 9. Trần Thanh Phong, 1996. Giáo trình bệnh truyền nhiễm do virus trên heo. Tủ sách Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Tr. 99- 104. 10. Võ Thị Đan Thanh, 2006. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Tp. HCM.  Tài liệu nƣớc ngoài 11. Ausvetplan, 2004. Disease stratery porcine reproductive and respiratory syndrome. 46 12. Benfield D.A., Collins J.E., Dee S.A., Halbur P.G., Joo H.S., Lager K.M., Mengelling W.L., Murtaugh M.P., Rossow K.D., Stevenson G.W., and Zimmerman J.J., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome. In disease of swine, 8 th edition. Ed.Straw B.E., D ’ Alleire S.D., Mengelling W.L., Taylor D.J..Iowa State University Press, Ames- Iowa, USA. p.201- 220. 13. Butler M, 2004. Animal cell culture and technology. The second edition- bios scientific publishers. P.1, P.55-58. 14. Delputte P. L, Vanderheijden N, Nauwynck H. J, 2001. Involvement of matrix protein in attachment of porcinereproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages. http//www. pubmedcentral.gov. 15. Han-Kook Chung, Changsun Choi, Junghyun Kim, Chanhee Chae, 2002. Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested PCR. p59. 16. Jeong-Ki Kim, Al-Majhdi Fahad, Kumar Shanmukhappa, and Sanjay Kapil, 2005. Defining The Cellular Target(s) Of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Blocking Monoclonal Antibody 7G10. 17. Kim H.S., Kwang J., Yoon I.J., Joo H.S., Frey M.L., 1993. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus a homogeneous subpopulation of MA- 104 cell line. Arch.Virol.133: 477- 483. 18. Meulenberg Janneke J.M., 2000. PRRS, the virus. http//www.csirus.com. 19. Nathalie Vanderheijden, Delputte Peter L., Favoreel Herman W., 2003. Involvememt of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages.http//www. pubmedcentral.gov. 47 20. Prieto C., and Castro J.M., 2000. Pathogennesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in gestating sows. Vet.Res.31:56- 57. 21. R.Allende, W.W.Laegreid, G.F.Kutish, J.A.Galeota, R.W.Wills and F.A.Osorio, 2000. Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus: Description Of Persistence In Individual Pigs Upon Experimental Infection. Journal of Virology. p. 10834 – 10837. 22. Rosso K.D.,1998. Review article: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome. Vet Pathol 35: 1-20. 23. Sinjder E.J., and Meulenberg J.J.M, 1998. Review article: the molecular biology of arteriviruses. Journal of General Virology 79: 961- 979. 24. Suarez Paloma, 2000. Ultrastructural pathogenesis of the PRRS virus. http//www.csirus.com. 25. Yoon K.J.,and Stevenson G., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome. Trends in emerging viral infection of swine. Iowa State Press. P.347- 354.  Tài liệu Internet PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP PHA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO Tất cả các thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.  Pha môi trƣờng EMEM (pha một lít). Cho 500 ml nƣớc cất khử ion vào bình thuỷ tinh. Cho một gói EMEM dạng bột (9,6g một gói) vào bình sao cho bột không dính vào thành, lắc kĩ để bột tan. Khuấy từ tối thiểu một giờ để bột tan hoàn toàn. Làm đầy thành một lít. Lọc tiệt trùng môi trƣờng với lƣới lọc 0,22 m và máy hút chân không trong tủ cấy vô trùng. Chắt ra một lọ nhỏ để ở 370C trong 48 giờ để kiểm tra sự tiệt trùng. Phần còn lại trữ trong ngăn dƣới của tủ lạnh.  Phƣơng pháp pha LAH 25% (pha một lít). Cân 250g LAH cho vào trong một lọ thuỷ tinh một lít, cho 500ml nƣớc cất khử ion vào lọ rồi dùng khuấy từ làm cho tan bột. Khi bột tan hết thì làm đầy thành một lít. Chia vào các lọ nhỏ, hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, trữ ở 40C.  Phƣơng pháp pha glutamine (pha một lít). Cân 29,2g glutamine và cho vào một lít, không cho bột dính vào thành lọ. Đong một lít nƣớc khử ion và cho vào lọ sao cho tan hết bột ở thành lọ. Trộn tối thiểu 15 phút để hoà tan. Khi tan hết, lọc với lƣới lọc 0,22 m và máy hút chân không. Khi lọc xong chiết ra lọ 5ml. Trữ lạnh đông.  Phƣơng pháp pha dung dịch P/S (Penicillin/Streptomycine) để pha 500ml (trong 1ml có 40000UI Penicillin và 40000 g Streptomycine). Lấy 20 lọ benzylpenicillin 1000000UI và 20 lọ Streptomycine Sulfate 1g. Bóc bỏ lớp vỏ để lộ phần cao su. Lấy xilanh hút 10ml nƣớc khử ion vào mỗi lọ Penicillin, 5ml vào mỗi lọ Streptomycine. Khi bột tan hút Penicillin và Streptomycine từ lọ cho vào lọ 500ml. Rửa lại các lọ nhƣ trên. Làm đầy thành 500ml với nƣớckhử ion. Chia nhỏ ra lọ 1ml và 4ml. Trữ -200C.  Pha dung dịch kháng nấm (Fungizone): pha 50ml dung dịch trong đó có 500 g Amphotericine B/ml. Lấy một lọ kháng nấm Amphotericine B (25mg/lọ), dùng xilanh bơm 10ml nƣớc cất khử ion vào lọ thuốc, lắc cho tan. Sau khi bột tan hút dung dịch từ lọ vào lọ 100ml. Bơm 10ml nƣớc cất để tráng sạch. Làm đầy thành 50ml Chia thành lọ nhỏ 2ml. trữ -200C.  Pha Na pyruvate100mM: Na pyruvate đã đƣợc nhà sản xuất pha sẳn ở dạng lọ 100ml. Do đó, chỉ cần tách ra các lọ 5ml để thuận tiện cho việc sử dụng.  Tổ hợp môi trƣờng phát triển: trong 100ml môi trƣờng gồm: Huyết thanh thai bò (FBS): 8ml. Glutamine: 1ml. Na pyruvate 100mM: 1ml. LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml. Sodium Bicarbonate 7%: 1ml. Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 400000UI penicillin, 400000 g streptomycine): 0,25ml. Kháng nấm (trong 1ml có 500 g amphotericine B): 0,5ml. EMEM (Eagle Minimum Essential Medium): làm đầy thành 100ml.  Môi trƣờng duy trì giống môi trƣờng phát triển nhƣng thay 8% FBS bằng 2% FBS.  Quy trình pha PBSA (phosphate bufferd saline solution A) pha 200ml. Cho 200ml nƣớc cất khử ion vào chai thuỷ tinh có nắp. Cho 2 viên PBSA vào. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Lƣu ý không đƣợc vặn nắp quá chặt. Sau khi hấp xong vặn chặt nắp, trữ lạnh 40C.  Pha trypsine 0,5% Cho 0,5ml EDTA-Tripsin vào ống falcon 15ml. Cho tiếp 9,5ml PBSA đã hấp khử trùng vào. Trộn đều và trữ ở 40C.  Pha hoá chất ly trích RNA Pha Sodium citrate.2H2O 0,75M - Cho 2,005g Sodium citrate.2H2O vào chai đã đựng 7ml H2O. - Dùng NaOH chuẩn độ đến pH 7,0. - Thêm nƣớc cho đủ 10ml. Pha Sarkosyl 10% - Cho 10ml nƣớc khử DEPC vào chai. - Cho 1g Sarkosyl vào khuấy tan. Pha -mercaptoethanol - Cho 0,36ml nƣớc khử DEPC vào eppendorf 1,5ml. - Cho 0,41g -mercaptoethanol vào., lắc đều cho tan hết. - Bảo quản trong 1 tháng ở nhiệt độ phòng. Pha dung dịch ly giải tế bào - Cho 40ml nƣớc đã khử DEPC vào chai. - Cho 37,092g guanidium thiocyanate vào. - Thêm 1,7ml Sodium citrate.2H2O 0,75M và 2,5ml Sarkosyl 10%. - Cho nƣớc khử DEPC vào đến khi đủ 50ml. - Khuấy trên máy khuấy có gia nhiệt ở 650C. - Bảo quản đƣợc ở nhiệt độ phòng trong 3 tháng, nếu ở nhiệt độ thấp hơn thì guanidium thiocyanate sẽ bị kết tủa. - Khi sử dụng thì cho thêm vào 0,36ml -mercaptoethanol/50ml dung dịch ly giải tế bào.  Quy trình ly trích RNA không sử dụng TRIzol o Bƣớc 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào  350 l dịch mẫu mô đƣợc nghiền nhuyễn trong PBS hay 350 l dịch tế bào.  500µl dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2-mercaptoethanol, pH 7.0). o Bƣớc 2: Phân tách và tinh sạch RNA  50µl sodium acetate 2M, pH 4.0; 600µl phenolchloroform.  Ủ ở 370C trong 5 phút.  Votex mạnh trong 15 giây và để yên ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.  Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. o Bƣớc 3: Kết tủa RNA  Thu dịch nổi.  Kết tủa RNA bằng 500µl isopropanol.  Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.  Hút bỏ dịch nổi, thu cặn. o Bƣớc 4: Rửa RNA  Rửa cặn với 1ml ethanol 75%.  Ly tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút.  Rửa lại lần nữa.  Làm khô tự nhiên trong chân không khoảng 5-10 phút. o Bƣớc 5: Hòa tan RNA  Hòa tan với 30µl nƣớc không chứa RNase (RNase – free water) trên đá, trộn đều và ủ ở 55-600C trong 10 phút.  Giữ RNA trong tủ -700C. Nên sử dụng RNA để thực hiện phản ứng PCR càng sớm càng tốt vì RNA để lâu dễ bị enzyme RNAse phân huỷ. Thời gian một lần cấy chuyển Analysis of Variance for TGIAN.ketqua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:TGIAN.ltb 705.69922 1 705.69922 7295.934 .0001 RESIDUAL .1934500 2 .0967250 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 705.89267 3 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for TGIAN.ketqua -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 4 59.282500 .1555032 58.613424 59.951576 A:TGIAN.ltb 700000 2 72.565000 .2199148 71.618783 73.511217 1E6 2 46.000000 .2199148 45.053783 46.946217 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TGIAN.ketqua by TGIAN.ltb -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1E 2 46.000000 X 700000 2 72.565000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 700000 - 1E6 26.5650 1.33815 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.