Khóa luận Tối ưu hóa quy tình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

nhân gây hại nào đó. Đến năm 1988, Cook đã đƣa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh học. Theo ông, phòng trừ sinh học bệnh cây là sử dụng sinh vật, gene và các sản phẩm của gene để điều khiển tác nhân gây bệnh. Cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (i) duy trì nguồn bệnh ở mức thấp dƣới ngƣỡng gây hại, (ii) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây. Các công trình nghiên cứu về tác nhân phòng trừ sinh học đƣợc công bố vào đầu thế kỉ 20 cho thấy vi khuẩn là một trong những tác nhân phòng trừ sinh học phổ biến và hiệu quả. Đây là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và cộng sự, 1978; Weller và Cook, 1983). Vi khuẩn đóng vai trò là tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên quan hệ đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh cây. Tác động đối kháng có thể xảy ra bằng nhiều cơ chế nhƣ: cạnh tranh chỗ cƣ trú; cạnh tranh dinh dƣỡng, đặc biệt là việc cạnh tranh chất Fe bằng cách tạo ra các hợp chất siderophore. Trong môi trƣờng tự nhiên khi thiếu một chất dinh dƣỡng nào đó hay hàm lƣợng chất đó không đủ cung cấp vi sinh vật thì loại vi sinh vật nào có khả năng đồng hóa mạnh sẽ lấy đƣợc nhiều thức ăn và phát triển, còn loại yếu bị đói và có thể bị tiêu diệt. Cơ chế thứ ba là tiết chất kháng sinh và phân hóa tố: trong quá trình hoạt động sống, nhiều vi sinh vật có thể tiết ra bên ngoài các chất có tác dụng ức chế một hoặc nhiều loại vi sinh vật khác. Các chất này có thể là kháng sinh hay các phân hóa tố để phân giải tế bào vi sinh vật khác. Tác động đối kháng cũng có thể do cơ chế siêu kí sinh trên mầm bệnh hoặc kích thích sự tăng trƣởng của cây trồng: nhiều vi khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cây trồng một cách gián tiếp bằng cách kích thích sự tăng trƣởng của cây nhờ đó cây kháng đƣợc mầm bệnh. 20 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Trong số các loài Pseudomonas spp., P. fluorescens là đƣợc chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram (-), có đơn hoặc tùng mao, sống hiếu khí bắt buộc nhƣng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kì linh hoạt giúp chúng sống đƣợc cả trong đất và trong nƣớc. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-300C. Chúng có trắc nghiệm dƣơng tính với oxidase. Một số dòng Pseudomonas fluorescens (chẳng hạn nhƣ CHAO hay Pf-5) có những đặc tính kiểm soát sinh học, giúp bảo vệ vùng rễ một số loài thực vật chống lại nấm kí sinh nhƣ Fusarium hay Pythium, cũng nhƣ một số loài nematode ăn thực vật. Đến nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết đƣợc chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết đƣợc đƣa ra nhƣ sau: thứ nhất ngƣời ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dƣỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ nhƣ tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe. Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn nhƣ các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide. 2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas 21 Loài: Pseudomonas fluorescens 2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Năm 1935, các nhà khoa học Liên Xô đã dùng một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas bón vào đất để chống lại nấm Sclerotonia và Botrylis bảo vệ nhiều loại cây trồng. Những chủng vi khuẩn vùng rễ trong đó có Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Rhizoctonia solani, Sclerotium (corticium) rolfsii. Nguồn vi khuẩn này cũng đƣợc sử dụng trong phòng trừ sinh học hiệu quả đối với bệnh thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất (Sakthivel và ctv, 1986). Mew và Rosales (1984) đã phân lập từ ngoài đồng hai loài vi khuẩn phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang trên môi trƣờng KB đối kháng với nấm Rhizoctonia solani. Gutter Son và ctv (1986) đã sử dụng dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông. Sivamani và Gnanamanickam (1988) đã xử lý cây chuối con Musa balbisiana bằng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens trên bệnh héo rũ. Kết quả bệnh ít hơn, rễ cây phát triển tốt hơn và tăng chiều cao. Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens có huỳnh quang và không có huỳnh quang phân lập từ rễ lúa ở miền Nam Ấn Độ đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani đƣợc thực hiện bởi Devi và ctv (1989). Voisard và ctv (1989) cho biết cyanide sản xuất bởi Pseudomonas fluorescens giúp ngăn chặn bệnh thối đen rễ thuốc lá. Lambert và ctv (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Serratia liquefacien và Bacillus sp. có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ cây bắp, lúa mạch, và xà lách xoong. 22 Jee và Kim (1987) nghiên cứu sự đối kháng giữa vi khuẩn và nấm đối với mầm bệnh héo rũ dƣa leo. Những chủng chính đã đƣợc chọn lọc là P.fluorescens, P.putida và Seratia sp., nấm đối kháng thì có Giocladium sp., Trichoderma harzianum và Trichoderma viridae. Trong môi trƣờng agar lỏng, vi khuẩn đối kháng ức chế sự nảy mầm của bào tử Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium từ 26% - 45%, P.fluorescens là vi khuẩn có tính kìm hãm mạnh nhất. Theo Gnanamanickam và ctv (1992), những nhóm vi khuẩn đối kháng phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang đƣợc quan sát trong ống nghiệm có khả năng kìm hãm nấm Rhizoctonia solani vì chúng có gene chitinase làm phân hủy chitin trong vách tế bào sợi nấm. Nhiều dòng vi khuẩn có hiệu quả kìm hãm sự phát triển khuẩn ty, ảnh hƣởng đến sự sống của hạch nấm và bảo vệ cây lúa tránh đƣợc sự xâm nhiễm của nấm bệnh. Gogoi và Roy (1996) cho biết những dòng vi khuẩn phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang phân lập ở Philippine đƣợc đánh giá là kháng với mầm bệnh đốm vằn Rhizoctonia solani. Giữa 9 dòng có hiệu quả thì 5 dòng đƣợc biết là Pseudomonas fluorescens, 1 dòng là Enterobacter. Theo Rindran và Vidhyaekaran (1996) những nòi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phát huỳnh quang phân lập từ vùng rễ cũng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani. Một trong những dòng có hiệu quả nhất là PfAIR2, phân lập trên than bùn đƣợc dùng để xử lý hạt, xử lý rễ, rải vào đất và phun lên lá. Mukhopadhyay và ctv (1996) cho biết khi phân lập từ mạ lúa đƣợc trồng từ hạt giống có khử trùng bề mặt, ngƣời ta tìm thấy 3 nòi hiện diện trên vỏ trấu hạt lúa là Bacillus spp., Pseudomonas fluorescens và Enterobacter. Sử dụng P.cepacia làm giảm bệnh mốc xanh sau thu hoạch do Penicillium digitatum trên trái chanh tới 80% so với không chủng (Smilanick và Ricardodenis- arrue, 1992). Tác động đối kháng của vi khuẩn đƣợc xác nhận do chất kháng khuẩn pyrrolnitrin. 23 Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm P.carolinianum ở Ai Cập đƣợc kiểm soát bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng P.fluorescens. Vi khuẩn đối kháng cao với nấm trong thí nghiệm trên đĩa petri và hạn chế đƣợc bệnh khi áp dụng trong đất. Hiệu quả kiểm soát khi trộn vi khuẩn vào đất cao hơn khi chủng vi khuẩn vào vùng rễ cây con trƣớc khi đem trồng. Tác động đối kháng là do cạnh tranh về dinh dƣỡng, siderophores, những chất có khả năng kháng khuẩn-HCN. Theo Notz và ctv (2001), sự hình thành 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4- DAPG) là quan trọng cho tính đối kháng của Pseudomonas fluorescens. Giống cây kí chủ có ảnh hƣởng nhất định tới mức độ tạo thành 2,4-DAPG. Pseudomonas fluorescens tạo ra 2,4-DAPG chống lại bệnh chết cây con do nấm trong đất và hạn chế bệnh chết cây do nấm Gaeumannomyces graminis var. tritici (Mavrodi và ctv, 2001). Hợp chất này đƣợc kiểm soát bởi gene phlD, một gene rất biến đổi về cấu trúc hóa học. Những nghiên cứu ở mức độ phân tử chỉ ra rằng phlD là một marker phân tử quan trọng để nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn tạo ra 2,4-DAPG. Hợp chất DAPG đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh chết cây con và bệnh hại rễ của nhiều loại cây trồng. Ví dụ, dòng CHAO hạn chế bệnh thối đen rễ thuốc lá, chết cây lúa mì, thối rễ cà chua, dòng f113 hạn chế bệnh chết cây con củ cải đƣờng. Kell (1992) chia vi khuẩn Pseudomonas thành hai nhóm dựa trên số hợp chất kháng khuẩn tạo ra. Nhóm 1 gồm những dòng vi khuẩn phân lập từ thuốc lá, cà chua, dƣa chuột, bông vải tạo ra DAPG, HCN, pyoluteprin. Nhóm thứ 2 gồm vi khuẩn tạo DAPG, HCN. Theo Gardener và ctv (2000) gene phlD mã hóa polyketide synthase tạo monacetylphloroglucinol và chuyển hóa tiếp thành 2,4-DAPG. Một phần lớn ORF của gene này đƣợc phân lập và phân tích cấu trúc. Sử dụng primer B2BF và BPR4 có thể xác định chính xác vi khuẩn đối kháng sản sinh ra hợp chất 2,4-DAPG. 24 Năm 1997, Bloemberg và ctv đã sử dụng green fluorescent protein nhƣ một marker để nghiên cứu sự phân bố, hình thành tập đoàn và hoạt tính trao đổi chất của vi khuẩn Pseudomonas. 2.6 Protein GFP 2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm GFP (Green Fluoescent Protein): là loại protein lần đầu tiên đƣợc tìm thấy vào năm 1974 nhƣ một hợp chất phát sáng – aequorin – có ở loài sứa jellyish Aequorea victoria sống ở vùng nƣớc lạnh biển bắc Thái Bình Dƣơng . Là một hexapeptide có trọng lƣợng phân tử 27 kDa, cấu tạo từ 238 aa, với đặc tính đặc biệt là tại trung tâm hoạt động của nó có sự tự động đóng vòng của 3 aa Serine 65 – Tyrosine66 – Glycine67 (Serine có thể thay thế bằng Threonine). Khi chuỗi protein gấp lại đoạn nhỏ Ser – Tyr – Gly này đƣợc chôn sâu vào bên trong lúc này có nhiều phản ứng hóa học xẩy ra. Glycine hình thành liên kết với Serine xảy ra phản ứng khử hydro tạo liên kết đôi hình thành một vòng mới với Tyrosine, nhƣng tại sao Glycine lại hình thành liên kết với Serine tạo vòng 5 cạnh là điều mà chƣa ai biết. Hydro đƣợc phóng thích kết hợp với oxy trong môi trƣờng tạo phân tử nƣớc (do đó vi sinh vật chuyển gene gfp phải nuôi cấy trong môi trƣờng hiếu khí). Chính sự chen lấn của phân tử nƣớc đã hấp thu năng lƣợng của protein ngay khi nó hấp thụ photon ánh sáng, do đó phát lại cũng dƣới dạng ánh sáng ở mức năng lƣợng Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP (Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006). 25 thấp hơn. Chuỗi protein có cấu trúc hình trụ mà bộ 3 Ser – Tyr – Gly nằm ở phần lõi bên trong làm cho đặc tính này của protein rất bền. Với đặc tính nổi bật nhƣ trên, gần đây gene gfp rất đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ hệ thống marker gene, reporter gene cho những vi sinh vật biến đổi gene. Vì tính dễ phát hiện chỉ cần quan sát dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang (epifluorescence microscopy), kính hiển vi tiêu cự laze (laser confocal microscopy), máy đếm tế bào (flow cytometry) và máy quang phổ đo huỳnh quang (spectrofluorimetry); tính ổn định cao, tồn tại lâu trong vi sinh vật không dễ mất đi nhƣ gene kháng kháng sinh; không cần co-enzyme nhƣ các hệ thống phát màu, phát ánh sáng hay phát huỳnh quang khác (Thí dụ nhƣ gene lux ở prokaryote hay gene luc ở eukaryote mã hóa cho sự hoạt động của enzyme luciferase cần các co-enzyme NADH cho luc hoặc FMNH2 cho lux mà các co-enzyme này thì phụ thuộc nhiều vào năng lƣợng dự trữ của tế bào vi sinh vật), gene gfp xuất phát từ loài cá nên không có sẵn trong hê thống gene của vi sinh vật nhƣ gene kháng kháng sinh, hay gene lux … nên không xẩy ra phản ứng dƣơng tính giả khi kiểm tra. Ngoài ra với đặc tính dễ quan sát, độ chính xác cao, không phá hủy tế bào, không gây độc cho tế bào và có thể kiểm tra từng tế bào chỉ có 1 bản sao, ngƣời ta dùng marker gfp để quan sát quá trình hoạt động bên trong khi vi sinh vật xâm nhập vào kí chủ. Thí dụ nhƣ quan sát Agrobacterium, Rhizobium khi chúng kí sinh vào rễ cây, quan sát sự hình thành khuẩn lạc, mật độ tế bào qua các phase cũng nhƣ cƣờng độ phát sáng. 2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp Sử dụng gene gfp nhƣ một loại marker dùng kiểm tra sự sống sót của vi khuẩn Pseudomonas sp. UG14Gr có khả năng khoáng hóa phenanthrene trong đất nhiễm creosote (Deena Errampalli, 1998), gene gfp nhƣ một lọai marker dễ nhìn thấy để kiểm soát vi khuẩn tổng hợp acid lactic trong hệ sinh thái phức tạp (Karen P. Scott, 1998), gene gfp nhƣ hệ thống marker và reporter trong vi khuẩn Helicobacter sp. (Christine Josenhans, 1998), gene gfp nhƣ một reporter biểu hiện 26 gene, một marker sống nghiên cứu nấm Phytophthora parasitica kháng nicotianae gây bệnh trên cây thuốc lá (Arnaud Bottin, 1998) Yeoung-Seuk Bae và Guy R. Knudsen (1999) sử dụng Polyethylene-glycol đồng biến nạp gene tổng hợp β-Glucuronidase (GUS) và gene tổng hợp GFP (Fluorescent Protein Genes ) vào nấm Trichoderma harzianum đế kiểm soát sự tăng trƣởng và họat động của nấm trong đất. Còn Pieter van West và cộng sự (1999) sử dụng phƣơng pháp biến nạp dựa trên CaCl2 và PEG (Polyethylene-glycol) chuyển gene gfp và gene gus nhƣ một reporter gene nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên thực vật. Ảnh hƣởng của tình trạng thiếu dinh dƣỡng (Starvation), tình trạng sống nhƣng không có khả năng tăng sinh (Viable-but-Nonculturable State ) đến khả năng phát sáng của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens A506 đánh dấu bởi gene gfp đã đƣợc M. Lowder và cộng sự (2000) nghiên cứu. Janus A.J. và cộng sự (2002) kiểm tra tại chổ (In situ detection ) việc chuyển gene theo chiều ngang của các yếu tố di truyền di động bằng cách xây dựng tổ hợp gene reporter gfp và promoter lac chuyển vào vi khuẩn. GFP phát ra những bƣớc sóng màu khác nhau cho phép xác định hoạt động tăng trƣởng, vị trí tế bào cho, tế bào nhận. Còn R. Bhatia (2002) thì xây dựng marker gfp vào vi khuẩn Bradyrhizobium cho những nghiên cứu sinh thái về sự cạnh tranh, sống sót trên đất, trên môi trƣờng chứa than đá. Năm 2003, Johan Goris đã nghiên cứu sự đa dạng của những vi khuẩn hoạt động ở cống rãnh dựa trên plasmid pC1-gfp làm giảm khả năng sản xuất 3-chloroaniline. Năm 2004, Tina S. Boldt đã nghiên cứu nhiều hệ thống reporter gfp khác nhau để kiểm soát hoạt động vi khuẩn Pseudomonas fluorescens F113 định cƣ trên rễ cây linh lăng phát triển qua nhiều giai đoạn tăng trƣởng không phụ thuộc vào sự suy thoái 3-chlorobiphenyl. Trong năm đó Gejiao Wang và cộng sự sử dụng Real- time PCR để định lƣợng dòng Pseudomonas putida đánh dấu gfp trong quá trình suy giảm 2-chlorobenzoate trong đất. Đến Ninwe Maraha và cộng sự thì kiểm soát tình trạng sinh lý của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens SBW25 đánh dấu gfp ở 27 những điều kiện dinh dƣỡng khác nhau trong đất bằng máy đếm tế bào (flow cytomerry). Chong Zhang và cộng sự, 2005 kiểm tra nhanh vi khuẩn Enterobacer aerogenes đánh dấu gfp trong điều kiện kị khí bằng phƣơng pháp AFR (Aerobic fluorescence recovery). Năm 1996, Chiu và ctv đã sử dụng GFP nhƣ một hệ thống reporter nhạy và linh hoạt để nghiên cứu nhiều loại tế bào thực vậtvà cả những cây chuyển gene. Cũng trong năm đó, Reichel và ctv đã nghiên cứu sự biểu hiện của gene gfp trong một loạt các tế bào thực vật một lá mầm và hai lá mầm. Straight và ctv (1996) đã nghiên cứu các nhiễm sắc thể nấm men đƣợc đánh dấu GFP và khám phá ra rằng những tƣơng tác protein – protein có thể kích thích các thanh nhiễm sắc chị em dính lại. Năm 1997, Bloemberg và ctv đã sử dụng green fluorescent protein nhƣ một marker để nghiên cứu sự phân bố, hình thành tập đoàn và hoạt tính trao đổi chất của vi khuẩn Pseudomonas. Sự biểu hiện của gene gfp ở một số dòng vi khuẩn E.coli và Agrobacterium tumefaciens đã đƣợc Nguyễn Hữu Hổ và ctv nghiên cứu vào năm 2006. Sơ qua tình hình nghiên cứu trên thế giới, chúng ta thấy gene gfp đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ hệ thống marker gene, reporter gene nhằm kiểm soát hoạt động của vi khuẩn trong nhiều môi trƣờng khác nhau (đất, nƣớc, không khí). 28 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 13 tháng 08 năm 2007. Địa điểm: Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh và phòng 118, 105 bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 3.2.1 Vật liệu 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp Trong thí nghiệm này sử dụng một biến thể của GFP, đó là thể đột biến P11 có sự thay đổi ở vị trí 167 aa isoleucine thành aa threonine làm thay đổi bƣớc sóng kích thích lên mức tối đa từ 396 nm thành 471 nm trong khi không có sự thay đổi bƣớc sóng phát ra 502 nm so với 508 nm của GFP bình thƣờng. Đoạn PpsbA – RBS – gfp đƣợc thiết kế nhƣ sau: Đoạn gfp (P11) đƣợc cắt ra từ plasmid pGEMEX-2(P11) sử dụng cặp enzyme cắt NedI – BamHI, sau đó đƣợc chèn vào sau vùng RBS (T7 gene 10) dài 35 bp của plasmid pET22b, lại tiếp tục đƣợc cắt ra bằng cặp enzyme XbaI – BamHI, đọan này đƣợc chèn tiếp vào vùng MCS của plasmid pIC19H nhằm sử dụng những vị trí chèn này cho quá trình subclone. Promoter psbA là promoter cấu trúc, mạnh, phổ kí chủ rộng phân lập từ Amaranthus hybridus , cắt ra từ plasmid pRL427 bằng enzyme XbaI, đoạn 170 bp này đƣợc chèn vào vùng MCS nằm trƣớc vùng RBS – gfp, lại đƣợc cắt ra bằng cặp enzyme BglII – BamHI chèn vào plasmid pUC18Not, tiếp tục cắt ra bằng enzyme NotI và chèn vào plasmid pUT mini-Tn5 hình thành plasmid pUT-gfp. 29 3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid hỗ trợ pRK600 đƣợc thêm vào hỗn hợp tiếp hợp gồm thể cho E.coli DH5α có chứa plasmid pUT-gfp và thể nhận Pseudomonas flourescens. Plasmid hỗ trợ pRK600 có Mob+ Tra+. pRK600 còn có một điểm khởi đầu sao chép và điểm khởi đầu chuyển gene (mob) ColE1. ColE1 chỉ cho phép plasmid nhân lên trong E.coli chứ không nhân lên trong vi khuẩn vùng rễ. Plasmid pRK600 đƣợc sử dụng để vận chuyển những plasmid lớn thông qua oriT, nó không tái bản lên, nhƣng sau một thời gian cho phép biểu hiện gene vận chuyển RK2 (S.Klein) chứa các yếu tố mob+ và tra+. 3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens đƣợc giữ trong tủ - 70oC thuộc bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học trƣờng đại học Nông Lâm. Các dòng đƣợc chọn đƣợc đem ra rã đông và tăng sinh trên môi trƣờng LB. Hình 3.1: Cấu trúc plasmid pUT-gfp (Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006). 30 Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan trong thí nghiệm Dòng và plasmid Đặc tính Nguồn E.coli DH5α (λ-pir) Thi pro hsdR recA; chromosomal RP4; tra + ; Sm/Sp R Simon và cộng sự, 1983 pRK2013 Km R ; ColE1 ori; RK2-mob; RK2-tra Figurski, D. and Helinski, D.,1979 pRK600 ColE1 replicon with RK2 transfer region, helper plasmid; Cm R Finan và cộng sự, 1986 pUTmini-Tn5 Ap R ; Km R ; delivery plasmid for mini-Tn5 Herrero và cộng sự ,1990 pUC18Not Ap R ; lacZ; oriColE1; MCS flanked by NotI sites Herrero và cộng sự ,1990 pGEMEX-2 (P11) Ap R ; T7 promoter; contains P11 Heim và cộng sự, 1994 pET22B Ap R ; lacI; f1 ori Novagen, Madison, WI pIC19H Ap R ; lacZ Marsh, J.L., Erfle, M. and Wykes, E.J. (1984) pRL427 Ap R ; psbA promoter J. Elhai and C.P. Wolk, unpublished pUTgfp Delivery plasmid for mini-Tn5::gfp; Ap R ; Km R ; oriT(PR4); oriRK6 Tombolini và cộng sự, 1997 Ap R gene kháng Ampicillin KmR gene kháng Kanamycin Sm R gene kháng Streptomycin SpR gene kháng Spectinomycin 31 3.2.2 Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng LB lỏng Môi trƣờng LB agar Môi trƣờng King’B agar Môi trƣờng M9 3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu Máy điện di Máy chụp gel Máy lắc định ôn Máy vortex Máy chiếu tia UV Kính hiển vi phát huỳnh quang Bồn nƣớc ổn nhiệt (water bath) Tủ cấy vô trùng (micro flow) Tủ - 20oC, - 70oC Tủ sấy dụng cụ Nồi hấp (Autoclave) Máy ly tâm Máy đo pH Cân kỹ thuật Ống nghiệm, đĩa petri Eppendorf 1,5 ml, 200 µl Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl) Pipet và đầu tip các loại 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1 Chọn lọc những dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm. Gồm các bƣớc: a. Kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn: cấy các dòng vi khuẩn vào môi trƣờng LB có chứa kanamycin (50 µg/ml) và môi trƣờng chứa chloramphenicol (20 µg/ml). b. Kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB: sử dụng phƣơng pháp cấy điểm cấy các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens lên môi trƣờng KB, ủ ở 280C trong 24 giờ, quan sát dƣới máy chiếu tia UV để chọn những dòng vi khuẩn phát sáng mạnh. 32 c. Chỉ tiêu tính đối kháng của vi khuẩn đối với nấm đã đƣợc Phan Thị Thu Hiền (2002) và Vƣơng Huỳnh Nhƣ (2007) nghiên cứu và chọn ra những dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với nấm. Giai đoạn 2 Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. Quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (theo Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006 có chỉnh sửa): 1. Nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong 16 giờ. o Vi khuẩn cho:Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp trong 5ml môi trƣờng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và kanamycin (50 µg/ml). o Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 trong 5 ml môi trƣờng LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml). o Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong 5ml LB, tùy dòng mà có chứa loại và nồng độ kháng sinh thích hợp. 2. Hút lần lƣợt 3 dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho : vi khuẩn hỗ trợ : vi khuẩn nhận = 1:1:3 = 300µl : 300 µl : 900 µl cho vào ependorf 1.5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 200C trong 1 phút. Thu sinh khối, rửa lại với 1 ml nƣớc cất vô trùng. Cho thêm vào ependorf 100 - 200 µl nƣớc cất vô trùng hòa tan sinh khối, đem vortex kỹ. 3. Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng KB, bằng cách sử dụng micropipet nhỏ từng giọt (khoảng 10µl ) lên môi trƣờng, ủ 24 giờ ở 28oC. 4. Sau khi khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc hấp vô trùng vào đĩa petri hòa tan các khuẩn lạc. Pha loãng dịch khuẩn. Tiếp tục hút khoảng 30 µl dịch vi khuẩn sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml) trang đều trên mặt đĩa, ủ 48 giờ ở 28 0 C. 33 Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, sử dụng que tăm đã hấp, sấy cấy điểm sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml). Thực hiện các khảo sát sau: a. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn: nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong thời gian nuôi cấy lần lƣợt là 16, 20, và 24 giờ. b. Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn: lần lƣợt thay đổi tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1:1:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:1:4, 1:1:5 c. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB: lần lƣợt thay đổi nhiệt độ nuôi cấy ở 24, 28, và 320C. Định tính kết quả bằng cách quan sát số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml). Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm MINITAB Release 13.2. Giai đoạn 3 Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. 34 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả 4.1.1 Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Mục đích kiểm tra kháng sinh là chọn ra những dòng Pseudomonas fluorescens không kháng với kanamycin, nhƣng kháng đƣợc với chloramphenicol để khi chọn lọc trên môi trƣờng M9 có chứa kanamycin và chloramphenicol thì chỉ những dòng Pseudomonas fluorescens đã nhận đƣợc plasmid pUT-gfp có gene kháng với kanamycin mới hình thành khuẩn lạc. Sau khi chọn đƣợc các dòng Pseudomonas fluorescens không kháng với kanamycin, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng phát sáng của những dòng này trên môi trƣờng KB, chọn ra một số dòng phát sáng mạnh. Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra tính kháng của những dòng này với chloramphenicol. Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của một số dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và bảng 4.2. Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Dòng vi khuẩn P. fluorescens Kanamycin (50 µg/ml) Dòng vi khuẩn P. fluorescens Kanamycin (50 µg/ml) 1.8 - 138 + 13 - 147 + 13.4 + 164 - 17 + 172 - 18 - 186 + 20.2 - 187 - 35 20.3 - 189 - 20.4 - 192 + 28 + 200 + 33 + 216 + 35 - 221 + 37 - 222 + 42 + 239 - 51 - 245 - 65 - 283 - 68 - 315 + 81 + 321 - 121 - 432 + 123 - 846 - 135 - Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Dòng vi khuẩn P. fluorescens Chloramphenicol (50 µg/ml) 1.8 + 13.4 - 20.2 - 20.3 + 20.4 - 283 + Kết quả kiểm tra kháng sinh cho thấy các dòng Pseudomonas fluorescens có tính kháng kháng sinh phù hợp với mục đích thí nghiệm là dòng 1.8, 20.3, 283. 36 Bảng 4.3: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu Dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Cây kí chủ Thời gian phân lập Ngƣời phân lập 1.8 cải ngọt 4-2007 Vƣơng Huỳnh Nhƣ 20.3 mùng tơi 4-2007 Vƣơng Huỳnh Nhƣ 283 khoai tây 2002 Phan Thị Thu Hiền 4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB Dựa trên kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh, chọn các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens không kháng với kanamycin (50 µg/ml), cấy điểm các dòng này lên môi trƣờng KB để kiểm tra khả năng phát sáng. Sau khi kiểm tra, chọn đƣợc dòng vi khuẩn 1.8 có khả năng phát sáng mạnh và ổn định nhất. Từ kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh và kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB, chúng tôi chọn dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 là đối tƣợng nghiên cứu trong đề tài này. Hình 4.1: Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trƣờng KB. (A) chụp dưới tia UV, (B) chụp dưới ánh sáng thường Khuẩn lạc P. fluorescens B A Khuẩn lạc phát sáng 37 4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần 4.1.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn Môi trƣờng LB là môi trƣờng dinh dƣỡng để tăng sinh vi khuẩn. Khi vi khuẩn phát triển bƣớc vào phase cấp số, trên vách tế bào có thể hình thành cầu nối tiếp hợp để truyền vật chất di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận. Nuôi cấy riêng từng dòng vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận và vi khuẩn hỗ trợ trong 5ml LB có chứa kháng sinh thích hợp cho từng dòng vi khuẩn ở 28OC, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Lần lƣợt sau 16, 20 và 24 giờ tăng sinh, thu sinh khối vi khuẩn và thực hiện theo quy trình tiếp hợp nêu trên. Đánh giá kết quả khảo sát bằng cách đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml), chọn nồng độ pha loãng là 10-12. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Bảng 4.4 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn Thời gian nuôi cấy (giờ) Số khuẩn lạc Lần 1 Lần 2 Lần 3 16 240 368 256 20 508 604 416 24 432 516 392 Xử lý thống kê kết quả đếm khuẩn lạc cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa với xác suất sai lầm P = 0.03 và đối với dòng Pseudomonas fluorescens 1.8, thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn là 20 tiếng cho khả năng tiếp hợp cao nhất. 38 4.1.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn Lập lại thí nghiệm nhƣ trên, thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn là 20 tiếng, các thông số khác giữ nguyên nhƣng lần lƣợt thay đổi tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận là 1 : 1: 1, 1 : 1 : 2, 1 : 1 : 3, 1 : 1 : 4, 1 : 1 : 5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đƣợc trình bày trong hình 4.3. Bảng 4.5 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo tỉ lệ vi khuẩn Tỉ lệ vi khuẩn Số khuẩn lạc Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 : 1 : 1 708 552 712 1 : 1 : 2 678 662 698 1 : 1 : 3 704 680 616 1 : 1 : 4 752 697 702 1 : 1 : 5 804 774 724 Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn đếm khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng là 10 -11, khuẩn lạc hình thành dày đặc, gây khó khăn trong quá trình đếm. Tuy nhiên, do chênh lệch số khuẩn lạc giữa các tỉ lệ không nhiều, sự khác biệt không lớn và Hình 4.2: Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9. (A) các dòng vi khuẩn được nuôi trong LB 16 giờ, (B) các dòng vi khuẩn được nuôi trong LB 20 giờ, (C) các dòng vi khuẩn được nuôi trong LB 24 giờ A B C 39 vẫn đạt yêu cầu là hình thành những khuẩn lạc rời rạc để cấy điểm sang môi trƣờng M9 nên chúng tôi không thực hiện lại thí nghiệm này. Xử lý thống kê kết quả đếm khuẩn lạc, chúng tôi nhận thấy sự khác biệt giữa các tỉ lệ không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nói cách khác tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận thay đổi ảnh hƣởng không lớn đến hiệu quả tiếp hợp. 4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB Lập lại thí nghiệm nhƣ trên, thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn là 20 tiếng, tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận là 1: 1: 3, các thông số khác giữ nguyên nhƣng thay đổi nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB lần lƣợt là 24 0 C, 28 0C, và 320C. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB đƣợc trình bày trong bảng 4.6. A B C D E Hình 4.3: Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9. Tỉ lệ vi khuẩn cho : vi khuẩn hỗ trợ : vi khuẩn nhận (A) = 1 : 1 : 1, (B) = 1 : 1 : 2, (C) = 1 : 1 : 3, (D) = 1 : 1 : 4, (E) = 1 : 1 : 5 40 Bảng 4.6 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB Nhiệt độ ủ Số khuẩn lạc Lần 1 Lần 2 Lần 3 24 0 C 688 720 504 28 0 C 816 1000 816 32 0 C 536 568 456 Xử lý thống kê kết quả đếm khuẩn lạc cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa với xác suất sai lầm P = 0.011. Đối với dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB là 280C cho khả năng tiếp hợp cao nhất, đây cũng là nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens. 4.1.3.4 Kết quả đối chứng Thực hiện quy trình tiếp hợp tƣơng tự nhƣ trên đối với riêng từng dòng vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận và vi khuẩn hỗ trợ chứ không trộn chung chúng với nhau. Kết quả trên môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml) nhƣ sau: dòng vi khuẩn cho có chứa plasmid pUT-gfp không hình thành khuẩn lạc, còn dòng vi khuẩn hỗ trợ có chứa plasmid pRK600 và dòng vi khuẩn nhận chƣa tiếp hợp vẫn sống đƣợc trên môi trƣờng này. Hình 4.4: Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9. (A) ủ ở 240C, (B) ủ ở 280C, (C) ủ ở 320C A B C 41 4.2 Thảo luận 4.2.1 Các thông số tối ƣu cho quá trình tiếp hợp Thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn trên môi trƣờng LB là 20 tiếng cho khả năng tiếp hợp cao nhất Tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận thay đổi ảnh hƣởng không lớn đến hiệu quả tiếp hợp. Điều này có thể giải thích là do môi trƣờng chọn lọc chúng tôi sử dụng chƣa tối ƣu nên chƣa thể thấy đƣợc sự khác biệt giữa tỉ lệ các dòng vi khuẩn khác nhau Nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB là 280C cho khả năng tiếp hợp cao nhất. 4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần Ba dòng vi khuẩn đƣợc trộn vào hỗn hợp tiếp hợp theo tỉ lệ thích hợp. E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid hỗ trợ pRK600 không thể tiếp hợp thành công với Pseudomonas fluorescens vì không có vùng tƣơng đồng, và không thể duy trì trong Pseudomonas fluorescens vì có điểm khởi đầu sao chép colE1. Theo Cameron (2007) gene tra + trên pRK600 gây nên sự hình thành pili, kéo vi khuẩn cho E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pUT-gfp lại gần, làm tan vách tế bào của vi khuẩn, hình thành cầu nguyên sinh chất. Tra+ cũng gây đứt gãy DNA tại Hình 4.5: Đối chứng trên môi trƣờng M9. (A) E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, (B) E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600, (C) Pseudomonas fluorescens 1.8 B C A 42 oriT (mob) và làm pRK600 duỗi ra. Một mạch đơn của pRK600 đƣợc chuyển vào thể cho E.coli DH5α. Lúc này có 2 plasmid trong thể cho. Gene tra+ trên pRK600 lại gây nên sự hình thành pili, kéo thể nhận Pseudomonas fluorescens lại gần, hình thành cầu nối nguyên sinh chất. Đồng thời tra+ cũng gây đứt gãy DNA tại oriT RP4, khởi đầu sự chuyển pUT-gfp vào thể nhận. Trong thể nhận, sự tái tổ hợp xảy ra giữa pUT-gfp và DNA bộ gene của thể nhận nhờ hệ thống transposon mini-Tn5. Các thể tái tổ hợp sau đó sẽ đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml. 4.2.3 Kết quả đối chứng Dòng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pUT-gfp không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9 vì chúng không kháng đƣợc với chloramphenicol (20µg/ml) có trong môi trƣờng. Dòng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pRK600 kháng đƣợc với kanamycin (50µg/ml), ampicillin (50µg/ml) và cả chloramphenicol (20µg/ml) nên môi trƣờng M9 chúng tôi sử dụng không loại bỏ đƣợc dòng này. Dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 không kháng đƣợc với kanamycin (50µg/ml) nhƣng khi nuôi riêng dòng vi khuẩn này qua các bƣớc nhƣ quy trình tiếp hợp nêu trên chúng vẫn có thể hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng M9 (có chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml). Để loại trừ trƣờng hợp kháng sinh kanamycin bị mất hoạt tính khi bổ sung vào môi trƣờng, chúng tôi cấy trực tiếp dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 lên môi trƣờng M9 bằng phƣơng pháp cấy điểm mà không nuôi qua các bƣớc nhƣ quy trình tiếp hợp. Kết quả vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9. Nhƣ vậy, chúng tôi cho rằng trong quy trình tiếp hợp, khi nuôi chung trên môi trƣờng KB có một cơ chế nào đó đã xảy ra làm cho dòng vi khuẩn nhận dù không nhận đƣợc plasmid vẫn có thể mọc đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc có kháng sinh. 43 4.2.4 Môi trƣờng thích hợp cho chọn lọc Môi trƣờng M9 có chứa các loại kháng sinh kanamycin, ampicillin, và chloramphenicol không phải là môi trƣờng chọn lọc thích hợp trong nghiên cứu này. Vì M9 là 1 loại môi trƣờng thích hợp cho cả Pseudomonas và E.coli nên khi chọn lọc phải dựa vào tính kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn. Điều này gây ra nhiều bất lợi Thứ nhất là phải kiểm tra chặt chẽ tính kháng kháng sinh của dòng vi khuẩn nhận. Dòng này phải kháng đƣợc với ít nhất một loại kháng sinh mà dòng vi khuẩn cho và vi khuẩn hỗ trợ không kháng đƣợc. Dòng này lại phải là dòng nhạy với kanamycin hoặc ampicillin để nếu chúng không nhận đƣợc plasmid thì sẽ không mọc đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc. Vì phải đáp ứng khắt khe về khả năng kháng kháng sinh nên những dòng Pseudomonas có khả năng kháng kháng sinh phù hợp để chọn lọc thƣờng không phải là dòng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh hoặc không phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB. Thứ hai là kháng sinh sau khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng bị phân hủy rất nhanh chóng bởi nhiệt độ và ánh sáng. Do đó khi chọn lọc cần sử dụng nồng độ kháng sinh cao nên rất tốn kém, ngoài ra chúng ta cũng không biết đƣợc chính xác nồng độ kháng sinh còn trong môi trƣờng. Để khắc phục những vấn đề trên, chúng tôi đề nghị 2 giải pháp: (i) Chúng ta có thể sử dụng loại môi trƣờng chọn lọc riêng cho Pseudomonas. Có nhiều loại môi trƣờng chọn lọc cho Pseudomonas dựa trên các loại sắc tố chúng tiết ra môi trƣờng. Ví dụ nhƣ môi trƣờng có potassium sulphate và magnesium chloride. Hai chất này giúp tăng cƣờng khả năng tạo pyocyanin. Đây là loại sắc tố xanh lục hơi ngả sang xanh lá cây do Pseudomonas tiết ra môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc. Dựa vào sắc tố chúng ta có thể chọn lọc Pseudomonas, loại bỏ các dòng E.coli. (ii) Bổ sung vào quy trình tiếp hợp nêu trên một bƣớc cấy điểm sang môi trƣờng KB. Khi khuẩn lạc hình thành, đem chiếu dƣới tia UV để xác định và loại bỏ các dòng E.coli. 44 Nhƣ vậy, dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc chọn làm vi khuẩn nhận chỉ cần đáp ứng điều kiện không kháng với kanamycin, môi trƣờng chọn lọc cũng chỉ cần bổ sung loại kháng sinh này để chọn lọc dòng Pseudomonas fluorescens đã nhận đƣợc plasmid. 4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 Để chứng tỏ những nhận định trên chúng tôi thực hiện lại thí nghiệm chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với quy trình đƣợc sửa đổi nhƣ sau: 1. Nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong 20 giờ. o Vi khuẩn cho: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp trong 5ml môi trƣờng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và kanamycin (50 µg/ml). o Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 trong 5 ml môi trƣờng LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml). o Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 trong 5ml LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml). 2. Hút lần lƣợt 3 dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1:1:3 = 300µl: 300 µl: 900 µl cho vào ependorf 1.5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 200C trong 1 phút. Thu sinh khối, rửa lại với 1 ml nƣớc cất vô trùng. Cho thêm vào ependorf 100 - 200 µl nƣớc cất vô trùng hòa tan sinh khối, đem vortex kỹ. 3. Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB agar, bằng cách sử dụng micropipet nhỏ từng giọt (khoảng 10µl ) lên môi trƣờng, ủ 24 giờ ở 28oC. 4. Sau khi khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc cất vô trùng vào đĩa petri hòa tan các khuẩn lạc. Pha loãng dịch khuẩn. Tiếp tục hút khoảng 30 µl dịch vi khuẩn sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml) trang đều trên mặt đĩa, ủ 48 giờ ở 280C. 45 Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, sử dụng que tăm đã hấp, sấy cấy điểm sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml), ủ 24 giờ ở 280C. Từ đĩa M9 này tiếp tục cấy điểm các khuẩn lạc sang đĩa môi trƣờng KB, giữ đúng vị trí các khuẩn lạc nhƣ trên môi trƣờng M9. Ủ 24 giờ ở 280C. Đối chứng cũng đƣợc thực hiện bằng cách nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn cho, nhận và hỗ trợ theo quy trình đƣợc trình bày trong mục 4.2.5. Kết quả đối chứng đƣợc trình bày trong hình 4.6. Kết quả đối chứng cho thấy dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 chƣa tiếp hợp không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml). Nhƣ vậy, các dòng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc là vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận đã tiếp hợp và vi khuẩn hỗ trợ. Các dòng vi khuẩn sau khi hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng KB đƣợc đem chiếu dƣới tia UV. Những dòng phát sáng là các dòng Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp, còn những dòng không phát sáng là các dòng vi khuẩn E.coli cho và hỗ trợ. Chỉ chọn những dòng phát sáng, loại bỏ những dòng không phát sáng. Nhƣ vậy, qua hai bƣớc chọn lọc: chọn lọc bằng kháng sinh và chọn lọc dựa vào khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB, chúng ta có thể thu đƣợc những dòng Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp. Do đó, chúng tôi kết luận quy trình đƣợc A B C Hình 4.6: Kết quả đối chứng. (A) dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chưa tiếp hợp, (B) dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid hỗ trợ pRK600, (C) dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid pUT-gfp 46 trình bày trong mục 4.2.5 là quy trình tối ƣu cho việc chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. So với nghiên cứu của Đỗ Thị Ngọc Hân (2006), chúng tôi đã tìm ra phƣơng pháp chọn lọc thích hợp hơn để thu nhận đƣợc các dòng Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp. Với quy trình tiếp hợp mà chúng tôi đã phát triển việc chọn lọc dòng vi khuẩn nhận thích hợp để làm đối tƣợng nghiên cứu cũng dễ dàng hơn rất nhiều vì không phải phụ thuộc quá chặt chẽ vào tính kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn nhận. Tuy nhiên, hạn chế của đề tài này là chúng tôi không thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Và do hạn chế về máy móc chúng tôi cũng không thực hiện đƣợc việc quan sát các tế bào vi khuẩn dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang để chọn ra dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tiếp hợp có biểu hiện phát sáng mạnh. Chúng tôi đã đƣa ra quy trình tối ƣu để chuyển DNA plasmid vào vi khuẩn bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần, tạo tiền đề để so sánh hiệu quả chuyển gene bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với phƣơng pháp biến nạp bằng cách xử lý với calcium chloride mà Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái (2005) đã trình bày trong nghiên cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α”, góp phần chọn ra phƣơng pháp thích hợp để thực hiện mục đích chuyển các gene mong muốn vào tế bào vi khuẩn để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tôi đã khảo sát và tìm ra quy trình thích hợp để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. Quy trình này không đòi hỏi phải sử dụng nhiều loại kháng sinh để chọn lọc, dòng vi khuẩn nhận không cần đáp ứng điều kiện phải kháng với ít nhất một loại kháng sinh mà vi khuẩn cho và vi khuẩn hỗ trợ không kháng đƣợc. Do đó có thể dễ dàng chọn đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu. Thay vì sử dụng nhiều loại kháng sinh chúng ta có thể dựa vào đặc điểm của Pseudomonas fluorescens là phát sáng trên môi trƣờng KB để phân biệt giữa Pseudomonas fluorescens và các dòng vi khuẩn E.coli cho và hỗ trợ. Trong quá trình tiếp hợp, nuôi chung 3 dòng vi khuẩn trên môi trƣờng LB agar sẽ cho kết quả chọn lọc tốt hơn là nuôi chung trên môi trƣờng KB. Cơ chế của hiện tƣợng này chúng tôi chƣa giải thích đƣợc. Hạn chế của đề tài này là chúng tôi không thực hiện đƣợc giai đoạn chạy PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. 5.2 Đề nghị Một số hƣớng phát triển của đề tài: Chuyển gene bằng phƣơng pháp điện biến nạp và so sánh hiệu quả giữa hai phƣơng pháp. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Quan sát dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang các dòng Pseudomonas fluorescens đã chuyển gene gfp để chọn ra dòng có biểu hiện phát sáng mạnh. Khảo sát khả năng định cƣ của Pseudomonas fluorescens trên rễ cây trồng. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006. Chuyển gene gfp (Green Fluorescent Protein) vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Duy Bình, 2004. Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Rhizoctonia solani gây hại trên cây bông vải. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Trọng Thể, 2004. Chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây hại trên cây bông vải và cây cà chua. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 4. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005. Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 5. Phạm Mỹ Liên, 2004. Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên cây cà chua. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh 1. Bloemberg, G. V., G. A. O’Toole, B. J. J. Lugtenberg, and R. Kolter. 1997. Green Fluorescent Protein as a marker for Pseudomonas spp.. Applied and Environmental Microbiology. 63: 4543-4551. 2. Brown, T. A. 1995. Gene cloning: an introduction, 3rd ed. Chapman and Hall, London, UK. 49 3. Cameron, L. 2007. Recombinant DNA technology. Mbio 4570 Laboratory, 201 Buller Bldg, Canada. 4. de Lorenzo,V. , M. Herrero, U. Jakubzik, and K. N. Timmis. 1990. Mini- Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gram-negative eubacteria. J. Bacteriol. 172: 6568-6572. 5. Finan,T.M., B. Kunkel, G.F. de Vos, and E.R. Signer. 1986. Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloti carrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes. J. Bacteriol. 167: 66-72. 6. Grall, S. and C. Manceau. 2003. Colonization of Vitis vinifera by a Green Fluorescence Protein-Labeled, gfp-Marked Strain of Xylophilus ampelinus, the Causal Agent of Bacterial Necrosis of Grapevine. Applied and Environmental Microbiology. 69(4): 1904–1912. 7. Mayer, G. 2007. Exchange of genetic information. In Microbiology and Immunology On-line, Hunt, R.C. editor. University of South Carolina School of Medicine. 8. Mergeay, M., and J. Gerits. 1978. F'-Plasmid Transfer from Escherichia coli to Pseudomonas fluorescens. J. Bacteriology. 135: 18-28. 9. Mølbak, L. 2003. Conjugative plasmids and the transfer of mobile genetic elements among bacteria in plant rhizosphere environments. PhDs thesis. National Environmental Research Institute, Denmark. 142 pp. 10. Royston,C. 1972. Molecular structure of bacterial plasmids. Bacteriological Reviews. 36: 361-405. 11. Sawada,H., H. Ieki, and I. Matsuda. 1995. PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains. Applied and Environmental Microbiology. 61: 828-831. 50 12. Sepúlveda-Torres, L. D. C., N. Rajendran, M. J. Dybas, C. S. Criddle. 1999. Generation and initial characterization of Pseudomonas stutzeri KC mutants with impaired ability to degrade carbon tetrachloride. Arch Microbiol. 171: 424-429. 13. Smith, A. W., and B. H. Iglewsski. 1989. Transformation of Pseudomonas aeruginosa by electroporation. Nucleic Acids Res. 17: 10509. 51 PHỤ LỤC Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Tryptone 10g Bacto yeast extract 5g NaCl 10g Thêm nƣớc cho tới 1000ml Chuẩn độ pH=7.0 bằng NaOH 1N Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút Môi trƣờng KB (King’s B) agar Proteose peptone 20g Glycerol 15ml K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 1.5g Thêm nƣớc cho tới 1000ml Chuẩn độ pH=7.2 bằng NaOH 1N Agar 15g Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút Môi trƣờng M9 Na2HPO4.7H2O 6g KH2PO4 3g NaCl 0.5g NH4Cl 1g Thêm 950ml nƣớc Chuẩn độ pH=7.4 bằng NaOH 1N 52 Bacto agar 15g Hấp khử trùng 1210C trong 20 phút, để nhiệt độ hạ xuống 600C thêm 10ml Glucose 20% đã đƣợc lọc 1ml CaCl2 0.1M đã hấp khử trùng 1ml MgSO4 1M đã hấp khử trùng 50 µl Thiamine 100 µg/ml đã đƣợc lọc Thêm nƣớc tới 1000ml Các dung dịch stock kháng sinh Pha các dung dịch stock có nồng độ 100µg/µl Cân 100 mg kháng sinh Ampicillin cho vào 1ml nƣớc hấp vô trùng trong eppendorf 1,5 ml, trộn đều rồi lọc qua đầu lọc 0.22 µm. Dung dịch kháng sinh đƣợc chiết ra các eppendorf 200µl. Cất ống eppendorf dùng thƣờng vào tủ mát 50C, các ống còn lại bảo quản trong tủ -200C, tất cả các ôngg đều đƣợc bọc giấy bạc và bảo quản trong tối. Pha tƣơng tự cho Kanamycin. Còn Chloramphenicol cũng đƣợc pha tƣơng tự nhƣng thay nƣớc bằng ethanol nguyên chất. Vật liệu dùng để xem kính hiển vi Lam Lame Dầu soi kính Giấy lau kính Bảng xử lý số liệu thống kê theo phần mềm MINITAB Release 13.2 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Thời gian Analysis of Variance for So khuan Source DF SS MS F P Thoi gia 2 78091 39045 6,62 0,030 Error 6 35413 5902 Total 8 113504 53 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 16 3 288,00 69,74 (--------*--------) 20 3 509,33 94,01 (--------*--------) 24 3 446,67 63,29 (--------*--------) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 76,83 240 360 480 600 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Tỉ lệ vi khuẩn Analysis of Variance for So khuan Source DF SS MS F P Ti le VK 4 24453 6113 2,30 0,130 Error 10 26557 2656 Total 14 51010 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 111 3 657,33 91,24 (---------*--------) 112 3 679,33 18,04 (--------*---------) 113 3 666,67 45,49 (--------*---------) 114 3 717,00 30,41 (--------*---------) 115 3 767,33 40,41 (---------*--------) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 51,53 630 700 770 840 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Nhiệt độ ủ Analysis of Variance for So khuan Source DF SS MS F P Nhiet do 2 199054 99527 10,59 0,011 Error 6 56405 9401 Total 8 255460 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+----- 24 3 637,3 116,6 (------*------) 28 3 877,3 106,2 (------*------) 32 3 520,0 57,7 (------*------) -+---------+---------+---------+----- Pooled StDev = 97,0 400 600 800 1000 Saving file as: C:\Data\day du.MPJ