Luận văn Khảo sát khả năng ức chế virus herpes simplex của diterpen lacton từ cây xuyên tâm liên

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 CHIẾT XUẤT DITERPEN LACTON TOÀN PHẦN TỪ LÁ XUYÊN TÂM LIÊN [6], [12], [28], [35], [54], [55], [61], [63] Dựa vào bảng 1.1 thể hiện phần trăm tổng các diterpen lacton trong Xuyên tâm liên khi thu hoạch ở các thời điểm tăng trưởng khác nhau. Ở cả 2 mẫu thì tại thời điểm nở hoa có tổng % diterpen lacton cao nhất và hàm lượng diterpen lacton trong lá có sự chênh lệch cao so với thân vì vậy lá được chọn làm nguyên liệu chiết xuất. Từ 10 kg Xuyên tâm liên dạng khô, loại bỏ thân, rễ thu lấy lá, xay nhỏ thu được 3,8kg, Làm ẩm bột lá (3,4kg), rồi cho vào bình ngấm kiệt dung tích 10 lít, ngâm qua đêm với MeOH. Rút dịch chiết với tốc độ 10 ml/phút, theo dõi khi dung môi xuống xấp mặt bột lá, bổ sung dung môi để đạt tỉ lệ dược liệu: dung môi là 1:6. Loại chlorophyl bằng than hoạt tính với tỉ lệ than là 15%. Thu được khoảng 20 lít dịch chiết, sau khi cô thu hồi bằng máy cô quay thu được 500 g cao loại màu tương đương với 14,7% (khối lượng cao/ khối lượng bột lá) cao hơn so với Subhash C. Mandal và cs tỷ lệ chiết bằng MeOH là 9,37%, chứng tỏ sử dụng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là MeOH tỷ lệ 1:6 chiết kiệt hơn so với kết quả đã công bố của Subhash C. Mandal bằng phương pháp Soxhlet. Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất diterpen lacton toàn phần từ lá XTL [6, 55, 63] Nguyên liệu Thu 500 g cao loại màu Chiết bằng pp ngấm kiệt (MeOH) Tỷ lệ 1:6 Xay bột (3,4kg) Cô chân không Dịch chiết loại tạp bằng than hoạt KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 Hình 3.1 Cao chiết loại màu Hình 3.2 SKLM so sánh cao toàn phần (CTP) với diterpen lacton đối chiếu (C) Vậy cao toàn phần có 3 chất là andrographolid, neoandrographolid, dehydroandrographolid. 3.2 PHÂN LẬP 3 DITERPEN LACTON CHÍNH TỪ CAO CHIẾT XTL 3.2.1 Phân lập A1[63] Dựa vào khả năng kết tinh dễ dàng của A1 trong dung môi MeOH bằng phương pháp kết tinh lạnh, tiến hành hòa tan 500g cao chiết loại màu với lượng MeOH nóng vừa đủ. Làm lạnh và để qua đêm, thu được 6,9 g kết tinh màu vàng. Lượng kết tinh này được rửa và tái kết tinh nhiều lần với MeOH lạnh, thu được 5,9 g tinh thể A1 có hình phiến, màu trắng. Dịch MeOH còn lại được cô thành cao. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 47 Sơ đồ 3.2. Quy trình phân lập A1 [55], [63] Hình 3.3 Tinh thể A1 qua các lần kết tinh: lần 1 (a), lần 2 (b), lần 3 (c), lần 4 (d) Cao đã loại màu 6,887g tinh thể Kết tinh lạnh Dịch MeOH còn lại Tái kết tinh nhiều lần (thu 5,9 g A1) Cô lại thành cao A2-3 a b c d KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 3.2.2 Phân lập A2 và A3 Thăm dò điều kiện sắc ký cột [3], [12], [63] Sắc ký cột cổ điển: Chuẩn bị cột sắc ký với lượng silicagel gấp 25 lần lượng mẫu. Cột được ổn định và khai triển bắt đầu với CHCl3, tăng dần đến hệ CHCl3-MeOH (99:1) (63), mỗi bước tăng 0,5% MeOH ứng với 5 phân đoạn 100 ml. Kết quả thu được phân đoạn 6 - 10 có A2. Tiếp tục tăng dần đến hệ CHCl3-MeOH (99:5) phân đoạn 31-38 có A3. Các phân đoạn A2 được gom lại và cô đuổi hết dung môi. Hòa cắn lại với CHCl3 vừa đủ, tiếp tục cho qua cột nhỏ để loại tạp với hệ CHCl3 - MeOH, tăng dần hệ CHCl3-MeOH mỗi bước tăng 0,2% để thu được phân đoạn A2 sạch nhất, thu phân đoạn này, cô đến cắn, sau đó hòa tan trở lại với một lượng MeOH nóng vừa đủ, để trong điều kiện lạnh, thu kết tinh, tái kết tinh lần thứ hai thu được 0,8g kết tinh A2. Tương tự với A3 cũng cho qua cột nhỏ hơn và cung tăng dần hệ CHCl3-MeOH mỗi bước tăng 0,2% để loại tạp, sau đó tiến hành kết tinh lạnh và tái kết tinh nhiều lần thu được 0,23g tinh thể A3. Sơ đồ 3.3 Quy trình phân lập (A2), (A3) Cao A2-3 Phân đoạn 31-38 Qua cột sắc ký cổ điển Phân đoạn 6-10 Gom các phân đoạn có A3, cô lại Gom các phân đoạn có A2, cô lại Kết tinh và tái kết tinh (thu được A3) Kết tinh và tái kết tinh (thu được A2) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 49 Hình 3.4 Tinh thể A2 qua các lần kết tinh: lần 1 (a), lần 2 (b), lần 3(c) Hình 3.5 Tinh thể A3 qua các lần kết tinh: lần 1 (a), lần 2 (b), lần 3 (c), lần 4(d), lần 5(e) 3.3 XÁC ĐỊNH LÝ HÓA TÍNH VÀ CÁC PHỔ NGHIỆM CỦA 3 DITERPEN LACTON PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.3.1 Cảm quan A1 có tinh thể hình phiến, không màu, không mùi, vị rất đắng. A2 có tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị đắng. A3 có tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, không có vị đắng. Cả 3 tan trong MeOH, EtOH, CHCl3, CH2Cl2. Tan kém trong nước. a b c c d e a b c KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50 ¾ Nhận xét: Tính chất của A1, A2, A3 phù hợp với tài liệu của tác giả C. Patarapanich, G.A. Akowuah. 3.3.2 Phản ứng hóa học Phản ứng tạo màu với thuốc thử Kedde, cho màu hồng tím đặc trưng của vòng lacton 5 cạnh. Cho vào ống nghiệm khoảng 1 mg tinh thể, thêm 1 ml MeOH vào hòa tan, nhỏ thêm 250 µl thuốc thử Kedde A và 250 µl thuốc thử Kedde B, lắc đều. Bảng 3.1 Kết quả phản ứng màu của A1, A2, A3 A1 A2 A3 Diterpen lacton đối chiếu (C) Hồng tím Hồng tím Hồng tím Hồng tím C: diterpen lacton đối chiếu Hình 3.6 Kết quả phản ứng màu của A1, A2, A3 ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 có phản ứng của vòng lacton 5 cạnh. 3.3.3 Điểm nóng chảy Điểm nóng chảy đo theo phương pháp mao quản trên máy Stuart SMP3. Bảng 3.2 Kết quả đo điểm nóng chảy của A1, A2, A3 [17], ]23] A1 Andrographolid Điểm nóng chảy (0C) 229 226-230 A2 Dehydroandrographolid Điểm nóng chảy (0C) 208 203-204 A3 Neoandrographolid Điểm nóng chảy (0C) 170 167-174 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 51 ¾ Nhận xét: điểm nóng chảy của A1, A2, A3 tương đương với điểm nóng chảy của andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid. 3.3.4 Sắc ký lớp mỏng Tiến hành sắc ký trên bản mỏng silicagel F254, dung môi CHCl3-MeOH (9:1), nồng độ dịch chấm 1 mg/ml trong MeOH, thể tích chấm 10 µl, khoảng khai triển 8 cm, phát hiện ở UV 254 nm và thuốc thử anisaldehyd sulfuric ở 1100C/5 phút. . UV 254 nm Thuốc thử anisaldehyd C: diterpen lacton đối chiếu, A1, A2, A3: 3 diterpen lacton phân lập Hình 3.7 SKLM so sánh A1, A2, A3 với diterpen lacton đối chiếu Bảng 3.3 Kết quả SKLM so sánh A1, A2, A3 với chuẩn UV 254 Rf Anisaldehyd A1 Tắt quang 0,33 Nâu A2 Tắt quang 0,54 Xám A3 Không tắt quang 0,15 Tím Vết 1 Tắt quang 0,55 Nâu Vết 2 Tắt quang 0,33 Xám Diterpen lacton đối chiếu Vết 3 Không tắt quang 0,14 Tím ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 cho vết có trị số Rf và màu sắc tương ứng với 3 vết của chuẩn diterpen lacton đối chiếu, trong đó vết A1 có Rf và màu sắc tương ứng với andrographolid đối chiếu, A1, A2, A3 chỉ cho một vết cho thấy chúng không lẫn tạp. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 3.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao Cân chính xác khoảng 1 mg tinh thể, hòa tan trong bình định mức 10 ml với MeOH, thêm MeOH đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện như mục 2.5. Phát hiện ở bước sóng hấp thu cực đại của mỗi chất. Hình 3.8 Sắc ký đồ của dung dịch chứa A1 Bảng 3.4. Thời gian lưu và diện tích đỉnh của dung dịch chứa A1 Đỉnh Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh % diện tích đỉnh % chiều cao đỉnh 1 1,6 1019 143 0,02 0,023 2 1,736 1670 329 0,033 0,053 3 1,916 8227 1230 0,164 0,198 4 2,853 1133 290 0,023 0,047 5 4,290 1062 141 0,021 0,023 6 5,358 2047 258 0,041 0,042 7 5,816 5006948 618477 99,698 99,615 Tổng 5022106 620869 100,000 100,000 A1 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 100 200 300 mAU Top / 5.135 min Dow nslope / 5.274 min Upslope / 4.936 min Hình 3.9 Độ tinh khiết của đỉnh A1 ¾ Nhận xét: Sắc ký đồ có một pic có tR = 5,816 phút chiếm hàm lượng 99,698% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ, đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 225 nm, độ tinh khiết của pic đạt. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min 0 25 50 75 100 125 mAU 250nm,4nm (1.00) 2. 89 4 3. 04 9 9. 25 6 Hình 3.10 Sắc ký đồ của dung dịch chứa A2 Bảng 3.5 Thời gian lưu và diện tích đỉnh của dung dịch chứa A2 Đỉnh Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh % diện tích đỉnh % chiều cao đỉnh 1 2,894 3203 355 0,257 0,554 2 3,049 1447 576 0,116 0,900 3 9,256 1240593 63123 99,627 98,547 Tổng 1245243 64053 100,000 100,000 A2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 25 50 75 mAU Top / 9.256 min Dow nslope / 9.440 min Upslope / 9.044 min Hình 3.11 Độ tinh khiết của đỉnh A2 ¾ Nhận xét: Sắc ký đồ có một pic có tR = 9,25 phút chiếm hàm lượng 99,63% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ, đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 250 nm, độ tinh khiết của pic đạt. Hình 3.12 Sắc ký đồ của dung dịch chứa A3 Bảng 3.6 Thời gian lưu và diện tích đỉnh của dung dịch chứa A3 Đỉnh Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh % diện tích đỉnh % chiều cao đỉnh 1 2,310 2358 312 0,180 0,551 2 3,845 3092 216 0,236 0,381 3 5,230 6576 315 0,502 0,556 4 8,794 1297946 55788 99,082 98,512 Tổng 1309973 56631 100,000 100,000 A3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 55 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 25 50 75 100 125 150 mAU Top / 8.793 min Dow nslope / 8.975 min Upslope / 8.550 min Hình 3.13 Độ tinh khiết của đỉnh A3 ¾ Nhận xét: Sắc ký đồ có một pic có tR = 8,79 phút chiếm hàm lượng 99,08% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ, đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 202 nm, độ tinh khiết của pic đạt. 3.3.6 Phổ tử ngoại Kết quả chụp phổ UV của AP, NP, DP được trình bày ở PL 2.2, số liệu được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7 Đỉnh hấp thu UV của A1, A2, A3 [17, 23] A1 Andrographolid Đỉnh thấp thu (nm) 225 223 A2 Dehydroandrographolid Đỉnh thấp thu (nm) 251 250 A3 Neoandrographolid Đỉnh thấp thu (nm) 201 202 ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 có đỉnh hấp thu UV tương ứng với đỉnh hấp thu UV của andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 56 3.3.7 Phổ hồng ngoại Kết quả chụp phổ UV của AP, NP, DP được trình bày ở PL 2.3, số liệu được trình bày trong bảng 4.7. Bảng 3.8 So sánh phổ IR của A1 và andrographolid IR (cm-1) Nhóm chức A1 Andrographolid [65] -OH -CH2- C =O (Vòng lacton) C=C =CH2 3398,3 2868,0 1728,1 1674,1 906,5 3450 2880 1730,0 1674,1 906,5 Bảng 3.9 So sánh phổ IR của A2 và dehydroandrographolid IR (cm-1) Nhóm chức A2 Dehydroandrographolid [28] -OH -CH2- C =O (Vòng lacton) C=C =CH2 3300 2850,6 1755 1637,5 883,3 3422 2880 1741 1640 883 Bảng 3.10 So sánh phổ IR của A3 và neoandrographolid IR (cm-1) Nhóm chức A3 Neoandrographolid [67] -OH -CH2- C =O (Vòng lacton) C=C =CH2 3386,8 2848,7 1747,4 1649,0 910,3 3300 2880 1748 1640 909 ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 có các đỉnh hấp thu IR tương ứng với đỉnh hấp thu IR của andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 57 3.3.8 Phổ khối (MS) Bảng 3.11 So sánh khối phổ MS của A1 và Andrographolid A1 Andrographolid [M + H]+ 351 351 A2 Dehydroandrographolid [M + H]+ 333 333 A3 Neoandrographolid [M + H]+ 481 481 Kết quả phổ MS: ESI-MS (pos.) [M+H]+ =351, khối lượng của phân tử A1 là 350, bằng với khối lượng phân tử của andrographolid (C20H30O5, M=350). ESI-MS (pos.) [M+H]+ = 333, khối lượng phân tử A2 là 332 bằng với khối lượng phân tử của dehydroandrographolid (C20H28O4, M=332). ESI-MS (neg.) [M-H+2H2O]- = 515, ESI-MS (pos.) [M+H]+ = 481. Vậy khối lượng phân tử của A3 là 480, bằng với khối lượng phân tử của neoandrographolid (C26H40O8, M=480). 3.3.9 Phổ proton NMR (1H-NMR) (Xem ở PL 5,6,7) Bảng 3.12 Dữ liệu phổ 1H-NMR (δ, 500 MHz) của các hợp chất A1( trong CDCl3 & MeOD), A2 và A3 (trong C6D5N) δH, ppm C A1 AP [66] A2 DP [64] A3 NP [66] 1 1,82 (H, m) 1,26 (H, m) 1,80 (H, m) 1,28 (H, m) 2 1,79 (2H, m) 1,78 (2H, m) 3 3,42 (H, m) 3,38 (H, m) 3,64 brt 0,93 (2H) 0,94 (2H) 5 1,30 (H, m) 1,32 (H, m) 6 1,26 (H, m) 1,85 (H.m) 1,28 (H, m) 1,90 (H, m) 7 2,01 (H, m) 2,42 (H, m) 2,04 (H, m) 2,42 (H, m) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 58 9 1,98 (H, dd.) 1,91 (H, dd. 9,4; 5,0) 11 2,57 (2H, m) 2,58 (2H, m) 7,14 (dd.10,5;16,0) 7,15(dd,10,3;15,5) 12 6,92 (H, dd.) 6,83 (H, dd. 6,7; 5,4) 6,26 (d,15,5) 6,40 (d,15,5) 2,20 (H,m) 2,50 (H,m) 2,34 (H,m) 2,51 (H,m) 14 4,97 (H, d.) 5,00 (H, d. 6,0) 7,32 m 7,36 m 7,15 (H,t, 1,5) 7,15 (H,t,1,5) 15 4,45 (H, dd.) 4,46 (H, dd.10,2; 6,1) 4,78 s 4,80 s 4,72 (2H) 4,72 (2H) 16 17 4,89 (2H, s) 4,87 (2H) 4,7 (brd. 1,5) 4,86 (d. 1,5) 4,81 brd 4,88 (d, 7,8) 4,70 (Ha,s) 4,91 (Hb,brs) 4,70 (Ha,s) 4,91 (Hb,brs) 18 1,23 (H, s) 1,28 (3H, s) 1,51 s 1.54 s 1,17 (3H,s) 1,18 (3H,s) 19 4,17 (H, d.) 3,31 (H, d.) 4,12 (H, d. 11,5) 3,35 (H, d. 11,5) 4,47 (d. 11,0), 2,38 (1H,d, 10,0; H-19a) 4,12 (d.12,0) 4,50 (d.11,0) 3,52 (Ha,d. 9,5) 4,32 (Hb,d. 9,5) 3,49 (Ha,d. 9,5) 4,32 (Hb,d. 9,5) 20 0,74 (3H, s) 0,74 (3H, s) 0,88 s 0,98 s 0,63 (3H,s) 0,64 (3H,s) 1’ - - - - 4,82 (H,d,J=7) 4,81 (H,d. 8,0) 2’ - - - - 4,03 (H,m) 4,02 (H,m) 3’, 4’ - - - - 4,19-4,24 (2H,m) 4,19-4,23 (2H,m) 5’ - - - - 3,95 (H,m) 3,94 (H,m) 6’ - - - - 4,38 (Ha,dd. 12,0;5,5) 4,54 (Hb,dd. 12,0;3,0) 4,37 (Ha,dd.12,0;5,5) 4,53 (Hb,dd. 11,5) 3.3.10 Phổ carbon 13 NMR (13C-NMR) (Xem ở PL 5,6,7) Nơi thưc hiện: Viện Hóa Học-Trung tâm KHTN và Công Nghệ Quốc Gia, Hà Nội. Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 13C -NMR của các hợp chất A2, A3 (δ, C6D5N, 125 MHz) δC, ppm C DEPT A2 Dehedroandro grapholid [64] DEPT A3 Neoandrogra pholid [66] 1 2 3 4 CH2 CH2 CH q 39,0 28,9 80,2 43,4 38,7 28.9 80,2 43,3 CH2 CH2 CH2 q 39,0 19,4 36,4 39,8 39,2 19,5 36,6 39,9 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 59 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ CH CH2 CH2 q CH q q CH q CH CH2 q CH2 CH3 CH2 CH3 - - - - - - 54,8 23,7 37,0 149,3 61,9 38,8 135,1 122,0 129,0 145,0 70,3 172,8 108,8 23,7 64,2 16,0 - - - - - - 55,6 24,7 37,4 149,3 61,9 39,5 134,2 122,0 129,0 145,3 70,6 174,5 108,0 23,7 64,2 16,0 - - - - - - CH CH2 CH2 q CH q CH2 CH2 CH CH CH2 q CH2 CH3 CH2 CH3 CH CH CH CH CH CH2 56,2 25,0 38,6 148,2 56,7 38,7 22,1 24,7 134,2 145,3 70,6 174,6 106,9 28,1 72,6 15,4 105,4 75,3 78,7 71,8 78,3 62,9 56,3 25,1 38,9 148,3 56,8 38,7 22,2 24,8 134,3 145,3 70,6 174,0 107,0 28,2 72,7 15,5 105,5 75,4 78,8 72,0 78,4 63,0 ™ Nhận xét chung: Qua các kết quả kiểm tra về cảm quan, phản ứng hóa học, nhiệt nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ IR, phổ UV và HPLC, MS và NMR có thể khẳng định A2 là dehydroandrographolid, A3 là neoandrographolid, A1 so sánh với andrographolid đối chiếu đã xác định phổ MS và NMR [1] được kết luận là andrographolid. Các chất này có độ tinh khiết trên 98% nên có thể dùng làm chuẩn đối chiếu cho định tính, định lượng và thử hoạt tính sinh học. Hình 3.14 Công thức cấu tạo của andrographolid, neoandrographolid, dehydroandrograhpholid KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60 3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3.4.1 Thăm dò điều kiện tách 3 diterpen lacton trên HPLC Sau khi xác định A1, A2, A3 lần lượt là andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid, các chất này được dùng làm chuẩn đối chiếu cho quá trình định lượng diterpen lacton trong dược liệu Xuyên tâm liên. Ba chất được trộn chung để thăm dò khả năng tách trên HPLC. Thử trên hệ dung môi methanol: Cân chính xác khoảng 1 mg mỗi chất andrographolid (AP), dehydroandrographolid (DP) và neoandrographolid (NP), hòa tan với hệ dung môi MeOH: H2O tỷ lệ 85:15, 75:25, 65:35, 55:45, 50:50 trong bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký với điều kiện: − Cột sắc ký: Supelco RP-C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). − Pha động: MeOH-H2O (65:35). − Tốc độ dòng: 1 ml/phút. − Thể tích bơm: 20 µl. − Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. − Bước sóng phát hiện: 223 nm. Thử trên hệ dung môi acetonitril: Cân chính xác khoảng 1 mg mỗi chất andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid, hòa tan với hệ ACN-H2O tỷ lệ 40:60, 50:50, 55:45 trong bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký với điều kiện như trên hệ dung môi methanol. ¾ Nhận xét: Sau khi thăm dò, có 2 hệ dung môi cho phép tách tốt 3 diterpen lacton, là hệ MeOH-H2O (50:50) và hệ ACN-H2O (40:60) nhưng hệ MeOH-H2O (50:50) có thời gian tách khá lâu không thích hợp cho quá trình định lượng. Hệ ACN-H2O (40:60) được lựa chọn để tách 3 diterpen lacton trên cột RP-C8. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 61 0 10 20 30 40 50 60 min 0 10 20 30 40 50 60 mAU 223nm,4nm (1.00) 1. 39 4 2. 98 0 7. 27 1 15 .2 69 52 .3 25 57 .5 24 Hình 3.15 Khả năng tách 3 diterpen lacton trên hệ MeOH-H2O (50:50) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 mAU 223nm,4nm (1.00) 5. 80 5 7. 69 5 14 .7 85 Hình 3.16 Khả năng tách 3 diterpen lacton trên hệ ACN-H2O (40:60) 3.4.2 Xây dựng quy trình định lượng ™ Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg andrographolid cho vào bình định mức 5 ml, hòa tan và điền đến vạch bằng hệ dung môi ACN-H2O (40:60) được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng thành các dung dịch có nồng độ thích hợp. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha tương tự cho dehydroandrographolid và neoandrographolid. ™ Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình tam giác 250 ml, chiết 6 lần, mỗi lần với 10 ml MeOH và đánh siêu âm trong 15 phút. Lọc qua giấy lọc, rửa bã dược liệu với 10 ml MeOH. Loại tạp bằng 200 mg than hoạt, lọc qua giấy lọc, rửa than bằng 10 ml MeOH. Cô cách thủy đuổi hết dung môi. Hòa lại với 30 ml hệ dung môi ACN-H2O (40:60), chuyển vào bình định mức 50 ml và điền dung môi đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 62 Sơ đồ 3.4 Chuẩn bị mẫu thử T: dịch chiết trước khi loại tạp bằng than hoạt S: dịch chiết sau khi loại tạp bằng than hoạt Hình 3.17 Dịch chiết trước và sau khi loại tạp bằng than hoạt ™ Điều kiện sắc ký HPLC được lựa chọn là: − Cột sắc ký: Supelco RP-C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). − Pha động: ACN-H2O (40:60). − Tốc độ dòng: 1 ml/phút. − Thể tích bơm: 20 µl. − Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. − Bước sóng phát hiện: 223 nm. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 63 3.4.3 Khảo sát tính tương thích hệ thống Chuẩn bị mẫu chuẩn của từng chất và mẫu thử theo mục (3.4.2), trộn 3 mẫu chuẩn thành mẫu chung. Tiêm 6 lần vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn. Bảng 3.14 Khảo sát tính tương thích hệ thống của andrographolid chuẩn n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 5,816 4987933 618145 1,143 11823,369 2,145 2 5,840 5020301 620393 1,142 11926,669 2,234 3 5,837 5042650 624040 1,147 11876,489 2,224 4 5,835 4917208 608593 1,149 11881,204 2,168 5 5,856 5006183 611190 1,151 11718,563 2,188 6 5,844 5095314 624368 1,156 11672,388 2,203 TB 5,838 5011598 617788 1,148 11816,447 2,194 SD 0,011 59241 6594 0,012 100,333 0,033 RSD (%) 0,22 1,18 1,07 0,45 0,85 1,54 Bảng 3.15 Khảo sát tính tương thích hệ thống của andrographolid thử n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 5,839 10713176 1385450 1,115 12929,962 2,156 2 5,843 10835348 1407275 1,117 13010,173 2,229 3 5,848 10672879 1369729 1,109 12774,642 2,185 4 5,836 10675571 1390385 1,119 12976,462 2,186 5 5,832 10417589 1370029 1,095 13078,538 2,244 6 5,825 10743935 1395167 1,124 12917,189 2,218 TB 5,839 10676416 1386339 1,112 12947,828 2,203 SD 0,014 140124 14665 0,012 103,003 0,034 RSD (%) 0,14 1,31 1,06 0,91 0,80 1,49 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 Bảng 3.16 Khảo sát tính tương thích hệ thống của dehydroandrographolid chuẩn n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 14,899 3467265 223844 1,025 19986,751 21,015 2 14,879 3483888 215460 1,027 20061,893 21,635 3 14,830 3556364 222985 1,039 20001,013 21,545 4 14,752 3557818 225214 1,031 20009,071 21,171 5 14,663 3552313 224881 1,022 19947,560 21,569 6 14,765 3521330 219434 1,028 20042,532 21,824 TB 14,803 3523163 221969 1,032 20008,141 21,460 SD 0,091 39556 3803 0,011 40,623 0,305 RSD (%) 0,60 1,12 1,71 0,57 0,20 1,42 Bảng 3.17 Khảo sát tính tương thích hệ thống của dehydroandrographolid thử n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 14,846 1089306 72048 1,085 20111,338 20,931 2 14,919 1119055 72415 1,066 20133,063 21,226 3 14,952 1071086 69953 1,062 20935,701 21,633 4 14,904 1087938 70790 1,084 20882,912 21,717 5 14,886 1088099 69941 1,102 20281,532 21,740 6 14,827 1098640 70472 1,103 20399,301 21,886 TB 14,889 1092354 70936 1,081 20457,309 21,517 SD 0,049 15822 1060 0,023 365,812 0,371 RSD (%) 0,31 1,45 1,49 1,59 1,79 1,70 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 65 Bảng 3.18 Khảo sát tính tương thích hệ thống của neoandrographolid chuẩn n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 7,702 573205 55050 1,106 12564,384 7,896 2 7,734 580467 56058 1,101 12860,402 8,216 3 7,720 602215 58311 1,104 12902,130 7,955 4 7,698 587638 56691 1,100 12711,691 7,784 5 7,774 589029 57192 1,086 13085,419 7,918 6 7,793 588895 57192 1,079 13169,355 7,959 TB 7,738 586908 56749 1,103 12882,232 7,955 SD 0,039 9721 1113 0,012 225,702 0,142 RSD (%) 0,50 1,66 1,96 0,99 1,75 1,80 Bảng 3.19 Khảo sát tính tương thích hệ thống của neoandrographolid thử n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 7,706 565565 57310 1,078 13688,763 7,965 2 7,706 558666 57233 1,108 14154,524 8,031 3 7,661 564002 56840 1,074 13812,229 7,751 4 7,644 546445 56231 1,079 14254,542 7,834 5 7,657 541403 56261 1,096 14217,700 7,918 6 7,668 548846 56731 1,118 14143,826 7,948 TB 7,672 554154 56767 1,092 14045,258 7,913 SD 0,031 9977 461 0,021 235,188 0,104 RSD (%) 0,34 1,80 0,81 1,66 1,67 1,27 ¾ Nhận xét: mẫu thử và mẫu chuẩn cho các giá trị thời gian lưu và diện tích đỉnh của andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid có giá trị RSD% < 2, nên quy trình sắc ký đã chọn và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo tính tương thích hệ thống. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66 3.4.4 Thẩm định quy trình định lượng 3.4.4.1 Khảo sát tính đặc hiệu 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 mAU 223nm,4nm (1.00) 19 50 95 1 32 77 45 49 36 81 Hình 3.18 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 mAU 223nm,4nm (1.00) 10 71 31 76 58 55 65 11 39 30 6 Hình 3.19 Sắc ký đồ của mẫu thử tương ứng 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 mAU 223nm,4nm (1.00) 18 54 74 51 16 08 60 9 24 41 41 5 Hình 3.20 Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn AP NP DP AP AP NP NP DP DP KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 67 Bảng 3.20 Phổ UV tại thời gian lưu của 3 diterpen lacton Andrographolid Dehydroandrographolid Neoandrographolid Mẫu chuẩn 225.0 250.0 275.0 300.0 nm 0 50 100 150 200 mAU 22 5 32 4 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 10 20 30 40 50 60 70 mAU 19 6 25 1 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 25 50 75 mAU 20 1 Mẫu thử 225.0 250.0 275.0 300.0 nm 0 500 1000 1500 2000 mAU 22 4 32 1 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 25 50 75 100 125 150 175 mAU 19 6 25 1 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 50 100 150 200 mAU 20 1 32 4 Mẫu thử thêm chuẩn 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 nm 0 500 1000 1500 2000 mAU 22 4 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 100 200 300 400 mAU 19 6 25 1 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 100 200 300 400 500 600 mAU 20 1 32 5 ¾ Nhận xét: mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn đều cho 3 đỉnh có thời gian lưu và phổ UV tương tự nhau. Diện tích 3 đỉnh của mẫu thử thêm chuẩn tăng lên rõ so với mẫu thử. Kết luận quy trình đạt độ đặc hiệu. 3.4.4.2 Khảo sát khoảng tuyến tính Chuẩn bị dung dịch chuẩn của từng chất như mục (3.4.2), sau đó pha loãng thành các dung dịch có nồng độ loãng dần. Tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn. Kết quả khảo sát sự tuyến tính như sau: Bảng 3.21 Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh AP DP NP Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh 0,025 1310810 0,013 444854 0,013 154895 0,050 2587560 0,025 863737 0,025 313942 0,100 5006948 0,050 1711876 0,050 602215 0,200 10515285 0,100 3267265 0,125 1551419 0,500 26216200 0,250 8553163 0,250 2986282 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 68 Hình 3.21 Đường biểu diễn sự tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của andrographolid Hình 3.22 Đường biểu diễn sự tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của dehydroandrographolid KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 69 Hình 3.23 Đường biểu diễn sự tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của neoandrographolid Bảng 3.22 Kết quả xử lý thống kê khảo sát khoảng tuyến tính AP DP NP Hệ số tương quan 0,9999 0,9996 0,9996 Hệ số b -74792 -23021 140151 Giá trị t của b -0,99 -0,45 0,76 Hệ số a 52583730 34146116 11962586 Giá trị t của a 170,66 82,02 82,66 Giá trị t0,05 3,18 3,18 3,18 Giá trị F 29126,48 6726,57 6832,10 Giá trị F0,05 10,13 10,13 10,13 Phương trình hồi quy y = 52583730x y = 34146116x y = 11962586x Khoảng tuyến tính (mg/ml) 0,025-0,500 0,013-0,250 0,013-0,250 ¾ Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của: − Andrographolid theo phương trình y=52583730x, R2= 0,9999 trong khoảng nồng độ từ 0,025 mg/ml đến 0,500 mg/ml. − Dehydroandrographolid theo phương trình y=34146116x, R2= 0,9996 trong khoảng nồng độ từ 0,013 mg/ml đến 0,250 mg/ml. − Neoandrographolid theo phương trình y=11962586x, R2= 0,9996 trong khoảng nồng độ từ 0,013 mg/ml đến 0,250 mg/ml. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 70 3.4.4.3 Khảo sát độ đúng Thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 bình mẫu thử thêm chuẩn với lượng tương đương 80%, 100%, 120% so với hàm lượng hoạt chất tương ứng trong mẫu thử. Mẫu thử được chuẩn bị theo mục (3.4.2) với thể tích 50 ml. Mẫu chuẩn của từng diterpen lacton được chuẩn bị theo mục (3.4.2) với nồng độ 1 mg/ml. Bảng 3.23 Kết quả khảo sát độ đúng của andrographolid Khoảng thêm Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ đo được (µg/ml) Lượng chuẩn tìm thấy (µg) Lượng chuẩn thêm vào (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) 230,85 10987896 208,96 935,35 923 101,34 230,85 10919011 207,65 922,25 923 99,9280% 230,85 11016817 209,51 940,85 923 101,93 230,85 11876561 225,86 1104,35 1154 95,70 230,85 11910740 226,51 1110,85 1154 96,26100% 230,85 12018537 228,56 1131,35 1154 98,04 230,85 13142251 249,93 1345,05 1385 97,12 230,85 13209558 251,21 1357,85 1385 98,04120% 230,85 13252677 252,03 1366,05 1385 98,63 TB 98,55 SD 2,15 RSD% 2,18 e 1,65 Bảng 3.24 Kết quả khảo sát độ đúng của dehydroandrographolid Khoảng thêm Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ đo được (µg/ml) Lượng chuẩn tìm thấy (µg) Lượng chuẩn thêm vào (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) 37,62 1147992 33,62 148,10 150 98,42 37,62 1156187 33,86 150,50 150 100,0180% 37,62 1154822 33,82 150,10 150 99,75 37,62 1271601 37,24 184,30 188 97,98 37,62 1253845 36,72 179,10 188 95,22100% 37,62 1282528 37,56 187,50 188 99,68 37,62 1396918 40,91 221,00 226 97,91 37,62 1395893 40,88 220,70 226 97,78120% 37,62 1406820 41,20 223,90 226 99,19 TB 98,44 SD 1,48 RSD% 1,51 e 1,14 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 71 Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ đúng của neoandrographolid Khoảng thêm Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ đo được (µg/ml) Lượng chuẩn tìm thấy (µg) Lượng chuẩn thêm vào (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) 43,33 464507 38,83 171,65 173,32 99,04 43,33 473838 39,61 179,45 173,32 103,5480% 43,33 469771 39,27 176,05 173,32 101,58 43,33 524799 43,87 222,05 216,65 102,49 43,33 513913 42,96 212,95 216,65 98,29100% 43,33 517621 43,27 216,05 216,65 99,72 43,33 568342 47,51 258,45 259,98 99,41 43,33 580544 48,53 268,65 259,98 103,33120% 43,33 575879 48,14 264,75 259,98 101,83 TB 101,03 SD 1,95 RSD% 1,93 e 1,50 ¾ Nhận xét: tỷ lệ hồi phục của andrographolid, dehydroandrographolid và neandrographolid nằm trong giới hạn cho phép nên quy trình đạt yêu cầu về độ đúng. 3.4.4.4 Khảo sát độ lặp lại Chuẩn bị 6 mẫu thử theo mục (3.4.2) với thể tích 50 ml. Tiêm mỗi mẫu một lần vào hệ thống, tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn. Bảng 3.26 Kết quả khảo sát độ lặp lại của andrographolid Mẫu Lượng cân (g) Diện tích đỉnh Nồng độ thử (µg/ml) Hàm lượng (%) 1 0,9937 13291064 252,76 1,27 2 0,9995 13397283 254,78 1,27 3 0,9968 13244264 251,87 1,26 4 1,0074 13237954 251,75 1,25 5 0,9933 13048127 248,14 1,25 6 0,9970 12980294 246,85 1,24 TB 1,26 SD 0,01 RSD (%) 1,15 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 72 Bảng 3.27 Kết quả khảo sát độ lặp lại của dehydroandrographolid Mẫu Lượng cân (g) Diện tích đỉnh Nồng độ thử (µg/ml) Hàm lượng (%) 1 0,9937 1334430 39,08 0,20 2 0,9995 1320089 38,66 0,19 3 0,9968 1328625 38,91 0,20 4 1,0074 1250431 36,62 0,18 5 0,9933 1292089 37,84 0,19 6 0,9970 1250431 36,62 0,18 TB 0,19 SD 0,01 RSD (%) 3,25 Bảng 3.28 Kết quả khảo sát độ lặp lại của neoandrographolid Mẫu Lượng cân (g) Diện tích đỉnh Nồng độ thử (µg/ml) Hàm lượng (%) 1 0,9937 663086 55,43 0,28 2 0,9995 671580 56,14 0,28 3 0,9968 625763 52,31 0,26 4 1,0074 670024 56,01 0,28 5 0,9933 651124 54,43 0,27 6 0,9970 637965 53,33 0,27 TB 0,27 SD 0,01 RSD (%) 2,65 ¾ Nhận xét: kết quả cho thấy hàm lượng 3 diterpen lacton trong các mẫu thử có RSD% < 5. Do đó phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại. ™ Nhận xét chung: quy trình định lượng đã chọn đạt các yêu cầu về độ đặc hiệu, sự tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại nên có thể áp dụng quy trình này định lượng 3 diterpen lacton là andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid trong Xuyên tâm liên. 3.4.5 Quy trình định lượng andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid trong dược liệu Xuyên tâm liên bằng HPLC Chuẩn bị mẫu thử theo mục (3.4.2) để được 50 ml mẫu thử. m x h S x t x100% X% = KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 73 Trong đó: X (%, kl/kl): hàm lượng phần trăm diterpen lacton S: nồng độ của diterpen lacton suy ra từ đường chuẩn h: độ ẩm của mẫu t: độ pha loãng của mẫu m: khối lượng mẫu 3.4.6 Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng 3 diterpen lacton chính trong bột lá Xuyên tâm liên và cao chiết loại màu (PL1) Bột dược liệu: cân chính xác 1g bột lá, tiến hành theo quy trình (3.4.2), độ pha loãng mẫu là 100, độ ẩm bột lá là 90%. Kết quả được trình bày bảng 3.29 Bảng 3.29 Bảng tính % của AP, NP, DP trong bột lá Xuyên tâm liên Bột lá Xuyên tâm liên Diện tích đỉnh Nồng độ suy ra từ đường chuẩn X% AP 10193990 0,1939 2,2% NP 566818 0,0474 0,5% DP 2618141 0,0767 0,9% Tổng diterpen lacton trong bột Xuyên tâm liên là 3,6%, so sánh với kết quả nghiên cứu của [10] ở một số mẫu Xuyên tâm liên lấy ở các địa phương khác ở Việt Nam là khá cao. Cao chiết loại màu: cân chính xác 0,163g cao loại màu, tiến hành theo quy trình (3.4.2), độ pha loãng mẫu là 100. Kết quả được trình bày bảng 3.30. Bảng 3.30 Bảng tính % của AP, NP, DP trong cao loại màu Cao loại màu Diện tích đỉnh Nồng độ suy ra từ đường chuẩn X% AP 2091552 0,0398 13,5% NP 128658 0,0108 3,7% DP 962125 0,0282 9,6% Kết luận: sau khi chiết xuất từ Xuyên tâm liên ta thu được cao loại màu với hàm lượng của các diterpen lacton tăng lên đáng kể so với hàm lượng của AP, NP, DP trong bột lá Xuyên tâm liên: AP chiếm 13,5%, NP chiếm 3,7%, DP chiếm 9,6%. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 74 3.5 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG HSV-1 VÀ HSV-2 CỦA CAO LOẠI MÀU VÀ 3 DITERPEN LACTON 3.5.1 Xác định hiệu giá virus theo TCID50 Chỉ số TCID50 của virus được khảo sát để xác định liều virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy trước khi sử dụng virus trong thử nghiệm để đánh giá hoạt tính kháng virus của chất thử. Kết quả khảo sát hiệu giá của HSV-1 và HSV-2 thử nghiệm trên tế bào Vero được minh họa trong PL3. Áp dụng công thức Karber, hiệu giá của virus được trình bày ở bảng 3.31. Bảng 3.31 Kết quả hiệu giá của chủng virus HSV-1 và HSV-2 L: Log của độ pha loãng thấp nhất dùng trong thử nghiệm D: Sự khác nhau giữa các độ pha loãng S: Tổng các tỷ lệ (số giếng hình thành đám hoại tử/ tổng số giếng tiếp xúc với virus ở từng nồng độ) TCID50= log [ L- d(S- 0.5)] Virus HSV-1 (S6) HSV-2(S8) L -1 -1 d 1 1 S TCID50 10-4,6/0,1ml 10-4,7/0,1ml 7 , 4 10 2 10 9 10 10 10 10 10 10 = ++++6,4 10 1 10 10 10 10 10 10 10 10 =++++ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 75 3.5.2 Khảo sát độ độc của cao chiết và chất tinh khiết trên tế bào Vero 3.5.2.1 Andrographolid (AP) Mật độ quang thử độc tính tế bào Vero của AP được trình bày ở PL 4.1 và kết quả thử nghiệm độc tính tế bào được trình bày ở bảng 3.32. Bảng 3.32 Kết quả gây độc tính trên tế bào của AP [ AP] (µg/ml) 7,81 15,62 31,25 62,5 125 250 500 Chứng TB (A) OD (B) 1,59 1,61 1,65 1,61 1,32 0,05 0,05 1,71 CC=(A-B)/A 6,96 5,53 3,42 5,75 22,88 96,79 96,91 PT CC y = 0,4426x – 19,652 R2 = 0,9503 CC50 157,4 Ghi chú: A: OD trung bình của tế bào (chứng tế bào) B: OD trung bình của tế bào tiếp xúc với dược chất CC50: nồng độ gây độc 50% tế bào Biểu đồ 3.1 Đồ thị tương quan giữa % độc tính và nồng độ AP Kết luận: tại nồng độ 157,4µg/ml, AP gây độc 50% tế bào. y = 0,4426x - 19,652 R2 = 0,9503 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 NỒNG ĐỘ AP % độc tính % độc tính Linear (% độc tính) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 76 3.5.2.2 Neoandrographolid (NP) Mật độ quang thử độc tính tế bào Vero của NP được trình bày ở PL 4.2 và kết quả thử nghiệm độc tính tế bào được trình bày ở bảng 3.33. Bảng 3.33 Kết quả gây độc tính trên tế bào của NP [NP] (µg/ml) 15,62 31,25 62,5 125 250 500 1000 Chứng TB (A) OD (B) 1,72 1,7 1,68 1,62 1,48 1,37 0,51 1,73 CC=(A-B)/A 0,73 1,62 2,79 6,7 14,75 20,89 70,83 PT CC y = 0,0681x – 2,408 R2 = 0,9594 CC50 769,58 Biểu đồ 3.2 Đồ thị tương quan giữa % độc tính và nồng độ NP Kết luận: tại nồng độ 769,58 µg/ml, NP gây độc 50% tế bào. y = 0,0681x - 2,408 R2 = 0,9594 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 NỒNG ĐỘ NP % độc tính Linear (% độc tính) % độc tính KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 77 3.5.2.3 Dehydroandrographolid (DP) Mật độ quang thử độc tính tế bào Vero của DP được trình bày ở PL 4.3 và kết quả thử nghiệm độc tính tế bào được trình bày ở bảng 3.34. Bảng 3.34 Kết quả gây độc tính trên tế bào của DP [DP] (µg/ml) 7,81 15,62 31,25 62,5 125 250 500 Chứng TB (A) OD (B) 1,6 1,52 1,45 1,25 0,05 0,05 0,05 1,71 CC=(A-B)/A 6,43 11,32 15,16 27,18 96,82 96,84 96,8 PT CC y = 0,7599x – 5,4251 R2 =0,9386 CC50 66,4 Biểu đồ 3.3 Đồ thị tương quan giữa % độc tính và nồng độ DP Kết luận: tại nồng độ 66,4 µg/ml, DP gây độc 50% tế bào. y = 0,7599x - 5,4251 R2 = 0,9386 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 140 NÔNG ĐỘ DP % độc tính % độc tính Linear (% độc tính) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 78 3.5.2.4 Cao loại màu (CLM) Mật độ quang thử độc tính tế bào Vero của CLM được trình bày ở PL 4.4 và kết quả thử nghiệm độc tính tế bào được trình bày ở bảng 3.35. Bảng 3.35 Kết quả gây độc tính trên tế bào của CLM [C1] (µg/ml) 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 6250 Chứng TB (A) OD (B) 1,7 1,67 1,61 1,58 1,03 0,05 0,05 1,71 CC=(A-B)/A 0,51 2,4 5,87 7,81 40,06 96,9 96,88 PT CC y = 0,0323x - 7,5539 R2 =0,9782 CC50 1781,8 Biểu đồ 3.4 Đồ thị tương quan giữa % độc tính và nồng độ CLM Kết luận: tại nồng độ 1781,8 µg/ml, CLM gây độc 50% tế bào. y = 0,0323x - 7,5539 R2 = 0,9782 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 NỒNG ĐỘ CLM % độc tính Linear (% độc tính) % độc tính KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 79 3.5.2.5 Acyclovir Mật độ quang thử độc tính tế bào Vero được trình bày ở PL 4.5 và kết quả thử nghiệm độc tính tế bào được trình bày ở bảng 3.36. Bảng 3.36 Kết quả gây độc tính trên tế bào của AC [ AC] (µg/ml) 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 6250 12500 Chứng TB (A) OD (B) 1,71 1,66 1,66 1,59 1,58 1,43 0,99 1,72 CC=(A-B)/A 0,46 3,66 3,41 7,88 8,25 16,92 42,22 PT CC y = 0,0033x - 0,4291 R2 = 0,9677 CC50 15281,5 Biểu đồ 3.5 Đồ thị tương quan giữa % độc tính và nồng độ AC Kết luận: tại nồng độ 15281 µg/ml, AC gây độc 50% tế bào. Bảng 3.37 Tóm tắt kết quả gây độc 50% tế bào của cao loại màu và 3 diterpen lacton Cao chiết và 3 diterpen lacton CC50(µg/ml) Andrographolid 157,4 Neoandrographolid 769,58 Dehydroandrographolid 66,4 Cao loại màu 1781,8 Acyclovir 15281,5 y = 0,0033x - 0,4291 R2 = 0,9677 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0,0 200 400 600 800 1000 1200 1400 NỒNG ĐỘ AC % độc tính Linear (% độc tính) % độc tính KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 80 3.5.3 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của cao chiết và chất tinh khiết trên tế bào Vero 3.5.3.1 Andrographolid (AP) a. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-1 của AP được trình bày ở PL 4.1 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.38. Bảng 3.38 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của AP HSV-1 Nồng độ AP 7,81 15,62 31,25 62,5 125 250 500 CC 6,96 5,53 3,42 5,75 22,88 96,79 96,91 IC 10-2.6 -0,81 -4,4 -5,45 -0,25 -11,69 -27,32 -27,35 IC 10-3.6 2,3 2,44 2,62 3,09 -12,67 -24,48 -24,52 PT biểu diễn IC y = 0,7098x + 10,63 R2 = 0,9558 PT biểu diễn CC y = 0,4426x – 19,652 R2 = 0,9503 IC50 55,5 CC50 157,4 Hệ số chọn lọc (SI) 2,8 Biểu đồ 3.6 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ AP trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-1 của AP AP HSV-1 2.6 y = 0,7098x + 10,63 R2 = 0,9558 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 NỒNG ĐỘ AP % ức chế Linear (% ức chế) % ức chế KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 81 b. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-2 của AP được trình bày ở PL 4.1 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.39. Bảng 3.39 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của AP HSV-2 Nồng độ AP 15,625 31,25 62,5 125 250 CC= 6,18 8,39 9,7 10,11 49,23 IC 10-2.7 -41,1 -36,7 15,6 71,1 -218,9 IC 10-3.7 43,6 56,6 71,4 91,1 -141,3 PT biểu diễn IC y = 0,8281x + 41,395 R2 = 0,9641 PT biểu diễn CC y = 0,3895x – 1,8251 R2 =0,9696 IC50 10,4 CC50 133,1 Hệ số chọn lọc (SI) 12,8 Biểu đồ 3.7 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ AP trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-2 của AP Nhận xét: khảo sát khả năng kháng HSV-1 và HSV-2 của AP cho hệ số SI lần lượt là 2,8 và 12,8, chứng tỏ AP có khả năng ức chế HSV-2 và có thể dùng AP trong trị liệu. AP HSV-2 3.7 y = 0,8281x + 41,395 R2 = 0,9641 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 NỒNG ĐỘ AP % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 82 3.5.3.2 Neoandrographolid (NP) a. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-1 của NP được trình bày ở PL 4.2 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.40. Bảng 3.40 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của NP HSV-1 Nồng độ NP 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 0,7 1,6 2,8 6,7 14,8 IC 10-2.6 62,2 48,5 34,2 12,8 -24,9 IC 10-3.6 54,1 41,9 -24,8 -96,6 -191,4 PT biểu diễn IC y = -0,4297x + 64,603 R2 = 0,9689 PT biểu diễn CC y = 0,0681x – 2,408 R2 = 0,9594 IC50 34,0 CC50 769,6 Hệ số chọn lọc (SI) 22,6 Biểu đồ 3.8 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ NP trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-1 của NP NP HSV-1 2.6 y = -0,4297x + 64,603 R2 = 0,9689 0 20 40 60 80 0 50 100 150 NỒNG ĐỘ NP % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 83 b. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-2 của NP được trình bày ở PL 4.2 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.41 Bảng 3.41 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của NP HSV-2 Nồng độ NP 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 16,5 13,8 17,4 19,7 30,2 IC 10-2.7 44,3 27,8 13,5 -32,2 -49,0 IC 10-3.7 55,8 22,2 14,0 -35,2 -78,3 PT biểu diễn IC y = -0,7536x +58,351 R2 = 0,9407 PT biểu diễn CC y = 0,0521x + 13,6 R2 = 0,9638 IC50 11,08 CC50 698,7 Hệ số chọn lọc (SI) 63,04 Biểu đồ 3.9 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ NP trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-2 của NP Nhận xét: khảo sát khả năng kháng HSV-1 và HSV-2 của NP, cho hệ số SI lần lượt là 22,6 và 63,4, chứng tỏ NP có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 và có thể dùng NP trong trị liệu. NP HSV-2 3.7 y = -0,7536x + 58,351 R2 = 0,9407 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 50 100 150 NỒNG ĐỘ NP % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 84 3.5.3.3 Dehydroandrographolid (DP) a. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-1 của DP được trình bày ở PL 4.3 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.42. Bảng 3.42 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của DP HSV-1 Nồng độ DP 7,81 15,62 31,25 62,5 125 CC 6,43 11,32 15,16 27,18 96,82 IC 10-2.6 40,2 28,7 -40,1 -94,3 -562,1 IC 10-3.6 12,5 -50,3 -87,5 -261,0 -1156,3 PT biểu diễn IC y = -1,7317x +54,517 R2 = 0,9604 PT biểu diễn CC y = 0,7599x – 5,4251 R2 =0,9386 IC50 2,61 CC50 72,94 Hệ số chọn lọc (SI) 27,96 Biểu đồ 3.10 Đồ thị tương quan giữa IC và nồng độ DP trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-1 của DP DP HSV-1 2.6 y = -1,7317x + 54,517 R2 = 0,9974 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 30 35 NỒNG ĐỘ DP IC IC Linear (IC) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 85 b. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-2 của DP được trình bày ở PL 4.3 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.43. Bảng 3.43 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của DP Nhận xét: khảo sát khả năng kháng HSV-1 cho hệ số SI là 27,96 nên có khả năng dùng DP trong trị liệu, đối với HSV-2 thấy IC50 <0 chứng tỏ DP không có khả năng ức chế HSV-2. 3.5.3.4 Cao loại màu (CLM) a. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-1 của CLM được trình bày ở PL 4.4 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.44. Bảng 3.44 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của CLM HSV-1 Nồng độ cao loại màu 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 CC 0,5 2,4 5,9 7,8 40,1 IC 10-2.6 25,8 39,0 46,1 58,2 -164,8 IC 10-3.6 5,4 16,6 33,3 51,3 -453,9 PT biểu diễn IC y = 0,0649x + 2,8691 R2 = 0,9612 PT biểu diễn CC y = 0,0161x - 7.9473 R2 = 0,9752 IC50 726,2 CC50 1781,9 Hệ số chọn lọc (SI) 2,5 HSV-2 Nồng độ DP 7,81 15,62 31,25 62,5 125 CC 4,5 10,5 14,6 33 96,8 IC 10-2.7 -23,7 -57,1 -81,5 -100,0 -563,6 IC 10-3.7 29,5 18,4 -17,3 -141,1 -715,6 PT biểu diễn IC y = -2,035x + 47,315 R2 =0,9889 PT biểu diễn CC y = 0,7816x – 5,968 R2 =0,9694 IC50 -1,3 CC50 71,6 Hệ số chọn lọc (SI) -54,3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 86 Biểu đồ 3.11 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ CLM trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-1 của CLM b. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-2 của CLM được trình bày ở PL 4.4 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.45. Bảng 3.45 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của CLM HSV-2 Nồng độ cao loại màu 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 CC 0,4 2,4 3,9 5,3 40,1 IC 10-2.7 21,8 30,4 39,5 48,3 -188,0 IC 10-3.7 29,3 36,5 57,4 62,3 -311,1 PT biểu diễn IC y = 0,0977x + 18,815 R2 = 0,993 PT biểu diễn CC y = 0,0326x - 8,615 R2 = 0,9717 IC50 319,1914 CC50 1798,006 Hệ số chọn lọc (SI) 5,6 CLM HSV-1 3.6 y = 0,0649x + 2,8691 R2 = 0,9612 0 10 20 30 40 50 60 0 200 400 600 800 1000 NỒNG ĐỘ CLM % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 87 Biểu đồ 3.12 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ CLM trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-2 của CLM Nhận xét: khảo sát khả năng kháng HSV-1 và HSV-2 của CLM, cho hệ số SI lần lượt là 2,5 và 5,6, chứng tỏ CLM không có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2. 3.5.3.5 AC a. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-1 của AC được trình bày ở PL 4.5 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.46. Bảng 3.46 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của AC HSV-1 Nồng độ AC 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 CC=(A-B)/A 0,46 3,66 3,41 7,88 8,25 IC 10-2.6 63,68 27,29 -2,3 -45,08 -36,09 IC 10-3.6 62,14 46,46 -1,85 -3,17 -49,74 PT biểu diễn IC y = -0,1113x + 86,295 R2 = 0,9908 PT biểu diễn CC y = 0,0033x - 0,4291 R2 = 0,9677 IC50 326,1 CC50 15281,5 Hệ số chọn lọc (SI) 46,9 CLM HSV-2 3.7 y = 0,0977x + 18,815 R 2 = 0,993 0 10 20 30 40 50 60 70 0.0 100 200 300 400 500 NỒNG ĐỘ CLM % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 88 Biểu đồ 3.13 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ AC trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-1 của AC b. Mật độ quang thử khả năng ức chế HSV-2 của AC được trình bày ở PL 4.5 và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế được trình bày ở bảng 3.47. Bảng 3.47 Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của AC HSV-2 Nồng độ AC 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 CC=(A-B)/A 0,3 3,6 7,7 11,8 15,1 IC 10-2.7 55,4 47,6 10 -30,5 -47,1 IC 10-3.7 53,31 42 27,93 26,81 -71,36 PT biểu diễn IC y = -0,0423x + 60,345 R2 = 0,9839 PT biểu diễn CC y = 0,0037x + 2,6855 R2 = 0,976 IC50 244,6 CC50 12787,7 Hệ số chọn lọc (SI) 52,3 AC HSV-1 3.6 y = -0,1113x + 86,295 R2 = 0,9908 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 0 200 400 600 800 1000 NỒNG ĐỘ AC % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 89 Biểu đồ 3.14 Đồ thị tương quan giữa % ức chế và nồng độ AC trong thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế HSV-2 của AC Nhận xét: khảo sát khả năng kháng HSV-1 và HSV-2 của AC để làm chứng cho khảo sát cao loại màu và 3 diterpen lacton tinh khiết, cho hệ số SI lần lượt là 46,9 và 52,3, chứng tỏ AC có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 như đã công bố và được sử dụng làm thuốc. 3.5.4 So sánh khả năng ức chế virus của cao chiết và các chất tinh khiết Bảng 3.48 Tổng kết kết quả khảo sát khả năng kháng herpes của cao loại màu, 3 diterpen lacton và acyclovir HSV-1 HSV-2 Cao chiết và chất tinh khiết CC50 IC 50 SI CC50 IC 50 SI AP- Andrographolid 157,4 55,5 2,8 133,1 10,4 12,8 NP - Neoandrographolid 769,6 34 22,6 698,7 11 63 DP - Dehydroandrographolid 72,94 2,61 27,96 71,6 -54,3 -1,3 CLM - Cao loại màu 1781,9 726,2 2,5 1798 319 5,6 AC 15281,5 326,1 46,9 12787 244,6 52,3 AC HSV-2 3.7 y = -0,0423x + 60,345 R 2 = 0,9839 0 10 20 30 40 50 60 0.0 200 400 600 800 1000 NỒNG ĐỘ AC % ức chế % ức chế Linear (% ức chế) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 90 Acyclovir là loại thuốc đã được sử dụng rộng rãi trên thị trường để điều trị herpes, trong phương pháp khảo sát khả năng kháng herpes của các diterpen lacton, Acyclovir được sử dụng như một chất đối chứng để xem hiệu quả kháng herpes của các diterpen lacton và cao loại màu. Khả năng kháng HSV-1 của diterpen lacton tinh khiết: Hệ số SI của AC khi khảo sát khả năng kháng HSV-1 là 46,9 >10; trong khi đó hệ số SI của neoandrographolid và dehydroandrographolid lần lượt là 22,6 và 27,96 đều >10 đều có khả năng làm thuốc để trị liệu. Kết quả này cũng phù hợp với C. Wiart, C. Wiart chỉ công bố khả năng kháng herpes của diterpen lacton nhưng không công bố kết quả cụ thể. Hệ số SI của andrographolid là 2,8 <10 chứng tỏ andrographolid không có khả năng ức chế HSV-1. Khả năng kháng HSV-2 của diterpen lacton tinh khiết: Hệ số SI của AC khi khảo sát khả năng kháng HSV-2 là 52,3 >10, trong khi đó hệ số SI của andrographolid và neoandrographolid lần lượt là 12,8 và 63 đều >10 đều có khả năng làm thuốc để trị liệu, hệ số SI của dehydroandrographolid là <0 chứng tỏ dehydroandrographolid không có khả năng ức chế HSV-2 (hiện nay chưa có công bố nào về khả năng kháng HSV-2 của các diterpen lacton). Dựa vào kết quả tính hàm lượng % của AP, NP, DP có trong cao loại màu ở bảng 3.28, suy ra hàm lượng AP, NP, DP có trong cao loại màu trong dãy nồng độ đem đi khảo sát khả năng kháng virus của cao. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 91 Bảng 3.49 Bảng tính hàm lượng của AP, NP, DP có trong cao loại màu khi đem khảo sát hoạt tính kháng virus Nồng độ CLM khảo sát hoạt tính kháng virus (µg/ml) Hàm lượng AP có trong cao loại màu (µg/ml) Hàm lượng NP có trong cao loại màu (µg/ml) Hàm lượng DP có trong cao loại màu (µg/ml) 6250 843,8 231,3 600 3125 421,9 115,6 300 1562,5 210,9 57,8 150 781,25 105,5 28,9 75 390,63 52,7 14,5 37,5 195,31 26,4 7,2 18,8 97,66 13,2 3,6 9,4 Dựa vào bảng 3.49, nồng độ cao loại màu đem đi khảo sát hoạt tính kháng virus từ 97- 6250µg/ml, có chứa hàm lượng andrographolid và dehydrographolid tương đương với lượng andrographolid và dehydrographolid tinh khiết khảo sát ở trên, tuy nhiên hệ số SI của cao loại màu trong khảo sát khả năng kháng HSV-1 và HSV-2 là 2,5 và 5,6 đều <10 chứng tỏ là cao loại màu không có khả năng sử dụng để làm thuốc trong trị liệu. Điều này có thể giải thích là trong cao loại màu, ngoài 3 diterpen lacton thì còn chứa nhiều các thành phần tạp khác (3.1), có thể do những thành phần này đã làm ảnh hưởng đến khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của cao.