Luận văn Tổng hợp và tạo dòng phân tử gen interferon alpha 2a

ó thể sản xuất ra interferon type I khi bị nhiễm bởi siêu vi, vi khuẩn hay các nguyên sinh động vật. Interferon type I có hai dạng chính là IFN α và IFN β. - IFN α là nhóm IFN đƣợc tiết chủ yếu từ bạch cầu, tối thiểu có khoảng 14 loại thuộc nhóm này, chúng có cấu trúc của chuỗi acid amin tƣơng đồng với nhau đến 90 %. IFN α trong điều trị nhiễm siêu vi viêm gan B và C có thể ngăn cản đƣợc tình trạng tăng sinh của siêu vi và sự tiến triển của bệnh khoảng 40 %. Một số bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ tế bào hắc tố, ung thƣ xƣơng, ung thƣ tƣơng bào… cũng đã đƣợc thử 3 nghiệm lâm sàng điều trị với interferon đơn thuần hoặc phối hợp cùng với các chất khác. - IFN β đƣợc tiết chủ yếu từ nguyên bào sợi. IFN type II hay còn đƣợc gọi là IFN miễn dịch (IFN γ) chủ yếu có hoạt tính biến điệu miễn dịch. Gần đây một số thử nghiệm sử dụng IFN γ trong việc hạn chế đáp ứng miễn dịch dịch thể và tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch tế bào đã đƣợc nghiên cứu (Phạm Hoàng Phiệt, 1999). 2.1.2. Đặc điểm IFN-α2a IFN-α2a là một thành viên trong họ protein interferon với những đặc điểm nhƣ kháng virus, điều hòa miễn dịch và có khả năng chống lại bệnh ung thƣ. IFN-α2a là một protein bao gồm 165 amino acid do một gen nằm trên NST số 9 ở ngƣời tổng hợp. 2.1.3. Tình hình nghiên cứu Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và những kỹ thuật mới những nghiên cứu về interferon ngày càng nhiều hơn. Sự biểu hiện và chức năng của interferon cũng đƣợc biết đến nhiều hơn. Reynolds, Premkumar và Pitha (1975) đã chuyển gen interferon vào tế bào eukaryote nhƣ Xenopus oocytes, đồng thời biểu hiện và xác định đƣợc protein interferon bằng hoạt động kháng virus của chúng trong nuôi cấy tế bào. Goeddel và cộng sự (1980) đã sản xuất đƣợc IFN-α2a lần đầu tiên bằng E. coli tái tổ hợp nhƣng ở mức độ biểu hiện thấp. Interferon đã đƣợc nghiên cứu ở mức độ điều trị lâm sàng ở một số bệnh nhƣ: viêm gan siêu vi B, viêm gan siêu vi C, ung thƣ tế bào hắc tố, ung thƣ tế bào sơ cấp (Spiegel, 1986; Scott M. Lippman và cộng sự, 1992; Eric Dieperink và cộng sự, 2000). Tuy vậy việc nghiên cứu về interferon ở nƣớc ta vẫn còn khiêm tốn. 2.2. KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTON) 2.2.1. Giới thiệu về phản ứng PCR Kỹ thuật PCR đƣợc mô tả bởi Mulis và cộng sự (1985) là kỹ thuật cho phép làm tăng bội một đoạn DNA cần đƣợc nghiên cứu. Khác với sự tăng bội DNA qua sự tạo dòng nhờ vi khuẩn, PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng enzyme. Theo lý thuyết, phƣơng pháp này có ba acid nucleic: một DNA dây đôi cần đƣợc khuếch đại, hai sợi đóng vai trò mồi (primer) với kích thƣớc rất ngắn chạy theo chiều thuận và 4 nghịch trên DNA nền, thêm vào là DNA polymerase, dNTPs và một muối Mg (M.J. McPherson và S.G. Moller, 2000). Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: - Bƣớc 1: Tạo dây đơn DNA nhờ hiện tƣợng biến chất (denature) thƣờng ở nhiệt độ 94 – 95oC - Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 60oC. - Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc thực hiện ở 72oC. Hình 2.2: Các chu kỳ phản ứng PCR 2.2.2. Một số yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 2.2.2.1. Enzyme DNA polymerase Enzyme đƣợc sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I.. Đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Phƣơng pháp PCR trở nên thuận lợi hơn với việc phát hiện ra enzyme DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus hiện diện trong suối nƣớc nóng, viết tắt là Taq polymerase, enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94oC. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase là 70 – 72oC. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng thì sẽ tạo ra sản phẩm không mong muốn. 2.2.2.2. Các nucleotide tự do (dNTPs) dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hỗn hợp 4 loại nucleotide 5 dATP, dTTP, dGTP và dCTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Mỗi loại dNTP thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 20 – 200 M. Nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm không mong muốn. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide sẽ làm phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. 2.2.2.3. Primer và nhiệt độ lai Primer là các đoạn oligonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu sợi khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Primer là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới tính đặc hiệu và tính hiệu quả của phản ứng khuếch đại. Trình tự của primer thƣờng đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngƣợc, không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung trong mỗi primer và Tm của 2 primer phải không quá cách biệt nhau. Ngoài ra, thành phần nucleotide của primer phải cân bằng tránh lập lại nhiều lần các cặp GC. Primer đƣợc chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự trên gen. Trình tự nằm giữa hai primer không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 2.2.2.4. DNA khuôn Kết quả phản ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào độ tinh sạch cũng nhƣ lƣợng DNA mẫu. Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu…. Lƣợng DNA mẫu thƣờng đƣợc sử dụng là 100 ng. Lƣợng mẫu phù hợp có tác dụng hạn chế sự khuếch đại tạo các sản phẩm không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 2.2.2.5. Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là Mg2+. Nó rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho hầu hết các enzyme DNA polymerase. Nồng độ tối ƣu của Mg2+ là 1,5 mM. Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu (Huỳnh Thùy Hồ Dƣơng, 1998). 6 2.2.2.6. Số chu kỳ phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế thƣờng không vƣợt quá 40 chu kỳ. Số chu kỳ tùy thuộc vào lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu số chu kỳ ít thì lƣợng DNA thu đƣợc ít. Nếu số chu kỳ quá nhiều thì hiệu suất của PCR giảm do cạn kiệt nồng độ các thành phần tham gia và sự mệt mỏi của các enzyme. 2.2.2.7. Nhiệt độ và pH Nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến độ chuyên biệt và năng suất của sản phẩm PCR. Nhiệt độ biến tính khoảng 94 – 95oC nếu vƣợt quá sẽ làm mất hoạt tính của enzyme DNA polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72oC là nhiệt độ tối ƣu cho enzyme DNA polymerase. Nhiệt độ khó xác định nhất là nhiệt độ bắt cặp giữa primer và mạch khuôn. Nhiệt độ đƣợc xác định tùy thuộc vào trình tự primer. Hầu hết các enzyme, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid các bazơ purin rất dễ bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR thì pH có thể đổi từ 6,8 – 7,8. 2.2.3. Tổng hợp gen Nguyên tắc: sử dụng những đoạn oligonucleotide đƣợc thiết kế sao cho có thể gối lên nhau theo nguyên tắc bổ sung. Những đoạn oligonucleotide này sẽ có khoảng 15 – 25 nucleotide bắt cặp với nhau sau khi tác động nhiệt và kéo dài ở đầu 3’ của mỗi sợi. Những đoạn oligonucleotide này sẽ đƣợc trộn lại với nhau và ủ ở nhiệt độ khoảng 72 oC để chúng bắt cặp với nhau, sau đó chạy PCR để tổng hợp đoạn gen hoàn chỉnh (M.J. McPherson và S.G. Moller, 2000). 2.2.4. Ứng dụng của phản ứng PCR Kể từ khi ra đời, phƣơng pháp PCR ảnh hƣởng sâu sắc tới các nghiên cứu về sinh học phân tử. Các ứng dụng tiêu biểu của PCR bao gồm: - Trong nông nghiệp: xác định tính đa dạng sinh học, dùng trong chọn giống và xác định yếu tố gây bệnh… - Trong thực phẩm: sử dụng để xem thực phẩm có sử dụng sản phẩm chuyển gen hay không, xác định nguyên nhân gây bệnh trong mẫu thực phẩm là do virus hay vi khuẩn. - PCR còn đƣợc sử dụng để nhân nhanh những đoạn gen quý hiếm và còn đƣợc sử dụng trong tổng hợp gen. 7 - Gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực của kỹ thuật PCR trong việc giải mã bộ gen ngƣời. 2.3. KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cho phép xác định kích thƣớc đoạn DNA. DNA sẽ đƣợc đi qua chất nền đƣợc gọi là gel trong một điện trƣờng. DNA tích điện âm cho nên trong điện di mẫu đƣợc cho vào những giếng gần cực điện âm và DNA sẽ di chuyển về phía cực dƣơng. Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử, những phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh và ngƣợc lại. Trong điện di ngƣời ta thƣờng sử dụng gel làm từ các vật liệu: agarose, acrylamide… Agarose là một trong các dạng của polysaccharide, chúng sẽ tạo thành hạt sau khi tan ở nhiệt độ cao. Khi nguội lại những hạt agarose này sẽ kết tụ lại với nhau. Giữa những hạt nhƣ vậy có những lỗ rất nhỏ. Kích thƣớc của những lỗ này có thể xê dịch chút ít tùy theo nồng độ của agarose. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này của DNA. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Ngƣời ta có thể quan sát chúng bằng mắt, nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA với ethidium bromide và chiếu dƣới tia cực tím. 2.4. HIỆN TƢỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN 2.4.1. Hiện tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đã đƣợc chứng minh lần đầu tiên năm 1928 trên vi khuẩn streptococcus pneumoniae bởi Fred Griffiths và đến năm 1944 đã đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự. Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng ở trạng thái khả nạp tự nhiên nên có khả năng hấp thu DNA có sẵn trong môi trƣờng sống. Đó là các DNA có nguồn gốc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu đƣợc là vi khuẩn thể hiện một vài tính trạng mới, ổn định và có khả năng di truyền. Trạng thái khả nạp tự nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dƣỡng và hàm lƣợng oxy trong môi trƣờng giảm xuống thấp. Thực tế khi nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả năng hấp thu DNA. 2.4.2. Vector – công cụ biến nạp Vector là vật liệu quan trọng trong các thí nghiệm biến nạp DNA và gen cloning. 8 Vector đƣợc chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ và cần có các tiêu chuẩn sau: - Có khả năng tự sao chép độc lập không phụ thuộc vào tế bào chủ. - Mang những gen chọn lọc để dễ dàng phát hiện vi khuẩn có chứa chúng. - Mang những vị trí duy nhất của một số enzyme cắt giới hạn. - Có chứa promoter thích hợp cho việc biểu hiện gen của tế bào chủ. Hai dạng vector thƣờng sử dụng là plasmid và phage: 2.4.2.1. Plasmid Plasmid đƣợc dùng phổ biến và thực hiện trong các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử. Trong tự nhiên plasmid có nhiều dạng có kích thƣớc khác nhau từ vài ngàn cặp base tới vài trăm kilobase. Thƣờng các plasmid dùng trong cloning có kích thƣớc từ 2 – 5 kb. Plasmid có các tính chất sau: - Plasmid là phân tử DNA vòng, xoắn đôi độc lập với tế bào vi khuẩn. - Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen có ích cho vi khuẩn nhƣ ampicillin giúp cho vi khuẩn tồn tại trên môi trƣờng có kháng sinh này. Và đây cũng đƣợc xem nhƣ một dấu hiệu để chọn lọc hay đặc điểm xác nhận sự hiện diện của gen ngoại lai Hình 2.3: Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài liệu T.A. Brown, 1997) Cấu trúc của plasmid bao gồm vùng ori giúp quá trình nhân nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào kí chủ cho việc nhân bản của nó, nhƣng đối với plasmid 9 lớn chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài plasmid gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kỳ phân chia tế bào, nhƣng trong một giai đoạn nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do. Phân loại plasmid dựa vào đặc tính cơ bản mã hóa bởi gen của nó. Đƣợc chia làm 5 loại: - Fertility plasmid chỉ mang tra gen có khả năng chuyển vị và tiếp hợp. - R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại chất kháng sinh giúp tế bào chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. - Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi khuẩn khác. - Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều nào đó nhƣ toluen, acid salycylyc. - Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005). 2.4.2.2 Phage Phages hay bacteriophages xem nhƣ phổ biến tiêm vào vi khuẩn, giống nhƣ tất cả virus, phage là cấu trúc đơn giản bao gồm phần đầu mang nhiều phân tử DNA chứa nhiều gen, phần đuôi xung quanh là lớp bọc tạo thành khối phân tử protein. Khi tấn công DNA của phage đƣợc truyền vào tế bào chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân nhanh về số lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào. Hình 2.4: Cấu trúc của phage T4 10 2.4.3. Biến nạp nhân tạo ở E. coli Biến nạp nhân tạo ở E. coli là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ E. coli nhằm nhân nhanh số lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác. E. coli là tế bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi vì có cấu trúc đơn giản và các thông tin di truyền đƣợc biết tƣờng tận nên dễ phát hiện ra đoạn gen đƣợc chèn. Các tế bào E. coli có khả năng hỗ trợ cho sự sao chép plasmid DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal. 2.4.3.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp Trong phòng thí nghiệm nhằm tăng cƣờng khả năng biến nạp ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào, tế bào đƣợc xử lý gọi là tế bào khả nạp. Ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp hóa học hoặc vật lý: Phƣơng pháp hóa học: Là phƣơng pháp sử dụng hóa chất để xử lý tế bào có thể kết hợp với nhiệt độ. Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào thấp nhƣng đơn giản và dễ thực hiện. Phƣơng pháp vật lý: Là phƣơng pháp sử dụng điện trƣờng mạnh trong thời gian ngắn làm tạm thời mất tính ổn định của màng tế bào. Tế bào đƣợc cho vào cuvette cùng với DNA, cho xung điện qua cuvette. Khi xung điện đi qua, điện trƣờng tạo thành các lỗ trên màng tế bào. Trong thời gian này, màng tế bào có khả năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trƣờng xung quanh, nhờ đó DNA có thể đƣợc chuyển vào tế bào. Khi xung điện tắt các lỗ trên màng tế bào đóng lại, giữ các DNA bên trong tế bào. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là dễ thực hiện, thời gian ngắn, không độc hại, hiệu quả cao, có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào. 2.4.3.2. Chọn lọc tế bào vi khuẩn đã đƣợc biến nạp Sự điều hòa operon lac ở E. coli Trong trƣờng hợp có glucose, E. coli tăng trƣởng nhanh chóng. Nếu thay glucose bằng lactose (β–galactisido–glucose), E. coli ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó nhờ tổng hợp đƣợc 3 enzyme: - Permerase kích thích sự thấm lactose - Acetylase (vai trò chƣa rõ) - β–galactosidase xúc tác sự thủy giải lactose thành galactose và glucose Ba enzyme này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose, chúng đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này 11 qua mô hình hoạt động của operon lac (lactose operon). Operon lac là đoạn DNA chứa: ba gen cấu trúc lac Z (mã hoá β–galactosidase), lac Y (mã hóa permerase) và lac A (mã hóa acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzyme. Operator quyết địmh RNA polymerase không liên kết hay liên kết với promoter và di chuyển dọc theo các gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). Hình 2.5: Cấu trúc của operon lac. Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng liên hệ cùng với promoter và operator là operon. Operon chỉ có ở prokaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp các gen liên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon lac Z là gen điều hoà I, gen này mã hóa repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự biểu hiện gen (I có promoter riêng) để tạo ra repressor. Repressor nhận biết và liên kết với operator, cản sự liên kết của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose liên kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không liên kết với operator, operon lac mở, RNA polymerase liên kết với promoter và trƣợt dài theo các gen của operon, mRNA (mã hóa cho cả 3 enzyme) đƣợc tạo thành và đƣợc dịch mã thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E. coli dùng glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP (catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). Phức hợp cAMP – CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng liên kết của RNA polymerase với promoter. 12 Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông thƣờng E. coli dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng theo hƣớng cơ bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn. Khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm tăng lƣợng plasmid tích lũy trong tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA-) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hóa chuẩn (Bùi Trang Việt, 2002). Chọn lọc tế bào đã đƣợc biến nạp Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, plasmid sẽ tự tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa kháng sinh thì tế bào chủ đã thu nhận plasmid mới có khả năng tồn tại, những tế bào nào không đƣợc tiếp nhận plasmid sẽ không thể phát triển. Tuy nhiên, kết quả phản ứng nối giữa vector và DNA là một tổ hợp của nhiều kết quả nối: vector – vector, vector – DNA. Vì vậy có những tế bào có khả năng phát triển trên môi trƣờng có chứa kháng sinh nhƣng không mang đoạn gen mong muốn. Việc chọn lọc các tế bào biến nạp mang gen mong muốn có nhiều cách: - PCR: sau khi tách plasmid của những khuẩn lạc tồn tại đƣợc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh, chạy phản ứng PCR với các primer của gen chèn. Sau đó sẽ chạy điện di để kiểm tra kết quả. - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai khuẩn lạc. - Sử dụng enzyme cắt plasmid để xác định sự hiện diện của gen chèn. - Sử dụng phƣơng pháp α-complementation. Nhiều plasmid mang một đoạn ngắn DNA của E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với chủng E. coli thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Nếu là trƣờng hợp vector – vector thì sản phẩm của gen lac I không thể kết dính với vùng hoạt động của promoter – operator của gen lac Z’, cho nên gen lac Z’ trong plasmid đƣợc chuyển mã và giải mã. Protein lac Z’ phối hợp với protein đã đƣợc mang tín hiệu di truyền của DNA nhiễm sắc thể để tạo ra một galactosidase lai. Cuối cùng thì 5-bromo-4 chloro-3 indolyl-β-D galactopyranoside (X-gal) trong môi trƣờng sẽ bị thủy phân bởi galactosidase lai này, 13 cho ra một sản phẩm màu xanh. Trong điều kiện nhƣ vậy thì khuẩn lạc có chứa thể vector – vector sẽ có màu xanh. Ngƣợc lại, những khuẩn lạc mang thể vector – DNA chèn sẽ có màu trắng bởi vì DNA đƣợc chèn vào vị trí restriction endonuclease.Trong nhiều chuỗi mã của dòng sẽ đột phá khả năng đọc của gen lac Z’ và ngăn cản việc sản xuất protein lac Z’ chức năng, tạo ra hệ quả là không có một galactosidase lai nào đƣợc sản xuất. Sự vắng mặt của galactosidase lai làm cho X-gal trong môi trƣờng không đƣợc chuyển đổi thành hợp chất màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG). 2.4.4. Vai trò và ứng dụng Hiện tƣợng biến nạp giúp cho vi khuẩn có thêm các tính trạng mới để dễ thích nghi với môi trƣờng mới. Đồng thời đây cũng là cơ sở của sự tiến hóa. Biến nạp là bƣớc đầu trong kỹ thuật cloning. Vi sinh vật đƣợc xem nhƣ là một cỗ máy sản xuất phục vụ nhu cầu con ngƣời. Ngày càng có nhiều những sản phẩm đƣợc sản xuất từ những vi sinh vật chuyển gen nhƣ: các kháng sinh, các kháng thể, các loại protein… Biến nạp gen còn phục vụ cho các nghiên cứu khác nhƣ: kiểm tra đa dạng sinh hoc, bảo tồn sự ổn định của một đoạn gen đƣợc dễ dàng. 2.5. TÁCH CHIẾT DNA PLAMID Sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc, tế bào chủ có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ đƣợc chọn lọc và thu sinh khối. Để đƣợc plasmid dƣới dạng tinh ngƣời ta thực hiện tách chiết plasmid. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid nhƣ: phƣơng pháp nhiệt độ cao, phƣơng pháp lythium, phƣơng pháp SDS-kiềm…Nhƣng quy trình của nó có các bƣớc chính sau: phá vỡ màng tế bào, biến tính, tủa và loại bỏ protein, tủa và thu nhận DNA plasmid. 2.6. MỘT SỐ ENZYME SỬ DỤNG TRONG BIẾN NẠP 2.6.1. Enzyme cắt giới hạn Trong thiên nhiên, các vi khuẩn thƣờng bị kí sinh bởi các virus với DNA. Để tự bảo vệ, tránh sự xen của DNA phage, vi khuẩn tạo các enzyme cắt hạn chế để cắt DNA virus, nói cách khác để hạn chế sự tồn tại của DNA lạ. Hiện tƣợng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influenzae. Chủng Rd đặt tên là Hind II. Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme) thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết trong phân tử DNA. 14 Các enzyme cắt giới hạn có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là enzyme cắt giới hạn tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lƣợng và kích thƣớc đoạn cắt dài hay ngắn tùy thuộc vào số lƣợng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn. Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để enzyme cắt giới hạn tiếp xúc tốt với cơ chất. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp xếp khác nhau). Trƣờng hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 44 = 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 46 = 4096 cặp nucleotide có một chỗ bị cắt. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định. Có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu dính. Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt ends). Các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với nhau. Để nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzyme nối DNA ligase, hoặc các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme. Ví dụ: Enzyme Sma I cắt tạo đầu bằng giữa các đoạn 6 bp 5’ … CCCGGG … 3’ 3’ … GGGCCC … 5’ 5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’ 3’ … GGG ~ P OH ~ CCC … 5’ Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn, tạo nên các đầu dính (cohesive ends). Các đầu dính tạo nên sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase, nhờ đặc 15 tính này enzyme giới hạn cắt đầu dính đƣợc sử dụng nhiều trong công nghệ DNA tái tổ hợp (T.A. Brown, 1997). Ví dụ: Vị trí phân cắt phân tử DNA của enzyme Nde I 5’ … CATATG … 3’ 5’ … CA ~OH + P ~ TATG … 3’ 3’ … GTATAC … 5’ 3’ … GTAT ~ P HO ~ AC … 5’ 2.6.2. Enzyme nối Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi enzyme T4 DNA ligase. 2.7. NGUYÊN TẮC ĐỌC TRÌNH TỰ 2.7.1. Phƣơng pháp đọc trình tự của Sanger Phƣơng pháp “sequencing” do Sanger và cộng sự tìm ra năm 1977, họ dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ dây nền của phân tử DNA. Mỗi dây đơn của DNA đƣợc tác động với một mồi tƣơng ứng trong phản ứng polymer. Trong các phản ứng tổng hợp sợi bổ sung, dideoxynucleotide đƣợc bổ sung vào thành phần phản ứng. Dideoxynucleotide (ddNTP) là các deoxynuckeotide đã đƣợc khử nhóm OH ở 3’, khi dideoxynucleotide gia nhập vào chuỗi, sự kéo dài chuỗi sẽ ngƣng lại. Các ddNTP đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ P32 . Mỗi chƣơng trình với một loại ddNTP đều có phần chung đầu 5’ nhƣng mỗi đầu có sự thay đổi chiều dài ở vị trí 3’. Sau khi ủ DNA, trộn lại và làm nóng lên sau đó dùng điện di tách băng DNA với sợi đơn DNA đƣợc đánh dấu phóng xạ. Mã trình tự có thể đƣợc đọc trực tiếp từ dấu hiệu phóng xạ. 2.7.2. Giả mã trình tự bằng hệ thống tự động Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phƣơng pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại primer xuôi và ngƣợc đều đƣợc sử dụng để đọc cả hai mạch đơn DNA. Giải trình tự theo phƣơng pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện cùng một lúc hiện tƣợng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Nde I 16 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Thời gian đƣợc tiến hành từ 2/2006 đến 7/2006 tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, công ty NTL Biotech. 3.2. VẬT LIỆU Hóa chất và vật liệu đƣợc sử dụng trong khóa luận này đƣợc cung cấp từ các công ty có uy tín nhƣ: Qiagen, Invitrogen, Promega, Merck… 3.2.1. Vật liệu làm thí nghiệm Vật liệu làm thí nghiệm gồm có: 6 đoạn oligonucleotide, 2 primer Reverse và Forward, vi khuẩn Top10F’, plasmid pGEM-T. 3.2.1.1. Sáu đoạn oligonucleotide và hai primer Sáu đoạn oligonucleotide đƣợc thiết kế để tổng hợp gen IFN-α2a. 1. 5’- TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAT AGC CTG GGC AGC CGT CGT ACC CTG ATG CTG CTG GCG CAG ATG CGT AAA ATC AGC CTG TTT AGC TGC CTG AAA GAT CGT -3’ (99) 2. 5’- CTG GAT CAT TTC ATG CAG AAC CGG GAT GGT TTC CGC TTT CTG AAA CTG GTT GCC AAA TTC TTC CTG CGG AAA GCC AAA ATC ATG ACG ATC TTT CAG GCA GCT -3’ (102) 3. 5’- GTT CTG CAT GAA ATG ATC CAG CAG ATC TTT AAC CTG TTT AGC ACC AAA GAT AGC AGC GCG GCG TGG GAT GAA ACC CTG CTG GAT AAA TTT TAT ACC GAA -3’ (99) 4. 5’- ATC TTC TTT CAT CAG CGG GGT TTC GGT AAC GCC AAC GCC CTG GAT AAC GCA CGC TTC CAG ATC GTT CAG CTG CTG ATA CAG TTC GGT ATA AAA TTT ATC CAG -3’ (102) 5. 5’- CCG CTG ATG AAA GAA GAT AGC ATC CTG GCG GTT CGT AAA TAT TTT CAG CGT ATC ACC CTG TAT CTG AAA GAA AAA AAA TAT AGC CCG TGC GCG TGG GAA -3’ (96) 6. 5’- GGA TCC TCA TTC CTT ACT ACG CAG GCT TTC CTG CAG GTT GGT GCT CAG GCT AAA GCT ACG CAT GAT TTC CGC ACG AAC AAC TTC CCA CGC GCA CGG GCT -3’ (96) Hai primer đƣợc thiết kế cho chạy phản ứng PCR. Primer Forward chứa một trình tự nhận biết enzyme cắt Xho I và primer Reverse chứa vị trí cắt Xba I. 17 Forward primer 5’-TCTCGAGAAAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCATAG-3’ (Xho I) Reverse primer 5’-CTTAATTCTAGATTATTCCTTACTACGCAGGCTTTC-3’ (Xba I) 3.2.1.2. Vi khuẩn E. coli Top10 F’ Đây là chủng dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng plasmid và cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation. Kiểu gen nhƣ sau: F′ {lacIq, Tn10(TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacΧ74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. 3.2.1.3. Plasmid pGEM-T Đây là plasmid đƣợc sử dụng trong cloning và giải trình tự. Plasmid này chứa vùng MSC (vùng gen đƣợc chèn) với trình tự nhận biết của 15 enzyme cắt giới hạn. Và chứa vùng trình tự promoter T7 và promoter SP6 có thể đƣợc dùng trong giải trình tự đoạn gen chèn. Hình 3.1: Vector pGEM-T 3.2.2. Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri, ống nghiệm, lọ thủy tinh, bình tam giác, pipet, đầu típ, eppendorf các loại, ống falcon, cuvette 0,2 cm... 3.2.3. Thiết bị máy móc 18 Tủ cấy vô trùng, thiết bị điện di, tủ vi khí hậu, máy lắc vi khuẩn, máy ly tâm, tủ sấy, máy đo OD, thiết bị PCR, máy chụp gel, lò vi sóng, tủ lạnh, nồi hấp… 3.2.4. Hóa chất sử dụng Hóa chất sử dụng trong PCR Taq DNA polymerase, ThemoPol buffer, dNTPs, MgCl2, Platinum® Pfx DNA Polymerase. Hóa chất sử dụng cho tách plasmid TE + Tris–HCl (pH 8) 10 mM + EDTA 1 mM Dung dịch II + NaOH 200 mM + SDS 1 % Dung dịch III + Potassium acetate 0,3 M + Acetic acide 11,5 ml/l Hóa chất sử dụng cho điện di Loading buffer +100 % glycerol 5 ml +TE 5X buffer 2,5 ml +Bromphenol Blue 0,015 ml TAE 50X + Tris-Base 242 g/l + Acetic acide 57,1 ml/l + EDTA (pH 8) 50 mM Các loại môi trƣờng nuôi cấy và biến nạp Môi trƣờng LB lỏng có tetracyclin (10 g pepton, 5 g bacto yeast extract, 5 g NaCl trên 1 lít +10 μg/ml tetracyclin). Môi trƣờng LB lỏng có tetracyclin và ampicillin (10 g pepton, 5 g bacto yeast extract, 5 g NaCl trên 1 lít + 10 μg/ml tetracyclin + 100 μg/ml ampicillin). Môi trƣờng LB agar có tetracyclin (10 g pepton, 5 g bacto yeast extract, 5 g NaCl, 15 g agar +10 μg/ml tetracyclin). Môi trƣờng LB agar có tetracyclin và ampicillin (10 g pepton, 5 g bacto yeast extract, 5 g NaCl, 15 g agar + 10 μg tetracyclin + 100 μg ampicillin, 0,5 mM IPTG, 80 μg/ml X-Gal). 19 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tóm tắt quy trình nghiên cứu: Tổng hợp gen PCR Điện di kiểm tra Tinh sạch DNA từ gel Phản ứng A-Taling E. coli T4 Ligase pGEM-T pGEM-T gắn DNA E. coli khả nạp xung điện Nuôi cấy chọn lọc Enzyme cắt Điện di PCR Tách plasmid Điện di kiểm tra kiểm tra giới hạn Giải trình tự kiểm tra 3.3.1. Tổng hợp đoạn gen IFN-α2a bằng PCR và chạy điện di kiểm tra 3.3.1.1. Tổng hợp đoạn gen Sử dụng 6 đoạn oligonucleotide đƣợc thiết kế ở trên. Những đoạn oligonucleotide này có 18 đến 21 nucleotide ở đầu 5’ và 3’ có khả năng bắt cặp bổ sung với nhau. Phản ứng tổng hợp gen IFN-α2a đƣợc thực hiện qua hai bƣớc: - Bƣớc nối các oligonucleotide, các oligonucleotide đƣợc biến tính ở 94 o C trong khoảng 1 phút, phản ứng nối gồm 15 chu kỳ nhiệt nhƣ sau: 20 94 oC 30 giây 50 oC 30 giây 72 oC 40 giây Chuẩn bị phản ứng 48 μl gồm các thành phần sau: Mỗi oligonucleotide (15 μM) 1 μl Platinum® Pfx DNA Polymerase (5 U/µl) 1 µl dNTPs (10 mM) 5 μl 10X PCR buffer 5 μl Nƣớc khử ion 31 μl - Bƣớc thực hiện phản ứng PCR: sau khi thực hiện xong việc nối các oligonucleotide, 1 μl của mỗi primer Forward và Reverse đƣợc thêm vào phản ứng. Sau đó phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo chƣơng trình sau: 94 o C 1 phút 94 o C 30 giây 50 o C 30 giây 72 o C 35 giây 72 o C 3 phút 3.3.1.2. Chạy điện di kiểm tra Chuẩn bị đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn; cân 0,5 g agarose cho vào 50 ml 1X TAE sau đó đun nóng bằng lò vi sóng khoảng 2 phút. Cho thêm khoảng 2 μl ethiumbromide lắc đều. Để nguội khoảng 50 – 60oC, đổ gel vào khuôn. Khi gel đã nguội gỡ lƣợc ra khỏi gel, sau đó đặt gel vào bồn điện di đã có sẵn 1X TAE một cách nhẹ nhàng. Chuẩn bị một miếng parafilm hút 4 μl loading buffer cho mỗi mẫu điện di, hút mẫu cần điện di trộn đều với loading buffer, hút toàn bộ dung dịch vừa trộn vào giếng. Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, chạy với hiệu địên thế 100 V, thời gian 30 phút. Sau khi điện di xong lấy gel ra và đọc kết quả dƣới tia UV. 3.3.2. Tinh sạch DNA từ gel và thực hiện phản ứng A-Tailing cho đoạn DNA Quy trình tinh sạch DNA từ gel Nhằm phân tách và thu nhận đoạn gene IFN- 2a mong muốn từ bản gel agarose sau khi điện di. Phƣơng pháp sử dụng bộ kit QIAquick Gel Extraction của Qiagen. Quy trình thực hiện nhƣ sau: Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV. 15 chu kỳ 30 chu kỳ 21 Bƣớc 2: Dùng dao sạch cắt phần gel chứa băng DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1,5 ml. Bƣớc 3: Thêm buffer QG vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 100 mg gel ≈ 300 µl buffer QG. Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 50oC khoảng 10 – 15 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Bƣớc 5: Sau khi gel đã tan, kiểm tra màu của hỗn hợp gel. Nếu có màu cam hoặc tím, thêm 10 μl 3 M sodium acetate pH 5,0 và trộn để hỗn hợp chuyển sang màu vàng. Bƣớc 6: Thêm isopropanol vào eppendorf với tỷ lệ 100 mg gel ≈ 100 μl isopropanol. Bƣớc 7: Chuẩn bị cột QIAquick, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch. Bƣớc 8: Hút mẫu cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch. Bƣớc 9: Thêm 0,75 ml buffer PE, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút. Bƣớc 10: Loại bỏ phần dịch ở dƣới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bƣớc 11: Lấy cột ra và để vào eppendorf 1,5 ml. Bƣớc 12: Thêm 50 μl buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) vào cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chứa DNA. Thực hiện phản ứng A-Tailing Phản ứng nhằm gắn dATP vào hai đầu 3’ của đoạn gen IFN-α2a. Phản ứng 10 μl bao gồm: Sản phẩm PCR 7 μl 10X buffer PCR 1 μl dATP (10 mM) 0,5 μl Taq DNA polymerase 0,5 μl H2O 1 μl Trộn nhẹ bằng pipet, ủ ở 72oC khoảng 15 – 30 phút. 3.3.3. Thực hiện phản ứng nối DNA đã đƣợc A-Tailing vào plasmid pGEM-T Nguyên tắc: dATP ở đầu 3’ của gen IFN-α2a sẽ bắt cặp bổ sung với dTTP ở đầu 3’ của vector pGEM-T nhờ enzyme T4 ligase. 22 Hình 3.2: Mô hình nối gen chèn vào vector pGEM-T Thực hiện phản ứng nối 10 µl với những thành phần nhƣ sau: 2X buffer 5 µl IFN-α2a đã gắn A 3 µl Vector pGEM-T 1 µl T4 ligase (1 U/µl ) 1 µl Trộn phản ứng bằng pipet và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp và thực hiện phản ứng biến nạp Chuẩn bị tế bào khả nạp Bƣớc 1: Trải một ít giống lên đĩa môi trƣờng LB có chứa 10 μg/ml tetracyclin, nuôi qua đêm ở 37oC. Bƣớc 2: Chọn một khuẩn lạc đƣờng kính 2 – 3 mm vào một ống nghiệm chứa 2 – 5 ml môi trƣờng LB có tetracyclin, nuôi cấy ở tủ lắc 37oC qua đêm. Bƣớc 3: Hút dịch nuôi cấy qua đêm vào lọ thủy tinh chứa 100 ml môi trƣờng LB có tetracyclin. Khi OD đạt khoảng 0,7 chuyển lọ chứa môi trƣờng nuôi cấy sang thùng đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 4: Ly tâm dịch tế bào 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Bƣớc 5: Sau khi ly tâm đổ bỏ phần dịch nổi, giữ lại phần tủa. Bƣớc 6: Thêm 20 ml glycerol 10 %, vortex nhẹ nhàng sau đó ly tâm 5000 vòng trong 10 phút ở 4oC, đổ bỏ phần dịch nổi. Lặp lại bƣớc này 2 lần. Bƣớc 7: Thêm khoảng 300 μl glycerol 10 %, lắc nhẹ cho tế bào tan ra. Hút khoảng 40 μl cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, trữ ở -70oC. Thực hiện phản ứng biến nạp Sử dụng phƣơng pháp chuyển gen xung điện. Sử dụng một điện trƣờng mạnh trong thời gian ngắn làm tạm thời mất tính ổn định của màng tế bào và tạo thành các lỗ trên màng cho DNA plasmid đi qua. Quy trình thực hiện nhƣ sau: 23 Bƣớc 1: Lấy ống eppendorf chứa 40 μl tế bào khả nạp từ –70oC ra và đặt trên đá cho tế bào tan ra, thêm 1 μl DNA plasmid, trộn nhẹ nhàng bằng pipet. Bƣớc 2: Cho hỗn hợp tế bào vào cuvette 0,2 cm, để trên đá khoảng 1 phút. Bƣớc 3: Để cuvette vào máy cho dòng điện 2,5 kV đi qua. Bƣớc 4: Thêm 200 μl môi trƣờng LB lỏng vào cuvette, ủ ở 37oC cho 1 giờ. Bƣớc 5: Hút lần lƣợt khoảng 40 μl, 60 μl và 100 μl cấy sang các đĩa môi trƣờng LB agar chứa tetracyclin và ampicillin. Nuôi ở 37oC qua đêm. 3.3.5. Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn Nguyên tắc của chọn lọc khuẩn lạc mong muốn là dựa vào kháng sinh ampicillin và phản ứng tạo màu của X-Gal trên môi trƣờng có IPTG. Sau khi ủ qua đêm, trên đĩa sẽ xuất hiện những khuẩn lạc màu trắng và màu xanh. Những khuẩn lạc màu trắng thƣờng chứa plasmid mang gene ngoại lai. Để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gene trong vector tạo dòng chúng tôi tiến hành chọn khoảng 10 khuẩn lạc cho vào 10 ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB lỏng có tetracyclin (10 μg/ml) và ampicillin (100 μg/ml). Nuôi cấy qua đêm ở trong tủ lắc 37oC. 3.3.6. Quy trình tách plasmid Bƣớc 1: Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn đã nuôi cấy qua đêm ở 37oC vào eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 2: Loại bỏ phần dịch nổi, thêm 100 μl TE, vortex cho đến khi tế bào tan hết. Bƣớc 3: Thêm 200 μl dung dịch II, đảo nhẹ. Bƣớc 4: Thêm 150 μl dung dịch III, đảo nhẹ, để vào trong đá khoảng 10 phút. Bƣớc 5: Ly tâm 13000 vòng/phút khoảng 5 phút. Hút phần dịch nổi chuyển qua eppendorf có 900 μl ethanol 100 %. Giữ trong đá khoảng 10 phút. Bƣớc 6: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần dịch nổi, giữ tủa lại. Bƣớc 7: Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần dịch nổi. Lập lại hai lần bƣớc này. Bƣớc 8: Để khô mẫu, thêm vào mỗi eppendorf 40 μl TE. Sau khi tách plasmid, thực hiện điện di trên gel agarose theo quy trình 3.3.1.2 để kiểm tra. 3.3.7. Chạy PCR kiểm tra Sau khi tách plasmid theo quy trình 3.3.6 và kiểm tra chúng tôi thực hiện phản ứng PCR để nhân đoạn gen chèn. Phản ứng 25 μl với những thành phần sau: 24 - 10X PCR buffer 2,5 μl - dNTPs 10 mM 2 μl - primer Forward 2 μM 1 μl - primer Reverse 2 μM 1 μl - Tag DNA polymerase (5 U/ μl) 0,25 μl - Plasmid 2 μl - H2O 16,25 μl Thực hiện phản ứng theo chƣơng trình chạy PCR tổng hợp gen ở 3.3.1.1. Sau khi chạy PCR thực hiện chạy điện di nhƣ quy trình 3.3.1.2 để kiểm tra đoạn gen chèn. 3.3.8 Thực hiện phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn Sau khi kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR, chúng tôi thực hiện phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn để khẳng định sự hiện diện của đoạn gen. Enzyme giới hạn đƣợc dùng ở đây là XhoI và XbaI. Trộn phản ứng 20 μl với những thành phần sau: Plasmid 7 μl 10X buffer 2 μl BSA 100X 0,2 μl Xhol I (20 U/ μl) 0,3 μl Xbal I (20 U/μl) 0,3 μl H2O 10,2 μl Trộn phản ứng nhẹ nhàng, sau đó ủ ở 37oC trong 2 giờ. Đem điện di xem kết quả. 25 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phản ứng tổng hợp IFN-α2a Nhƣ chúng ta đã biết IFN-α2a là một đoạn gen nằm trên NST số 9 ở ngƣời. Để có đƣợc đoạn gen IFN-α2a ngƣời ta có thể phân lập đoạn gen này từ genome hoặc tổng hợp nhân tạo đoạn gen. Dựa vào những điều kiện của phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành với phƣơng pháp tổng hợp nhân tạo. Những đoạn oligonucleotide ở đây sẽ đƣợc thiết kế sao cho phù hợp để E. coli có thể nhận biết trong quá trình dịch mã acid amin. Bên cạnh đó chúng tôi cũng thiết kế hai primer có vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn lần lƣợt trên từng primer là Xho I và Xba I để phục vụ cho quá trình kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen và dễ dàng hơn trong quá trình chuyển gen vào vector biểu hiện sau này. Sau khi tiến hành tổng hợp gen IFN-α2a từ 6 oligonucleotide ở trên cùng với 2 primer Forward và Reverse chúng tôi thực hiện điện di trên gel agarose 1 % và có kết quả sau: 1 2 3 Hình 4.1: Kết quả tổng hợp gen 1;2: Đoạn gen tổng hợp 3: Leader 1 kb plus Kết quả ở hình 4.1 cho thấy sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 500 bp, phù hợp với kích thƣớc đoạn gen mong muốn. Để có đƣợc lƣợng DNA mong muốn sử dụng cho tạo dòng và thực hiện các biện pháp kiểm tra, chúng tôi tiến hành tinh sạch đoạn DNA này từ gel. Ở khóa luận này chúng tôi sử dụng bộ kit QIAquick Gel Extraction (của hãng Qiagen). Sau khi tinh sạch chúng tôi thực hiện kiểm tra trên gel. 500 bp 26 4.2. Tạo dòng phân tử IFN-α2a 4.2.1. Kết quả biến nạp Sau khi DNA đƣợc tinh sạch, chúng tôi thực hiện phản ứng A-Tailing để gắn dATP vào các đầu 3’ của sợi DNA. Tiếp đó DNA này sẽ đƣợc chèn vào vector pGEM-T nhờ enzyme T4 ligase. Vector đã đƣợc gắn gen sẽ đƣợc chuyển vào vi khuẩn E. coli Top10F’ nhờ phƣơng pháp biến nạp bằng xung điện. Sau khi biến nạp, để có thể xác định đƣợc những vi khuẩn nào mang vector có chứa đoạn gen chèn chúng tôi thực hiện chọn lọc dựa trên phƣơng pháp α-complementation. Ủ dịch biến nạp ở 37oC khoảng 1 giờ sau đó cấy ra đĩa môi trƣờng chọn lọc có ampicillin, tetracycline, X-Gal và IPTG, tiếp tục ủ qua đêm ở 37oC. Trên đĩa xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng. Những khuẩn lạc màu trắng thƣờng chứa vector có đoạn gen chèn mong muốn, những khuẩn lạc màu xanh chứa vector tái bắt vòng. Hình 4.2: Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc chứa ampicillin (100 μg/ml), tetracyclin (10 μg/ml) và X-Gal/IPTG. 4.2.2. Tách plasmid Sau khi chọn lọc đƣợc vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc, để có thể kiểm tra xem vi khuẩn có vector chứa gen hay không đồng thời để có mẫu vector biến nạp đem đọc trình tự thì phải có đƣợc plasmid từ vi khuẩn mà chúng ta nghi ngờ là mang gen mong muốn. Chúng tôi chọn đĩa có nhiều khuẩn lạc rời, sau đó dùng đầu tip sạch chấm từng khuẩn lạc lớn màu trắng cấy sang môi lỏng chọn lọc có ampicillin và tetracyclin, nuôi cấy tới khi OD đạt khoảng 0,7 thì tiến hành tách plasmid. Sau đó chúng tôi chạy điện di trên gel agarose 1 % để kiểm tra: 27 1 2 3 4 5 Hình 4.3: Kết quả điện di plasmid trên gel agarose 1 % 1, 2, 3, 4: Sản phẩm DNA plasmid chiết tách 5: Leader 1 kb plus Kết quả cho thấy đã tách plasmid thành công. Những plasmid này sẽ đƣợc kiểm tra bằng enzyme cắt và PCR để xác định sự hiện diện của đoạn gen IFN-α2a. 4.3. Kết quả kiểm tra 4.3.1. Kiểm tra PCR Để kiểm tra đoạn gen chèn trong vector chúng tôi thực hiện phản ứng PCR. Chúng tôi thực hiện PCR kiểm tra với hai primer Forward và Reverse: 1 2 3 4 5 Hình 4.4: Kết quả PCR kiểm tra 1: Leader 1 kb plus 2, 3, 4, 5: Sản phẩm PCR Sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 500 bp chứng tỏ đã có đoạn gen IFN-α2a chèn mong muốn. DNA plasmid 500 bp 28 4.3.2. Cắt bằng enzymee giới hạn Sau khi kiểm tra bằng PCR có kết quả mong muốn, để có thể khẳng định thêm phần chính xác sự hiện diện của đoạn gen chèn chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với hai enzyme XhoI và XbaI. 1 2 Hình 4.5 Kiểm tra bằng enzyme cắt 1: Leader 1 kb 2: Sản phẩm plasmid đƣợc cắt Kết quả cho thấy sau khi cắt plasmid xuất hiện hai băng ở khoảng kích thƣớc mong muốn. 4.4. Kết quả giải trình tự Sau khi qua các phƣơng pháp kiểm tra bằng điện di plasmid, PCR có kết quả mong muốn chúng tôi gửi mẫu để giải trình tự. Cặp mồi đƣợc sử dụng để giải trình tự là: T7 promoter và SP6, đây là hai mồi có vị trí bắt cặp bổ sung trên trình tự DNA của vector pGEM-T. TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAT AGC CTG GGC AGC CGT CGT ACC CTG ATG CTG CTG GCG CAG ATG CGT AAA ATC AGC CTG TTT AGC TGC CTG AAA GAT CGT CAT GAT TTT GGC TTT CCG CAG GAA GAA TTT GGC AAC CAG TTT CAG AAA GCG GAA ACC ATC CCG GTT CTG CAT GAA ATG ATC CAG CAG ATC TTT AAC CTG TTT AGC ACC AAA GAT AGC AGC GCG GCG TGG GAT GAA ACC CTG CTG GAT AAA TTT TAT ACC GAA CTG TAT CAG CAG CTG AAC GAT CTG GAA GCG TGC GTT ATC CAG GGC GTTGGC GTT ACC GAA ACC CCG CTG ATG AAA GAA GAT AGC ATC CTG GCG GTT CGT AAA TAT TTT CAG CGT ATC ACC CTG TAT CTG AAA GAA AAA AAA TAT AGC CCG TGC GCG TGG GAA GTT GTT CGT GCG GAA ATC ATG CGT AGC TTT AGC CTG AGC ACC AAC CTG CAG GAA AGC CTG CGT AGT AAG GAA TGA Hình 4.6: Trình tự đoạn gen IFN- 2a tổng hợp đƣợc 2,9 kb 0,5 kb 29 Kết quả giải trình tự đƣợc dịch mã sang trình tự acid amin nhờ công cụ dịch mã (translate tool) của ExPASy. Sau đó sẽ đƣợc so sánh với trình tự acid amin của IFN-α2a trên ngân hàng gen NCBI. 100.0% identity in 165 residues overlap; Score: 851.0; Gap frequency: 0.0% UserSeq1, 1 CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI UserSeq2, 1 CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI ************************************************************ UserSeq1, 61 QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVR UserSeq2, 61 QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVR ************************************************************ UserSeq1, 121 KYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE UserSeq2, 121 KYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE ******************************************** Hình 4.7: Kết quả so sánh trình tự acid amin Kết quả cho thấy trình tự acid amin của đoạn gen tổng hợp đƣợc tƣơng đồng với trình tự acid amin trên ngân hàng gen NCBI là 100 %. 30 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc chúng tôi có những kết luận sau: - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình tổng hợp gen IFN-α2a bằng kỹ thuật PCR. - Tạo dòng thành công gen IFN-α2a trong vi khuẩn E. coli và thu nhận đƣợc trình tự DNA có thể mã hóa để nhận đƣợc trình tự acid amin đúng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 5.2. Đề nghị Trong khóa luận này chúng tôi đã tổng hợp thành công gen IFN-α2a, đồng thời kết quả giải trình tự cũng cho thấy trình tự acid amin là đúng. Từ đó chúng tôi có một số đề nghị nhƣ sau: - Thực hiện chuyển gen IFN-α2a vào vector biểu hiện và chuyển vào E. coli phù hợp cho sản xuất interferon. - Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen IFN-α2a trên E. coli. 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TP Hồ Chí Minh. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục. 3. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 4. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 5. Phạm Hoàng Phiệt, 1999. Miễn dịch sinh lý bệnh (tập 1). Nhà xuất bản thành phố Hồ Chí Minh. 6. Bùi Trang Việt, 2002. Bài giảng sinh học phân tử (chương trình cao học). Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu nƣớc ngoài 7. T.A. Brown, 1997. Gene cloning an introduction (third edition). Chapman and Hall. 8. Daniel j.j. Carr, 2005. Interferon methods and protocols. Humana Press Totowa, New Jersey. 9. Eric Dieperink, M.D., Mark Willenbring, M.D. and Samuel B. Ho, M.D. Neuropsychiatric Symptoms Associated With Hepatitis C and Interferon Alpha: A Review. Am J Psychiatry 157:867-876, June 2000. 10. Fernanda O. Neves et al. Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon in Escherichia coli. Protein Expression and PuriWcation 35 (2004) 353–359. 11. DV Goeddel, H M Shepard, E Yelverton, D Leung, R Crea, A Sloma, and S Pestka. Synthesis of human fibroblast interferon by E. coli. Nucleic Acids Res. 1980 September 25; 8(18): 4057–4074. 12. Isaacs, A. and Lindenmam, J. Virus interference. I. The interferon. Proc. R. Lond. B. Biol. Sci. 174, 258. 32 13. M.J. McPherson and S.G. Møller, 2000. PCR. Springer. 14. Mullis K et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symn. Quant. Biol.51: 263-273. 15. Poonam Srivastava et al. Overexpression and purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 41 (2005) 313–322. 16. F. H. Reynolds, JR., E. Premkumart, and P. M. Pitha. Interferon activity produced by translation of human interferon messenger RNA in cell-free ribosomal systems and in Xenopus oocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 72, No. 12, pp. 4881-4885, December 1975 Biochemistry. 17. Sambrook and Russell. Molecular cloning - Laboratory manuals, volume 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 18. Scott M. Lippman. 13-cis-Retinoic Acid and Interferon -2a: Effective Combination. Therapy for Advanced Squamous Cell Carcinoma of the Skin. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 84, No. 4, 235-241, February 19, 1992. 19. Spiegel RJ. Intron A (Interferon Alfa-2B): clinical overview and future directions. Seminars in Oncology 13(3, Suppl 2): 89-101, 1986. 20. Woojin Jeong and Hang-Cheol Shin. Supply of the argU gene product allows high-level expression of recombinant human interferon-a2a in Escherichia coli. Biotechnology Letters, Vol 20, No 1, January 1998, pp. 19–22. Tài liệu web 1. &val=11067750 2. 3. 4. 024.jpg 5. 33 PHỤ LỤC Phụ lục : Kết quả đọc trình tự từ Macrogen ở Hàn Quốc >060308-02_N16_pGEM-2a-7-T7promoter.ab1 855 0 855 ABI NNNNAACGGCTATCGAGCTCCGGCCGCCTGGCCGCGGGATTTGCGGCCGC TCTAGATTATTCCTTACTACGCAGGCTTTCCTGCAGGTTGGTGCTCAGGC TAAAGCTACGCATGATTTCCGCACGAACAACTTCCCACGCGCACGGGCTA TATTTTTTTTCTTTCAGATACAGGGTGATACGCTGAAAATATTTACGAAC CGCCAGGATGCTATCTTCTTTCATCAGCGGGGTTTCGGTAACGCCAACGC CCTGGATAACGCACGCTTCCAGATCGTTCAGCTGCTGATACAGTTCGGTA TAAAATTTATCCAGCAGGGTTTCATCCCACGCCGCGCTGCTATCTTTGGT GCTAAACAGGTTAAAGATCTGCTGGATCATTTCATGCAGAACCGGGATGG TTTCCGCTTTCTGAAACTGGTTGCCAAATTCTTCCTGCGGAAAGCCAAAA TCATGACGATCTTTCAGGCAGCTAAACAGGCTGATTTTACGCATCTGCGC CAGCAGCATCAGGGTACGACGGCTGCCCAGGCTATGGGTTTGAGGCAGAT CACATCTTTTCTCGAGAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCAT ATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTG TCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAG TGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATAAATGCGNTG CGCTCACTGCCCNGCTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTA ATGAN 34