Xác định salbutamol trong mẫu thịt bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (gc/ms) - Trần Nguyễn An Sa

Pham Trung Kien, Huynh Dai Phu, Nguyen Van Tam, Ngo Vo Ke Thanh, 72 8. Pham Trung Kien. - Ability to use wasted cullet in glass industry as environmental- friendly materials for sustainable development. RCME 29-30 Oct 2015, Bangkok, section 1C-3, pp. 1. TÓM TẮT TỔNG HỢP KHOÁNG CALCIUM SILICATE HYDRATE (CSH) TỪ NGUỒN NGUYÊN LIỆU TRẤU Pham Trung Kien1*, Phan Viet Hoang1, Huynh Dai Phu1, Nguyen Van Tam2, Ngo Vo Ke Thanh2, Nguyen Hoc Thang3, Hirofumi Hinode4 1Đại học Bách Khoa TP.HCM, 2Trung tâm Nghiên cứu triển khai - Khu Công nghệ cao TP.HCM, 3Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, 4Viện Công nghệ Tokyo. *Email: phamtrungkien@hcmut.edu.vn Việt Nam là nước nông nghiệp, sản xuất nhiều gạo và sản phẩm phụ là trấu. Trấu được xem là chất thải nông nghiệp và được đốt bỏ. Quá trình này gây ô nhiễm môi trường, thu hút nhiều nghiên cứu để tận dụng trấu. Nhóm nghiên cứu ở bộ môn Ceramic tận dụng trấu như nguồn cung cấp silica (SiO2). Cần nhấn mạnh rằng thành phần chính của trấu là silica. Nghiên cứu này công bố kỹ thuật mới phối trộn tro và CaO với tỷ lệ mol Ca/Si 1.0 để tổng hợp khoáng xonotlite như vật liệu môi trường. Ưu điểm của nghiên cứu này là tận dụng nguồn trấu Việt Nam và giảm tác hại lên môi trường bằng phản ứng thủy nhiệt. Từ khóa: Calcium silicate, trấu, thủy nhiệt, ceramic. Tạp chí Khoa học công nghệ và Thực phẩm 12 (1) (2017) 73-80 XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) Trần Nguyễn An Sa*, Nguyễn Trang Vi Hậu Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: satna@cntp.edu.vn Ngày nhận bài: 29/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 18/9/2017 TÓM TẮT Nội dung nghiên cứu của báo cáo là khảo sát các điều kiện tối ưu trong qui trình xác định salbutamol trong mẫu thịt bằng phương pháp GC/MS với hệ thống thiết bị Agilent 7890N, đầu dò MSD 5975C, cột mao quản khảo sát là HP – 5MS. Các điều kiện khảo sát bao gồm: khảo sát các thông số của hệ thống GC/MS; xây dựng đường chuẩn và khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn; LOD, LOQ của mẫu, khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình. Kết quả khảo sát thu được qui trình phân tích với chế độ quét phổ: SIM; chương trình nhiệt: 120 oC giữ 0,1 phút, tăng 15 oC/phút đến 245 oC, tăng 30 oC/phút đến 300 oC giữ 10 phút; chế độ tiêm mẫu: Splitless; LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb, khoảng tuyến tính từ 10 ppb – 200 ppb, LOD và LOQ trên nền mẫu lần lượt là: 0,018 ppb và 0,049 ppb. Từ khóa: Salbutamol, salbutamol – d3, GC/MS, mẫu thịt, SIM. 1. MỞ ĐẦU Chất tăng trọng hay chất tạo nạc là một hợp chất hóa học thuộc họ β – agonist được xếp vào loại chất cấm sử dụng trong chăn nuôi trên toàn thế giới. Họ β – agonist, điển hình là salbutamol, là các hợp chất tổng hợp phenethanolamine. Trong y học, salbutamol được sử dụng như là một tác nhân dùng điều trị các bệnh về hô hấp, được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol [1], Trong chăn nuôi, dược liệu này được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, salbutamol gây hại cho gia súc và cả người nếu ăn phải thịt vật nuôi có sử dụng các loại thức ăn có trộn salbutamol, vì nó là chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan [2]. Từ lâu, salbutamol đã là chất bị cấm sử dụng trong chăn nuôi theo quyết định của Tổ chức Y tế thế giới, Tổ chức lương thực và nông nghiệp của Liên hợp quốc. Vào tháng 7/1997, Châu Âu đã cấm sử dụng β – agonist (ngoại trừ dùng làm thuốc thú y). Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm β – agonist trong đó có salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn. Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân sử dụng trong chăn nuôi, do đó, ngay sau khi có thông tin về việc nguyên liệu salbutamol có khả năng bị sử dụng sai mục đích trong chăn nuôi, Bộ Y tế đã tích cực thực hiện các biện pháp để ngăn chặn việc lạm dụng, sử dụng sai mục đích nguyên liệu làm thuốc, đặc biệt là với trường hợp của salbutamol. Cục quản lý dược đã có Công văn số 21590/QLD-KD ngày 20/11/2015 thông báo đến các cơ sở nhập khẩu, các Sở Y tế, Tổng cục hải quan về việc tạm ngừng nhập khẩu nguyên liệu salbutamol [3-5]. 73 Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu Trong thời gian qua, trên thế giới và ở Việt Nam cũng đã có một số báo cáo về các phương pháp phân tích salbutalmol trên những đối tượng mẫu kiểm nghiệm khác nhau nhằm xác định tồn dư thuốc, đánh giá hiệu quả của việc sử dụng thuốc trong chăn nuôi, liều an toàn đối với gia súc, gia cầm và con người [6]. Các phương pháp phân tích sử dụng bao gồm định tính bằng kỹ thuật ELISA trong mẫu thức ăn chăn nuôi [7], định lượng bằng phương pháp GC/MS trong mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi với chất nội chuẩn 17-ethyltesttosterone [8-10]; phương pháp HPLC/MS xác định salbutamol trong mẫu thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt [2, 11], nước tiểu [12], trong mẫu sữa [13]. Đối với phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn salbutamol – d3 cũng đã có nhiều nghiên cứu đề cập [14-16] nhưng tập trung nhiều vào salbutamol trong các mẫu đơn giản như mẫu thức ăn gia súc, mẫu nước tiểu của gia súc, riêng đối với mẫu thịt, qui trình phân tích vẫn chưa tối ưu các điều kiện phân tích trên thiết bị Agilent 7890N và thẩm định phương pháp [17]. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Thiết bị Máy sắc ký Agilent 7890A với đầu dò MSD 5975C, khí mang heli, cột HP – 5MS Agilent, thành phần pha tĩnh 5% phenyl – 95% dimethylpolysiloxane (30 m × 0,25 mm × 0,25 m). 2.1.2 Hóa chất Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu này là loại tinh khiết dành cho phân tích GC: Methanol HPLC (Merck, grade ≥ 99,8%); Acetonitril HPCL (Merck, grade ≥ 99,8%); Ethyl acetate (Merck, 99,5%); Sabutamol.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Salbutamol – d3.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); BSTFA (1% TMCS) (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Amonium hydroxide (Merck, 25%); Natri acetat (Merck, 99,5%); Acid acetic (Merck, 99,8%). 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu Dung dịch chuẩn dùng làm khảo sát các thông số: từ dung dịch chuẩn salbutamol 1000 ppm, pha thành 100 µL dung dịch chuẩn salbutamol 1 ppm, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3, 1 mL methanol, vào vial 1,5 mL. Đối với mẫu: cân 10 g mẫu thịt, chiết với methanol trong môi trường đệm acetat (pH 5,2), lắc voltex, ly tâm 2500 vòng/phút ở 20 oC trong 15 phút, làm sạch bằng cách cho qua cột PCX, dung dịch rửa giải etylacetat/acetonitril/ammonium hydroxide (90:10:5). Thổi khô dung dịch chiết bằng khí nitơ ở 40 oC, hòa tan bằng 1 mL methanol, chuyển hết vào vial 1,5 mL, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3. 2.2.2 Khảo sát các thông số của hệ thống GC/MS Để khảo sát các thông số của hệ thống, tạo dẫn xuất salbutamol và salbutamol d3 với BSTFA:TMCS (99:1) trong môi trường đệm acetat, chiết dẫn xuất này và tiến hành chạy sắc ký với các chương trình nhiệt và chế độ chia dòng khác nhau. 2.2.3 Xây dựng đường chuẩn và khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Do điều kiện thí nghiệm hạn chế (dẫn xuất đồng vị d3 có giá thành cao) nên đường chuẩn được bắt đầu từ nồng độ salbutamol là 10 ppb. Bên cạnh đó, salbutamol là chất cấm, không được có trong thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam nên để đánh giá khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn cần khảo sát với khoảng nồng độ salbutamol  200 ppb. 74 Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu 74 Trong thời gian qua, trên thế giới và ở Việt Nam cũng đã có một số báo cáo về các phương pháp phân tích salbutalmol trên những đối tượng mẫu kiểm nghiệm khác nhau nhằm xác định tồn dư thuốc, đánh giá hiệu quả của việc sử dụng thuốc trong chăn nuôi, liều an toàn đối với gia súc, gia cầm và con người [6]. Các phương pháp phân tích sử dụng bao gồm định tính bằng kỹ thuật ELISA trong mẫu thức ăn chăn nuôi [7]; định lượng bằng phương pháp GC/MS trong mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi với chất nội chuẩn 17-ethyltesttosterone [8-10]; phương pháp HPLC/MS xác định salbutamol trong mẫu thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt [11, 2], nước tiểu [12], trong mẫu sữa [13]. Đối với phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn salbutamol – d3 cũng đã có nhiều nghiên cứu đề cập [14-16] nhưng tập trung nhiều vào salbutamol trong các mẫu đơn giản như mẫu thức ăn gia súc, mẫu nước tiểu của gia súc, riêng đối với mẫu thịt, qui trình phân tích vẫn chưa tối ưu các điều kiện phân tích trên thiết bị Agilent 7890N và thẩm định phương pháp [17]. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Thiết bị Máy sắc ký Agilent 7890A với đầu dò MSD 5975C, khí mang heli, cột HP – 5MS Agilent, thành phần pha tĩnh 5% phenyl – 95% dimethylpolysiloxane (30 m × 0,25 mm × 0,25 m). 2.1.2 Hóa chất Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu này là loại tinh khiết dành cho phân tích GC: Methanol HPLC (Merck, grade ≥ 99,8%); Acetonitril HPCL (Merck, grade ≥ 99,8%); Ethyl acetate (Merck, 99,5%); Sabutamol.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Salbutamol – d3.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); BSTFA (1% TMCS) (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Amonium hydroxide (Merck, 25%); Natri acetat (Merck, 99,5%); Acid acetic (Merck, 99,8%). 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu Dung dịch chuẩn làm việc dùng khảo sát các thông số: từ dung dịch chuẩn salbutamol 1000 ppm, chúng tôi pha thành 100 µL dung dịch chuẩn làm việc salbutamol 1 ppm, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3, 1 mL methanol, vào vial 1,5 mL. Đối với mẫu: cân 10g mẫu thịt, chiết với methanol trong môi trường đệm acetat (pH = 5,2), đánh votex, ly tâm 2500 vòng/phút ở 20 oC trong 15 phút, làm sạch bằng cách cho qua cột PCX, dung dịch rửa giải etylacetat/acetonitril/ammonium hydroxide (90:10:5). Thổi khô dung dịch chiết bằng khí nitơ ở 40 oC, hòa tan bằng 1 mL methanol, chuyển hết vào vial 1,5 mL, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3. 2.2.2 Khảo sát các thông số của hệ thống GC/MS Để khảo sát các thông số của hệ thống, tạo dẫn xuất salbutamol và salbutamol d3 với BSTFA:TMCS (99:1) trong môi trường đệm acetat, chiết dẫn xuất này và tiến hành chạy sắc ký với các chương trình nhiệt và chế độ chia dòng khác nhau. 2.2.3 Xây dựng đường chuẩn và khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Do điều kiện thí nghiệm hạn chế (dẫn xuất đồng vị d3 có giá thành cao) nên đường chuẩn được bắt đầu từ nồng độ salbutamol là 10 ppb. Bên cạnh đó, salbutamol là chất cấm, không được có trong thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam nên để đánh giá khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn cần khảo sát với khoảng nồng độ salbutamol  200 ppb. Xác định salbutamol trong mẫu thịt bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 75 2.2.4 Khảo sát hiệu suất thu hồi của qui trình và phân tích mẫu Dung dịch chuẩn 100 ppb (pha từ dung dịch salbutamol 1000 ppm) được dùng để đánh giá độ chính xác của đường chuẩn và hiệu suất thu hồi của phương pháp. Để đánh giá hiệu suất thu hồi qui trình: cân 10 g mẫu thịt, thêm 0,1 mL dung dịch chuẩn salbutamol 100 ppb và 0,1 mL dung dịch nội chuẩn salbutamol d3 100 ppb. Chiết salbutamol trong mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn với dung môi methanol trong môi trường đệm acetat. Cô khô mẫu dưới dòng khí nitơ, thêm thuốc thử (BSTFA:TMCS) tạo dẫn xuất với salbutamol và nội chuẩn salbutamol d3. Tiêm mẫu vào máy sắc ký với thể tích mẫu là 1 L. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát các thông số của hệ thống GC/MS Do salbutamol và clenbuterol cùng thuộc họ β – agonic, nên thường xác định đồng thời salbutamol và clenbuterol trong cùng điều kiện. Kết quả sắc ký đồ thể hiện ở Hình 1 cho thấy khi sử dụng chương trình 1 (100 ºC giữ 1,5 phút, tăng 10 ºC /phút đến 280 ºC, tăng 5 ºC /phút đến 300 ºC) các peak của dẫn xuất clenbuterol, clenbuterol d9 với thuốc thử tách khỏi peak của dẫn xuất giữa salbutamol, salbutamol d3 nhưng dẫn xuất của salbutamol không tách hoàn toàn khỏi salbutamol d3, với thời gian lưu (tR) của clenbuterol, clenbuterol d9, salbutamol, salbutamol d3 lần lượt là 8,332; 8,272 và 8,505; 8,512. Hình 1. Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt 1 Kết quả sắc ký đồ thu được (Hình 2) khi thay đổi chương trình nhiệt của hệ thống và tiến hành chạy sắc ký với chương trình nhiệt 2 như sau: 120 ºC giữ 0,1 phút, tăng 15 ºC/phút đến 245 ºC, tăng 30 ºC/phút đến 300 ºC giữ 10 phút, cho thấy 2 peak của dẫn xuất giữa salbutamol, salbutamol d3 với thuốc thử vẫn không tách khỏi nhau. So với chương trình 1, chương trình 2 có hiệu suất tách tương đương nhưng với thời gian tách ngắn hơn. Kết quả khảo sát ở cả 2 chương trình 1 và 2: peak của dẫn xuất giữa chuẩn salbutamol, và nội chuẩn đồng vị salbutamol d3 với thuốc thử (BSTFA:TMCS) có hiện tượng không tách hoàn toàn khỏi nhau. Sử dụng sắc ký đồ không tách được 2 peak này vì salbutamol và đồng vị có tính chất hóa học gần giống nhau nên sẽ xuất hiện cùng lúc, khó tách ra được. Do đó tiếp tục lấy khối phổ của 2 dẫn xuất tạo thành, khảo sát mảnh ion định lượng cho salbutamol và salbutamol d3 theo chương trình 2 ở chế độ quét phổ SCAN. Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu 76 Hình 2. Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt 2 Kết quả khảo sát thể hiện ở Hình 3 cho thấy có 4 mảnh ion chính là 73, 86, 369 và 372. Khi so sánh với thư viện NIST, các mảnh m/z = 73 và 86 của salbutamol và salbutamol d3 là trùng nhau, các mảnh m/z = 369 của salbutamol và 372 salbutamol d3 là tách biệt rõ rệt (Hình 3 và 4). Do đó chúng tôi chọn mảnh m/z = 369 là mảnh ion định lượng của salbutamol, và mảnh ion 372 là mảnh ion định lượng cho salbutamol d3 theo chương trình 2 ở chế độ SIM. So sánh tài liệu tham khảo [14, 15], chương trình nhiệt được lựa chọn có hiệu quả sắc ký tương đương nhưng thời gian tách ngắn hơn, do đó tiết kiệm được thời gian và hóa chất. Hình 3. Khối phổ đồ chuẩn salbutamol và salbutamol d3 Hình 4. Khối phổ đồ chuẩn salbutamol và salbutamol d3 tra từ thư viện NIST (Text File) Scan 242 (8.517 min): SCAN HH STD 100PPB .D\ data.ms 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 0 50 100 57 86 95 117 147 207 286 308 353 372 405 443 477 499 (mainlib) Salbutamol, tris(trimethylsilyl) ether 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 0 50 100 57 73 68 104 147 161 207 265 293 350 369 440 O OSi Si O NH Si (Text File) Scan 241 (8.507 min): SCAN HH STD 100PPB .D\ data.ms 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 0 50 100 57 73 86 117 147 207 265 297 372 401 443 Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu 76 Hình 2. Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt 2 Kết quả khảo sát thể hiện ở hình 3 cho thấy có 4 mảnh ion chính là 73, 86, 369 và 372. Khi so sánh với thư viện NIST, các mảnh m/z = 73 và 86 của salbutamol và salbutamol d3 là trùng nhau, các mảnh m/z = 369 của salbutamol và 372 salbutamol d3 là tách biệt rõ rệt (hình 3 và 4). Do đó chúng tôi chọn mảnh m/z = 369 là mảnh ion định lượng của salbutamol, và mảnh ion 372 là mảnh ion định lượng cho salbutamol d3 theo chương trình 2 ở chế độ SIM. So sánh tài liệu tham khảo [14, 15], chương trình nhiệt được lựa chọn có hiệu quả sắc ký tương đương nhưng thời gian tách ngắn hơn, do đó tiết kiệm được thời gian và hóa chất. Hình 3. Khối phổ đồ chuẩn salbutamol và salbutamol d3 Hình 4. Khối phổ đồ chuẩn salbutamol và salbutamol d3 tra từ thư viện NIST (Text File) Scan 242 (8.517 min): SCAN HH STD 100PPB .D\ data.ms 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 0 50 100 57 86 95 117 147 207 286 308 353 372 405 443 477 499 (mainlib) Salbutamol, tris(trimethylsilyl) ether 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 0 50 100 57 73 86 104 147 161 207 265 293 350 369 440 O OSi Si O NH Si (Text File) Scan 241 (8.507 min): SCAN HH STD 100PPB .D\ data.ms 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 0 50 100 57 73 86 117 147 207 265 297 372 401 443 Xác định salbutamol trong mẫu thịt bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 77 Kết quả khảo sát chế độ chia dòng ở các tỉ lệ chia dòng lần lượt là 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 với chương trình 2 và chế độ quét phổ SIM thể hiện ở Bảng 1 và 2. So sánh diện tích peak và tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu nền giữa chế độ tiêm mẫu chia dòng và không chia dòng ở các tỉ lệ khác nhau cho thấy: chế độ tiêm mẫu không chia dòng cho cường độ tín hiệu và tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu nền cao nhất, đảm bảo độ nhạy của phương pháp. Bảng 1. Diện tích peak và tỉ lệ tín hiệu đo với chế độ Split (chia dòng) Dung dịch đo Tỉ lệ chia dòng Chất phân tích Diện tích peak (S) Tỉ lệ tín hiệu / nhiễu nền (S/N) Chuẩn salbutamol 100 ppb trong dung môi 2:1 Salbutamol 11275 1251,9 Salbutamol d3 19163 5:1 Salbutamol 5991 1068,9 Salbutamol d3 10355 10:1 Salbutamol 3486 582,7 Salbutamol d3 5883 20:1 Salbutamol 1798 268,0 Salbutamol d3 3086 Chuẩn salbutamol 2 ppb trên nền mẫu 2:1 Salbutamol 10019 250,3 Salbutamol d3 17021 5:1 Salbutamol 5365 290,4 Salbutamol d3 8829 10:1 Salbutamol 2785 220,0 Salbutamol d3 4600 20:1 Salbutamol 1461 246,8 Salbutamol d3 2408 Bảng 2. Diện tích peak và tỉ lệ tín hiệu đo với chế độ Splitless (không chia dòng) Dung dịch đo Diện tích peak (S) Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu nền Chuẩn salbutamol 100 ppb trong dung môi 35482 (Salbutamol) 1293,9 55539 (Salbutamol d3) Chuẩn salbutamol 2 ppb trên nền mẫu 22944 (Salbutamol) 507,6 37893 (Salbutamol d3) 3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn và khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Đánh giá sự phù hợp của đường chuẩn với thực nhiệm dựa vào việc kiểm định theo chuẩn Student: từ phương trình đường chuẩn: r2 = 0,9994; 2adjustedr = 0,988; tTN = 15,72. So sánh tTN với t0,99, f = t0,99,3 = 5,84: phương trình hồi quy phù hợp với thực nghiệm. Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu 78 Hình 5. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của salbutamol với dẫn xuất (BSTFA:TMCS) Từ phương trình hồi quy ở Hình 5, tính LOD, LOQ theo công thức (1), kết quả thu được: LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb 0,99,f=N+m-2 S N+m LODLOD = t ; LOQ = 10× b Nm 3 residue (1) Dựa vào qui trình xử lý mẫu ở sơ đồ 1, LOD và LOQ trên nền mẫu lần lượt là: 0,018 ppb và 0,049 ppb. Theo thông tư số 01/2016/TT – BNNPTNT ngày 15/2/2016 quy định mẫu dương tính theo phương pháp định lượng, hàm lượng giới hạn tối đa cho phép của salbutamol trong thịt là < 5 ppb [3]. Thông thường, giá trị LOD phải thấp hơn giá trị giới hạn tối đa cho phép khoảng 10 lần mới đảm bảo độ tin cậy. Dựa vào LOD tính được nhỏ hơn 10 lần giới hạn tối đa cho phép, do đó, phương pháp xác định là đáng tin cậy. So sánh với tài liệu tham khảo phương pháp phân tích thu được đạt độ nhạy cao hơn, giới hạn phát hiện thấp hơn, có thể áp dụng để xác định salbutamol trong thực tế [14,15]. Sơ đồ 1. Qui trình xử lý mẫu thịt xác định salbutamol Xác định salbutamol trong mẫu thịt bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 79 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình và phân tích mẫu thật Kết quả thu được từ quá trình khảo sát hiệu suất thu hồi trên mẫu thịt, cho thấy salbutamol trong mẫu cho hiệu suất thu hồi 100,7% thuộc khoảng chấp nhận (80%  H  110%). Do đó, quy trình trên có thể áp dụng xác định salbutamol trên nền mẫu thịt. Để xác định salbutamol có trong mẫu, chúng tôi tiến hành chiết salbutamol và tạo dẫn xuất với (BSTFA:TMCS). Kết quả phân tích mẫu theo quy trình xác định salbutamol với thuốc thử (BSTFA:TMCS) cho thấy hàm lượng salbutamol trong mẫu thịt có hàm lượng dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp. Do đó phù hợp với quy định về hàm lượng tồn dư salbutamol cho phép ở mẫu thịt theo Thông tư 01/2016 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 4. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu và khảo sát qui trình phân tích salbutamol bằng phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn đồng vị Salbutamol – d3 thu được những kết quả như sau: chế độ quét phổ: SIM; chương trình nhiệt: 120 ºC giữ 0,1 phút, tăng 15 ºC /phút đến 245 ºC, tăng 30 ºC /phút đến 300 ºC giữ 10 phút; chế độ tiêm mẫu: Splitless; LOD và LOQ của đường chuẩn lần lượt là LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb, khoảng tuyến tính từ 10 ppb – 200 ppb, LOD và LOQ trên nền mẫu lần lượt là: 0,018 ppb và 0,049 ppb. So sánh với tài liệu tham khảo [14, 15] cho thấy phương pháp thu được tối ưu hơn, độ nhạy cao hơn. Tuy nhiên, nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế, cần khảo sát thêm một số vấn đề sau: tạo dẫn xuất với một số thuốc thử khác như: MSTFA, (MSTFA: NH4I: DTE),; lựa chọn cột chiết có khả năng chiết tốt nhất; lựa chọn dung môi chiết để chiết hoàn toàn salbutamol ra khỏi mẫu; khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo dẫn xuất như: thời gian, nhiệt độ,.. phân tích trên mẫu chuẩn được chứng nhận CRM (Certified Reference Material). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen C., Li H., Fan Y. - Determination of salbutamol sulfate in medicaments by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection, Se Pu 29 (2) (2011) 137-140. 2. Liu Caiyun, Wang Long - Research on determination of clenbuterol and salbutamol in pork by SPE/HPLC, International Conference on New Technology of Agricultural Engineering, 2011. 3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Thông tư số 28/2014/TT-BNNPTNT Ban hành danh mục hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, khinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam, 2014. 4. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT Sửa đổi, bổ sung một số điều của thông tư số 57/2012/BNNPTNT ngày 07/11/2012 Quy định việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist trong chăn nuôi, 2016. 5. Cục Quản lý dược - Công văn số 21590/QLD-KD về việc tạm ngừng nhập khẩu nguyên liệu salbutamol và clenbuterol, Bộ Y tế, 2015. 6. Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, 2002, pp. 8-35. 7. Đoàn Thị Khang - Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi, Viện Chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi, Số 13, Tháng 8/2008. Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu 80 8. Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. HCM - Quyết định về việc quy định các bước xác định hàm lượng chất clenbuterol và salbutamol, 16/04/2012. 9. Chu Vân Hải - Phân tích các chất kích thích tăng trưởng họ β-agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS, Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. HCM, 2008. 10. Chu Phạm Ngọc Sơn - Tài liệu tập huấn về sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS, 03/2016. 11. Nguyễn Thị Thu Thủy - Đánh giá hàm lượng các chất β- agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ, Luận án Tiến sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM, 2011. 12. Zhang X.Z., Gan Y.R., Zhao F.N. - Determination of salbutamol in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography with a coulometric electrode array system, Journal of Chromatographic Science 42 (5) (2004) 263-267. 13. Li C., Wu Y. L, Yang T., Zhang Y., Huang-Fu W.G. - Simultaneous determination of clenbuterol, salbutamol and ractopamine in milk by reversed-phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution, Journal of Chromatography A 1217 (50) (2010) 7873-7877. 14. TCVN : 2014, Thực phẩm – xác định dư lượng β2- agonist trong thịt gia súc – Phương pháp sắc ký ghép hai lần khối phổ. 15. Cơ quan Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương II - Xác định dư lượng salbutamol, clenbuterol trong thịt và nước tiểu gia súc bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS, Tài liệu lưu hành nội bộ, 2016. 16. Montrade M. P., Monteau F., Siliart B., Andre F.- Multi-residue analysis for β-agonistic drugs in urine of meat-producing animals by gas chromatography-mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 275 (1–2) (1993) 253-268. 17. Trần Cao Sơn - Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2010. ABSTRACT DETERMINATION OF SALBUTAMOL IN MEAT SAMPLES WITH GC-MS METHOD An-Sa Tran Nguyen*, Vi-Hau Nguyen Trang Ho Chi Minh City University of Food Industry *Email: satna@cntp.edu.vn The optimal conditions for determination of salbutamol in meat samples by GC/MS method with Agilent 7890N system, MSD 5975C, HP – 5MS have been investigated. The parameters for the column oven, injector, detector, limit of detection (LOD), and limit of quantitation (LOQ), recovery performance, conditions of sample processing methods have been also examined. The results of the survey were obtained with the scanning mode: SIM; program heat: 120 ºC (0,1 min), increase 15 ºC/min to 245 ºC, increase 30 ºC /min to 300 ºC for 10 minutes; injection mode: splitless; LOD = 0.12 ppb, LOQ = 0.41 ppb, linear range from 10 ppb to 200 ppb, LOD and LOQ on the sample were 0.018 ppb and 0.049 ppb, respectively, and the recovery of method: 100.7 %. Key words: Salbutamol, Salbutamol – d3, GC/MS, meat samples, SIM.