Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu xạ can, bọ mắm và dâu tằm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 216 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHẾ PHẨM THUỐC BỘT PHỐI HỢP TỪ CÁC DƯỢC LIỆU XẠ CAN, BỌ MẮM VÀ DÂU TẰM Nguyễn Thị Dịu Hiền*, Nguyễn Thị Ngọc Đan**, Lâm Bích Thảo**, Trần Công Luận**, Dương Thị Mộng Ngọc**, Lã Văn Kính*** TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu Xạ can, Bọ mắm và Dâu tằm. Phương pháp: Định tính các hợp chất saponin, alkaloid, flavonoid và rutin bằng phản ứng hoá học và sắc ký lớp mỏng. Định lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến. Kết quả: Đã xây dựng được tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu Xạ can, Bọ mắm và Dâu tằm. Xác định sự hiện diện của 3 nhóm hợp chất là flavonoid, saponin, alkaloid. Trên hình ảnh sắc ký đồ của chế phẩm cho thấy có sự hiện diện của cả 3 loại dược liệu và hoạt chất rutin. Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm là 0,088%. Kết luận: Phương pháp phân tích đáng tin cậy, đơn giản nên có thể ứng dụng vào công tác kiểm tra đánh giá chất lượng chế phẩm cũng như giúp ích cho việc ổn định quy trình sản xuất. Từ khoá: Xạ can, Bọ mắm, Dâu tằm, rutin, sắc ký lớp mỏng, quang phổ tử ngoại khả kiến. ABSTRACT THE STANDARDIZATION OF THE POWDER PREPARATION FROM SOME MEDICINAL PLANTS: BELAMCANDA CHINENSIS, POUZOLZIA ZEYLANICA AND MORUS ALBA Nguyen Thi Diu Hien, Nguyen Thi Ngoc Dan, Lam Bich Thao, Tran Cong Luan, Duong Thi Mong Ngoc, La Van Kinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 216 - 221 Objectives: The aim of this study to develop the standardization for anlyzing the powder preparation from some medicinal plants: Belamcanda chinensis, Pouzolzia zeylanica and Morus alba. Methods: Chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC) were used to identify the presence of saponins, alkaloids, flavonoids and rutin in the powder preparation. Quantitative determination of total flavonoid expressed in rutin by UV spectrophotometric method. Results: The testing standardization of the powder preparation were establised. The presence of saponins, alkaloids, flavonoids were determined by chemical reactions. TLC showed the presence of the medicinal plants and rutin in the preparation. Total flavonoid content expressed in rutin was determined to be 0.088%. Conclusions: The preparation have been standardized for stabilizing the producing process as well as the quality of product. The analytical method was proven to be reliable. This result is used to further study. Keywords: Belamcanda chinensis, Pouzolzia zeylanica, Morus alba, rutin, TLC, UV spectrophotometric. ∗ Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM ∗∗ Trung Tâm Sâm & Dược Liệu TP. HCM ∗∗∗ Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Tác giả liên lạc: PGS.TS. Lã Văn Kính ĐT: 0913916201 email: lakinh@hcmgmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 217 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của y học cổ truyền, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đang được nghiên cứu và đưa vào sản xuất rất nhiều. Những loại thuốc này tốt cho sức khỏe người sử dụng, ít tác dụng phụ hơn các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học. Từ xa xưa, Xạ can được coi là một vị thuốc quý chữa các bệnh về họng, viêm amidan có mủ, ho nhiều đờm, khản tiếng. Lá Dâu tằm có vị đắng, ngọt, tính hàn, có tác dụng chữa cảm mạo, phong nhiệt, sốt nóng, ho, viêm họng. Bọ mắm chữa viêm họng, ho lâu ngày, bệnh về phổi. Nhằm góp phần cho cho sự phát triển các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu Xạ can, Bọ mắm và Dâu tằm để điều trị các bệnh về hô hấp đang được tiến hành nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng các phương pháp lý hóa để khảo sát độ ẩm, định tính các nhóm hoạt chất chủ yếu có trong chế phẩm. Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định sự hiện diện của các dược liệu trong thành phần chế phẩm. Đồng thời, áp dụng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin. Từ đó, góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm trong các nghiên cứu triển khai tiến tới giới thiệu một sản phẩm mới cho cộng đồng. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Chế phẩm thuốc bột được bào chế bởi Bộ môn Hoá – chế phẩm – Trung tâm Sâm và dược liệu Tp. HCM. Thành phần gồm cao Xạ can (4,75%), cao Bọ mắm (3,55%), cao Dâu tằm (2,8%) và tá dược làm dạng bột (88,90%). Phương tiện Hóa chất: methanol (TQ); anhydric acetic (Merck); diethyl ether (TQ): ethyl acetate (TQ); cloroform (TQ); toluene (TQ), rutin chuẩn (Sigma - Aldrich, độ tinh khiết ≥ 95%) Dụng cụ: Máy siêu âm (εlma, LC60H); tủ sấy; bể cách thủy; bình sắc ký; cân có độ chính xác 0,1mg (Mettler Tolerdo, AB204); máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Thermo Spectronic - Heλios γ) Phương pháp khảo sát độ ẩm, độ mịn, độ đồng đều khối lượng (1) Khảo sát độ ẩm (mất khối lượng do sấy khô) theo DĐVN IV, phụ lục 9.6, trang PL-182: Cân 1g chế phẩm, sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Khảo sát độ mịn theo DĐVN IV, phụ lục 3.5, trang PL-110. Khảo sát độ đồng đều khối lượng theo DĐVN IV, phụ lục 11.3, trang PL-221, thực hiện với 20 gói, lấy ngẫu nhiên. Định tính bằng phương pháp hóa học (2,4) Thực hiện các phản ứng hóa học để xác định sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin trong chế phẩm. Hợp chất alkaloid: Dùng dịch chiết H2SO4 5% của 5g bột chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với H2SO4 5% (3 lần x 5ml), làm các phản ứng màu với thuốc thử (TT) đặc trưng của hợp chất alkaloid (Mayer, Bouchardat, Dragendroff). Hợp chất flavonoid: Dùng dịch chiết methanol của 3g chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với 20ml MeOH, lọc. Dịch lọc được cô đến cắn. Hoà cắn với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc, làm các phản ứng với thuốc thử (TT) đặc trưng của hợp chất flavonoid (NaOH 10%, FeCl3 10%, chì acetat 5%, Mg/HCl đđ). Hợp chất saponin: Cân khoảng 3g bột chế phẩm, thêm 30ml ethanol 70%, đun cách thủy 30 phút, lọc. Dịch lọc chia làm hai phần: Phần 1: Cô dịch lọc đến cắn. Hòa cắn với 5ml nước nóng, lọc vào ống nghiệm. Pha loãng với nước cất cho đủ khoảng 10ml, lắc dọc theo chiều thẳng đứng của ống nghiệm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 218 Phần 2: dịch lọc cô đến cắn. Hòa cắn với 0,5ml anhydric acetic, 1ml cloroform và cho vào ống nghiệm, cho từ từ vào ống nghiệm H2SO4 đđ (phản ứng Lieberman). Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Dung dịch mẫu thử Bọ mắm Cân khoảng 20g nguyên liệu và 100g chế phẩm, cho vào cốc có mỏ 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% đến khi dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với cồn 72% và cồn 48% đến khi kiệt. Tập trung toàn bộ dịch chiết được, lọc và cô giảm áp thu hồi dung môi đến cắn. Cắn hòa với 50ml nước cất, siêu âm cho tan cắn. Dịch nước được lắc với ether ethylic đến khi dịch ether hết màu. Tập trung dịch ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch mẫu thử Dâu tằm, Xạ can và hoạt chất rutin Cân khoảng 20g nguyên liệu và 100g chế phẩm, cho vào cốc có mỏ 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% đến khi dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với cồn 72% và cồn 48% đến khi kiệt. Tập trung toàn bộ dịch chiết được, lọc và cô giảm áp thu hồi dung môi đến cắn. Cắn hòa với 50ml nước cất, siêu âm cho tan cắn. Dịch nước được lắc với ether ethylic đến khi dịch ether hết màu, loại dịch ether. Dịch nước được lắc tiếp với chloroform, loại dịch chloroform. Dịch nước được lắc tiếp với ethyl acetat. Tập trung dịch ethyl acetat cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký của nguyên liệu. Dung dịch chuẩn rutin Hoà tan rutin chuẩn trong methanol để được dung dịch 1mg/ml. Điều kiện sắc ký Bản mỏng nhôm Silicagel 60F254 (dày 0,25 mm, 20 x 20 cm) Merck, Germany. Hệ dung môi khai triển Toluene - Ethyl acetate (7:3) để xác định sự hiện diện của Xạ can, Dâu tằm, Bọ mắm. Ethyl acetate – acid formic – acid acetic – nước (100:11:11:26) để xác định sự hiện diện của hoạt chất rutin. Thể tích chấm : 20µl dd nguyên liệu, 10µl dd chế phẩm và 10µl dd chuẩn. Phát hiện Soi UV 254nm, UV 365nm và thuốc thử FeCl3 5% trong cồn để phát hiện Xạ Can, rutin. Soi UV 365nm và thuốc thử Anisaldehyd để phát hiện Dâu tằm, Bọ mắm. Định lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (4) Thuốc thử AlCl3 5% trong methanol 70% Mẫu thử Cân chính xác 10g chế phẩm cho vào bình soxhlet. Thêm 250ml ether dầu, chiết đến khi dịch chiết không còn màu. Để nguội và gạn bỏ dịch ether. Bột chế phẩm trong bình Soxhlet được chiết tiếp tục với 250ml methanol 70%, cho đến khi dịch chiết không còn màu. Dịch chiết methanol 70% được chuyển vào bình định mức 250ml, bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu dung dịch A. Lấy chính xác 1 ml dung dịch A bằng micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 4ml methanol 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong methanol 70%, lắc đều (tiến hành 3 mẫu thử tương tự để lấy giá trị trung bình). Mẫu trắng thử Lấy chính xác 1ml dung dịch A cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm chính xác 4,075ml methanol 70%, lắc đều. Mẫu chuẩn Thêm chính xác vào ống nghiệm chứa 50 µg chuẩn rutin 5ml methanol 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong methanol 70%, lắc đều. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 219 Tất cả các mẫu đều để ở nhiệt độ phòng lạnh, đậy kín ống nghiệm, sau 30 phút tiến hành đo, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại λmax = 425nm, dùng methanol 70% làm mẫu trắng để chỉnh máy về 0. Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin có trong chế phẩm được tính theo công thức sau: m dm A AA X c c tt 4' 10250 −× ××× − = Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử. A’t: Độ hấp thu mẫu trắng thử. Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn. mc : Khối lượng chất chuẩn (µg). d: Độ tinh khiết của chất chuẩn (95%). m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm(g). KẾT QUẢ Độ ẩm, độ đồng đều khối lượng của chế phẩm dạng bột Bảng 1. Độ ẩm, độ đồng đều khối lượng của chế phẩm Chỉ tiêu Số lần lặp lại thí nghiệm Trung bình Yêu cầu phải đạt Độ ẩm (%) 3 5,414 ± 0,0015 ≤ 9 Độ đồng đều khối lượng (g) 20 20,166 ± 0,125 ±7,5 Độ ẩm của chế phẩm là 5,414% đạt yêu cầu về độ ẩm của thuốc bột theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Khối lượng bột thuốc trong mỗi gói trung bình là 20,166 g, nằm trong giới hạn cho phép (18,654 ≤ khối lượng trung bình ≤ 21,678), đạt yêu cầu về độ đồng đều khối lượng theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Chế phẩm là dạng bột mịn (180/125) theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Định tính bằng phương pháp hóa học Bảng 2. Kết quả định tính các hợp chất có trong viên nang BKHH bằng phương pháp hóa học Hợp chất Chế phẩm Kết quả Alkaloid Xuất hiện tủa trắng với thuốc thử Mayer + Xuất hiện tủa cam với thuốc thử Dragendroff + Hợp chất Chế phẩm Kết quả Xuất hiện tủa đỏ nâu với thuốc thử Bouchardat + Flavonoid Dung dịch tăng màu với thuốc thử NaOH 10% ++ Dung dịch có màu xanh rêu với thuốc thử FeCl3 10% ++ Dung dịch có tủa trắng với thuốc thử chì acetat 5% ++ Dung dịch có màu hồng với Mg/HCl đđ + Saponin Xuất hiện lớp bọt bền ++ Vòng ngăn cách có màu nâu đỏ ++ Trong chế phẩm có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Sắc ký đồ của chế phấm với các nguyên liệu đối chiếu . Toluene : Ethyl acetate (7: 3) Chế phẩm Xạ can Chế phẩm Xạ can Chế phẩm Xạ can Soi UV 254 nm Soi UV 366 nm Phun TT FeCl3 5% trong cồn và quan sát dưới ánh sáng thường Toluene : Ethyl acetate (7: 3) Chế phẩm Bọ mắm Chế phẩm Bọ mắm Chế phẩm Bọ mắm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 220 Dâu tằm Chế phẩm Dâu tằm Chế phẩm Dâu tằm Chế phẩm Soi UV365nm Phun TT Anisaldehyd và quan sát dưới ánh sáng thường Phun TT Anisaldehyd và soi UV365nm Qua kỹ thuật phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã chứng minh trong chế phẩm có sự hiện diện của cả 3 dược liệu. Đặc biệt, trên hình ảnh sắc ký đồ cho thấy trong chế phẩm có một vết cùng giá trị Rf và màu sắc với hoạt chất rutin. Sắc ký đồ của chế phẩm với hoạt chất rutin Ethyl acetate – acid acetic – acid formic – nước (100 : 11 : 11 : 26) Chế phẩm Rutin Chế phẩm Rutin Chế phẩm Rutin Chế phẩm Rutin Quan sát dưới ánh sáng thường Soi UV 254 nm Soi UV 366 nm Phun TT FeCl3 5% trong cồn và quan sát dưới ánh sáng thường Định lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến Bảng 3. Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin. Khối lượng chế phẩm đã trừ ẩm (g) At A’t Ac Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin (%) 9,470 0,565 0,330 0,336 0,088 9,558 0,561 0,325 0,332 0,088 9,536 0,562 0,331 0,331 0,087 Trung bình (%) 0,088 RSD % 0,656 Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phấm là 0,088%. Từ những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đề nghị một số tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm thuốc bột (bảng 4) như sau. Bảng 4. Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm. Tiêu chuẩn Yêu cầu 1 Mất khối lượng do sấy khô Không quá 9% 2 Độ mịn (rây 180/125) Bột mịn 3 Độ đồng đều khối lượng ± 7,5% 4 Định tính bằng phương pháp hóa học Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất flavonoid. Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất alkaloid. Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất saponin. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 221 Tiêu chuẩn Yêu cầu 5 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Các sắc ký đồ của chế phẩm phải có các vết tương ứng với các vết của dược liệu chuẩn: Bọ mắm, Xạ can, Dâu tằm và vết của rutin 6 Định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin 0,075% - 0,10% KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được từ thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau: - Chế phẩm đạt các yêu cầu về độ ẩm, độ mịn, độ đồng đều khối lượng theo các quy định của Dược điển Việt Nam IV. - Chế phẩm có các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin. - Chế phẩm có sự hiện diện của 3 dược liệu: Bọ mắm, Xạ can, Dâu tằm. - Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm trung bình là 0,088%. Những kết quả thu được từ nghiên cứu này góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm, phục vụ cho các nghiên cứu triển khai tiếp theo và có triển vọng đóng góp với cộng đồng một lựa chọn mới trong điều trị bệnh hô hấp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr. PL110, 182, 221. 2. . Pereira C B, Marin A, Tiago D. T. Maki, Raquel M. M.Necchi, Melania Palermo Manfron (2011). Physicochemical quality control and dosage of total polyphenols,flavonoids of Morus alba Leaves (MORACEAE), Saúde (Santa Maria). Ahead of Print, v.37, n.2, pp .5768. 3. Trần Hùng (2006). Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y dược TP. HCM. 4. Viện Dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 219 - 220 (I), 613 – 618 (I),1095 - 1098 (II). Ngày nhận bài báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/10/2013, 17/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2013