235_242_6939_2109596_20190324_022112

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 235 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.), THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TAXUSPINE F ĐÃ PHÂN LẬP Hứa Hoàng Oanh*, Trần Ngọc Thùy Dương*, Bùi Thị Bích Trâm*, Hà Diệu Ly**,Bùi Thế Vinh***, Trần Công Luận***, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mở đầu: Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) là một dược liệu quý, đã được trồng ở Lâm Đồng với triển vọng là nguồn cung cấp nguyên liệu cho việc sản xuất các thuốc trị ung thư. Do đó, việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu cũng như đánh giá chất lượng các taxoid được chiết tách từ thông đỏ lá dài là hết sức quan trọng và cần thiết. Chính vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất tự nhiên từ lá thông đỏ lá dài và thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ hợp chất taxoid phân lập được. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: cao methanol 60% của lá thông đỏ lá dài.Phương pháp nghiên cứu: Xử lý cao: loại tạp kém phân cực có trong cao methanol 60% bằng ether dầu hỏa. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên: phân lập hợp chất tự nhiên từ cao sau khi loại tạp bằng các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế và phương pháp kết tinh trong dung môi, xác định cấu trúc chất phân lập bằng các phương pháp phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR. Sau cùng, độ tinh khiết của chất phân lập được xác định bằng kỹ thuật HPLC pha đảo với đầu dò PDA. Thiết lập chất chuẩn thiên nhiên theo hướng dẫn của WHO, ASEAN và ISO/IEC 15328: đánh giá chất chuẩn bằng định tính dựa trên các giá trị: phổ UV-Vis, IR, MS, NMR, định lượng bằng HPLC; đóng gói, đánh giá đồng nhất, đánh giá liên phòng thí nghiệm (ba phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP). Kết quả: Từ 75 g cao methanol 60% đã phân lập được 425 mg hợp chất taxinine B (độ tinh khiết > 98%), 732 mg hợp chất taxuspine F (độ tinh khiết > 97%) và 310 mg hợp chất bis-(2-ethylhexyl)-phtalate. Theo hướng dẫn của WHO, ASEAN và ISO/IEC 15328, 300 mg chất chuẩn taxuspine F được thiết lập đạt độ đồng nhất khi đóng gói và độ tinh khiết 97,46%. Kết luận: Đề tài đã phân lập được hai taxoid là taxinine B và taxuspine F, và hợp chất bis-(2-ethylhexyl)- phtalate từ lá thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng. Trong đó, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate được phân lập lần đầu tiên từ Taxus wallichiana. Thiết lập được một chất chuẩn đối chiếu là taxuspine F đạt độ tinh khiết 97,46%. Từ khóa: Taxus wallichiana, taxinine B, taxuspine F, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate, reference standard. ABSTRACT ISOLATION AND STRUCTURAL IDENTIFICATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS FROM THE NEEDLES OF TAXUS WALLICHIANA ZUCC., AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD TAXUSPINE F Hua Hoang Oanh, Tran Ngoc Thuy Duong, Bui Thi Bich Tram, Ha Dieu Ly, Bui The Vinh, Tran Cong Luan, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 235 - 242 * Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh ** Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. HCM *** Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. HCM Tác giả liên lạc: ThS. Hứa Hoàng Oanh ĐT: 0909 62 32 35 Email: oanhhuahoang@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 236 Background – Objectives: Taxus wallichiana Zucc. is a precious medicinal herb with prospect of becoming the source for supplying raw material to produce anti-cancer drugs. Therefore, standardization of this herb as well as evaluation of quality of the taxoids extracted from Taxus wallichiana Zucc. are very important and necessary. Thus, the aim of this study was to isolate, identify chemical structure of chemical constituents from the needles of Taxus wallichiana Zucc. and establish reference standard from one of isolated taxoids. Materials and Methods: Materials: 60% methanol extract from the needles of Taxus wallichiana Zucc cultivated in Lam Dong province. Methods: Isolated and identification of chemical constituents: Low polar residues from 60% methanol extract were removed by petroleum ether, the constituents were isolated and purified from the resultant methanol extract by column chromatography, preparative HPLC, and crystallization in solvent. Then, the purified compounds was elucidated chemical structure by means of UV-Vis, IR, MS, NMR spectroscopy. Finally, the purity of two taxoids was determined by reversed phase HPLC with PDA detector. Establishment of reference standard taxuspine F according to the guidelines of WHO, Asean and ISO/IEC 15328: Basing on the data of infrared spectrometry, ultraviolet spectrometry, mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectrometry and high performance liquid chromatography, the quality and quantity of taxuspine F were evaluated. In addition, the validation of method and the assessment of inter-laboratories were conducted to set up the assigned values of the established reference standard. Results: From 75 g of 60% methanol extract, the isolated taxoids were identified as taxinine B (425 mg) with over 98% purity and taxuspine F (732 mg) with over 97% purity; furthermore, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate was separated about 310 mg. 300 mg of taxuspine F (97,46% purity), which was isolated in this study, was established as reference standard according to the guidelines of WHO, Asean and ISO/IEC 15328. Conclusion: Two taxanes, taxinine B and taxuspine F were successfully isolated from the needles of Taxus wallichiana Zucc. cultivated in Lam Dong province. Bis-(2-ethylhexyl)-phtalate is isolated from Taxus wallichiana for the first time. Taxuspine F was established as the reference standard and the assigned value reached 97,46% purity. Key words: Taxus wallichiana, taxinine B, taxuspine F, bis-(2-ethylhexyl)-phtalate, reference standard. MỞ ĐẦU Paclitaxel (Taxol®) được dùng trong điều trị nhiều loại ung thư: ung thư vú, ung thư phổi, cũng như điều trị ung thư Kaposi sarcoma có liên quan đến AIDS(3,4,12). Để điều trị cho một bệnh nhân thì cần trung bình khoảng 2g paclitaxel chiết từ 3-10 cây thông đỏ (Taxus baccata). Việc chiết xuất paclitaxel chủ yếu từ vỏ cây vì hoạt chất tập trung nhiều, do đó, đã làm cạn kiệt nguồn dược liệu(8). Vì vậy, ở Việt Nam đã tiến hành trồng thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) và nghiên cứu chiết xuất paclitaxel, 10-DAB từ lá nhằm thay thế nguồn nguyên liệu vỏ cây. Tuy nhiên, để thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng được đưa vào khai thác để cung cấp nguồn nguyên liệu làm thuốc thì cần phải tiến hành tiêu chuẩn hóa dược liệu. Mục tiêu nghiên cứu này là phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất tự nhiên từ lá thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.); bước đầu thiết lập chất chuẩn từ một taxoid phân lập được, có thể dùng trong kiểm tra chất lượng dược liệu và các chế phẩm liên quan. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Cao chiết methanol phân đoạn 60% (gọi tắt là cao methanol 60%) từ lá thông đỏ lá dài được trồng ở Lâm Đồng, và nguồn dược liệu đã được tiêu chuẩn hóa. Qui trình chiết xuất được trình bày trong sơ đồ 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 237 Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất phân đoạn cao methanol 60%. Phương pháp nghiên cứu Phân lập hợp chất Cao methanol 60% được lắc phân bố với ether dầu hỏa (PE) để loại tạp kém phân cực, sau đó, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) thu được kết tinh KT1 (phân đoạn I) và 8 phân đoạn II - IX. Phân đoạn II tiếp tục được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi PE-aceton (7:3) thu được kết tinh KT2 (phân đoạn IIA) và 5 phân đoạn IIB đến IIF. Kết tinh KT1 và KT2 được tinh chế và kiểm tra lại bằng sắc ký lớp mỏng, được gộp lại thành kết tinh TW1; sau đó, được kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC pha đảo với đầu dò PDA. Kết tinh TW1 được tiến hành HPLC điều chế thu được hợp chất T1 có độ tinh khiết trên 98% và hợp chất 100 mg hợp chất T3. Từ 5 phân đoạn IIB đến IIF thu được kết tinh TW2, hợp chất này được tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC pha đảo với đầu dò PDA. Tiếp theo là thực hiện HPLC điều chế kết tinh TW2 và thu được hợp chất T2 có độ tinh khiết trên 97% và hợp chất 210 mg hợp chất T3. Xác định cấu trúc Dựa vào các kết quả phân tích phổ UV-Vis, IR, MS, NMR đã xác định được hợp chất T1 là taxinine B, hợp chất T2 là taxuspine F và hợp chất T3 là bis-(2-ethylhexyl)-phtalate. Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích Water Alliance 2695 – đầu dò dãy diod quang (PDA), cột Xterra C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). HPLC phân tích được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của các hợp chất được phân lập. Hệ thống HPLC điều chế Merck-Knauer, đầu dò UV K-2600, cột Phenomenex Gemini RP C18 (250 x 21,20 mm; 5 µm). Phương pháp HPLC điều chế được áp dụng để tinh chế các hợp chất được phân lập. Các điều kiện tiến hành HPLC phân tích và HPLC điều chế được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Điều kiện sắc ký trong đánh giá độ tinh khiết và tinh chế các hợp chất được phân lập. Điều kiện sắc ký HPLC HPLC điều chế Pha động ACN-nước (95:5) ACN-nước (95:5) Nhiệt độ cột 25ºC 25ºC Bước sóng phát hiện 210 nm 210 nm Tốc độ dòng 1 ml/phút 3 ml/phút Thể tích tiêm mẫu 10 µl 10 ml Thiết lập chất chuẩn Hợp chất taxuspine F sau khi phân lập đã được xác định cấu trúc bằng các kết quả phân tích phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR. Hợp chất này có độ tinh khiết cao trên 97% khi đánh giá bằng phương pháp HPLC, được dùng làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn điều chế qua các bước sau đây: Định lượng và thẩm định qui trình định lượng bằng HPLC. Vì không có chất chuẩn đối chiếu taxuspine F, kết quả định lượng taxuspine F điều chế được tính theo phương pháp HPLC qui về 100% diện tích pic trên sắc ký đồ. Qui trình định lượng được thẩm định bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính và độ lặp lại. Hòa cao khô với 8 lít nước Lắc với CH2Cl2(96 lít) Cao khô MeOH (8 kg) Cô quay áp suất giảm, thu hồi MeOH Sắc ký cột Diaion HP- 20 Phân đoạn cao MeOH 60% (1600 g) Cao CH2Cl2 (1600 g) Dược liệu (25 kg) Dịch chiết MeOH (150 lít) Chiết ngấm kiệt với MeOH, tỷ lệ 1:6 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 238 Thiết lập chất chuẩn taxuspine F Qui trình thiết lập chất chuẩn taxuspine F gồm các bước: đóng gói, đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ, đánh giá kết quả định lượng liên phòng thí nghiệm tại ba phòng thí nghiệm đạt GLP, xác định giá trị ấn định trên phiếu kiểm nghiệm(6,7,11). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập hợp chất Từ 75 g cao methanol 60% đã phân lập được 720 mg phân đoạn giàu hợp chất T1 và 935 mg phân đoạn giàu hợp chất T2 bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển. Sau khi được tinh khiết hóa bằng kỹ thuật HPLC điều chế thu được 425 mg hợp chất T1 (độ tinh khiết > 98%), 732 mg hợp chất T2 (độ tinh khiết > 97%) và 310 mg hợp chất T3. Xác định cấu trúc Hợp chất T1 Hợp chất T1 là kết tinh dạng tinh thể nhỏ, mịn, không màu, có ánh lấp lánh, dễ tan trong cloroform, acetonitril, ethyl acetate, ít tan trong methanol. Phổ UV của T1 trong MeOH cho đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 217 và 279,4 nm. Điều này phù hợp với các taxoid vì các taxoid có đỉnh hấp thu cực đại trong khoảng 190 – 300 nm(5). Các băng hấp thụ đáng chú ý trên phổ IR của T1: 1684 cm-1 (C=O), 1634 cm-1 (C=C), 1132 cm-1 và 1070 cm-1 (C-O-C). Điều này phù hợp với các taxoid vì trong cấu trúc của các taxoid đều có sự hiện diện của nhóm carbonyl ester ở vị trí C5, nhóm ceton (C=O) ở vị trí C13(5). Phổ MS – ES+ trong MeOH cho thấy ion có m/z = 687,28 với cường độ cao nhất, đây là mảnh [M+Na]+, do vậy T1 có khối lượng phân tử là 664 Dalton, có khả năng tương ứng với công thức phân tử của một hợp chất taxoid là taxinine B (C37H44O11) (2). So sánh dư ̃ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của T1 vơ ́i các chất đã đươ ̣c công bố thì dư ̃ liệu phổ của T1 hoàn toàn trùng khơ ́p vơ ́i dữ liệu phổ của taxinine B(2). Bảng 2: So sánh phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của T1 và taxinine B(2). C Hợp chất T1 (trong CDCl3) Taxinine B (trong CDCl3) δH (J, Hz) δC δH (J, Hz) δC 1 2,25; d (7) 48,7 2,24; d (1,5; 7) 48,7 2 5,63; dd (1,5; 6,5) 68,6 5,62; dd (1,5; 6,5) 68,6 3 3,33; d (6) 42,0 3,32; d (6,5) 42,0 4 - 139,8 - 139,8 5 5,39; s 76,2 5,38; t (3) 76,2 6a 1,77; s 35,1 1,75; m 35,1 6b 2,08; m 2,11; m 7 5,45; m 69,6 5,44; dd (6; 11) 69,6 8 - 47,6 - 47,6 9 5,94; d (11) 75,0 5,94; d (10,5) 75,0 10 6,25; d (10,5) 72,8 6,24; d (10,5) 72,8 11 - 150,5 - 150,5 12 - 138,6 - 138,6 13 - 199,3 - 199,3 14a 2,39; d (21) 36,2 2,34; d (20) 36,2 14b 2,85; dd (7; 20) 2,84; dd (7; 20) 15 - 37,7 - 37,4 16 1,15; s 37,3 1,15; s 37,8 17 1,77; s 25,3 1,76; s 25,3 18 2,39; s 14,3 2,38; s 14,3 19 1,03; s 13,2 1,02; s 13,2 20a 4,92; s 118,8 4,92; s 118,8 20b 5,45; s 5,43; s 21 - 166,2 - 166,2 22 6,45; d (16) 117,4 6,44; d (16) 117,4 23 7,69; d (16) 146,4 7,68; d (16) 146,4 2-OAc 169,3 169,3 Me 2,08; m 20,8 2,06; s 20,8 7-OAc 169,7 169,7 Me 2,08; m 21,3 2,06; s 21,3 9-OAc 169,7 169,7 Me 2,08; m 21,4 2,06; s 21,4 10-OAc 169,2 169,2 Me 2,08; m 20,7 2,02; s 20,7 1’ 134,5 134,5 2’, 6’ 7,78; d (7) 129,0 7,77; d (7) 129,0 3’, 5’ 7,47; m 128,6 7,42; m 128,6 4’ 7,44; m 130,5 7,42; m 130,5 Hình 1: Cấu trúc hóa học của taxinine B. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 239 Từ các kết quả phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR, hợp chất T1 được xác định là taxinine B. Taxinine B còn có tên gọi khác là 7β-acetate-O- taxinine A được Woods M.C. cùng các cộng sự phân lập lần đầu tiên vào năm 1968 từ lá Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.(3). Sau đó, vào năm 1988, Yeh M.K. cùng các cộng sự cũng đã phân lập được hợp chất này từ gỗ của Taxus mairei(3). Hợp chất T2 Hợp chất T2 có dạng rắn vô định hình, màu trắng, tan trong methanol, acetonitril, cloroform. T2 có cực đại hấp thu tại bước sóng 266,7 nm; phù hợp với phổ UV của taxuspine F đã công bố(9,10). Phổ hồng ngoại của T2 tương tự như taxuspine F(9,10), có các đỉnh hấp thu tương ứng với các nhóm chức: 3450 cm-1 (nhóm -OH), 1747 cm-1 và 1679 cm-1 (C=O), 1199 cm-1 (C-O-C). Trên phổ MS, T2 cho mũi cao nhất tương ứng với m/z = 557,22 phù hợp với mảnh [M+Na]+. Do vậy, T2 có khối lượng phân tử là 534,2 Dalton, tương ứng với công thức phân tử có thể là C28H38O10, cùng công thức phân tử với taxuspine F (9,10). So sánh dữ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của T2 với các chất đã được công bố cho thấy cấu trúc của T2 hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của taxuspine F(9,10). Bảng 3: So sánh phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của T2 và taxuspine F (9,10) Hợp chất T2 (trong CDCl3) Taxuspine F (trong CDCl3) C DEPT δC δH (J, Hz) δC δH (J, Hz) 1 CH 48,8 2,20 d (6,0) 48,8 2,20 (dd; 2,0; 6,5) 2 CH 68,9 5,6 (dd; 1,5: 6,0) 69,0 5,6 (dd; 2,0; 6,0) 2-OAc C 169,7 - 169,4 - Me CH3 21,3 2,05 (s) 21,3 2,05 (s) 3 CH 39,7 3,53 (d; 6,0) 39,7 3,55 (d; 6,0) 4 C 139,2 - 139,2 - 5 CH 74,5 4,22 (d; 2,5) 74,5 4,22 (d; 2,0) 6 CH2 37,5 1,61(m) 1,94 (m) 37,6 1,61 (m) 1,94 (ddd; 3,0; 5,5; 13,5) 7 CH 69,5 5,50 (dd; 5,5; 11,5) 69,6 5,52 (dd; 5,5;11) 7-OAc C 169,2 - 169,2 - Me CH3 21,3 2,08 (s) 21,4 2,08(s) 8 C 47,8 - 47,9 - 9 CH 75,1 5,90 (d; 11,0) 75,2 5,90 (d; 10,5) 9-OAc C 169,3 - 169,4 - Me CH3 20,9 2,05 20,9 2,05 10 CH 72,8 6,26 (d; 11,0) 72,8 6,25 (d; 10,5) 10-OAc C 169,8 - 169,8 - Me CH3 20,7 2,02 20,7 2,02 11 C 149,8 - 149,9 - 12 C 144,7 - 144,8 - 13 C 199,4 - 199,6 - 14 CH2 36,1 2,33 (dd; 19,5) 2,77 (dd; 7,0; 20,0) 36,1 2,33 (d; 19,5) 2,76 (dd; 6,5; 19,5) 15 C 37,8 - 37,8 - 16 CH3 25,4 1,74 (s) 25,4 1,74 (s) 17 CH3 37,4 1,11 (s) 37,4 1,12 (s) 18 CH3 14,5 2,33 (s) 14,5 2,31 (s) 19 CH3 12,9 0,98 (s) 12,9 0,98 (s) 20 CH2 115,5 4,81 (s); 5,23 (s) 115,5 4,82 (s); 5,23 (s) Dựa vào các kết quả phổ: UV-Vis, IR, MS, NMR, hợp chất T2 được xác định là taxuspine F. Taxuspine F đã được phân lập từ Taxus cupidata Sieb.et Zucc năm 1995 và từ Taxus Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 240 wallichiana Zucc bởi Nguyễn Thị Thanh Tâm năm 2007(10). Hình 2: Cấu trúc hóa học của taxuspine F. Hợp chất T3 Hợp chất T3 có dạng dầu, trong suốt, không màu, không mùi. Phổ UV của T3 có cực đại hấp thu tại bước sóng 274,4-276,8 nm. Phổ MS – ES+ trong MeOH của T3 có m/z = 413,17 là mảnh [M+Na]+, do vậy khối lượng phân tử của T3 là 390,27 Dalton, có khả năng tương ứng với công thức phân tử của một hợp chất là bis(2-ethylhexyl)-phtalate (C24H38O4) (1). So sánh dữ liệu phổ NMR một chiều và hai chiều của T3 với các chất đã được công bố thì hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của hợp chất bis(2-ethylhexyl)-phtalate (1). Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của T3 có các mũi tại vị trí δ 4,25 (2H, m); 1,70 (1H, m); 1,25~1,46 (8H, m); 0,88 (3H, t, J=4,5 Hz); 0,93 (3H, t); 7,71 (1H, m); 7,53 (1H, m). Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của T3 có các mũi tại vị trí δ 68,17 (t, C-1); 38,75 (d, C-2); 30,38 (t, C-3); 22,98 (t, C-4); 28,93 (t, C-5); 14,04 (q, C-6); 23,77 (t, C-7); 10,96 (q, C-8); 167,76 (s, C=O); 132,47 (s, C-1’); 128,81 (d, C-2’); 130,87 (d, C-3’). Hình 3: Cấu trúc hóa học của bis-(2-ethylhexyl)- phtalate. Bis-(2-ethylhexyl)-phtalate là hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ Taxus wallichiana Zucc. Hợp chất này có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram âm và Gram dương (1). Đánh giá độ tinh khiết của taxinine B và taxuspine F. Độ tinh khiết của 2 hợp chất taxoid đã phân lập được đánh giá bằng phương pháp HPLC phân tích. Độ tinh khiết của taxinine B trên 98% và taxuspine F tinh khiết trên 97%. (a) (b) Hình 4: Độ tinh khiết sắc ký (a): taxinine B, (b): taxuspine F. Điều kiện tiến hành sắc ký được trình bày trong bảng 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 241 Thiết lập chất chuẩn Định lượng và thẩm định qui trình định lượng bằng HPLC Bảng 4: Kết quả thẩm định qui trình định lượng taxuspine F điều chế bằng HPLC. Tính tương thích hệ thống RSD (tR) = 0,09% < 1% RSD (Spic) = 0,51% < 2% Tính chọn lọc Đạt Độ lặp lại (n=6) RSD = 0,13% < 2% Tính tuyến tính R2 = 0,9992 > 0,995 Độ đúng (n=6) 97,77% Nhận xét: qui trình định lượng bằng HPLC đạt các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính và độ lặp lại. Hàm lượng taxuspine F điều chế được tính theo phương pháp HPLC qui về 100% diện tích pic trên sắc ký đồ. Kết quả: hàm lượng taxuspine F là 97,77% tính trên chế phẩm nguyên trạng. Thiết lập chất chuẩn taxuspine F Đóng gói và đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ. 300 mg taxuspine F điều chế được đóng gói vào 30 lọ, khối lượng đóng gói: 10 mg/ lọ. Điều kiện đóng gói: trong buồng Glove-box chứa 99,99% khí nitơ ở nhiệt độ phòng (25ºC) và độ ẩm 30 – 40%. Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ sau khi đóng gói: số lọ đánh giá (g) được chọn ngẫu nhiên, số lượng lọ được tính bằng công thức = 6 (N: tổng số lọ). Mỗi lọ được định lượng 2 lần để tránh sai số và dùng phép kiểm Dixon để loại giá trị bất thường trong kết quả định lượng. Bảng 5: Kết quả phân tích phương sai ANOVA một yếu tố. Tổng bình phương Bậc tự do Bình phương Ftn Ftc Giữa các nhóm 0,002 1 0,002 0,127 4,964 Trong cùng nhóm 0,169 10 0,016 Tổng cộng 0,171 11 Nhận xét: Ftn = 0,127 < Ftc = 4,964 nên các lọ chất chuẩn đạt yêu cầu về độ đồng nhất giữa các lọ. Đánh giá kết quả định lượng liên phòng thí nghiệm. Bảng 6: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và kết quả định lượng taxuspine F điều chế tại 3 phòng thí nghiệm (n=6). PTN 1* PTN 2* PTN 3* Hàm lượng trung bình 97,72% 97,00% 97,61% Số đĩa lý thuyết (phải lớn hơn 30,000) 35,679 36,559 36,659 RSD của thời gian lưu (phải nhỏ hơn 2%) 0,11% 0,13% 0,22% RSD hàm lượng (phải nhỏ hơn 2%) 0,12% 0,36% 0,34% * PTN 1: Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh. PTN 2: Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh. PTN 3: Phòng Đảm bảo chất lượng, Công ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long. Xác định giá trị ấn định Bảng 7: Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng taxuspine F điều chế (n = 18). x * 0 x * 1 x * 2 δ = 1,5 x s * x * - δ x * + δ - - - 0,613 97,024 98,250 0,611 96,881 98,103 Trung bình Độ lệch s x * mới s * mới 97,462 0,405 97,637 0,409 97,492 0,359 97,492 0,407 97,492 0,359 97,492 0,407 Từ kết quả trên, tính z-score. Tất cả 18 giá trị định lượng đều có < 2. Như vậy, độ tinh khiết của taxuspine F điều chế tính trên chế phẩm nguyên trạng là 97,46% với độ không đảm bảo đo là 0,12 và độ lệch 0,409. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã áp dụng phương pháp sắc ký cột cổ điển đơn giản và những dung môi thông dụng để phân lập các hợp chất taxoid trong cao methanol 60% chiết từ lá thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.). Ngoài ra, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế cũng được ứng dụng để tinh khiết các hợp chất được phân lập. Cấu trúc của các hợp chất được xác định dựa vào các kết quả phân tích phổ UV-Vis, IR, MS, NMR. Hai hợp chất taxoid được phân lập là taxinine B và taxupine F có độ tinh khiết cao trên 97%, đủ điều Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 242 kiện để thiết lập chất chuẩn đối chiếu và một hợp chất mới được phân lập lần đầu tiên từ Taxus wallichiana là bis-(2-ethylhexyl)-phtalate. Hợp chất taxuspine F đã phân lập được sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu theo hướng dẫn của WHO và ASEAN. Lô chất chuẩn đóng gói được đánh giá độ đồng nhất và được thẩm định tại ba phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP. Chất chuẩn taxuspine F điều chế có độ tinh khiết cao 97,46% (tính trên chế phẩm nguyên trạng), có thể được sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu thông đỏ lá dài Việt Nam (Taxus wallichiana Zucc.) và các chế phẩm liên quan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Bari MAA, Sayeed MA, Rahman MS and Mossadik MA (2006). Characterization and Antimicrobial Activities of a Phthalic Acid Derivative Produced by Streptomyces bangladeshiensis A Novel Species Collected in Bangladesh. Research Journal of Medicine and Medical Sciences, 1(2): 77-81. 2. Baloglu E, Kingston DGI (1999). The Taxane Diterpenoids. J. Nat. Prod.; 62: 1448-1472. 3. Brambilla L, Romanelli A, Bellinvia M, Ferrucci S, Vinci M, Boneschi V, Miedico A, Tedeschi L (2008). Weekly paclitaxel for advanced aggressive classic Kaposi sarcoma: experience in 17 cases. Br J Dermatol; 158: 1339-1344. 4. Dhillon T, Stebbing J, Bower M (2005). Paclitaxel for AIDS- associated Kaposi’s sarcoma. Expert Rev Anticancer Ther; 5: 215- 219.3. 5. Itokawa H, Lee KH (2003). Taxus. The genus Taxus, Taylor and Francis Group, London, 180-205. 6. ISO Guide 13528: 2005, Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons. 7. ISO Guide 35: 2006, Reference materials – General and statistical principles for certification. 8. Kikuchi Y, Yatagai M (2003). The commercial cultivation of Taxus species and production of taxoids. In: Itokawa H, Lee KH. (eds.) Taxus: The Genus Taxus. CRC Press; 151-178. 9. Kobayashi J, Inubushi A, Hosoyama H, Yoshida N, Sasaki T, Shigemori H (1995). Taxuspines E-H and J, New Taxoids from the Japanese Yew Taxus cuspidata. Tetrahedron; 51: 5971-5978. 10. Nguyen Thi Thanh Tam, Nguyen Trung Nhan (2009). The study on chemical constituents from the needles of Taxus wallichiana Zucc. (Taxaceae). Journal Science and Technology Development; 12 (10): 53-57. 11. WHO Expert Committee on Specific cations for Pharmaceutical Preparations: forty-first report (WHO technical report series; no. 943). 12. Zhou J, Giannakakou P (2005). Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Curr Med Chem Anticancer Agents; 5: 65-71. Ngày nhận bài báo : 15/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo : 19/10/2013 Ngày bài báo được đăng : 02/01/2014