Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự tạo rễ trong nuôi cấy in vitro cây sâm bố chính (Abelmoschus Sagittifolius Kurz)

Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Open Access Full Text Article Bài nghiên cứu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Liên hệ Dương Huỳnh Ngọc Trân, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: dhnt91@gmail.com Lịch sử  Ngày nhận: 27-3-2019  Ngày chấp nhận: 30-4-2019  Ngày đăng: 25-6-2020 DOI : 10.32508/stdjns.v4i2.710 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM. Đây là bài báo công bố mở được phát hành theo các điều khoản của the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự tạo rễ trong nuôi cấy in vitro cây sâm bố chính (Abelmoschus Sagittifolius Kurz) Dương Huỳnh Ngọc Trân*, Lê Thị Diễm, Võ Thị BạchMai Use your smartphone to scan this QR code and download this article TÓM TẮT Sâm Bố Chính (Abelmoschus sagittifolius Kurz) được biết đến là loài cây dược liệu có tác dụng dược lý điển hình của cây họ Nhân sâm. Tuy nhiên, số lượng cây trong tự nhiên đang giảm nhanh do nhu cầu khai thác tăng cùng với sự thu hẹp vùng phân bố và tỷ lệ nảy nầm của hạt thấp, ảnh hưởng đến việc sử dụng để nghiên cứu và phát triển nguồn gene làm nguyên liệu sản xuất thuốc tại nhiều nơi. Trong các bộ phận của cây, rễ được cho là bộ phận quan trọng nhất, vì vậy việc nghiên cứu sự hình thành rễ in vitro vừa có ý nghĩa trong việc đánh giá tác động của chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong sự cảm ứng rễ, vừa có ý nghĩa trong việc tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho các khảo sát về sự sinh tổng hợp các hợp chất thuộc nhóm saponin in vitro để thay thế cho việc trồng cây bên ngoài. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 2 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (88%) khi hạt được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%, 3 phút rồi ngâm trong dung dịch GA3 20,0 mg/L, 120 phút, cuối cùng nuôi cấy hạt trên môi trường MS + 20 g/L đường saccharose + GA3 5,0 mg/L + 7 g/L agar. Mô sẹo hình thành từ khúc cắt trụ hạ diệp nuôi cấy trên môi trường MS + 20 g/L đường saccharose + NAA 0,5 mg/L + BA 1,5 mg/L + 7 g/L agar cho tỷ lệ tạo mô sẹo tốt, phù hợp để sử dụng nuôi cấy cho mục đích tạo rễ in vitro. Và sự hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS + 20 g/L sucrose + IAA 0,3 mg/L + 7 g/L agar. Như vậy, phương pháp nuôi cấy mô phù hợp cho sự hình thành rễ bất định từ mô sẹo có nguồn gốc từ trụ hạ diệp cây sâm Bố Chính. Từ khoá: Abelmoschus sagittifolius Kurz, in vitro, mô sẹo, rễ MỞĐẦU Sâm Bố Chính, còn được gọi là sâmThổ Hào, là một trong số các loài cây thuộc chiAbelmoschus, vừa được sử dụng làm dược liệu trong các bài thuốc y học cổ truyền, vừa được trồng làm cảnh nhờ vẻ đẹp của hoa và đã được đưa vào chương trình “Bảo tồn và sử dụng bền vững nguồn gene đến năm 2025, định hướng đến năm 2030”1. Sâm Bố Chính có tên khoa học Abel- moschus sagittifolius Kurz, thuộc chi Vông vang, họ Bông (Malvaceae), phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới. Về mặt hoá học, rễ sâm Bố Chính có chứa hợp chất phytosterol, coumarin, acid béo, acid hữu cơ và hợp chất uronic2. Ngoài ra, trong rễ sâm Bố Chính còn xác định có các chất như: ventricosin A, 4–eudesmen–11– ol, tagitinin A, b–sitosterol, b– sitosterol–3–O–glucopyranoside3. Về mặt y học, rễ cây được sử dụng làm thuốc bổ, thông tiểu, điều kinh, chữa sốt, bệnh viêm phổi và bạch đới 4. Ngoài ra, cây còn được sử dụng điều trị loét dạ dày, an thần, giảm đau, tăng cường thể lực và không có biểu hiện độc tính cấp3. Trong tự nhiên tỷ lệ nảy mầm của hạt sâm Bố Chính thấp, thời gian phát triển lâu, cây bị khai thác nhiều, thêm vào đó sự thu hẹp của rừng tự nhiên dẫn đến sự suy giảm đáng kể nguồn gene của cây này. Vì vậy, việc bảo tồn nguồn gene của các loại dược liệu quý nói chung và sâm Bố Chính nói riêng ở Việt Nam rất cần thiết. Ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây sâm Bố Chính. Năm 2014, Phan Duy Hiệp và cộng sự 5 đã bước đầu tìm hiểu về ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh hình thái của một số giống sâm Bố Chính trong điều kiện in vitro. Trong nghiên cứu này, tác giả đưa ra một số kết luận về điều kiện thích hợp nhất cho sự nảy mầm hạt sâm Bố Chính cũng như môi trường thích hợp để tăng sinh chồi và hình thành rễ từ chồi. Ngoài ra, gần đây, năm 2017, Phan Xuân Huyên và cộng sự 6 đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây sâm Bố Chính thông qua nuôi cấy đốt thân. Tuy nhiên hiện chưa có công bố nào về nghiên cứu tạo rễ bất định cây sâm Bố Chính. Trong khi đó, rễ được coi là bộ phận quan trọng nhất, vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm tạo bước đầu cho Trích dẫn bài báo này: Trân D H N, Diễm L T, Mai V T B. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự tạo rễ trong nuôi cấy in vitro cây sâm bố chính (Abelmoschus Sagittifolius Kurz). Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci.; 4(2):556-566. 556 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 nghiên cứu nuôi cấy nhân số lượng rễ in vitro để cung cấp nguồn nguyên liệu chủ động cho việc thu nhận các chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho ngành dược. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Hạt giống cây sâm Bố Chính (Abelmoschus sagitti- folius Kurz) hoa màu đỏ, trồng tại thành phố Tây Ninh, được sử dụng làm vật liệu ban đầu. Tử diệp, trụ hạ diệp cây sâmBốChính in vitro 14 ngày tuổi gieo từ hạt được sử dụng làm nguồnmâũ cho các thí nghiệm tạo mô sẹo và rễ in vitro. Khử trùng hạt Hạt được ngâm qua đêm, khử trùng lần lượt bằng xà phòng trong 2 phút, dung dịch Javel thương phẩm nồng độ 25%, 5 phút, dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% hoặc 0,5%, thời gian 2, 3, 5 hoặc 7 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi lắc qua cồn 70% trong 2 phút, ngâm trong dung dịch GA3 20,0mg/L, 120 phút (Hình 1 A). Mẫu vật sau khi khử trùng được nuôi cấy cho sự nảy mầm (Hình 1 B, C). Một số bộ phận cây con in vitro được sử dụng làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Nuôi cấy in vitro hạt cây sâm Bố Chính Môi trường cho sự nảy mầm hạt cây sâm Bố Chính là môi trường khoángMS, vitaminMorel, đường sac- charose 20 g/L, agar 7g/L bổ sung GA3 5,0 mg/L, điều kiện sáng với cường độ ánh sáng 2000 200 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 27 2oC và độ ẩm 55 5%. Ảnhhưởngauxin và cytokinin lên sự tạomô sẹo Vật liệu nuôi cấy: tử diệp được rạch 2 đường nhỏ 5 mm trên bề mặt để tạo vết thương và trụ hạ diệp cây sâm Bố Chính in vitro 14 ngày tuổi thu từ thí nghiệm khử trùng hạt. Thí nghiệm 1: Môi trường khoáng MS tương tự thí nghiệm khử trùng hạt bổ sung NAA 0,5mg/L kết hợp BA 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/L. Thí nghiệm 2: Môi trường khoáng MS tương tự thí nghiệm khử trùng hạt bổ sung BA nồng độ cho kết quả tốt nhất từ thí nghiệm 1 kết hợp NAA 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/L. Các mô cấy được đặt trong tối ở phòng nuôi có nhiệt độ 27 2oC, độ ẩm 55 5%. Tỉ lệ mâũ cấy phát sinh mô sẹo và hình thái mô sẹo được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm gồm 28 nghiệm thức, môĩ nghiệm thức lặp lại 3 lần, môĩ lần 9 bình, môĩ bình 2 mâũ cấy. Ảnhhưởngcủaauxinvàcytokinin lênsự tạo rễ Vật liệu nuôi cấy: tử diệp, trụ hạ diệp cây sâm Bố Chính in vitro 14 ngày tuổi thu từ thí nghiệm khử trùng hạt và mô sẹo 4 tuần tuổi của nghiệm thức cho kết quả tốt nhất từ thí nghiệm tạo mô sẹo. Thí nghiệm 1: Môi trường khoáng MS tương tự thí nghiệm khử trùng hạt bổ sung IAA 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0 mg/L. Thí nghiệm 2: Môi trường khoáng MS tương tự thí nghiệm khử trùng hạt bổ sung IAA nồng độ cho kết quả tốt nhất từ thí nghiệm trên kết hợp NAA 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/L hoặc BA 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/L. Các mô cấy được đặt trong tối ở phòng nuôi có nhiệt độ 27 2oC, độ ẩm 55 5%. Số lượng rễ (số rễ/mẫu cấy) và chiều dài rễ được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm gồm 51 nghiệm thức, môĩ nghiệm thức lặp lại 3 lần, môĩ lần 9 bình, môĩ bình 1 mâũ cấy. Quan sát cấu trúc giải phẫu Mô sẹo sau 5 và 10 ngày nuôi cấy được cắt ngang và rễ in vitro sau 7 và 10 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng được cắt dọc theo phương pháp cắt bằng tay, sau đó nhuộm theo phương pháp nhuộm hai màu đỏ carmin - xanh iod, quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh. Xử lý số liệu Các số liệu ghi nhận được xử lý thống kê bằng phần mềm StartGraphics Plus 3.0. Sự sai biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05. KẾT QUẢ VÀ BIÊ￿N LUÂ￿N Khử trùng hạt tạo nguồn vật liệu ban đầu Hạt dùng để nuôi cấy được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% hoặc 0,5% ở các thời gian khác nhau. Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy, đối với nồng độ 0,5%, thời gian 2 và 3 phút có xuất hiện hạt nảy mầm và không nhiễm, nhưng tỷ lệ không cao (Bảng 1). Khi tăng thời gian lên 5 và 7 phút ở cả hai nồng độ nhận thấy hoàn toàn không có sự nảy mầm (Bảng 1). Khi nồng độ khử trùng là 0,1% và thời gian 2 phút, tỷ lệ hạt nảymầmvà khôngnhiễm thấp (Bảng 1). Nhưng cùng ở nồng độ này, khi tăng thời gian lên 3 phút cho tỉ lệ mẫu sống và không bị nhiễm cao nhất (88%) so với nồng độ và các thời gian còn lại (Bảng 1). Như vậy, HgCl2 nồng độ 0,1% và thời gian 3 phút cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (88%). 557 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Hình 1: Hạt và quá trình phát triển của cây sâm Bố Chính in vitro. A: hạt. B: sau 7 ngày nuôi cấy. C: sau 14 ngày nuôi cấy. Bảng 1: Kết quả nảymầm của hạt sau 2 tuần nuôi cấy Thời gian (phút) Tỷ lệ hạt nảy mầm và không nhiễm (%) HgCl2 0,1% HgCl2 0,5% 2 20,00b 6,67b 3 88,00c 13,33c 5 0,00a 0,00a 7 0,00a 0,00a CV (%) 5,27 4,98 Trong cùng một cột, số có cùng mẫu tự thì không khác biệt nhau ở mức p 0,05 qua phép thử Dunc an. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tạomô sẹo Thí nghiệm 1: Sự nuôi cấy in vitro tử diệp và trụ hạ diệp trênmôi trườngMS bổ sungNAAkết hợp với BA các nồng độ khác nhau Auxin là một hormone thực vật quan trọng liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng và phát triển của thực vật. Ở mức tế bào, auxin kiểm soát sự phân chia, kéo dài và phân hóa tế bào. Các tế bào biểu bì và dưới biểu bì phản ứngmạnh nhất với auxin. Auxin kích thích mạnh sự phân chia của tế bào tượng tầng, do đó tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính. Đồng thời auxin giúp sự phân hóa các mô dẫn và có khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hóa tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn7. Cytokinin (CK) là một hormone thực vật có vai trò kích thích hoặc ức chế trong điều hòa nhiều khía cạnh của sự tăng trưởng và phát triển thực vật. CK hoạt động kết hợp với các hormone thực vật khác để điều hòa các đáp ứng khác nhau ở thực vật, trong đó có vai trò làm chậm sự lão suy7. Ngoài ra, CK có vai trò đặc biệt trong việc kích thích sinh tổng hợp protein và điều khiển chu trình tế bào. Vì vậy, người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do CK hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp acid nucleic và protein dẫn đến kích thích sự phân chia tế bào 8. Trong nuôi cấy mô, CK cùng với auxin cần thiết cho sự phân chia tế bào 9. Sự kết hợp giữa auxin và cy- tokinin trong môi trường nuôi cấy giúp kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào để tạo mô sẹo 10,11. Ngoài ra, yếu tố vết thương cũng cảm ứng hình thành và vận chuyển các hormone thực vật nội sinh, từ đó những chất này sẽ kích thích hình thành mô sẹo. Mặt khác sự tạo vết thương còn làm tăng sự hấp thu chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh. Điều này có thể thấy ở các tế bào sát vùng tạo vết thương đã hình thành các mạch khi tiếp xúc với NAA và BA12. Sau 5 và 10 ngày nuôi cấy, tử diệp và trụ hạ diệp in vitro đã có sự cảm ứng tạo mô sẹo trên một số môi trường (Hình 4 B,C), sau 4 tuần đã có sự hình thành và phát triển mô sẹo. Điều này có thể do BA giúp làm tăng hoạt động tổng hợp các protein liên quan tới sự phân chia tế bào đồng thời làm chậm sự thoái biến CK, qua đó làm chậm sự lão hoá13. Trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L kết hợp với BA các nồng độ khác nhau, sự hình thành mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L kết hợpBA1,5mg/L hoặc 2,0mg/L,mâũ cấy phát sinh mô sẹo 100% (Bảng 2), mô sẹo phát triển nhanh và nhiều (Hình 2). Mô sẹo trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5mg/L kết hợp BA 1,5 mg/L không bị hoá nâu sau 4 tuần nuôi cấy. Khi tăng hoặc giảm nồng độ BA tỷ lệ mô sẹo giảm dần hoặc không có sự xuất hiện mô 558 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 sẹo. Điều này cho thấy sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Bên cạnh đó, sự tạo mô sẹo còn phụ thuộc vào nguồn gốc của mâũ cấy, có lẽ sự hiện diện của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật nội sinh trong các loại mâũ cấy khác nhau có đáp ứng khác nhau đối với sự hình thành mô sẹo. Quan sát hiệu quả tạo mô sẹo trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L kết hợp BA 1,5 mg/L ở hai vật liệu tử diệp và trụ hạ diệp, nhận thấymô sẹo phát sinh từ trụ hạ diệp phát triển nhanh, đều và nhiều hơn (Hình 2 C). Vì vậy, trụ hạ diệp trên môi trườngMS bổ sungNAA0,5mg/L kết hợp BA 1,5 mg/L được sử dụng làmnguồn vật liệu cho thí nghiệm tạo rễ gián tiếp thông qua mô sẹo. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của LêHồngGiang (2010) khi khảo sát sự tạomô sẹo trênHydnophytum formicarum Jack, khi nuôi cấy mô lá non trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L kết hợp BA 2,0 mg/L, tỷ lệ phát sinh mô sẹo đạt 75% 14. Thí nghiệm 2: Sự nuôi cấy in vitro tử diệp và trụ hạ diệp trênmôi trườngMS bổ sungBAkết hợpNAA các nồng độ khác nhau Tương tự thí nghiệm trên, quan sát hình thái mô sẹo hình thành từ 2 nguồn vật liệu nêu trên sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/L kết hợp NAA các nồng độ khác nhau, cho thấy ở môi trường có BA 1,5 mg/L kết hợp NAA 0,5 mg/L mô sẹo phát triển tốt hơn các môi trường còn lại (Bảng 3, Hình 3). Điều này có thể do auxin có tác dụng làm ngừng chương trình sinh lý đang có săñ trongmô thực vật đã phân hoá bằng cách gây methyl hoá DNA, làm tế bào đáp ứng với auxin gây phản phân hoá và bắt đầu phân chia 12. Quan sát cấu trúc giải phẫu Cấu trúc giải phâũ trụ hạ diệp cho thấy ở ngày 0 nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L kết hợp BA 1,5 mg/L, các tế bào chưa có sự phân chia (Hình 4 A). Theo dõi sau 5 và 10 ngày nuôi cấy có sự cảm ứng của các tế bào nhu mô trụ hạ diệp và phân chia không định hướng (Hình 4 B, C). Điều này dẫn đến sự hình thành mô sẹo. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ Thínghiệm1: Sự nuôi cấy in vitro tử diệp, trụ hạdiệp và mô sẹo trên môi trường MS bổ sung IAA các nồng độ khác nhau Trong hầu hết các loài thực vật, sự hình thành rễ bất định đều được khởi phát bởi auxin. Auxin cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin kích thích sự tạo rễ và hoạt hoá cơ quan, có vai trò chủ yếu trong sự cảm ứng tạo rễ15. Việc sử dụng auxin cảm ứng tạo rễ được nghiên cứu và ứng dụng rất phổ biến trên nhiều đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên loại và nồng độ auxin còn tùy thuộc vào từng đối tượngmà sử dụng phù hợp. Trong thí nghiệmnày, chúng tôi sử dụng IAA để cảm ứng ra rễ. Kết quả cho thấy khi tăng dần nồng độ IAA thì 100%mâũ cấy đều được cảm ứng tạo rễ. Số rễ cao nhất trên môi trường MS + IAA 0,3 mg/L là 4,2 rễ/mẫu cấy đối với tử diệp, 3,76 rễ/mẫu cấy đối với trụ hạ diệp và 5,83 rễ/mâũ cấy đối vớimô sẹo (Bảng 4). Tuy nhiên, mô sẹo có sự hình thành rễ nhiều nhất, rễ dài nhất (Bảng 4, Hình 5), vì thế được sử dụng là nguồn vật liệu phù hợp cho sự tạo rễ cây sâm Bố Chính. Kết quả này tương tự Phạm Minh Quang (2018) khi nghiên cứu về khả năng tạo rễ bất định trên Dendrobium caesar với môi trường KC bổ sung IAA 1,0 mg/L cho số lượng rễ đạt 15,186 rễ/mâũ cấy16. Thínghiệm2: Sựnuôi cấy in vitro tử diệp, trụ hạdiệp và mô sẹo trên môi trường MS bổ sung IAA kết hợp NAA hoặc BA các nồng độ khác nhau Trên môi trường MS bổ sung IAA 0,3 mg/L kết hợp với NAA các nồng độ khác nhau nhận thấy số lượng rễ giảm so với môi trường MS chỉ bổ sung IAA 0,3 mg/L (Bảng 5). Điều này có lẽ do nồng độ cao của NAA có thể cản sự tích lũy cytokinin làm ngăn chặn sự phát sinh hình thái17. Đồng thời, khi bổ sungNAA các nồng độ kết hợp với IAA 0,3 mg/L cũng làm giảm chiều dài rễ (Bảng 5). Điều này có thể do nồng độ auxin ngoại sinh quá cao làmmất cân bằng hàm lượng hormone thực vật nội sinh, qua đó ảnh hưởng tới sự tạo rễ. Auxin nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này18. Còn khi quan sát môi trường MS bổ sung IAA 0,3 mg/L kết hợp với BA các nồng độ khác nhau không quan sát thấy sự xuất hiện rễ, chỉ có sự phát triển mô sẹo, có lẽ vì auxin đang ở nồng độ phù hợp để tạo sơ khởi rễ, khi kết hợp với cytokinin thì sự tăng dần nồng độ dẫn đến sự mất dần cấu trúc sơ khởi rễ, dẫn đến sự hình thành mô sẹo 19. Quan sát cấu trúc giải phâũ Cấu trúc giải phâũ trụ hạ diệp ở ngày đầu tiên nuôi cấy cho thấy xung quanh vùng trụ giữa và vùng nhu mô vỏ chưa có sự xuất hiện sơ khởi rễ (Hình 6 A). Sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung IAA 0,3 mg/L có sự hình thành sơ khởi rễ từ nhóm tế bào có đặc tính phân chia mạnh của vùng tượng tầng liber mộc (Hình 6 B). Ở ngày 10, rễ hình thành và kéo dài ra vùng vỏ (Hình 6 C). 559 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Bảng 2: Sự phát triển củamô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy trênmôi trườngMS bổ sung NAA kết hợp BA các nồng độ khác nhau Mâũ cấy Nghiệm thức Tỷ lệ phát sinh mô sẹo (%) Ghi chú Tử diệp MS 0,00a Mâũ cấy không đáp ứng với môi trường MS+NAA0,5mg/L +BA0,5 mg/L 0,00a Mâũ cấy có hiện tượng hoá vàng. MS+NAA0,5mg/L +BA1,0 mg/L 45,45d Mâũ cấy phát sinh mô sẹo chậm và không đều giữa các mâũ cấy. MS + NAA 0,5 mg/L + BA 1,5 mg/L 100,00e Mô sẹo phát triển nhanh và đều ở tất cả các mâũ cấy. MS + NAA 0,5 mg/L + BA 2,0 mg/L 100,00e Môsẹo xuất hiện sớmnhưng saumột thời gian mô sẹo bắt đầu hoá nâu ở một số mâũ cấy. MS+NAA0,5mg/L +BA2,5 mg/L 0,00a Mâũ cấy hoá vàng sớm và nhiều mâũ cấy chết sớm. MS+NAA0,5mg/L +BA3,0 mg/L 0,00a Mâũ cấy hoá vàng sớm và nhiều mâũ cấy chết sớm. Trụ hạ diệp MS 0,00a Mâũ cấy không đáp ứng với môi trường MS+NAA0,5mg/L +BA0,5 mg/L 0,00a Mâũ cấy có hiện tượng hoá vàng. MS+NAA0,5mg/L +BA1,0 mg/L 45,45d Mâũ cấy sinh mô sẹo chậm. MS + NAA 0,5 mg/L + BA 1,5 mg/L 100,00e Mô sẹo phát triển nhanh và ổn định ở tất các mâũ cấy. MS + NAA 0,5 mg/L + BA 2,0 mg/L 100,00e Môsẹo xuất hiện sớmnhưng saumột thời gian mô sẹo bắt đầu hoá nâu ở một số mâũ cấy. MS+NAA0,5mg/L +BA2,5 mg/L 33,33c Mâũ cấy sinh mô sẹo yếu, hoá đen và một số chết sớm. MS+NAA0,5mg/L +BA3,0 mg/L 6,66b Mâũ cấy sinh mô sẹo yếu, hoá đen và một số chết sớm. CV (%) 12,74 Trong cùng một cột, số có cùng mẫu tự thì không khác biệt nhau ở mức p 0,05 qua phép thử Dunc an. Hình 2: Mô sẹo hình thành trên môi trường MS + NAA 0,5 mg/L + BA 1,5 mg/L sau 4 tuần nuôi cấy. A, C: tử diệp, trụ hạ diệp. Hoặc môi trường MS + NAA 0,5 mg/L + BA 2,0 mg/L. B, D: tử diệp, trụ hạ diệp. 560 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Bảng 3: Sự phát triển củamô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy trênmôi trườngMS bổ sung BA kết hợp với NAA các nồng độ khác nhau Mâũ cấy Nghiệm thức Tỷ lệ sinh mô sẹo (%) Ghi chú Tử diệp MS 0,00a Mâũ cấy không đáp ứng với môi trường MS + BA 1,5 mg/L + NAA 0,5 mg/L 100,00e Mô sẹo phát triển nhanh và đều. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 1,0 mg/L 72,27d Mô sẹo phát triển khá chậm và không đều giữa các mâũ cấy. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 1,5 mg/L 20,00c Mâũ cấy không sinh mô sẹo và mô sẹo có hiện tượng hoá nâu sớm. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 2,0 mg/L 0,00a Mâũ cấy có hiện tượng hoá nâu sớm. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 2,5 mg/L 0,00a Mâũ cấy có hiện tượng hoá vàng ở nhiều mâũ. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 3,0 mg/L 0,00a Mâũ cấy hoá vàng và có hiện tượng hoá đen ở nhiều vị trí. Trụ hạ diệp MS 0,00a Mâũ cấy không đáp ứng với môi trường MS + BA 1,5 mg/L + NAA 0,5 mg/L 100,00e Mô sẹo phát triển nhanh và đều. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 1,0 mg/L 72,27d Mô sẹo phát triển khá chậm. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 1,5 mg/L 20,00c Mô sẹo phát triển chậm và hoá vàng. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 2,0 mg/L 5,55b Mâũ cấy sinhmô sẹo yếu, cómâũ chết. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 2,5 mg/L 0,00a Mâũ cấy có hiện tượng hoá vàng. MS + BA 1,5 mg/L + NAA 3,0 mg/L 0,00a Mâũ cấy có hiện tượng hoá đen. CV (%) 13,51 Trong cùng một cột, số có cùng mẫu tự thì không khác biệt nhau ở mức p 0,05 qua phép thử Dunc an. Hình 3: Mô sẹo hình thành trên môi trường MS + BA 1,5 mg/L + NAA 0,5 mg/L sau 4 tuần nuôi cấy. A, B: tử diệp, trụ hạ diệp. 561 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Hình 4: Trụ hạ diệp nuôi cấy trên môi trường MS + NAA 0,5 mg/L + BA 1,5 mg/L. A, B, C: ngày 0, ngày 5, ngày 10. (mũi tên: tế bào đang phân chia) Bảng 4: Sự phát triển của rễ in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trênmôi trườngMS bổ sung IAA các nồng độ khác nhau Mâũ cấy Nghiệm thức Số rễ/mâũ cấy Chiều dài rễ (cm) Tử diệp MS 0,70b 0,50b MS + IAA 0,2 mg/L 2,48cd 0,50b MS + IAA 0,3 mg/L 4,20i 1,05f MS + IAA 0,4 mg/L 3,88h 0,83d MS + IAA 0,5 mg/L 2,56d 0,57bc MS + IAA 1,0 mg/L 3,50fg 1,20g Trụ hạ diệp MS 0,00a 0,00a MS + IAA 0,2 mg/L 2,22c 0,51 MS + IAA 0,3 mg/L 3,76gh 0,93de MS + IAA 0,4 mg/L 3,50fg 0,67c MS + IAA 0,5 mg/L 3,33f 0,56bc MS + IAA 1,0 mg/L 3,01e 1,03ef Mô sẹo MS 0,00a 0,00a MS + IAA 0,2 mg/L 1,79c 2,55e MS + IAA 0,3 mg/L 5,83fgh 5,10k MS + IAA 0,4 mg/L 5,90gh 3,13h MS + IAA 0,5 mg/L 5,66f 2,95g MS + IAA 1,0 mg/L 6,00h 5,00j CV (%) 11,45 10,23 Trong cùng một cột, số có cùng mẫu tự thì không khác biệt nhau ở mức p 0,05 qua phép thử Duncan. KẾT LUẬN Phương pháp thích hợp cho sự nảy mầm của hạt sâm Bố Chính hoa màu đỏ là khử trùng hạt lần lượt bằng Javel thương phẩm 25%, 2 phút và dung dịch khử trùng HgCl2 0,1%, thời gian 3 phút, rồi lắc qua cồn 70%, 2 phút và ngâm hạt trong dung dịch GA3 20,0 mg/L, 120 phút, cuối cùng nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung GA3 5,0 mg/L, điều kiện sáng. Môi trường thích hợp cho sự tạomô sẹo là môi trườngMS bổ sung NAA 0,5 mg/L kết hợp BA 1,5 mg/L trong điều kiện tối với vật liệu nuôi cấy là trụ hạ diệp (100%). Sự hình thành rễ thích hợp trên môi trường MS bổ sung IAA 0,3 mg/L trong điều kiện tối, với số rễ là 4,2 rễ/mâũ cấy đối với tử diệp, 3,76 rễ/mâũ cấy đối với trụ hạ diệp và 5,83 rễ/mâũ cấy đối với mâũ cấy mô sẹo. 562 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Hình 5: Sự hình thành rễ trên môi trường MS + IAA 0,3 mg/L sau 4 tuần nuôi cấy. A, B, C: tử diệp, trụ hạ diệp, mô sẹo Bảng 5: Sự phát triển của rễ in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trênmôi trườngMS bổ sung IAA kết hợp NAA các nồng độ khác nhau Mâũ cấy Nghiệm thức Số rễ/mâũ cấy Chiều dài rễ (cm) Tử diệp MS 0,70c 0,50d MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,1 mg/L 1,00d 1,03h MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,2 mg/L 1,41e 0,50d MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,3 mg/L 1,77j 0,54e MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,4 mg/L 1,82k 1,01g MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,5 mg/L 1,67h 0,40c Trụ hạ diệp MS 0,00a 0,00a MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,1 mg/L 0,72c 0,88f MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,2 mg/L 1,51f 0,50d MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,3 mg/L 1,64g 0,56e MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,4 mg/L 1,70i 1,02gh MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,5 mg/L 0,50b 0,30b Mô sẹo MS 0,00a 0,00a MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,1 mg/L 3,57e 0,79c MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,2 mg/L 6,00h 1,84d MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,3 mg/L 5,73fg 3,21i MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,4 mg/L 2,70d 2,76f MS + IAA 0,3 mg/L + NAA 0,5 mg/L 1,13b 0,72 CV (%) 13,49 13,72 Trong cùng một cột, số có cùng mẫu tự thì không khác biệt nhau ở mức p 0,05 qua phép thử Duncan . 563 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 Hình 6: Trụ hạ diệp nuôi cấy trên môi trườngMS + IAA 0,3 mg/L. A, B, C: ngày 0, ngày 5, ngày 10 (mũi tên: sơ khởi rễ). LỜI CẢMƠN Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học Thực nghiệm – Hướng Sinh lý Thực vật, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bài báo này. DANHMỤC TỪ VIẾT TẮT BA: Benzyl adenine CK: Cytokinin GA: Gibberellic acid IAA: Indole acetic acid MS:Murashige và Skoog, 1962 NAA: Naphthalene acetic acid DNA: Deoxyribonucleic acid XUNGĐỘT LỢI ÍCH Các tác giả cam đoan không có xung đột lợi ích trong việc công bố bài báo này ĐÓNGGÓP CỦA TÁC GIẢ Tác giả Dương Huỳnh Ngọc Trân: là tác giả chính tham gia thực hiện thí nghiệm, lấy kết quả nghiên cứu và viết bản thảo. Tác giả LêThị Diễm: là tác giả tham gia viết bản thảo và biện luận các kết quả nghiên cứu. Tác giả Võ Thị Bạch Mai: là tác giả tham gia hướng dẫn, chỉnh sửa bản thảo. TÀI LIỆU THAMKHẢO 1. Quyết định số 3765/QĐ-BKHCN ngày 30 tháng 11 năm 2016 của Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ;. 2. LuậnTC, PhươngBTM. Khảo sát thànhphầnhóahọc của rễ cây sâm Bố Chính (Hibiscus sagittifolius Kurz. Malvaceae) trồng ở Bạc Liêu. Công trình nghiên cứu khoa học, Viện Dược Liệu. 2001;. 3. Vui DT. Nghiên cứu thành phần hóa học và tác động dược lý theo hướng điều trị loét dạ dày của rễ củ cây sâm báo (Abel- moschus sagittfolius (Kurz) Merr). Viện Dược liệu. 2008;115. 4. Hộ PH. Cây có vị thuốc ở Việt Nam. NXB Trẻ. 2003;;:105–115. 5. Hiệp PD, Minh NT, Huyên PX, Hùng CD, Khiêm DV, Hằng NTT. Nghiên cứu ảnhhưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh hình thái của một số giống cây sâm Bố Chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) trong điều kiện in vitro. Tạp chí Sinh học. 2014;36(1se):266–271. 6. Huyên PX, Ngoan HT, Hoàng NTP. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây sâm Bố Chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) thông qua nuôi cấy đốt thân. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 2017;15(5):664–672. 7. Việt BT. Sinh lý thực vật đại cương. Phần II: Phát triển. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 2000;. 8. Vụ VV, Tâm VT, Tấn HM. Sinh lý học Thực vật. NXB Giáo Dục, Hà Nội. 2003;. 9. Staden V, Zazimalova E, George EF. Plant growth regulators II: Cytokinins, their analogues andantagonist. Plant Propagation by Tissue Culture (3rd ed). Eds. George E. F., Hall M. A., Klerk G. J. . Springer, Dordrecth, The Neverlands. 2008;p. 205–226. 10. Litwack G. Vitamins and Hormones. Plant hormone Eds Litwack G. 2005;72:1–357. 11. Machakova I, Zazimalova E, George EF. Plant Growth reg- ulators: introduction; auxin, their analogues and inhibitors. Plant Propagation by Tissue Culture (3rd ed). Vol. 1: The Back- ground. Eds. George E. F., Hall M. A., Klerk G. J. Springer, Dor- drecht, The Netherlands. 2008;p. 175–205. 12. Mai VTB. Sự phát triển chồi và rễ. NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh. 2004;. 13. Gahan P, George EF. Adventitious regeneration. Plant Propa- gation by Tissue Culture (3rd ed). Vol. 1: The Background. Eds. George E. F., Hall M. A., Klerk G. J. Springer, Dordrecht, The Neverlands. 2008;p. 355–401. 14. Giang LH, Toàn NB. Tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô lá non cây bí kì nam (Hydnophytum formicarum Jack.). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ. 2010;16a:216–222. 15. Taiz L, Zeiger E. Plant Physiology (3rd ed). Sinauer Associates, USA. 2002;. 16. QuangPM, KiênDC, PhươngQND,MinhHTT. Vi nhângiống và ra vườn ươm cây lan nắng Dendrobium Caesar. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ: chuyên san Khoa học Tự nhiên. 2018;2(3):14–22. 17. Rahman ZA, Roowi S, Wan ZWS, Subramaniam S. Regener- ation of Malaysian India rice (Oryza sativa) variety MR232 via optimesed somatic embryogenesis system. Journal of Phytol- ogy. 2010;2(3):30–38. 18. Tiếng NTN, Lang NTN, Thanh DV, Sanh ND, Việt BT. Kích thích tố dâm cành. Phần II: Cơ chế tạo rễ bất định. Thông báo Khoa học, Đại học Tổng hợp Tp Hồ Chí Minh. 1980;4:93–98. 564 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):556-566 19. Pernisová M, et al. Cytokinins modulate auxin-induced organogenesis in plants via regulation of auxin efflux. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 2009;106:3609–3614. PMID: 19211794. Available from: https: //doi.org/10.1073/pnas.0811539106. 565 Science & Technology Development Journal – Natural Sciences, 4(2):556-566 Open Access Full Text Article Research Article University of Science, VNU-HCM Correspondence Duong Huynh Ngoc Tran, University of Science, VNU-HCM Email: dhnt91@gmail.com History  Received: 27-3-2019  Accepted: 30-4-2019  Published: 25-6-2020 DOI : 10.32508/stdjns.v4i2.710 Copyright © VNU-HCM Press. This is an open- access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Effect of plant growth regulators on the root formation in in vitro culture of Abelmoschus Sagittifolius Kurz Duong Huynh Ngoc Tran*, Le Thi Diem, Vo Thi BachMai Use your smartphone to scan this QR code and download this article ABSTRACT Abelmoschus sagittifolius Kurz is a medicinal plant with typical pharmacological of ginseng. How- ever, the number of trees in the nature wild is declining rapidly due to the increasing demand for logging along with the narrowing of the distribution area and the low incidence of seed germina- tion, affecting the use for researching and developing gene sources for drug production in many areas. In this plant, root is themost important organ of the plant, so the study of root formation in in vitro has been of great significance in assessing the effect of plant growth regulators on induction roots, as well as creating a source of starting material for studies on the biosynthesis of saponin in in vitro compounds as an alternative to outside planting. The results showed that after 2 weeks of culture, the germination rate was highest (88%) when the seeds were disinfected with HgCl2 0.1%, 3 minutes and then soaked in GA3 20,0 mg/L, 120 minutes, finally seed culture on MS + 20 g/L saccharose + GA3 5.0 mg/L + 7 g/L agar. The callus formation from hypocotyl in the environment on MS medium + 20 g/L sucrose + NAA 0.5 mg/L + BA 1.5 mg/L + 7 g/L agar was appropriate for root reduction and the best root formation was applied in the medium of MS + 20 g/L sucrose + IAA 0.3 mg/L + 7 g/L agar. In conclusion, the method of tissue culture is suitable for the formation of adventitious roots from callus formation from hypocotyl of Abelmoschus sagittifolius Kurz. Key words: Abelmoschus sagittifolius Kurz, callus, in vitro, root Cite this article : Tran D H N, Diem L T, Mai V T B. Effect of plant growth regulators on the root forma- tion in in vitro culture of Abelmoschus Sagittifolius Kurz. Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci.; 4(2):556-566. 566