Ảnh hưởng của colchicine và oryzalin lên cảm ứng đa bội và phát sinh hình thái của cây lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) nuôi cấy in vitro

Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 103 ẢNH HƯỞNG CỦA COLCHICINE VÀ ORYZALIN LÊN CẢM ỨNG ĐA BỘI VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) NUÔI CẤY IN VITRO Vũ Quốc Luận1, Đỗ Thị Thúy Tâm1, Nguyễn Phúc Huy1, Hoàng Thanh Tùng1, Vũ Thị Hiền1, Đỗ Mạnh Cường1, Bùi Văn Thế Vinh2, Dương Tấn Nhựt1,* 1Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (HUTECH) *Người chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: duongtannhut@gmail.com Ngày nhận bài: 07.8.2019 Ngày nhận đăng: 26.10.2019 TÓM TẮT Lan Kim Tuyến (Anoectochilus spp.) là một trong những cây dược liệu quan trọng được dùng để chữa bệnh như huyết áp, tiểu đường, tim mạch, gan, phổi cũng như phục hồi sức khỏe. Cảm ứng đa bội bằng colchicine và oryzalin được ứng dụng rộng rãi trên nhiều loài thực vật và được xem là công cụ hữu hiệu trong chọn tạo giống cây trồng. Trong nghiên cứu này, chồi non lan Kim Tuyến in vitro với chiều cao 1 cm được xử lý với colchicine (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 µM) và oryzalin (0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 µM) với thời gian xử lý khác nhau (0, 12, 24, 36, 48 giờ). Kết quả cho thấy, chồi được xử lý từ 24 – 48 giờ với nồng độ từ 2 – 10 µM colchicine và từ 40 – 100 µM oryzalin đã xuất hiện những biến dị về mặt hình thái từ 10,00% – 16,00% và các chồi này có xu hướng phục hồi sau nhiều lần cấy chuyền. Kích thước khí khẩu có liên quan chặt chẽ với mức độ đa bội, cây lưỡng bội (2n = 2x) có kích thước khí khẩu trung bình khoảng 33,50 µm ở độ phóng đại x100 và khi đo bằng phương pháp flow cytometry cho kết quả với đỉnh peak ở 70 FL. Những cây đa bội được xác định có kích thước khí khẩu lớn hơn 40,12 µm. Phương pháp đo flow cytometry cho thấy các cây có chiều dài kích thước khí khẩu từ 40,12 µm đến 50,00 µm đều ở dạng thể khảm giữa cây lưỡng bội (2n = 2x) và cây tứ bội (2n = 4x) với 2 đỉnh peak 70 FL và 90 FL. Các mẫu được xử lý ở nồng độ 4, 6, 8 µM colchicine với thời gian xử lý 48 giờ và 60 µM oryzalin với thời gian xử lý 24 giờ có chiều dài kích thước khí khẩu khoảng 52,03 µm đến 71,25 µm được xác định là cây tứ bội (2n = 4x) với đỉnh peak nằm khoảng 120 FL. Từ khóa: cảm ứng đa bội, cây tứ bội, khí khẩu, lan Kim Tuyến, phát sinh hình thái MỞ ĐẦU Chi lan Kim Tuyến (Anoectochilus) có khoảng 40 loài, chúng mọc sát khe suối trên những thảm mục của những khu rừng cây lá rộng thường xanh (Belitsky, Bersenev, 1999). Một số loài đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh trong y học cổ truyền của một số nước ở Châu Á như huyết áp, tiểu đường, tim mạch, gan, phổi và phục hồi sức khỏe (Liang et al., 1990; Lin et al., 2000). Một số nghiên cứu về phân tích hoạt chất đã cho thấy chúng chứa nhiều hợp chất quan trọng trong điều trị bệnh như kinsenoside, flavonoids, β–sitosterol, adenosine và nhiều phức hợp mới đã được tìm thấy (He et al., 2006; Zhang et al., 2013; Liu et al., 2013; Vũ Quốc Luận et al., 2015, 2017). Năm 1981, cây lan Kim Tuyến được thu hái ngoài tự nhiên có giá khoảng 320 USD/kg trọng lượng tươi và 3200 USD/kg trọng lượng khô và nhu cầu sử dụng loại thảo dược này ngày càng tăng (Lin, Namba, 1981a; 1981b). Cho đến nay, Vũ Quốc Luận et al. 104 chúng bị khai thái quá mức và có nguy tuyệt chủng ngoài tự nhiên; các sản phẩm được thương mại hóa trên thị trường hiện nay chủ yếu có nguồn gốc từ nuôi trồng nhân tạo và nhu cầu thị trường của chúng tăng lên hàng năm. Nhu cầu trung bình hàng năm của Hàn Quốc và Nhật Bản khoảng 1000 tấn và 70% phụ thuộc vào hàng nhập khẩu. Theo số liệu thống kê sơ bộ năm 2014, số lượng giống lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii được nuôi cấy là 60 triệu chai, sản lượng hàng năm là 2500 tấn tươi và giá trị hàng năm đạt 30 tỷ nhân dân tệ tại Trung Quốc (Ye et al., 2017). Cảm ứng đa bội bằng colchicine và oryzalin đã được ứng dụng rộng rãi trên nhiều loại cây trồng và được coi là một công cụ hữu hiệu nhằm cải thiện di truyền của nhiều loài thực vật (Madon et al., 2005). Trên một số loài lan Kim Tuyến, cảm ứng đa bội bằng colchicine cũng đã được thực hiện, kết quả cho thấy số lượng nhiễm sắc thể tăng lên gấp đôi trên loài Anoectochilus roxburghii tương ứng trong cây lưỡng bội và tứ bội (2n = 40 và 80) ở nồng độ 300 mg/L colchicine sau 13 ngày xử lý (Wang et al., 2010). Trên loài lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus khi được xử lý với colchicine để cảm ứng đa bội, ở nồng độ 100 mg/L colchicine kết quả đã thu được 50% cây đa bội và định lượng hoạt chất Gastrodin và Flavonoid trong cây tứ bội cao hơn đáng kể so với cây lưỡng bội (Chung et al., 2017). Trong nghiên cứu này, colchicine và oryzalin được dùng để khảo sát nồng độ và thời gian xử lý thích hợp đối với sinh trưởng và cảm ứng đa bội ở cây lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro, đồng thời độ đa bội của cây được xác định bằng phương pháp đo kích thước khí khẩu và phương pháp flow cytometry. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chồi non lan Kim Tuyến in vitro được tái sinh từ các đốt thân sau 20 ngày nuôi cấy với chiều cao 1 cm (Hình 1a) được sử dụng để xử lý với colchicine và oryzalin. Môi trường và điều kiện nuôi cấy Môi trường nuôi cấy in vitro là môi trường SH (Schenk, Hildebrandt, 1972) bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA, 9 g/L agar, 30 g/L đường, 1 g/L than hoạt tính và pH = 5,8 (Vũ Quốc Luận et al., 2015), sau đó được hấp khử trùng trong Autoclave ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút. Sau khi xử lý với colchicine và oryzalin mẫu được cấy vào bình có dung tích 100 mL chứa 20 mL môi trường và đặt trong phòng nuôi với nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 55 – 60%, sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang với cường độ 40 – 45 µmol.m-2.s-1, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý colchicine hoặc oryzalin lên sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến trong nuôi cấy in vitro Ở trường hợp xử lý bằng colchicine, chồi non lan Kim Tuyến có chiều cao 1 cm được tiến hành ngâm trong dung dịch colchicine ở các nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 µM) với thời gian xử lý (0, 12, 24, 36, 48 giờ). Cuối cùng, chúng được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần và cấy lên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/L đường, 9 g/l agar, 1,0 g/L than hoạt tính. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống sót, tỷ lệ phát sinh hình thái, chiều cao chồi (cm), số đốt/chồi, khối lượng tươi (g). Ở trường hợp xử lý bằng oryzalin, chồi non lan Kim Tuyến có chiều cao 1 cm được tiến hành ngâm trong dung dịch oryzalin ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 µM) và thời gian xử lý (0, 12, 24, 36, 48 giờ). Cuối cùng, chúng được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần và cấy lên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/L đường, 9 g/L agar, 1,0 g/L than hoạt tính. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống sót, tỷ lệ phát sinh hình thái, chiều cao chồi (cm), số đốt/chồi, khối lượng tươi (g). Xác định độ đa bội thông qua khí khẩu Tách một lớp mỏng ở mặt sau của lá từ các chồi đã xử lý với colchicine và oryzalin. Đặt lớp mỏng lên lam kính, nhỏ một giọt nước, đậy lamen. Đặt lam kính lên kính hiển vi quan sát và Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 105 chụp ảnh khí khẩu ở vật kính x 100. Độ dài khí khẩu của lá đã xử lý ≥ 1,25 x độ dài của khí khẩu đối chứng được xác định là thể đa bội (Russell, 2004). Xác định độ đa bội bằng phương pháp flow cytometry Cân 50 mg lá và đặt trong đĩa petri, thêm 1 ml dung dịch A (14,3 ml MgSO4 lạnh, 15 mg dithiothreitol, 300 µL PI stock, 375 µL Triton X100 stock) vào đĩa, sau đó, cắt nhuyễn mẫu bằng lưỡi dao sắc. Mẫu được lọc qua màng lọc có kích thước 33 µm. Ly tâm 15.000 vòng/phút từ 15 đến 20 giây và loại bỏ phần dịch phía trên. Tiếp theo, hòa tan cặn trong 200 µL dung dịch B (3 ml dung dịch A, 7,5 µL RNAse, 3.0CRBC) và ủ 15 phút ở 37°C, sau đó, chạy mẫu trên máy Partec Ploidy AnalyserPA-I (Doležel et al., 1989). Xử lý số liệu Thí nghiệm xử lý bằng colchicine và oryzalin mỗi nghiệm thức xử lý 25 mẫu với 3 lần lặp lại, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD) theo phương pháp của Compton và Mize (1999) sử dụng để nghiên cứu thực vật trong phòng thí nghiệm và nhà kính. Trung bình của các chỉ tiêu theo dõi giữa các nghiệm thức được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), sau đó so sánh với phép thử Duncan ở mức tin cậy P ≤ 0,05 bằng phần mềm SAS 9.1. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý colchicine lên sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro Nồng độ và thời gian xử lý khác nhau của colchicine có tác động lên quá trình sinh trưởng, khả năng sống sót và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến in vitro (Bảng 1). Sau 90 ngày nuôi cấy, chồi lan Kim Tuyến ở các nồng độ 0, 1, 2, 4, 6 µM/L với thời gian xử lý từ 12 đến 48 giờ cho tỷ lệ sống sót 100% (Bảng 1); khi nồng độ colchicine tăng lên 8 – 10 µM/L, có hiện tượng chết mẫu ở các mốc thời gian xử lý từ 24 – 48 giờ (Bảng 1, Hình 1h). Witayaporn và đồng tác giả (2015) cũng chỉ ra rằng, tỷ lệ sống sót của cây cau diệp giảm (65,2; 55,6; 48,1; 45,0 %) khi tăng nồng độ xử lý với colchicine (0,25; 0,5; 0,75; 1,0 % (w/v). Nguyễn Thị Lý Anh và đồng tác giả (2014) khi tiến hành xử lý chồi hoa cẩm chướng với colchicine cho rằng, khi tăng nồng độ và thời gian xử lý với tỷ lệ (0,1% và 72 giờ; tương ứng) tỷ lệ sống sót giảm chỉ còn 46,67%. Trong khi đó, cây con được xử lý với 5 mg/L colchicine trong 96 giờ cho tỷ lệ sống sót chỉ có 16% (Suthana et al., 2012). Trong nghiên cứu này, chồi đỉnh có xu hướng ngừng phát triển và có xu hướng phát triển chồi bên khi xử lý colchicine trong thời gian dài và nồng độ cao (Hình 1d). Các chỉ tiêu theo dõi như: chiều cao, số đốt, khối lượng tươi có xu hướng giảm so với đối chứng khi nồng độ xử lý tăng (Bảng 1). Kết quả cũng cho thấy, một số chồi khi xử lý với nồng độ 4 và 6 µM trong 48 giờ cũng cho kiểu hình như lá dầy và xanh đậm (Hình 1i. 2) và một số dạng hình thái khác như nửa lá khảm màu trắng (Hình 1b), lá loang lổ với các vùng thiếu sắc tố (Hình 1g). Chồi mang lá màu vàng nhung với viền khảm xanh thu được ở nồng độ xử lý từ 4 – 8 µM với thời gian từ 24 – 36 giờ (Hình 1e, f). Chồi mang đốt ngắn, lá thu nhỏ, bò lan (Hình 1c) thu được ở nồng độ xử lý 8 µM trong 48 giờ và 10 µM trong 24 – 48 giờ. Mẫu xử lý ở nồng độ (6 – 8 µM) với thời gian xử lý 24 giờ cho tỷ lệ biến dị hình thái cao nhất (15,00 – 15,33 %) (Bảng 1). Tỷ lệ biến dị hình thái chồi trong nghiên cứu này thấp hơn so với báo cáo của một số tác giả như Nguyễn Thị Lý Anh và đồng tác giả (2014) cho kết quả biến dị hình thái đạt (33,33 %) ở nồng độ 0,01% sau 72 giờ. Wu và đồng tác giả (2007) lại cho kết quả tỷ lệ đột biến tăng khi thời gian xử lý tăng dần (24, 48, 72 giờ; 15,63; 34,38; 50% tương ứng) trên đối tượng P. grandifloras. Lê Duy Thành (2001) cho thấy, nồng độ xử lý hiệu quả với colchicine là 0,1 – 1,0%, nồng độ thích hợp cho một số loại cây trồng là 0,2%, nồng độ xử lý cao với thời gian ngắn cho hiệu quả tốt hơn khi xử lý với nồng độ thấp và thời gian dài. Khi nghiên cứu tạo giống đa bội bằng colchicine ở nồng độ (0; 0,3; 0,5; 1,0%) trên phôi soma với thời gian 48, 72 và 96 giờ cũng cho kết quả tương tự (Beyene et al., Vũ Quốc Luận et al. 106 2013). Tuy nhiên, khi xử lý colchicine tạo đa bội in vitro, một số tác giả lại cho rằng nồng độ colchicine thấp và thời gian xử lý dài cho hiệu quả cao hơn như: xử lý nồng độ colchicine 0,025% trong thời gian 6 ngày cho tỷ lệ tứ bội cao nhất là 10% trên cây dưa hấu (Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Kim Hằng, 2010); tạo cỏ tứ bội Brachiaria đạt 3,9% khi nồng độ xử lý 0,1% colchicine sau 48 giờ (Carine và Cacilda, 2009). Như vậy, nồng độ và thời gian xử lý colchicine lên quá trình biến dị phụ thuộc vào kiểu di truyền của từng loại cây. Khi xử lý cochicine trên loài lan Cau diệp ngà Spathoglottis eburnea, kết quả thu được một số mẫu mang kiểu hình với lá khảm màu hoặc trắng (Witayaporn et al., 2015). Các nồng độ xử lý colchicine (1,25 – 6,25 µM) dẫn đến gia tăng tỷ lệ mẫu chết (Carvalho et al., 2016). Ngoài ra, Awoleye và đồng tác giả (1994) đã cho thấy, chỉ có 24% cây con sống sót khi nó được xử lý với 10,0 µM colchicine. Những kết quả này cho thấy mức độ nhạy cảm khác nhau với colchicine tùy thuộc vào loài (Carvalho et al., 2016). Premjet và Premjet (2016) báo cáo kết quả xử lý colchicine ở nồng độ thấp (0,5 – 2%) không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, nhưng ở nồng độ cao (5%) tỷ lệ sống giảm xuống còn 50%. Chất ức chế phân bào tạo ra những biểu hiện nổi bật về mặt hình thái có thể nhìn thấy được như lá, màu sắc lá bị thay đổi, nhưng đó chỉ là những biểu hiện tạm thời và chúng dần hồi phục lại bình thường sau thời gian dài nuôi cấy. Tốc độ tăng trưởng của cây được xử lý đột biến với chiều cao thấp hơn, chiều dài lóng ngắn, biến dạng như lá nhăn so với cây lưỡng bội. Nồng độ colchicine càng cao cho tỷ lệ sống càng thấp và tác động của colchicine chủ yếu tập trung vào kỳ giữa của nguyên phân, tuy nhiên không phải tất cả các tế bào đang trong giai đoạn nguyên phân đều trở thành đa bội. Tốc độ tăng trưởng và khối lượng của cây lưỡng bội và đa bội là khác nhau, do sự kết hợp của các tế bào lưỡng bội và đa bội gây ra hiện tượng khảm với lá nhăn (Yang et al., 2015). Như vậy, ở kết quả phát sinh hình thái của nghiên cứu này cho thấy các dạng hình thái mới xuất hiện từ 10% – 15,33% khi thời gian xử lý từ 24 – 48 giờ ở các nồng độ xử lý từ 2 – 10 µM/L colchicine. Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin lên sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro Ảnh hưởng của oryzalin ở các nồng độ và thời gian xử lý với khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro sau 90 ngày nuôi cấy được thể hiện qua Bảng 2. Tỷ lệ sống sót của chồi khi xử lý với oryzalin cho thấy ở nồng độ thấp 0 – 40 µM/L hầu như không có sự khác biệt đáng kể (trừ nồng 40 µM/L với thời gian xử lý 48 giờ) (Bảng 2). Trong khi đó, ở các nồng độ 60 – 100 µM/L tỷ lệ mẫu chết có xu hướng gia tăng. Kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp với báo cáo của Carvalho và đồng tác giả (2016) cho thấy nồng độ 3 và 6 µM oryzalin không ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh trưởng và phát triển; tuy nhiên, tăng nồng độ và thời gian tiếp xúc với oryzalin làm ảnh hưởng đến sự phát triển và phát sinh hình thái in vitro, chiều cao trung bình giảm (62,67%), số lượng lá (44,62%), số lượng rễ (70,75%). Awoleye và đồng tác giả (1994) báo cáo tỷ lệ sống sót thấp, số lượng cây tái sinh và chiều dài giảm khi gia tăng nồng độ oryzalin. Ở nồng độ cao và thời gian xử lý dài làm giảm tỷ lệ sống sót còn 50% khi xử lý cây giống với 13, 15, 22 µM oryzalin (Parson et al., 2001). Tác động của oryzalin đã thành công trong việc gây ra sự thay đổi về số lượng nhiễm sắc thể, trong khi nồng độ thấp của oryzalin không ảnh hưởng rõ ràng đến sự phát triển của chồi, tuy nhiên, nồng độ cao làm chồi nhỏ hơn. Stanys và đồng tác giả (2003) cho rằng, tác động của oryzalin lên tái sinh chồi in vitro ít bị ảnh hưởng bất lợi hơn so với colchicine. Chiều cao chồi khi được xử lý với oryzalin cho kết quả khác biệt so với đối chứng ở tất cả các nồng độ và thời gian xử lý. Kết quả ghi nhận được cho thấy, chiều cao chồi, số đốt, khối lượng tươi có xu hướng giảm khi nồng độ và thời gian xử lý tăng dần (Bảng 2). Trong quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi in vitro, kết quả cho tỷ lệ phát sinh hình thái cao nhất (14,00; 16,00%) thu được ở nồng độ (40, 80 µM) với thời gian xử lý 36 giờ (Bảng 2). Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Josephine và đồng tác giả (2015) với biến dị kiểu hình (90 – 100%) ở nồng độ xử lý 30 – 150 µM sau 5 ngày Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 107 xử lý chồi đỉnh của cây Zehneria capillacea, kết quả này cho thấy, sự mẫn cảm với oryalin giữa các loài rất khác nhau dẫn đến tỷ lệ % về biến dị kiểu hình giữa các loài rất khác nhau. Ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau cũng thu được một số kiểu hình như thân và lá gần như khảm trắng hoàn toàn (Hình 2d, e), trên bề mặt lá loang lổ các vùng thiếu sắc tố (Hình 2a, b, c) chủ yếu thu được ở nồng độ từ 40 - 60 µM và thời gian xử lý dài từ 36 – 48 giờ. Chồi hình thành với thân ngắn với lá nhỏ (Hình 2f, g), hoặc chồi chính không phát triển và hình thành cụm chồi bên theo hướng bò lan và không hình thành lá (Hình 2h, i) thu được ở nồng độ xử lý cao từ 80 – 100 µM/L và thời gian xử lý dài 36 – 48 giờ. Quan sát các cây con sau khi tiếp xúc oryzalin cho thấy một số bất thường về hình thái như lá cong, nhăn, thiếu sắc tố hoặc loang lổ trên bề mặt lá (Lam et al., 2014) và kiểu hình khác biệt tương tự đã được báo cáo bởi (Harbard et al., 2012). Khi xử lý đột biến có thể dẫn đến những bất thường về hình thái mà không thay đổi về lưỡng bội của cây (Harbard et al., 2012). Ảnh hưởng của nồng độ oryzalin lên chiều cao cây cũng là điều hiển nhiên và mong đợi. Tuy nhiên, nhóm tác giả hy vọng rằng, các cây sau khi xử lý sẽ phục hồi và sinh trưởng giống như ban đầu (Lam et al., 2014). Khi xử lý với oryzalin cũng thu được hình thái lá lớn hơn, rễ phát triển mạnh hơn so với cây đối chứng (Parson và Benchamas, 2001). Các cây con được xử lý xuất hiện bạch tạng, lùn với lá dầy. Cây con xử lý với 45 µM oryzalin sau 7,5 giờ thường bị chết vì nồng độ cao (Parson và Benchamas, 2001). Như vậy, ở kết quả phát sinh hình thái của nghiên cứu này cho thấy các dạng hình thái mới xuất hiện từ 10% – 16,00% khi thời gian xử lý từ 24 – 48 giờ ở các nồng độ xử lý từ 40 – 100 µM/L oryzalin. Hình 1. Ảnh hưởng của colchicine ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro. a, Nguồn mẫu in vitro trước khi xử lý; b, Chồi khảm nửa lá màu trắng; c, Chồi mang đốt ngắn, lá thu nhỏ; d, Chồi chính ngừng phát triển và phát sinh chồi bên; e, f, Chồi mang lá màu vàng nhung với viền khảm màu xanh; g, Lá loang lổ với các vùng thiếu sắc tố; h, Chồi non chết do nồng độ colchicine cao và thời gian xử lý dài. i1, Đối chứng; i2, Chồi với lá dầy và thân đậm; i3, Chồi với lá thuôn dài; i4, Chồi mang đốt thân ngắn với lá tròn và nhỏ; i5, Chồi mang đốt ngắn với lá nhỏ uốn cong. Vũ Quốc Luận et al. 108 Bảng 1. Ảnh hưởng của colchicine ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến sau 90 ngày nuôi cấy in vitro. Nồng độ colchicine (µM/L) Thời gian xử lý (giờ) Số mẫu sống sót (%) Tỷ lệ mẫu biến dị hình thái (%) Chiều cao chồi (cm) Số đốt/chồi Khối lượng tươi (g) Hình thái chồi 0 0 100a 0,00l 4,50a 6,00a 0,583a Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 1 12 100a 4,00k 4,00b 5,53b 0,446b Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 7,00j 3,86cd 5,40bc 0,430cd Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 36 100a 6,66j 3,76de 5,26cdef 0,396hijk Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 100a 8,33hij 3,76de 4,90i 0,386ijklm Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 2 12 100a 6,66j 3,90bc 5,36bcd 0,440bc Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 12,66cd 3,86cd 5,26cdef 0,420cef Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 36 100a 11,66cdef 3,76de 5,13efgh 0,400ghij Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 100a 10,00ghi 3,60fg 4,96hi 0,390ijkl Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 4 12 100a 7,66ij 3,90bc 5,30cde 0,426cde Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 13,00c 3,80cd 5,16efg 0,403fghi Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 36 100a 10,00fgh 3,63fg 5,00ghi 0,380klm Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 100a 11,00def 3,46hi 4,86ij 0,376lmn Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 6 12 100a 8,33hij 3,86cd 5,20def 0,423cde Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 15,33a 3,76de 4,96hi 0,410efgh Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 36 100a 13,33bc 3,60fg 4,90i 0,390ijkl Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 100a 13,00c 3,40i 4,70jk 0,373lmn Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 8 12 100a 9,00ghi 3,80cd 5,26cdef 0,416defg Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 15,00ab 3,66ef 4,96hi 0,390ijkl Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 36 98b 15,00ab 3,46hi 4,90i 0,383jklm Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 95c 13,00c 3,43hi 4,60kl 0,370mn Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 10 12 100a 10,66fge 3,76de 5,10fgh 0,400ghij Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 94d 15,00ab 3,53gh 5,00ghi 0,376lmn Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 36 90e 12,33cde 3,40i 4,70jk 0,373lmn Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 81f 11,00def 3,36i 4,50l 0,360n Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt CV 0,51 10,70 2,15 2,03 2,32 F-Test * * * * * Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a, b, c) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 109 Hình 2. Ảnh hưởng của oryzalin ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro. a, b, Chồi mang lá khảm một phần màu trắng; c-e, Thân và lá gần như bạch tạng hoàn toàn; f, g, Chồi mang đốt ngắn, lá thu nhỏ; h, I, Chồi chính ngừng phát triển do nồng độ oryzalin cao và hình thành chồi bên với lá thu gọn; j, Chồi non chết do nồng độ oryzalin cao và thời gian xử lý dài. Bảng 2. Ảnh hưởng của oryzalin ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái chồi lan Kim Tuyến sau 90 ngày nuôi cấy in vitro. Nồng độ oryzalin (µM/L) Thời gian xử lý (giờ) Số mẫu sống sót (%) Tỷ lệ mẫu biến dị hình thái (%) Chiều cao chồi (cm) Số đốt/ch ồi Khối lượng tươi (g) Hình thái chồi 0 0 100a 0,00l 4,60a 5,90a 0,590a Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 10 12 100a 3,66k 4,16b 5,53b 0,456b Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 4,66jk 4,00bc 5,50b 0,436bcd Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm Vũ Quốc Luận et al. 110 36 100a 6,00ijk 3,90cd 5,30cde 0,406 bcdef g Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 100a 6,33hij 3,83 cd e 5,00 fgh 0,400cdefg Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 20 12 100a 4,66jk 3,96cd 5,40bc 0,443bc Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 6,00ijk 3,83 cd e 5,26 cde 0,400cdefg Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 36 100a 6,66ghij 3,63 fgh i 5,10 efg 0,393cdefg Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 100a 7,66fghi 3,46ijk 4,90gh 0,383efghi Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 40 12 100a 5,66ijk 4,00bc 5,56bcd 0,420bcde Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 100a 13,00bc 3,70efg 5,20de 0,386defgh Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 36 99,0a 14,00ab 3,50hij 4,90gh 0,373efghi Chồi đơn, mập, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 96,0b 1,00def 3,36jk 4,80hi 0,366fghi Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 60 12 100a 10,00 de f 3,80 def 5,13ef 0,416bcdef Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 96,0b 13,66 ab c 3,60 ghi 4,86h 0,400cdefg Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 36 89,5d 13,00bc 3,40jk 4,85h 0,380efghi Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 82,6e 13,33bc 3,30kl 4,60ij 0,360ghi Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 80 12 97,6 a b 8,66 fgh 3,70efg 5,10efg 0,406 bcdef g Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 92,6c 16,00a 3,66 efg h 4,90 gh 0,383efghi Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 36 82,3e 14,33ab 3,46ijk 4,80hi 3,370efghi Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 72,6g 12,66bc 3,16lm 4,50ik 0,356ghi Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 100 12 87,6d 9,33ef 3,66 efg h 4,80 hi 0,390defgh Chồi đơn, mập, lá to, xanh đậm 24 77,6f 11,33 cd e 3,30 kl 4,63ij 0,370efghi Chồi chính chậm phát triển, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 36 67,3h 12,33 bc d 3,03 m 4,60ij 0,363ghi Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt 48 62,3i 12,00 bc d 3,00 m 4,40k 0,340hi Chồi chính chậm phát triển, hình thành cụm đa chồi, bò lan, đốt ngắn, lá nhỏ, xanh nhạt CV 1,67 14,33 2,54 2,06 6,72 F-Test * * * * * Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a, b, c) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 111 Bảng 3. Xác định độ bội thông qua đo kích thước khí khẩu và phương pháp Flow cytometry. Nồng độ (µM/L) Thời gian xử lý (giờ) Kích thước khí khẩu trung bình/lá (µm) Số mẫu đa bội Mức độ đa bội Chỉ số hàm lượng DNA (đo bằng Flow cytometry) Colchicine Oryzalin 0 (ĐC) 0 33,50 0 2n = 2x ≤ 70 FL 4 36 70,15 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 48 48,45 1 2n = 4x ≤ 120 FL 6 24 45,30 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 36 43,55 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 & ≤ 90 36 47,70 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 48 55,32 1 2n = 4x ≤ 120 FL 8 24 50,00 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 24 47,14 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 36 41,25 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 48 52,03 1 2n = 4x ≤ 120 FL 10 24 47,38 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 36 45,32 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 40 48 40,12 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 60 24 71,25 1 2n = 4x ≤ 120 36 47,56 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 80 24 44,15 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL 100 24 46,37 1 2n = 2x + 2n = 4x ≤ 70 FL & ≤ 90 FL Xác định độ đa bội bằng phương pháp đo kích thước khí khẩu và phương pháp Flow cytometry Kết quả thu nhận sau 12 tháng cấy chuyền cho thấy, phần lớn các chồi bị biến dị hình thái do xử lý với colchicine và oryzalin có xu hướng phục hồi lại và có kiểu hình giống với những mẫu đối chứng. Tuy nhiên, đã xuất hiện những dạng hình thái mới như thân mập, lá to và đậm hơn (Hình 3h). Qua kiểm tra đo kích thước khí khẩu theo phương pháp của Russell (2004) đã thu được các mẫu có độ dài khí khẩu của lá đã xử lý ≥ 1,25 x lần so với độ dài của khí khẩu của lá đối chứng được thể hiện qua bảng 3. Khi quan sát khí khẩu trên những cây được xử lý với colchicine cho thấy kích thước của khí khẩu thường lớn hơn 40,12 µm và có hình dạng bất thường so với những cây không xử lý có kích thước khí khẩu trung bình khoảng 33,50 µm (Hình 3a, d) (Bảng 3) và đỉnh của peak đo bằng phương pháp flow cytometry nằm ở khoảng 70 FL (Hình 4a) là cây lưỡng bội (2n = 2x). Vũ Quốc Luận et al. 112 Hình 3. Sự khác biệt về hình thái khí khẩu và chồi lan Kim Tuyến khi xử lý với colchicine và oryzalin. a-c, Xử lý với colchicine; d-f, Xử lý với oryzalin; a, d, Khí khẩu nhỏ, tròn trên lá cây đối chứng với kích thước trung bình từ 33,50 µm; b, e, Khí khẩu hình bầu dục với kích thước trung bình từ 40,12 – 50,00 µm thu được trên cây đa bội khảm (2n = 2x) và (2n = 4x); c, f, Khí khẩu hình thuôn dài với kích thước trung bình trên 50 – 70 µm thu được trên cây tứ bội (2n = 4x); g, Cây lưỡng bội (2n = 2x); h, Cây tứ bội (2n = 4x). Hình 4. Xác định cây đa bội bằng phương pháp Flow cytometry. a, Cây lưỡng bộ (2n = 2x); b, Cây đa bội khảm (2n = 2x) và tứ bội (2n = 4x); c, Cây tứ bội (2n = 4x). Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 113 Kết quả đo khí khẩu trên loài lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus khi xử lý với colchicine của Chung và đồng tác giả (2017) cho thấy chiều dài của khí khẩu cây tứ bội (30,5 µm) và cây lưỡng bội (26,5 µm), điều này cho thấy kích thước khí khẩu có sự khác biệt giữa các loài lan Kim Tuyến. Chiều dài khí khẩu đo được trên những cây đa bội có kích thước từ 40,12 µm đến 50,00 µm (Hình 3b. e) cho thấy chúng ở dạng thể khảm giữa cây lưỡng bội (2n = 2x) và cây tứ bội (2n = 4x) với 2 đỉnh peak nằm khoảng 70 FL và 90 FL (Hình 4b). Kích thước khí khẩu đo được với chiều dài từ 52,03 µm đến 71,25 µm (Hình 3c, f) cho thấy chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh peak nằm khoảng 120 FL (Hình 4c) là cây tứ bội (2n = 4x). Kết quả của cây lan Kim Tuyến tứ bội trong nghiên cứu này cũng phù hợp với cây tứ bội của loài lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus với đỉnh peak lớn hơn 100 FL (Chung et al., 2017). Kích thước khí khẩu đo được trên những cây đa bội của nghiên cứu này cũng phù hợp với báo cáo của một số tác giả cho thấy cây đa bội, tứ bội có kích thước lỗ khí khẩu thường lớn hơn cây lưỡng bội. Premjet và Premjet (2016) cho thấy chiều dài và chiều rộng của lỗ khí khẩu (35,2 và 27,9 µm) có kích thước lớn hơn khi xử lý với 1% colchicine so với cây lưỡng bội (25,9 và 20,4 µm) và cây không được xử lý có mật độ khí khẩu cao nhất (450/mm) trong khi cây được xử lý có mật độ (110/mm). Trong nghiên cứu của Liu và đồng tác giả (2007) cũng cho thấy, khí khẩu của các cây tứ bội lớn hơn cây lưỡng bội, trong khi đó, Meenakshi và đồng tác giả (2014) cũng cho thấy kích thước lỗ khí khẩu và chiều dài là lớn hơn trong khi mật độ khí khẩu ít hơn. Trong lúc đó, khi quan sát khí khẩu trên các chồi được xử lý với oryzalin cho thấy, kính thước của khí khẩu thường lớn hơn và có hình dạng bất thường so với những chồi đối chứng (Hình 3e, f) và kích thước khí khẩu từ 40,12 µm đến 47,56 µm cũng cho thấy hình thành đa bội dạng khảm giữa cây lưỡng bội (2n = 2x) và cây tứ bội (2n = 4x) với 2 đỉnh peak thu được tương tự với hình 4b. Trong khi đó, cây có kích thước khí khẩu 71,25 µm được xác định là cây tứ bội (2n = 4x) chỉ xuất hiện 1 đỉnh peak nằm khoảng 120 FL (Hình 4c). Parson và Benchamas (2001) đã cho thấy kích thước lỗ khí khẩu khi được xử lý với oryzalin ở thế hệ MV3 dài hơn (28 µm) trong khi cây đối chứng là (19 µm). Như vậy, kết hợp giữa phương pháp đo kích thước khí khẩu và phương pháp flow cytometry đã xác định được đa bội dạng khảm giữa cây lưỡng bội (2n = 2x) và cây tứ bội (2n = 4x) và đa bội ở dạng tứ bội (2n = 4x) trong quá trình xử lý với colchicine và oryzalin. KẾT LUẬN Khi tăng nồng độ và thời gian xử lý với colchicine và oryzalin đã ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng cũng như sự biến dị về mặt hình thái chồi lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, chồi được xử lý từ 24 – 48 giờ với nồng độ từ 2 – 10 µM colchicine và từ 40 – 100 µM oryzalin đã xuất hiện những biến dị về mặt hình thái từ 10,00% – 16,00% và các chồi này có xu hướng phục hồi sau nhiều lần cấy chuyền. Cây lưỡng bội (2n = 2x) có kích thước khí khẩu trung bình khoảng 33,50 µm ở độ phóng đại x100 và khi đo bằng phương pháp flow cytometry cho kết quả với đỉnh peak ở 70 FL. Phương pháp đo flow cytometry cho thấy các cây có chiều dài kích thước khí khẩu từ 40,12 µm đến 50,00 µm đều ở dạng thể khảm giữa cây lưỡng bội (2n = 2x) và cây tứ bội (2n = 4x) với 2 đỉnh peak 70 FL và 90 FL. Cây có chiều dài kích thước khí khẩu từ 52,03 µm đến 71,25 µm được xác định là cây tứ bội (2n = 4x) với đỉnh peak nằm khoảng 120 FL. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.01-2019- 48 và Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. TÀI LIỆU THAM KHẢO Awoleye F, Van DM, Dolezel J, Novak FJ (1994) Nuclear DNA content and in vitro induced somatic polyploidization cassava (Manihot esculenta Crantz) breeding. Euphytica 76: 195-202. Belitsky I, Bersenev VNA (1999) Jewel orchids. Mag Amer Orchid Soc 1999: 33-37. Beyene D, Thunya T, Shermarl W, Benya M (2013) Vũ Quốc Luận et al. 114 Induced mutation by colchicine treatment of somatic embryos in ‘Namwa’ Banana (Musa sp. ABB). Inter Trans J Engin Manag Appl Sci Tech 4(4): 311-320. Carine S, Cacilda BDV (2009) Chromosome duplication in Brachiaria (A. Rich.) Stapf allows intraspecific crosses. Crop Breed Appl Biotech 9: 328-334. Carvalho MDJDSD, Gomes VB, Souza ADS, Aud FF, Santos SJA, Oliveira EJ (2016) Inducing autotetraploids in cassava using oryzalin and colchicine and their in vitro morphophysiological effects. Gen Mol Res 15(2): 1-14. Chung HH, Shi SK, Huang B, Chen JT (2017) Enhanced agronomic traits and medicinal constituents of autotetraploids in Anoectochilus formosanus Hayata, a top-grade medicinal orchid. Molecules 22: 1-13. Compton ME, Mize CW (1999) Statistical considerrations for in vitro reasearch: I - birth of an idea to collecting data. In Vitro Cell Dev-Plant 35: 115-121. Doležel J, Binarová P, Lucretti S (1989) Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry. Biol Plant 31: 113-120. Duncan DB (1955) Multiple range and multiple F tests. Biometrics 11(1): 1-42. Harbard JL, Griff in AR, Foster S, Brooker C, Kha LD, Koutoulis A (2012) Production of colchicine- induced autotetraploids as a basis for sterility breeding in Acacia mangium Willd. Forestry 85: 427-436. He CN, Wang CL, Guo SX, Yang JS, Xiao PG (2006) A novel flavonoid glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. J Integrat Plant Biol 48(3): 359-363. Josephine UA, Chimezie E, Bosa EO (2015) Effect of oryzalin treatments on polyploidy induction, phenotypic and quantitative traits Zehneria capillacea (Shumach.) C. Jeffrey. Inter J Trop Agr 33(3): 2067-2073. Lam HK, Harbard JL, Koutoulis A (2014) Tetraploid induction of Acacia crassicarpa using colchicine and oryzalin. J Tro For Sci 26(3): 347-354. Lâm Ngọc Phương, Nguyễn Kim Hằng (2010) Tạo cây dưa hấu tứ bội bằng xử lý colchicine in vitro. Tạp chí Khoa học (Trường Đại học Cần Thơ) 16a: 234-244. Lê Duy Thành (2001) Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 67-97. Liang WL, Chen RC, Chiang YJ, Su CH, Yang LL, Yen KL (1990) Study of Anoectochilus species. I. Study on the physiological activities of Jin-Sian- Lian. Formosan Sci 43: 47-58. Lin CC, Huang PC, Lin JM (2000) Antioxidant and hepatoprotective effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum. Amer J Clin Med 28(1): 87-96. Lin CC, Namba T (1981a) Pharmacognostical studies on the crude drugs of Orchidaceae from Taiwan (VI) on “kim soan lian” (1). Shoyakugaku Zasshi 35: 262-271. Lin CC, Namba T (1981b) Pharmacognostical studies on the crude drugs of Orchidaceae from Taiwan (VII) on “kim soan lian” (2). Shoyakugaku Zasshi 35: 272-286. Liu G, Li Z, Bao M (2007) Colchicine induction chromosome doubling in Platanus acerifolia and its effect on plant morphology. Euphytica 157: 145-154. Liu ZL, Liu Q, Xiao B, Zhou J, Zhang JG, Ya Li (2013) The vascular protective properties of kinsenoside isolated from Anoectochilus roxburghii under high glucose condition. Fitoterapia 86: 163-170. Madon M, Clyde MM, Hashim H, Mohd YY, Mat H, Saratha S (2005) Polyploidy induction of oil palm through colchicine and oryzalin treatments. J Oil Palm Res 17: 110-123. Meenakshi D, Ram AS, Ved PG, Sumer SP (2014) Cytomorphological investigations in colchicine- induced polyploids of Lablab purpureus (L.) Sweet. Ind J Biotech 13: 347-355. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Thanh Phương, Hồ Thị Thu Thanh, Lê Hải Hà, Nguyễn Thị Hân (2014) Tạo dòng cẩm chướng (Dianthus chinensis) đa bội bằng xử lý colchicine in vitro. Tạp chí Khoa học và Phát triển 12(8): 1322-1330. Parson S, Benchamas S (2001) Some chemical treatments on Kluai Khai through tissue culture for mutation breeding. Nat Sci 35: 231-241. Premjet S, Premjet D (2016) Induction of mutation in Jatropha curcas L by treatment with mitotic inhibitors. Aus J Bas Appl Sci 10(6): 77-85. Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 103-116, 2020 115 Russell G (2004) Stomatal guard cell measurements using leaf prints. CSA J 4: 137-139. Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50: 199-204. Stanys V, Weckman A, Staniene G (2003) Polyploidization of Japanese quince plants (Chaenomeles japonica), In: Japanese quince - potential fruit crop for northern Europe, Stanys V, Weckman A, Staniene G (Eds), 19-28 pp. Suthana K, Thunya T, Anchaya M, Shermarl W (2012) Effect of colchicine on increasing pollen viability in a Curcuma hybrid (Curcuma sparganifolia × C. parvifl ora). Nat Sci 46: 363-370. Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Thanh Tùng, Trần Công Luận, Dương Tấn Nhựt (2017) Ảnh hưởng của thể tích và điều kiện thoáng khí trong nuôi cấy in vitro và định tính adenosine trong cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 307-317. Vũ Quốc Luận, Trần Đình Phương, Trần Công Luận, Dương Tấn Nhựt (2015) Vi nhân giống và định tính hoạt chất β–sitosterol trên cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(4): 1113-1125. Wang LF, Huang J, Lin X (2010) Polyploidy in Anoectochilus roxburghii induced by colchicine in vitro. Acta Agr Zhejiangensis 22(6): 760-763. Witayaporn P, Kanchit T, Ngarmnij C, Nathinee P (2015) Alteration of Spathoglottis eburnea Gagnep. Ploidy level after colchicine treatments. Walailak J Sci Technal 12: 1-15. Wu HZ, Zheng S, He Y, Yan G, Bi Y, Zhu Y (2007) Diploid female gametes induced by colchicine in oriental Lilies. Sci Hort 114: 50-53. Yang N, Rong E, Li Q, Dong J, Du T, Zhao X, Wu Y (2015) Tetraploid induction and identification of Gossypium arboretum. Agr Sci 6: 436-444. Ye S, Shao Q, Zhang A (2017) Anoectochilus roxburghii: A review of its phytochemistry, pharmacology, and clinical applications. J Ethnopharmacol 209: 184-202. Zhang FS, Yali LV, Zhao Y, Guo SX (2013) Promoting role of an endophyte on the growth and contents of kinsenosides and flavonoids of Anoectochilus formosanus Hayata, a rare and threatened medicinal orchidaceae plant. J Zhejiang Univ-Sci B 14(9):785-792. EFFECT OF COLCHICINE AND ORYZALIN TREATMENT ON POLYPLOID INDUCTION AND MORPHOGENESIS OF Anoectochilus setaceus Blume CULTURED IN VITRO Vu Quoc Luan1, Do Thị Thuy Tam1, Nguyen Phuc Huy1, Hoang Thanh Tung1, Vu Thi Hien1, Do Manh Cuong1, Bui Van The Vinh2, Duong Tan Nhut1 1Tay Nguyen Institute of Scientific Research, Vietnam Academy of Science and Technology
 2Ho Chi Minh City Univeristy of Technology (HUTECH) SUMMARY Jewel orchid (Anoectochilus setaceus Blume) is one of the important medicinal plants used for many common diseases treatment such as hypertension, diabetes, and heart, liver and lung diseases, as well as improving the health in general. Polyploid induction using colchicine and oryzalin has been widely performed in various types of crops and could be considered a valuable tool for plant breeding. In the present study, in vitro young shoots of A. setaceus Blume (1 cm in height) were treated with different concentrations of colchicine (0, 1, 2, 4, 6, 8, and 10 µM) and oryzalin (0, 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µM) at different durations (0, 12, 24, 36, and 48 h). The results showed that shoots with length of treatment from 24 to 48 h and the concentrations from 2 to 10 µM of colchicine and from 40 to 100 µM of oryzalin appeared morphological differences (10.00% - 16.00%) but the tendency to return to normal of these shoots after several times of sub-culture was Vũ Quốc Luận et al. 116 observed. Stomatal length had a close correlation with the level of ploidy. Diploid plantlets (2n = 2x) had the average stomatal length of 33.50 µm when observed under an optical microscope at 100x magnification and corresponding to the peak at 70 FL in flow cytometric DNA histogram. In all identified polyploid plantlets, the stomatal lengths were greater than 40.12 µm. Moreover, flow cytometric analysis indicated that plantlets with stomatal lengths ranged from 40.12 to 50.00 µm were diploid-tetraploid mosaicisms represented by two separate peaks at 70 FL and 90 FL. Finally, samples treated with 4, 6, and 8 µM colchicine with treatment time of 48 h, and 60 µM oryzalin with treatment time of 24 h that had stomatal lengths ranged from 52.03 to 71.25 µm were determined to be tetraploid (2n = 4x) represented by a peak at 120 FL position. Keywords: Anoectochilus, morphogenesis, polyploid induction, stomata, tetraploid