Ảnh hưởng của ethyl methanesulfonate và tia cực tím đến sự hình thành biến dị soma in vitro của cây hoa cúc

18 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 ẢNH HƯỞNG CỦA ETHYL METHANESULFONATE VÀ TIA CỰC TÍM ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH BIẾN DỊ SOMA IN VITRO CỦA CÂY HOA CÚC Nguyễn Thị Mỹ Diên1, Lê Công Hùng1, Hoàng Thị Thúy1 TÓM TẮT Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý Ethyl methanesulfonate (EMS) và tia cực tím (UV) đến khả năng tạo dòng biến dị in vitro, đồng thời đánh giá sinh trưởng, phát triển và biến dị của các dòng biến dị này trên loài cúc vàng (Chrysanthemum indicum) nhằm tạo nguồn nguyên liệu phong phú cho công tác chọn tạo giống hoa cúc mới. Trong nghiên cứu này, các chồi cúc in vitro được cắt bỏ lá, được cắt thành các mẫu có kích thước 1,0 - 1,5 (cm) mang một mắt ngủ đem ngâm vào môi trường xử lý MS lỏng có bổ sung 0,1mg/1BA và EMS vô trùng với các nồng độ khác nhau (từ 0,1% đến 0,3%) và xử lý bằng tia UV có cường độ 125 μW/cm2 ứng với bước sóng 253nm với trong 8 giờ. Kết quả cho thấy, trong điều kiện in vitro thu được tỷ lệ chồi biến dị hình thái cao nhất ở công thức 2 (EMS 0,1% + UV), tỷ lệ biến dị đạt 20% chiều cao cây, số lá và khả năng ra rễ của các dòng cúc giảm dần khi tăng nồng độ xử lý EMS. Sự sinh trưởng, phát triển của các dòng cúc ở vườn trồng cũng có sự khác nhau, chiều cao cây của các dòng đối chứng tốt hơn, trong khi đó chiều cao cây của dòng M2 là thấp nhất. Một số dạng biến dị có lợi về hình thái thân lá và hình thái hoa đã được quan sát thấy ở dòng M2 (EMS 0,10% + UV), dòng M6 (EMS 0,30% + UV). Các biến dị này có tiềm năng cho công tác chọn tạo giống hoa cúc mới. Từ khóa: Ảnh hưởng, cúc vàng, biến dị, Ethyl methanesulfonate (EMS), tia UV 1 Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa cúc là một loại hoa đẹp với nhiều màu sắc khác nhau. Đối với các nước trên thế giới cũng như Việt Nam thì hoa cúc luôn là loại hoa phù hợp với phần đông thị hiếu của người dân. Hiện trên thế giới có  1500 giống hoa cúc  nhưng tại Việt Nam không phải giống nào cũng phát triển mạnh và có hoa đẹp cho người chơi hoa. Bởi vậy, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các phương pháp chọn, tạo nhân giống hoa cúc nhằm tạo đa dạng các giống hoa, phục vụ nhu cầu thẩm mỹ ngày càng cao của thị trường, cũng như tăng lựa chọn, thu nhập cho người trồng hoa. Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng. Ở Việt Nam và trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu riêng rẽ dùng hóa chất EMS và các tia phóng xạ như tia X, tia Gamma, tia UV- C,... để gây đột biến nhân tạo đã được công bố (Đào Thanh Bằng và ctv., 2006). Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về ứng dụng tạo đột biến như ảnh hưởng của xử lý Ethyl methane sulphonate in vitro đối với cây cẩm chướng (Nguyễn Thị Lý Anh và ctv., 2009), ảnh hưởng của xử lý đột biến in vitro bằng Ethyl methane sulfonate kết hợp chiếu xạ tia gamma đến sự biến dị ở cây hoa cẩm chướng (Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh, 2013), ảnh hưởng của loại mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái sinh chồi cây hoa cúc (Nguyễn Bá Nam và ctv., 2012). Trên thế giới, các công trình nghiên cứu sử dụng UV để tạo dòng biến dị còn ít như tạo biến dị sô ma từ mô sẹo khoai tây gây ra bởi bức xạ UV-C (Ehsanpour, 2007), đánh giá đa dạng di truyền của bốn giống hoa cúc nhỏ sử dụng RAPD (Chattejee et al., 2005), ảnh hưởng của bức xạ cực tím đến sự biến động sô ma ở cây khoai tây (Iuliana and Cerasela, 2014), ảnh hưởng của tia X và gamma đối với quá trình tạo chồi trong chậu của hoa cẩm chướng (Jerzy and Zalewska, 2000),... nhưng việc sử dụng kết hợp cả hai tác nhân là tia UV và hóa chất EMS làm gia tăng hiệu quả gây đột biến thì chưa được đề cập. Trong khuôn khổ bài báo này, nhóm nghiên cứu lựa chọn hai tác nhân gây đột biến là hóa chất Ethyl methanesunfonate (EMS) và tia cực tím (UV) thực hiện trên đối tượng nghiên cứu là giống cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum) để gia tăng tần suất xuất hiện biến dị nhằm tạo nguồn nguyên liệu phong phú cho công tác chọn tạo giống hoa cúc mới. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Cây cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro 30 ngày tuổi do Trung tâm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang cung cấp. - Hóa chất đa lượng, vi lượng trong nuôi cấy mô (Xilong, Trung Quốc), đường sacharose (Biên Hòa, Việt nam), agar (Công ty Hải Long, Việt Nam), BA (Benzyl adenin purin), NAA (Merk, Đức) được sử dụng trong môi trường Murashige và Skoog (1962). Phân bón đầu trâu (NPK - 14 : 14 : 14) (Bình Điền, Việt Nam). 19 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tạo dòng in vitro ở cây cúc vàng bằng EMS và UV Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mẫu ban đầu là đốt thân cây cúc vàng in vitro (30 ngày tuổi) kích thước 1 - 1,5 cm được đảo đều trong dung dịch EMS với 7 nồng độ riêng rẽ (tương ứng với 7 công thức thí nghiệm được ký hiệu từ CT 1 - CT 7): 0,0; 005; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 và 0,3 (%). Sau đó, mẫu được thấm khô và cấy lên môi trường tái sinh và nhân nhanh (môi trường MS cơ bản + 30 g/l đường saccharose + 100 ml/l nước dừa + 100 mg/l myo inositol + 0,1 mg/l BA, pH = 5,8) (Murashige and Skoog, 1962). Chiếu tia UV cường độ 125 μw/cm2 (~bước sóng 253 nm) liên tục trong 8 giờ. Theo dõi các chỉ tiêu: tỷ lệ sống (%), tỷ lệ bật chồi (%), tỷ lệ biến dị (%), chiều cao chồi (cm), số lá (lá/chồi), hệ số nhân nhanh sau 4 tuần nuôi cấy. 2.2.2. Đánh giá sinh trưởng, phát triển của một số dòng cây hoa cúc vàng Các chồi cúc thu được ở thí nghiệm 1 cho ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh (môi trường MS cơ bản + 30 g/l đường saccharose + NAA 0,1 mg/l, pH = 5,8), cây in vitro được huấn luyện ngoài vườn ươm và chăm sóc theo hướng dẫn kỹ thuật (Viện Nghiên cứu Rau Quả, 2017). Theo dõi các chỉ tiêu tỷ lệ sống (%), tỷ lệ biến dị (%), số nhánh/cây (sau 3 tháng), chiều cao cây tối đa (sau 3 tháng), số lá/cây (sau 3 tháng), thời gian ra hoa (ngày), tỷ lệ hoa biến dị (%), đường kính hoa (cm), độ bền hoa cắt (ngày). 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và IRRISTAT 4.0. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 5 năm 2018 đến tháng 5 năm 2019. Các thí nghiệm thực hiện trong phòng thí nghiệm, ruộng thí nghiệm tại Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo dòng in vitro ở cây cúc vàng bằng EMS và UV Kết quả được thể hiện ở bảng 1 cho thấy khi tăng nồng độ EMS xử lý thì tỷ lệ mẫu sống và tỉ lệ mẫu bật chồi cúc giảm dần. Ở công thức xử lý bằng (EMS 0,30% + UV) có tỷ lệ mẫu sống và bật chồi thấp nhất, chỉ đạt tương ứng 66,67 và 63,33 (%). Bên cạnh đó, tỷ lệ xuất hiện các chồi cúc biến đổi hình thái lại tăng dần khi tăng nồng độ xử lý EMS, ngoại trừ công thức xử lý bằng (EMS 0,10% + UV) có tỷ lệ biến dị cao nhất đạt 20% và công thức xử lý bằng (EMS 0,20% + UV) có tỷ lệ chồi biến dị là 10%; ở 2 công thức này xuất hiện nhiều lá nhỏ (Hình 1). Tỷ lệ biến dị cao là cần thiết để tạo nguyên liệu cho chọn lọc dòng in vitro. Về chỉ tiêu chiều cao trung bình chồi, số lá/chồi và hệ số nhân nhanh ở các công thức xử lý bằng EMS và UV đều thấp hơn so với công thức đối chứng. Bảng 1. Một số chỉ tiêu tái sinh chồi biến dị từ chồi cây hoa cúc in vitro sau xử lý EMS kết hợp tia UV (sau 4 tuần nuôi cấy) Công thức Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Tỷ lệ biến dị (%) 4 tuần sau cấy chuyển Chiều cao (cm) Số lá (lá) Hệ số nhân nhanh CT1 (ĐC) 100,00 100,00 0,00 4,76 5,70 1,36 CT2 (EMS 0,05% + UV) 90,00 86,67 3,33 3,40 5,40 1,23 CT3 (EMS 0,10% +UV) 83,33 80,00 20,00 2,93 5,03 1,26 CT4 (EMS 0,15% +UV) 80,00 76,67 6,67 3,60 5,26 1,16 CT5 (EMS 0,20% +UV) 76,67 70,00 10,00 3,60 5,60 1,23 CT6 (EMS 0,25% +UV) 73,33 66,67 13,33 3,76 5,33 1,30 CT7 (EMS 0,30% +UV) 66,67 63,33 16,67 3,13 5,20 1,13 CV (%) 3,20 2,30 5,30 LSD0,05 0,20 0,21 0,11 20 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Hình 1. Biến dị hình thái thu được sau xử lý chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro EMS kết hợp tia UV Dạng chồi biến dị thân, lá nhỏ, màu sắc lá nhạt hơn xuất hiện ở công thức 3 (EMS 0,10% + UV) Dạng chồi biến dị tăng chiều cao, số lá xuất hiện ở công thức 5 (EMS 0,20% + UV) 3.2. Đánh giá sinh trưởng, phát triển của một số dòng cây hoa cúc vàng Kết quả theo dõi tỷ lệ sống, các dạng biến dị hình thái, động thái tăng trưởng chiều cao, số lá, số nhánh/cây sau 3 tháng sinh trưởng được thể hiện qua bảng 2 và bảng 3. Kết quả được thể hiện ở bảng 2 cho thấy, sau khi đã qua giai đoạn thích ứng vườn ươm, bộ rễ cây được ổn định, khi đưa ra vườn trồng, cây có thể hút nước và dinh dưỡng thuận lợi hơn. Vì vậy, ngoài tỷ lệ sống cao, các dòng cúc đã thể hiện sự tăng trưởng chiều cao, số lá, số nhánh qua các lần theo dõi, cụ thể chiều cao cây tối đa đạt từ 50,12 cm ở dòng M2 (EMS 0,10% + UV) đến 63,20 cm ở dòng M0 (ĐC), số lá tối đa đạt từ 19,75 ở dòng M2 (EMS 0,10% + UV) đến 22,84 ở dòng M0 (ĐC), số nhánh tối đa đạt từ 2,42 ở dòng M5 (EMS 0,25% + UV) đến 3,56 ở dòng M0 (ĐC). Tương tự, giai đoạn tạo dòng in vitro, tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị ở dòng đối chứng M0 là thấp nhất (0,0%), tỷ lệ này tăng dần tỷ lệ thuận với nồng độ xử lý EMS, ngoại trừ dòng M2 (EMS 0,10% + UV), tỷ lệ biến dị là 18,5%. Kết quả này cho thấy dòng M2 (EMS 0,10% + UV) cho hiệu quả gây biến dị hình thái cao nhất. Tỷ lệ biến dị cao là cần thiết để tạo nguyên liệu cho chọn tạo giống cúc mới. Bảng 2. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sự biến dị của một số dòng cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý kết hợp EMS và tia cực tím (UV) in vitro trong điều kiện vườn trồng Công thức Dòng cúc Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ biến dị (%) Số nhánh cuối cùng (tháng thứ 3) Chiều cao cuối cùng (tháng thứ 3) Số lá cuối cùng (tháng thứ 3) EMS 0,0% + UV M0 100,0 0,0 3,56 63,20 22,84 EMS 0,05% + UV M1 92,5 7,4 3,48 61,84 21,56 EMS 0,10% + UV M2 85,1 18,5 3,02 50,12 19,75 EMS 0,15% + UV M3 90,7 9,2 3,50 61,00 21,22 EMS 0,20% + UV M4 83,3 11,1 3,52 62,41 21,90 EMS 0,25% + UV M5 81,4 12,9 2,42 60,84 20,73 EMS 0,30% + UV M6 79,6 16,7 3,25 60,00 20,26 LSD0,05 0,27 0,43 0,10 CV (%) 6,50 7,60 4,10 Kết quả được thể hiện ở bảng 3 cho thấy sau trồng khoảng 80 ngày, ở các dòng được xử lý bằng EMS + UV đều ra hoa sớm so với dòng đối chứng M0, cụ thể thời gian ra hoa ở các dòng được xử lý dao động từ 70 đến 85 ngày sau trồng, còn ở dòng đối chứng M0 thời gian ra hoa là 90 ngày sau trồng. Đường kính hoa trung bình dao động từ 5,3 cm ở công thức M2 (EMS 0,10% + UV) đến 6,2 cm ở công UV+0.10% ĐC ĐC UV+0.20% 21 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 thức M0 (ĐC). Độ bền hoa cắt dao động từ 10 ngày ở dòng M2 (EMS 0,10% + UV) đến 11,8 ngày ở dòng M0 (ĐC). Ngoài ra, trong quá trình theo dõi chúng tôi có phát hiện một số biến dị đáng quan tâm: Hoa có kích thước nhị lớn và hoa tiêu biến nhị ở dòng M2 (EMS 0,10% + UV), cấu trúc hoa thay đổi ở dòng M6 (EMS 0,30% + UV). Bảng 3. Đặc điểm ra hoa của một số dòng cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS kết hợp tia cực tím (UV) in vitro trong điều kiện vườn trồng Công thức Dòng cúc Thời gian ra hoa (ngày sau trồng) Tỷ lệ hoa biến dị (%) Đường kính hoa (cm) Độ bền hoa cắt (ngày sau cắt) EMS 0,0% + UV M0 90 0,0 6,2 11,8 EMS 0,05% + UV M1 85 3,7 6,0 11,2 EMS 0,10% + UV M2 70 14,8 5,3 10,0 EMS 0,15% + UV M3 86 7,4 5,88 11,0 EMS 0,20% + UV M4 85 9,2 5,88 11,0 EMS 0,25% + UV M5 84 14,8 5,69 10,8 EMS 0,30% + UV M6 83 18,5 5,69 11,0 Hình 3. Một số dạng biến dị hình thái thân lá, hoa thu được của các dòng cúc vàng sau xử lý EMS và UV in vitro Hoa bình thường ở dòng M0 Hoa có cấu trúc thay đổi ở dòng M6 (EMS 0,3% + UV) Dạng hoa tiêu biến nhị ở dòng M2 (EMS 0,1% +UV) Biến dị hình thái lá ở dòng M6 (EMS 0,3% + UV) Hoa có kích thước nhị lớn ở dòng M2 (EMS 0,1% + UV) Biến dị hình thái lá ở dòng M6 (EMS 0,3% + UV) IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Xử lý kết hợp EMS và tia UV có khả năng tạo biến dị in vitro từ chồi của cúc vàng (Chrysanthemum indicum), công thức xử lý EMS + UV 0,10% có tỷ lệ biến dị hình thái cao nhất (20,0%). Chồi in vitro tái sinh có đặc điểm chậm ra rễ, giảm chiều cao, giảm số lá/chồi, giảm số rễ/chồi, giảm chiều dài rễ so với các chỉ tiêu này ở dòng cúc đối chứng. 22 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Sự sai khác về sinh trưởng, phát triển của các dòng cúc được tiếp tục thể hiện ở vườn trồng: Dòng cúc M0 (ĐC) có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh nhất, dòng M2 (EMS 0,1% + UV) có chiều cao trung bình thấp nhất. Khi phân lập biến dị về hình thái thân, lá và hoa ở giai đoạn vườn trồng cho thấy: Các dạng biến dị có tiềm năng cho công tác chọn tạo giống cúc mới chủ yếu xuất hiện ở dòng M2 (EMS 0,10% + UV), dòng M6 (EMS 0,30% + UV), dạng hoa tiêu biến nhị, và hoa có cấu trúc nhị lớn, chiều cao cây thấp. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà và Vũ Hoàng Hiệp, 2009. Ảnh hưởng của xử lý Ethyl methane sulphonate in vitro đối với cây cẩm chướng. Tạp chí Khoa học và phát triển, 7 (2): 130-136. Đào Thanh Bằng, Nguyễn Hữu Đống và Trần Duy Quý, 2006. Thành tựu và triển vọng của việc ứng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến trong công tác chọn giống cây trồng. Viện Di truyền Nông nghiệp - 20 năm (1984 - 2004) xây dựng và phát triển. NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 17-32. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh, 2013. Ảnh hưởng của xử lý đột biến in vitro bằng Ethyl methane sulfonate kết hợp chiếu xạ tia gamma đến sự biến dị ở cây hoa cẩm chướng. Trong Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 9/2013. NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tr. 817-821. Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Đình Lâm, Dương Tấn Nhựt, 2012. Ảnh hưởng của loại mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái sinh chồi cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat. cv. “Jimba”) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (6): 595-606. Viện Nghiên cứu Rau quả, 2017. Quy trình kỹ thuật trồng và chăm sóc hoa cúc (chrysanthemum sp.). Địa chỉ: quy-trinh-ky-thuat-trong-va-cham-soc-hoa-cuc- chrysanthemum-sp. Chattejee. A.K.A., Madal. S.A., Ranade. S.K., Datta, 2005. Estimation of genetic diversity of four Chrysanthemum mini cultivars using RAPD. Pakistan Journal of Biotechnology Sciences, 8 (4): 546-549. Ehsanpour, 2007. Detection of somaclonal variation in potato callus induced by UV-C radiation using RAPD-PCR. Gen. Appl. Plant Physiology, 33 (1-2): 3-11. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15 (3): 473-479. Iuliana C., Cerasela P., 2014. The effect of the ultraviolet radiation on the somaclonal variability for Solanum tuberosum. Rom Biotechnol Lett, 19 (3): 9339-9344. Jerzy, M., Zalewska, M., 2000. Effect of X and Gamma rays on in vitro adventitious bud production of pot carnation, Revista Chapingo. Serie Horticultura, 6 (1): 49-52. Effects of ethyl methanesulfonate and ultraviolet radiation on formation of in vitro somaclonal variation of chrysanthemum indicum Nguyen Thi My Dien, Le Cong Hung, Hoang Thi Thuy Abstract This paper presents the study on the effect of ethyl methanesulfonate (EMS) and ultraviolet (UV) radiation treatment on the in vitro variation and also assesses the growth, development and variation of these lines of Chrysanthemum indicum to produce an abundant material sources for selection of new cultivars. In this experiment, the segments without leaves from the in vitro shoots were used as explants of 1 - 1.5 cm in length and contained a bud. These explants were immersed in liquid MS supplemented with 0.1 mg/1BA and sterilized EMS with different concentrations from 0.1% to 0.3% and then treated by UV with intensity of 125μW/cm2 corresponding to 253 nm wavelength in 8 hours. The results showed the treament 2 (EMS 0.10% + UV) had the highest proportion of variant buds, the rate of variation reached 20% in in vitro conditions. The shoot height, the number of leaves and the rooting ability of the Chrysanthemum indicum lines decreased correspondingly with the increasing concentration of EMS. The growth and development of these Chrysanthemum indicum lines in nurseries were also different, the height of plant in M0 lines (the control) was better than that in the others treaments while the height plant of M2 line was lowest. Several morphological variant traits of leaf and flower were obsered in M2 line (EMS 0.10% + UV) and M6 line (EMS 0.30% + UV). These variant materials are potential for selection and breeding of new Chrysanthemum cultivars. Keywords: effect, Chrysanthemum indicum, variation, Ethyl methanesulfonate (EMS), ultraviolet (UV) Ngày nhận bài: 15/11/2019 Ngày phản biện: 12/12/2019 Người phản biện: TS. La Việt Hồng Ngày duyệt đăng: 13/01/2020