Kết quả của công trình nghiên cứu cho
thấy đa số các mẫu huyết thanh được gửi đến
xét nghiệm định lượng HCV-RNA là thuộc
genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% còn lại
phân phối vào các genotype khác như
genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype
2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b (1%),
genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b (<1%).
Chúng tôi không cho rằng tỷ lệ này phản ánh
thật sự đúng tần số lưu hành các genotype
HCV trong các người nhiễm HCV tại Việt
Nam mà chỉ nói lên được tần số genotype
trong các bệnh nhân sắp, đang và đã điều trị
đặc hiệu bệnh viêm gan mạn tính do HCV.
Chính trên đối tượng nghiên cứu này nên
chúng ta thấy tỷ lệ genotype 1b (là genotype
đáp ứng kém với điều trị đặc hiệu) là đến 55%
với đa số có giá trị định lượng HCV-RNA khá
cao (từ 100.000 đến 10.000.000 copies/ml).
Có một số nhà nghiên cứu cho là nếu định
genotype bằng giải trình tự vùng 5’-NC sẽ
không cho kết quả chính xác mà phải giải trình
tự vùng NS5B trên bộ gen của HCV. Sở dĩ các
nhà nghiên cứu này quan niệm như vậy vì đã
có một số y văn trên thế giới chứng minh là
nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ
có thể phân biệt được các subtype tốt hơn là
dựa trên vùng 5’-NC(7), cũng như là phân biệt
được type 6 với subtype 1b(4) hay 1a và 1b
chính xác hơn(3). Tuy nhiên các nghiên cứu như
vậy hãy còn khá ít, và kết quả chính xác hay
không lại còn tùy thuộc vào thư viện gen mà
chúng ta dùng để phân tích trình tự giải
được(19). Ngoài ra, dù hiện nay đã có nhiều cải
thiện trong thử nghiệm RT-PCR phát hiện
HCV dựa trên vùng NS5B, nhưng hãy còn
kém nhạy cảm xa so với thử nghiệm trên vùng
5’-NC, do vậy quan niệm được nhiều người
thừa nhận nhất hiện nay là: định genotype dựa
trên giải trình tự vùng 5’-NC vẫn là thích hợp
và hữu dụng nhất cho lâm sàng vì độ nhạy
cảm cao, còn vùng NS5B chỉ nên dùng cho các
nghiên cứu dịch tễ học về sự phân bố các
genotype HCV vì khả năng phân biệt các
subtype cao(7,2,15).
8 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 07/02/2022 | Lượt xem: 79 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phầm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 242
ÁP DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR
THU NHẬN ĐƯỢC TỪ THỬ NGHIỆM RT REAL-TIME PCR
VÙNG 5’-NC ĐỂ LÀM XÉT NGHIỆM ĐỊNH KIỂU GEN HCV
Nguyễn Thanh Bảo*, Phạm Hùng Vân*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype là xét nghiệm mà các bác sĩ lâm sàng cần xác định trước khi
bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để có thể quyết định thời gian điều trị. Có nhiều phương pháp để xác
định genotype HCV, tuy nhiên tiêu chuẩn nhất và hữu dụng lâm sàng nhất vẫn là giải trình tự vùng 5’-
NC.
Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại một
đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút ra các kinh nghiệm chủ yếu.
Vật liệu và phương pháp: Các mẫu huyết thanh sau khi thu thập sẽ được tách chiết RNA cùng với
RNA chứng nội tại được cho vào mẫu và tổng hợp thành cDNA từ dịch ly trích này. Thực hiện phản ứng
real-time PCR dùng mồi và các đoạn dò Taqman đặc hiệu định lượng HCV có trong mẫu ban đầu. Tiến
hành giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại này, so sánh với ngân hàng gene để định các subtype của
HCV. Phân tích các kết quả và rút các kinh nghiệm chủ yếu.
Kết quả: Từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2008, tác giả đã áp dụng kỹ thuật này để định kiểu gene HCV
cho 2000 trường hợp với kết quả ghi nhận được: 58% thuộc subtype 1b, 8% thuộc subtype 1a, 5% thuộc
subtype 1c, 10% thuộc subtype 2a, 0,4% thuộc subtype 2b và 17% thuộc subtype 6a.
Kết luận: Từ kết quả trên chúng ta nhận thấy các bệnh nhân nhiễm HCV ở Việt Nam hầu hết đều tập
trung vào subtype 1b và 6a. Trong nghiên cứu này, tác giả đã đưa ra được kỹ thuật tốt nhất để vừa định
lượng, vừa định type trên cùng một sản phẩm khuếch đại có chứa hỗn hợp DNA đích và DNA chứng nội
tại, đồng thời chứa cả hệ thống chống ngoại nhiễm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng của xét
nghiệm. Một ưu điểm nữa của phương pháp giải trình tự là có thể cho kết quả phân biệt được từng loại
subtype trong khi các phương pháp khác sẽ có một tỉ lệ không cho subtype hay thậm chí không phân biệt
được subtype.
ABSTRACT
APPLY THE DIRECT SEQUENCING OF THE QPCR PRODUCTS
TO DO THE HCV GENOTYPING.
Nguyen Thanh Bao, Pham Hung Van
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 243 - 248
Background: HCV genotyping is one of the testing that the physicians need to indicate before dicide the specific
treatment on the HCV infected patients. There are many methods for HCV genotyping, however, the most effective
and sensitive is the direct sequencing of the PCR product specific the 5’-NC of the virus.
Objective: Set up the techniques for genotyping of HCV by direct sequencing the qPCR product
specific to 5’-NC of viral genome, and carry out the analysis of the results and the outcome experiences.
Materials and methods: The collected patients sera were added with the RNA-internal control and
then were extracted the total RNA which were carried out the cDNA synthesis. The qPCR using specific
* Bộ môn Vi Sinh, Đại Học Y Dược TP. HCM
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 243
primers and taqman probes were done to quantify the RNA-HCV copies in the samples. The qPCR products
were sequenced and the collected sequences were aligned to the library of HCV genotype sequences to get the
results of HCV genotyping.
Results: From 1/2007 to 5/2008, authors applied these techniques on 2000 samples and the analysed
results revealed that: 58% were belong to subtype 1b, 8% belong to subtype 1a, 5% belong to subtype 1c,
10% belong to subtype 2a, 0.4% belong to subtype 2b and 17% belong to subtype 6a.
Conclusions: The received results demonstrated that most of the HCV infected patients in Viet Nam are
infected with genotype 1b and 6a. In this study, the authors have proved that this testing will not only do the
quantity but also do the genotyping of the HCV by direct sequencing of the qPCR products which contain the target
sequence DNA. Another advantage of this testing is the internal control products and build-in contamination
system did not influence to the sequencing results. Besides that, sequencing always results the subtype while other
methods will give a low ratio or even can not differentiate the subtype of HCV.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trước khi chỉ định điều trị đặc hiệu, xét
nghiệm định lượng và định kiểu gene virus
viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm là một
xét nghiệm tối cần thiết mà bác sĩ phải chỉ định
cho bệnh nhân(8). Phương pháp lai trên vạch
dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)(18) và
phương pháp giải trình tự với hệ thống giải
trình tự kín của Trugene(17) là hai phương pháp
được nhiều nhà lâm sàng chấp nhận để xác
định kiểu gene HCV dùng trong chẩn đoán.
Tuy nhiên, do giá thành khá cao nên xét
nghiệm xác định kiểu gene HCV chưa được
chỉ định rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu
hành HCV là khá cao trên thế giới (5 - 8%
người bình thường có nhiễm HCV)(16) và dĩ
nhiên nguy cơ dẫn đến một tỷ lệ khá cao bị xơ
gan và ung thư gan (4%)(1). Trong các nghiên
cứu trước đây, chúng tôi đã xây dựng thành
công kỹ thuật xác định kiểu gene HCV bằng
kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR định
lượng nhắm vào vùng 5’-NC. Nghiên cứu lần
này nhắm đến mục đích phân tích kết quả và
đúc kết các kinh nghiệm của việc triển khai xét
nghiệm này trên 2000 mẫu định kiểu gene
HCV được thực hiện vừa qua.
VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đây là nghiên cứu tiền cứu cắt ngang với
đối tượng là các mẫu huyết thanh được đã xác
định dương tính HCV qua xét nghiệm HCV-
RNA (+). Các mẫu này được nhiều phòng thí
nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí
nghiệm NK-Biotek với yêu cầu định lượng và
định kiểu gene HCV. Để phát hiện và định
lượng được HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử
dụng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR
(reverse transcriptase real-time PCR dùng
taqman probe) do công ty Nam Khoa sản xuất
theo các thuốc thử và qui trình đã được chúng
tôi nêu trong các nghiên cứu trước(12). Thử
nghiệm real-time PCR được thực hiện trên
máy IQ5 của Biorad. Sản phẩm real-time PCR
cho kết quả real-time PCR (+) được làm tinh
sạch để thu nhận sản phẩm PCR với bộ thử
nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR (PCR clean-
up kit) do Promega sản xuất (Cat. #A9281). Sản
phẩm PCR sau khi tinh sạch được điện di và
định lượng nồng độ DNA bằng máy
Gentquant của Pharmacia và sau này được
chúng tôi định lượng bằng điện di trên chíp
điện di và thiết bị điện di chip bio-analyzer
của Agilent. Sau đó, thực hiện phản ứng giải
trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch bằng kit
và thiết bị CEQ8000 của Becman Coulter và
sau này chúng tôi còn thực hiện thêm trên kit
và thiết bị ABI 3130XL. Kết quả giải trình tự
được lên NCBI blast qua internet để so sánh
với gene bank và lên local blast của phần mềm
miễn phí bio-edit để so sánh với thư viện HCV
genotype mà chúng tôi tự tạo để có được kết
quả genotype.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 244
KẾT QUẢ
Trong thời gian từ 17/01/07 đến 17/07/08,
có tất cả 2000 mẫu huyết thanh dương tính
HCV-RNA được làm xét nghiệm RT real-time
PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu 5’-
NC theo qui trình trên. Tất cả 2000 mẫu HCV-
RNA dương tính này cũng đã được chúng tôi
đồng thời xác định genotype của HCV bằng
giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của qui
trình qPCR trên. Kết quả định lượng tương
ứng với kết quả xác định genotype của 234
mẫu trong 2000 mẫu được chúng tôi phân tích
và trình bày trong bảng 1 cho thấy 100% các mẫu
cho kết quả phát hiện và định lượng dương tính
HCV-RNA đều cho được kết quả định được
genotype HCV dù kết quả định lượng có thấp
đến mức tối thiểu (là 445 copies/ml huyết thanh
trong nghiên cứu này). Kết quả này cho phép
nhận định là phương pháp định genotype
HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm
PCR của phản ứng real-time PCR dùng
taqman probe mà chúng tôi áp dụng đạt được
độ nhạy phát hiện tương đương độ nhạy phát
hiện của RT TQ real-time PCR.
Bảng 1: Kết quả định genotype so với kết quả
định lượng
Kết quả định
lượng copies/ml
Số
mẫu
Genotype(số mẫu)
100 – 999 1* 1b(1)
1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1)
10.000 – 99.999 57 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11)
100.000 –
999.999 123
1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1),
2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30)
1.000.000 –
9.999.999 37 1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4)
10.000.000 –
99.999.999 2
**
1(1), 1b(1)
Tổng cộng 234
1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2),
2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2),
2a/2c(2), 6a(46)
* Mẫu có kết quả định lượng thấp nhất là
445copies/ml huyết thanh. **mẫu cao nhất có kết
quả định lượng là 13.792.596 copies/ml.
Biểu đồ 1 dưới đây trình bày tỷ lệ phần
trăm các genotype HCV của 2000 mẫu huyết
thanh thử nghiệm. Kết quả cho thấy có đến
1.156 (57,8%) các mẫu là thuộc genotype 1b,
348 (17,4%) thuộc genotype 6a, 198 (9,9%)
genotype 2a, 156 (7,8%) genotype 1a, 108
(5,4%) genotype 1c, 24 (1,2%) genotype 6b, 8
(0,4%) genotype 2b.
Trong kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản
phẩm PCR, kết quả chỉ có thể tốt khi có sản
phẩm PCR thuần nhất, không bị các sản phẩm
phụ. Các kết quả điện di của sản phẩm PCR
sau khi tinh sạch rất là rõ nét, dù nồng độ
HCV trong một số mẫu là khá thấp. Điều này
chứng tỏ qui trình RT real-time PCR phát hiện
và định lượng HCV-RNA mà chúng tôi đang
áp dụng là tối ưu và hoàn chỉnh. Đa số các
trường hợp các trình tự giải được có chiều dài
phù hợp với chiều dài mà chúng tôi dự đoán,
là từ 190bp đến < 200bp.
BÀN LUẬN
Định genotype HCV bằng kỹ thuật giải
trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai
trên vạch của Bayer đều dựa trên một đoạn
nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’-NC. Đây là cả
hai phương pháp được FDA và y học chấp
nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm
sàng. Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn
phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều
trường hợp không thể phân biệt được các
subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không
cần thiết phải có thiết bị giải trình tự vốn được
xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt
kỹ thuật, do vậy InoLIPA có thể triển khai
thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 245
nghiệm lâm sàng nào có trang bị phương tiện
cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA phải
thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của
phản ứng nested PCR nên khả năng bị ngoại
nhiễm là khá cao và đây chính là lí do giải
thích được tại sao có khá nhiều trường hợp
InoLIPA có kết quả không thể xác định được
genotype(9,13). Để có thể khắc phục được nhược
điểm này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công
một qui trình thực hiện RT-PCR với PCR mix
cực kỳ nhạy cảm chỉ cần dùng mồi vòng trong
của HCV-InoLIPA và có thêm khả năng chống
được ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại nhờ
có chứa dUTP và UNG; và chính nhờ cải tiến
quan trọng, HCV-InoLIPA có khả năng áp
dụng được rộng rãi tại Việt Nam(13). Tuy vậy
khả năng triển khai sử dụng HCV-InoLIPA tại
Việt Nam cũng còn khá xa vời vì giá thành hãy
còn khá cao (#100USD/mẫu) so với điều kiện
kinh tế của nhiều bệnh nhân cũng như khả
năng tài chính của các bệnh viện hiện nay. Về
phương pháp giải trình tự của Trugene, các
nhà sản xuất khuyến cáo nên thực hiện trên
sản phẩm PCR của Roche Amplicor, và đây
chính là một trở ngại khá lớn vì giá thành của
Roche Amplicor dành cho HCV rất đắt (trên
120 USD/mẫu thử). Ngoài giá thành của Roche
Amplicor, các vật liệu tiêu hao khác đi kèm với
thử nghiệm giải trình tự cũng phải đến trên 60
USD nữa, do vậy giá thành của một thử
nghiệm genotype HCV bằng giải trình tự của
Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới 180
USD. Trong thời gian qua, chúng tôi đã nghiên
cứu thành công một bộ thử nghiệm RT-PCR
với PCR mix dùng cặp mồi hoàn toàn tương
thích với hệ thống Trugene nhờ vậy mà phòng
thí nghiệm không nhất thiết phải sử dụng
Roche Amplicor làm RT-PCR(13,6). Chính nhờ
áp dụng thành công này mà hiện nay giá xét
nghiệm HCV genotype tại trung tâm Medic
chỉ còn không qua 120 USD/một mẫu thử. Tuy
vậy, giá thành này cũng hãy còn khá cao để có
thể được chỉ định rộng rãi cho các bệnh nhân.
Ngoài ra, Trugene là một hệ thống hoàn toàn
kín, chỉ được dùng để đáp ứng yêu cầu định
genotype HCV của lâm sàng do vậy kết quả
chỉ có thể hiển thị được trên màn hình và in ra
giấy, do vậy nhà nghiên cứu không thể có
được kết quả trên một tập tin vi tính để có thể
làm blast search hay nghiên cứu phylogenetic.
Thư viện HCV là một thư viện được xây dựng
sẵn và người dùng có thể cập nhật thêm các
kết quả của mình (thực hiện trên chính máy
giải trình tự của Trugene) vào thư viện này,
nhưng không thể lấy thư viện này ra bên ngoài
cũng như không thể đăng nhập được một
trình tự có được từ các máy giải trình tự khác
để search trên thư viện này. Đây chính là một
bất tiện đặc biệt cho các nhà nghiên cứu khi
muốn nghiên cứu sâu thêm về HCV genotype
trên các kết quả có được từ các nguồn khác
nhau.
Phương pháp giải trình tự để định
genotype HCV do chúng tôi phát triển và trình
bày trong công trình nghiên cứu này được
thực hiện trên một trình tự dài không quá
200bp của một sản phẩm PCR dài khoảng 240-
250bp, kết quả từ thử nghiệm RT real-time
PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu một
đoạn đích tương tự của Trugene và InoLIPA
trên vùng 5’-NC. Chính điều này đảm bảo tính
chính xác của kết quả định genotype HCV do
chúng tôi phát triển không khác gì kết quả
định genotype bằng kỹ thuật giải trình tự của
Trugene vì đoạn trình tự đích của phương
pháp của chúng tôi và đoạn trình tự đích của
phương pháp Trugen gần như phù hợp nhau
hoàn toàn. Sở dĩ chúng tôi nghiên cứu thành
công được công trình này là nhờ chúng tôi có
được các thành công trong nghiên cứu thiết kế
được mồi để chế tạo bộ thử nghiệm RT-PCR
phát hiện HCV tương thích cho thử nghiệm
định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự
của Trugene(6,12,13). Ngoài ra, việc nghiên cứu
thành công bộ thử nghiệm RT real-time PCR
dùng mồi và taqman probe để phát hiện và
định lượng HCV-RNA trên một đoạn đích đến
240-250bp mà chúng tôi đã nghiên cứu và áp
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 246
dụng tại khá nhiều phòng thí nghiệm tại Việt
Nam(10) là một bước đi đột phá (phá vở qui luật
là real-time PCR dùng taqman probe chỉ cho
kết quả tối ưu khi sản phẩm khuếch đại không
quá 150bp, chứng minh qua các kết quả trình
bày trong biểu đồ 2-A) và chính nhờ vậy đã góp
nên một yếu tố rất quan trọng để giảm được
giá thành của xét nghiệm định genotype bằng
kỹ thuật giải trình tự này vì không cần thiết
phải thực hiện một RT-PCR để có sản phẩm
PCR dành riêng cho giải trình tự. Giá thành
định genotype HCV bao gồm cả định lượng
HCV-RNA hiện nay của chúng tôi có khả năng
sẽ không quá 50 USD/mẫu.
Kết quả của công trình nghiên cứu cho
thấy đa số các mẫu huyết thanh được gửi đến
xét nghiệm định lượng HCV-RNA là thuộc
genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% còn lại
phân phối vào các genotype khác như
genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype
2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b (1%),
genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b (<1%).
Chúng tôi không cho rằng tỷ lệ này phản ánh
thật sự đúng tần số lưu hành các genotype
HCV trong các người nhiễm HCV tại Việt
Nam mà chỉ nói lên được tần số genotype
trong các bệnh nhân sắp, đang và đã điều trị
đặc hiệu bệnh viêm gan mạn tính do HCV.
Chính trên đối tượng nghiên cứu này nên
chúng ta thấy tỷ lệ genotype 1b (là genotype
đáp ứng kém với điều trị đặc hiệu) là đến 55%
với đa số có giá trị định lượng HCV-RNA khá
cao (từ 100.000 đến 10.000.000 copies/ml).
Có một số nhà nghiên cứu cho là nếu định
genotype bằng giải trình tự vùng 5’-NC sẽ
không cho kết quả chính xác mà phải giải trình
tự vùng NS5B trên bộ gen của HCV. Sở dĩ các
nhà nghiên cứu này quan niệm như vậy vì đã
có một số y văn trên thế giới chứng minh là
nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ
có thể phân biệt được các subtype tốt hơn là
dựa trên vùng 5’-NC(7), cũng như là phân biệt
được type 6 với subtype 1b(4) hay 1a và 1b
chính xác hơn(3). Tuy nhiên các nghiên cứu như
vậy hãy còn khá ít, và kết quả chính xác hay
không lại còn tùy thuộc vào thư viện gen mà
chúng ta dùng để phân tích trình tự giải
được(19). Ngoài ra, dù hiện nay đã có nhiều cải
thiện trong thử nghiệm RT-PCR phát hiện
HCV dựa trên vùng NS5B, nhưng hãy còn
kém nhạy cảm xa so với thử nghiệm trên vùng
5’-NC, do vậy quan niệm được nhiều người
thừa nhận nhất hiện nay là: định genotype dựa
trên giải trình tự vùng 5’-NC vẫn là thích hợp
và hữu dụng nhất cho lâm sàng vì độ nhạy
cảm cao, còn vùng NS5B chỉ nên dùng cho các
nghiên cứu dịch tễ học về sự phân bố các
genotype HCV vì khả năng phân biệt các
subtype cao(7,2,15).
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp giải trình tự một đoạn
DNA đích dài dưới 200bp của sản phẩm PCR
kết quả từ thử nghiệm RT-PCR dùng mồi và
Taqman probe đặc hiệu vùng 5’-NC, chúng tôi
đã định được genotype của HCV trong huyết
thanh của bệnh nhân bị viêm gan mạn tính do
nhiễm HCV. Nghiên cứu này đã mở ra được
một khả năng ứng dụng rộng rãi không chỉ
nhờ giá thành xét nghiệm thấp giúp cho các
bác sĩ điều trị không ngần ngại khi cho chỉ
định xét nghiệm cho bệnh nhân, mà còn có thể
triển khai được tại nhiều phòng thí nghiệm
hiện đang có máy giải trình tự mà vẫn ít hay
chưa có hướng ứng dụng trong y học như thực
tế hiện nay chúng ta vẫn thường gặp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Alter MJ, Semin Liver Dis (1995). Management of
Hepatitis C NIH Consensus Statement 1997; March 24-
26:15(3).
2. Cantaloube J., Venault H., Zappitelli J., Gallian P., Touinssi
M., Attoui H., Biagini P., de Lamballerie X., de Micco P.. 2000.
Molecular analysis of HCV type 1 to 5 envelope gene:
application to investigations of posttransfusion transmission
of HCV. Transfusion 40: 712–717.
3. Chen Z, and Weck. KE. (2002). Hepatitis C virus
genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region
cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J. Clin.
Microbiol. 40:3127–3134.
4. Chinchai T., Labout J., Noppornpanth S., Theamboonlers
A., Haagmans BL., Osterhaus AD., and Poovorawan Y..
2003. Comparative study of different methods to genotype
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 247
hepatitis C virus type 6 variants. J. Virol. Methods
109:195–201.
5. Germer JJ, Rys PN, Thorvilson JN., and Persing DH..
(1999). Determination of hepatitis C virus genotype by
direct sequence analysis of products generated with the
Amplicor HCV test. J. Clin. Microbiol. 37:2625– 2630.
6. Ho Tan Dat (2005) Genotyping the Hepatitis C virus based
on the sequencing of the 5’ non – coding of the virus
genome The Viet Nam National Conference on laboratory
Medicine. 26-28 Oct. 2005
7. Laperche S, Lefrère JJ et al (2005). Comparison of Hepatitis
C Virus NS5b and 5’ Noncoding Gene Sequencing
Methods in a Multicenter Study. Journal of Clinical
Microbiology, 43(2); 733-739
8. National Institute of Health Consensus (2002).
Development Conference Statement: Management of
Hepatitis C: 2002 June 10-12. Final Statement Revisions
made September 12, 2002.
9. Nguyen Bao Toan (2005). HCV genotyping by LIPA kit
and by Trugene sequencer. Why we need and how we can
apply effectively and economically in the clinical
laboratory The Viet Nam National Conference on
laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005
10. Nguyen Thanh Tong (2005). The complete solution using
molecular biology tool kits for diagnosis and monitoring
HBV & HCV infection. ANCLS conference 26-28 Oct. 2005
11. Nguyễn Thanh Hảo và CS (2000). Genotýp virút viêm gan
C ở Việt Nam. Hội nghị chuyên đề bệnh gan mật. Hội gan
mật Hà Nội. Tháng 4/2000.
12. Phạm Hùng Vân et al. (2005). Direct sequencing the PCR
product for genotyping of HCV and HPV. Becman
Coulter’ s customer meeting in Singapore.
13. Phạm Hùng Vân et al. (2005). LiPA and Trugene HCV
genotyping system - Why we need it and how we can
apply it economically and effectively in the clinical
laboratories in Vietnam?. Bayer’s customer meeting in
TsingTao, China.
14. Sandres-Saune K., Deny P., Pasquier C., Thibaut V.,
Duverlie G., and Izopet J.. 2003. Determining hepatitis C
genotype by analyzing the sequence of the NS5b region. J.
Virol. Methods 109:187–193.
15. Tamalet C., Colson P., Tissot-Dupont H, Henry M.,
Tourres C., Tivoli N., Botta D., Ravaux I., Poizot-Martin I.,
and Yahi N.. 2003. Genomic and phylogenetic analysis of
hepatitis C virus isolates: a survey of 535 strains
circulating in southern France. J. Med. Virol. 71:391–398.
16. Trịnh Kim Ảnh và CS. Tình hình viêm gan virus B & C ở
bệnh viện Chợ Rẩy. Mạng y khoa net
17. Trugene HCV Genotyping Assay (Sequencing)
18. Versant HCV Genotyping Assay (LiPA)
19. Yao JDC. (2003). Evaluation of the TRUGENE HCV 5_NC
Genotyping Kit with the New GeneLibrarian Module 3.1.2 for
Genotyping of Hepatitis C Virus from Clinical Specimens.
Journal of clinical microbiology. 4855–4857
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 248
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Nội Khoa 249
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- ap_dung_ky_thuat_giai_trinh_tu_truc_tiep_san_pham_pcr_thu_nh.pdf