Bài giảng Các kỹ thuật chính của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1Ch−¬ng iii C¸c kü thuËt chÝnh cña c«ng nghÖ nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc vËt I.nh©n gièng v« tÝnh in vitro ( vi nh©n gièng c©y trång ) 21.Kh¸I niÖm chung Nh©n gièng v« tÝnh in vitro:
Lµ qu¸ tr×nh s¶n xuÊt mét l−îng lín c©y hoµn chØnh, tõ c¸c bé phËn, c¬ quan nh− chåi, m¾t ngñ, v¶ycñ, ®o¹n th©n, l¸,...cña c©y mÑ ban ®Çu th«ng qua kü thuËt nu«i cÊy in vitro. Nh©n nhanh in vitro ®−îc øng dông vµo:
Duy tr× vµ nh©n nhanh c¸c kiÓu gen quÝ lµm vËt liÖu cho c«ng t¸c gièng.
Nh©n nhanh c¸c loµi hoa, c©y c¶nh khã trång b»ng h¹t.
Duy tr× nh©n nhanh c¸c dßng bè mÑ vµ c¸c dßng lai ®Ó t¹o h¹t gièng c©y rau, c©y hoa vµ c©y trång kh¸c.
Nh©n nhanh kÕt hîp víi lµm s¹ch virus.
B¶o qu¶n nguån gen in vitro −u ®iÓm cña kü thuËt nh©n nhanh in vitro:
Ph−¬ng ph¸p cã hÖ sè nh©n rÊt cao vµ cho ra c¸c c¸ thÓ t−¬ng ®èi ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn
Cã thÓ nh©n gièng c©y trång ë qui m« c«ng nghiÖp (kÓ c¶ trªn c¸c ®èi t−îng khã nh©n b»ng ph−¬ng ph¸p th«ng th−êng)
DÔ dµng t¹o ®−îc c©y s¹ch virus
C¸c c©y sau nh©n in vitro cã xu h−íng ®−îc trÎ ho¸---->n©ng cao hiÖu qu¶ nh©n b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p th«ng th−êng sau ®ã 3H¹n chÕ cña kü thuËt nh©n nhanh in vitro:
Chi phÝ cao so víi c¸c ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh kh¸c nªn gi¸ thµnh kh«ng c¹nh tranh
Kh«ng ph¶i bÊt cø loµi c©y nµo còng cã thÓ vi nh©n gièng
Mét sè loµi c©y trång rÊt dÔ bÞ biÕn dÞ khi nh©n gièng in vitro 2.C¸c b−íc chÝnh trong nh©n v« tÝnh in vitro B−íc 0 lùa chän c©y mÑ Ra rÔ Giai ®o¹n v−ên −¬mB−íc 4 ChuyÓn ra m«i tr−êng tù nhiªn B−íc 2 Nh©n nhanh LÊy mÉu B−íc I Nu«i cÊy khëi ®éng ThÝch nghi Vi gi©m cµnh H×nh 27. C¸c b−íc trong nh©n c©y trång b»ng nu«i cÊy m« Nguån: Robert N. Trigiano Dennis J. Gray, 2000 B−íc 3 4B−íc 0: Chän läc vµ chuÈn bÞ c©y mÑ
Tr−íc khi tiÕn hµnh nh©n gièng in vitro cÇn chän läc cÈn thËn c¸c c©y mÑ (c©y cho nguån mÉu nu«i cÊy).
C¸c c©y nµy cÇn ph¶i s¹ch bªnh, ®Æc biÖt lµ bÖnh virus vµ ë giai ®o¹n sinh tr−ëng m¹nh.
ViÖc trång c¸c c©y mÑ trong ®iÒu kiÖn m«i tr−êng thÝch hîp víi chÕ ®é ch¨m sãc vµ phßng trõ s©u bÖnh hiÖu qu¶ tr−íc khi lÊy mÉu cÊy sÏ lµm gi¶m tû lÖ mÉu nhiÔm, t¨ng kh¶ n¨ng sèng vµ sinh tr−ëng cña mÉu cÊy in vitro. B−íc 1: Nu«i cÊy khëi ®éng Lµ giai ®o¹n khö trïng ®−a mÉu vµo nu«i cÊy in vitro. Giai ®o¹n nµy cÇn ®¶m b¶o c¸c yªu cÇu: Tû lÖ nhiÔm thÊp, tû lÖ sèng cao, m« tån t¹i vµ sinh tr−ëng tèt. -Khi lÊy mÉu cÇn chän ®óng lo¹i m«, ®óng giai ®o¹n ph¸t triÓn cña c©y: m« non, Ýt chuyªn ho¸ ( ®Ønh chåi, m¾t ngñ, l¸ non, v¶y cñ...) -X¸c ®Þnh chÕ ®é khö trïng mÉu cÊy thÝch hîp:th−êng dïng c¸c chÊt: HgCl2 0,1% xö lý trong 5-10 phót, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xö lý trong 15-20 phót, hoÆc H2O2, dung dÞch Br... 5B−íc 2: Nh©n nhanh  Lµ giai ®o¹n kÝch thÝch m« nu«i cÊy ph¸t sinh h×nh th¸i v¨ t¨ng nhanh sè l−îng th«ng qua c¸c con ®−êng: ho¹t ho¸ chåi n¸ch, t¹o chåi bÊt ®Þnh vµ t¹o ph«i v« tÝnh.  VÊn ®Ò lµ ph¶i x¸c ®Þnh ®−îc m«i tr−êng vµ ®iÒu kiÖn ngoaÞ c¶nh thÝch hîp ®Ó cã hiÖu qu¶ lµ cao nhÊt. Theo nguyªn t¾c chung m«i tr−êng cã nhiÒu xytokinin sÏ kÝch thÝch t¹o chåi. ChÕ ®é nu«i cÊy th−êng lµ: 25-270C, 16 giê chiÕu s¸ng/ ngµy, c−êng ®é ¸nh s¸ng 2000- 4000 lux. B−íc 3: t¹o c©y in vitro hoµn chØnh
§Ó t¹o rÔ cho chåi, ng−êi ta chuyÓn chåi tõ m«i tr−êng nh©n nhanh sang m«i tr−êng t¹o rÔ. M«i tr−êng t¹o rÔ th−êng ®−îc bæ sung mét l−îng nhá auxin. Mét sè chåi cã thÓ ph¸t sinh rÔ ngay sau khi chuyÓn tõ m«i tr−êng nh©n nhanh giµu xytokinin sang m«i tr−êng kh«ng chøa chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng.
§èi víi c¸c ph«i v« tÝnh th−êng chØ cÇn gieo chóng trªn m«i tr−êng kh«ng cã chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng hoÆc m«i tr−êng cã chøa nång ®é thÊp cña xytokinin ®Ó ph«i ph¸t triÓn thµnh c©y hoµn chØnh 6B−íc 4: thÝch øng c©y in vitro ngoµi ®iÒu kiÖn tù nhiªn.
§Ó ®−a c©y tõ èng nghiÖm ra v−ên −¬m víi tû lÖ sèng cao, c©y sinh tr−ëng tèt cÇn ®¶m b¶o mét sè yªu cÇu:
C©y trong èng nghiÖm ®n ®¹t nh÷ng tiªu chuÈn h×nh th¸i nhÊt ®Þnh (sè l¸, sè rÔ, chiÒu cao c©y).
Cã gi¸ thÓ tiÕp nhËn c©y invitro thÝch hîp: gi¸ thÓ s¹ch, t¬i xèp, tho¸t n−íc.
Ph¶i chñ ®éng ®iÒu chØnh ®−îc Èm ®é, sù chiÕu s¸ng cña v−ên −¬m còng nh− cã chÕ ®é dinh d−ìng phï hîp. C¸c ph−¬ng thøc nh©n gièng v« tÝnh in vitro (Nguån: E.F. George, 1993) C©y mÑ Nh©n gièng tõ chåi n¸ch Nh©n gièng tõ chåi bÊt ®Þnh vµ ph«i v« tÝnh Meristem §Ønh chåi M¾t ngñ C©y gièng C©y con Nu«i cÊy chåi ®Ønh Nu«i cÊy ®o¹n th©n T¹o chåi trùc tiÕp T¹o ph«i trùc tiÕp C©y tõ ph«i T¹o chåi gi¸n tiÕp T¹o ph«i gi¸n tiÕp C©y con Ph¸t sinh h×nh th¸i trùc tiÕp Ph¸t sinh h×nh th¸i gi¸n tiÕp MÉu cÊy MÉu cÊy Callus Ph«i v« tÝnh Chåi bÊt ®Þnh HuyÒn phï tÕ bµo Callus 7Ho¹t ho¸ chåi n¸ch
Sù ph¸t triÓn cña chåi n¸ch ®−îc kÝch thÝch b»ng c¸ch lo¹i bá −u thÕ ngän khi nu«i cÊy c¸c ®Ønh chåi vµ ®o¹n th©n mang m¾t ngñ. Theo ph−¬ng thøc nµy sù ph¸t triÓn chåi diÔn ra theo hai c¸ch: -C©y ph¸t triÓn trùc tiÕp tõ chåi ®Ønh hoÆc chåi n¸ch. Tr−êng hîp nµy th−êng x¶y ra khi nu«i cÊy c©y hai l¸ mÇm nh− thuèc l¸, khoai t©y, hoa cóc... -T¹o côm chåi tõ chåi ®Ønh hoÆc chåi n¸ch. Tr−êng hîp nµy hay gÆp víi c©y 1 l¸ mÇm nh− mÝa, lóa,... 8T¹o chåi bÊt ®Þnh
Trong tr−êng hîp nµy cÇn ph¶i thùc hiÖn qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ vµ t¸i ph©n ho¸ tÕ bµo ®Ó b¾t c¸c tÕ bµo soma h×nh thµnh chåi trùc tiÕp hoÆc gi¸n tiÕp th«ng qua giai ®o¹n ph¸t triÓn m« seo.
ë c¸c ®èi t−îng mét l¸ mÇm nh− lan, døa, chuèi, hoa loa kÌn... th−êng gÆp sù ph¸t triÓn c©y qua giai ®o¹n dÎ hµnh (protocorm): cïng mét lóc mÉu cÊy t¹o thµnh hµng lo¹t protocorm, c¸c thÓ nµy hoÆc tiÕp tôc s¶n sinh protocorm míi hoÆc ph¸t triÓn thµnh c©y. 9T¹o ph«i v« tÝnh
T−¬ng tù nh− t¹o chåi bÊt ®Þnh, ®Ó t¹o ph«i v« tÝnh còng cÇn ph¶i thùc hiÖn qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ vµ t¸i ph©n ho¸ tÕ bµo ®Ó b¾t c¸c tÕ bµo soma h×nh thµnh ph«i trùc tiÕp hoÆc gi¸n tiÕp th«ng qua giai ®o¹n ph¸t triÓn m« sÑo.Nh−ng ph«i v« tÝnh cã cÊu tróc l−ìng cùc bao gåm c¶ chåi mÇm vµ rÔ mÇm
C¸c ph«i v« tÝnh cã thÓ t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh hoÆc sö dông lµm nguyªn liÖu s¶n xuÊt h¹t gièng nh©n t¹o. T¹o ph«i v« tÝnh Sù h×nh thµnh ph«i cã 2 b−íc:
Sù ph©n ho¸ c¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh ph«i: cÇn m«i tr−êng giµu auxin. C¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh ph«i lµ c¸c tÕ bµo nhá, nh©n lín, nhiÒu h¹ch nh©n, kh«ng cã kh«ng bµo, tÕ bµo chÊt ®Ëm ®Æc, giµu protein vµ ARN th«ng tin.
Sù ph¸t triÓn cña nh÷ng tÕ bµo ph«i míi h×nh thµnh: cÇn m«i tr−êng nghÌo hoÆc kh«ng cã auxin. Nång ®é cao cña auxin kÝch thÝch sù h×nh thµnh ph«i v« tÝnh nh−ng øc chÕ qu¸ tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¸t triÓn tiÕp theo cña c¸c ph«i nµy. 10 C BA H×nh 28. Sù h×nh thµnh ph«i v« tÝnh cña c©y c¶i dÇu. A: giai ®o¹n sím (7-10 ngµy); B: giai ®o¹n gi÷a (10-14 ngµy); C: giai ®o¹n cuèi 11 S¶n xuÊt h¹t nh©n t¹o tõ ph«i v« tÝnh Kh¸i niÖm
Cã thÓ sö dông c¸c polyme sinh häc ®Ó bao gãi 1 ph«i v« tÝnh víi mét thÓ tÝch nhÊt ®Þnh m«i tr−êng dinh d−ìng ®Ó t¹o h¹t nh©n t¹o
H¹t nh©n t¹o ®−îc dïng trong nh©n gièng c¸c c©y lai F1cã gi¸ trÞ cao, c©y chuyÓn gen, b¶o tån c©y cã nguy c¬ tuyÖt chñng vµ nguån gen −u tó (elit)… S¶n xuÊt h¹t nh©n t¹o tõ ph«i v« tÝnh
¦u thÕ cña h¹t nh©n tao:  Cã gi¸ c¹nh tranh do s¶n xuÊt tù ®éng ho¸  Cã thÓ sö dông gieo trång trùc tiÕp trªn ®ång ruéng kh«ng cÇn giai ®o¹n thÝch øng  Cã thÓ bæ sung vµo phÇn “vá” h¹t c¸c chÊt b¶o vÖ thùc vËt, chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng  DÔ dµng b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn 12 S¶n xuÊt h¹t nh©n t¹o tõ ph«i v« tÝnh §iÒu kiÖn:
HÖ thèng s¶n xuÊt h¹t gièng nh©n t¹o ph¶i cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt víi sè l−îng lín c¸c thÓ ph«i soma vµ ph«i soma ®−îc s¶n xuÊt ®ång nhÊt, ®Ó cã thÓ ®−îc trång trät b»ng nh÷ng kü thuËt truyÒn thèng mét c¸ch trùc tiÕp.
HÖ thèng s¶n xuÊt h¹t nh©n t¹o ph¶i ®−îc c¬ giíi hãa vµ kh«ng phô thuéc vµo nh÷ng thiÕt bÞ ®¾t tiÒn vµ nhÊt lµ tháa mnn yªu cÇu v« trïng. S¶n xuÊt h¹t nh©n t¹o tõ ph«i v« tÝnh
C¸c b−íc t¹o h¹t nh©n t¹o  T¹o huyÒn phï ph«i v« tÝnh trong m«i tr−êng dinh d−ìng víi mËt ®é phï hîp vµ bæ sung Na-alginate ®−îc lµm tan trong n−íc víi nång ®é 2-4%  Dïng pipet (m¸y nhá giät) nhá 100-150µl huyÒn phï nªu trªn cã chøa 1 ph«i soma vµo dung dÞch CaCl2 (2- 2,5%). Khi ®ã sÏ sinh ra ph¶n øng trao ®æi ion Na-Ca vµ h¹t nh©n t¹o ®−îch×nh thµnh, cã ®ñ ®é cøng thÝch hîp. Sau ®ã chuyÓn qua ng©m trong n−íc lµm cøng h¹t 13 S¶n xuÊt h¹t nh©n t¹o tõ ph«i v« tÝnh  Dïng Ca-alginate th−êng h¹t lu«n lu«n Èm −ít bÒ mÆt, hiÖn nay ng−êi ta dïng mét lo¹i polymer Elvax 4260 ®Ó bao líp alginate.  Giai ®o¹n kÕ tiÕp lµ lµm kh« h¹t ®Ó gióp h¹t nh©n t¹o dÔ dµng b¶o qu¶n vµ nÈy mÇm khi cÇn thiÕt. Kitto & Janick, ®Æt h¹t c©y cµ rèt trªn khay cã chøa 25% polyoxyethylene ®Ó lµm mÊt n−íc, vµ khi lµm −ít l¹i th× h¹t ®−îc t¸i sinh vµ ph¸t triÓn thµnh c©y hoµn chØnh. H¹t n¶y mÇm in vitro H¹t t¹o tõ ph«i v« tÝnh H¹t t¹o tõ protocorm H¹t n¶y mÇm in vitro Callus ph«i ho¸ C©y mÑ Côm ph«i v« tÝnh Protocor m C©y tõ h¹t nh©n t¹o C©y in vitro ë v−ên −¬m C©y tõ h¹t nh©n t¹o C©y mÑ T¹o h¹t nh©n t¹o 14 Nh©n gièng qua t¹o cñ in vitro T¹o cñ khoai t©y in vitro Nh©n gièng qua t¹o cñ in vitro T¹o cñ loa kÌn in vitro 15 C¸c tån t¹i cña nh©n gièng c©y trång b»ng nu«i cÊy m« 1.TÝnh bÊt ®Þnh vÒ mÆt di truyÒn (genetic instability).
Môc ®Ých cña nh©n gièng in vitro lµ t¹o ra quÇn thÓ c©y ®ång nhÊt (True-to-type) víi sè l−îng rÊt lín. Tuy nhiªn, trong mét sè tr−êng hîp ph−¬ng ph¸p nµy còng tao ra nh÷ng biÕn dÞ soma. TÇn sè biÕn dÞ còng hoµn toµn kh¸c nhau vµ kh«ng lÆp l¹i. c©y t¹o ra do nu«i cÊy tÕ bµo m« sÑo cã nhiÒu biÕn dÞ h¬n so víi nu«i cÊy chåi ®Ønh.
Nh÷ng nh©n tè g©y ra biÕn dÞ tÕ bµo soma cã thÓ lµ;  KiÓu di truyÒn (Genotype): TÇn sè biÕn dÞ ¶nh h−ëng bëi genotyp cña c¸c loµi c©y trång kh¸c nhau. Nãi chung c©y cµng cã møc béi thÓ cao th× cµng dÔ biÕn bÞ.  Sè lÇn cÊy chuyÓn (Subcultures) sè lÇn cÊy chuyÓn cµng nhiÒu th× ®é biÕn dÞ cµng cao. Theo Amstrong vµ Phillips (1988): khi nu«i cÊy l©u dµi th−êng g©y ra biÕn dÞ nhiÔm s¾c thÓ.  Lo¹i m« (Tissue): Nãi chung nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng trong nh©n nhanh in vitro Ýt bÞ biÕn dÞ h¬n so víi nu«i cÊy c¸c c¬ quan kh¸c. BiÕn dÞ trong nh©n gièng døa Cayen Chåi bÞ säc l¸, b¹ch t¹ngChåi dÞ d¹ng 16 C¸c tån t¹i cña nh©n gièng c©y trång b»ng nu«i cÊy m« 2.Sù nhiÔm mÉu (explant contamination). C¸c vi sinh vËt nh− nÊm, vi khuÈn nãi chung ®Òu bÞ lo¹i trõ khi khö trïng mÉu ®−a vµo nu«i cÊy. Tuy nhiªn, mét sè lo¹i vi khuÈn nh−: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia vµ Pseudomonas cã thÓ x©m nhiÔm vµo m« dÉn, tån t¹i trong m« vµ b¾t ®Çu g©y t¸c h¹i khi tÕ bµo b¾t ®Çu ph©n chia (sau 1-2 tuÇn nu«i cÊy). §Ó kh¾c phôc ®−îc hiÖn t−îng trªn cÇn:  Tr−íc hÕt cÇn ph¶i lùa chän c©y mÑ ®óng tiªu chuÈn.  Cã thÓ sö dông mét sè chÊt kh¸ng sinh ®Ó chèng hiÖn t−îng nhiÔm khuÈn vµ nÊm . Nh−ng m« thùc vËt rÊt mÉn c¶m víi kh¸ng sinh vµ cã ph¶n øng ®Õn kiÓu di truyÒn do ®ã cÇn rÊt thËn träng khi sö dông kh¸ng sinh. ChÊt kh¸ng sinh th−êng g©y ra nh÷ng huû ho¹i ë ty thÓ vµ l¹p thÓ nªn cã ¶nh h−ëng ®Õn di truyÒn tÕ bµo chÊt. Sù nhiÔm mÉu cÊy 17 C¸c tån t¹i cña nh©n gièng c©y trång b»ng nu«i cÊy m« 3.ViÖc s¶n sinh c¸c chÊt ®éc tõ m« nu«i cÊy (Toxic compounds phenol). Trong nu«i cÊy m« th−êng quan s¸t thÊy hiÖn t−îng ho¸ n©u hay ®en mÉu, mÉu nµy cã thÓ khuyÕch t¸n trong m«i tr−êng. HiÖn t−îng nµy lµ do mÉu nu«i cÊy cã chøa nhiÒu chÊt tanin hoÆc hydroxyphenol. ThÝ dô c¸c chÊt phenol eucomicacid vµ tyramine ®n lµm ho¸ n©u mÉu c©y lan Cattleya khi nu«i cÊy. C¸c ph−¬ng ph¸p lo¹i trõ sù ho¸ n©u:  Bæ sung than ho¹t tÝnh vµo m«i tr−êng nu«i cÊy (0,1 - 0,3%): ph−¬ng ph¸p nµy ®Æc biÖt cã hiÖu qu¶ trªn c¸c loµi phong lan Phalenopsis, Cattleya vµ Aerides. Tuy nhiªn than ho¹t tÝnh cã thÓ lµm chËm qu¸ tr×nh nh©n nhanh c©y do hÊp phô mét sè chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng vµ dinh d−ìng cÇn thiÕt kh¸c.  Bæ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) cã t¸c dông khö n©u ho¸ tèt ë mÉu mét sè c©y ¨n qu¶, (t¸o, hång).  Sö dông m« non, g©y vÕt th−¬ng nhá nhÊt khi khö trïng.  Ng©m mÉu vµo dung dÞch ascorbic vµ xytric vµi giê tr−íc khi cÊy.  Nu«i cÊy mÉu trong m«i tr−êng láng, O2 thÊp, kh«ng cã ¸nh s¸ng (1 - 2 tuÇn).  CÊy chuyÓn mÉu liªn tôc(1-2ngµy/lÇn) sang m«i tr−êng t−¬i trong 1 - 2 tuÇn Sù tiÕt ®éc tè tõ mÉu cÊy 18 C¸c tån t¹i cña nh©n gièng c©y trång b»ng nu«i cÊy m« 4.HiÖn t−îng thuû tinh ho¸ (Vitrification).  C©y bÞ “thuû tinh ho¸”- th©n l¸ c©y mäng n−íc,trong suèt, c©y rÊt khã sèng khi ®−a ra ngoµi m«i tr−êng do bÞ mÊt n−íc rÊt m¹nh.  Th−êng x¶y ra khi nu«i cÊy trong m«i tr−êng láng hay m«i tr−êng Ýt agar, sù trao ®æi khÝ thÊp. §Æc biÖt th−êng x¶y ra khi nu«i cÊy t¸o, mËn, hoa cÈm ch−íng, hoa ®ång tiÒn vµ hoa cóc.  C©y bÞ thuû tinh ho¸ th−êng cã hµm l−îng líp s¸p b¶o vÖ thÊp, cÊu t¹o cã nhiÒu ph©n tö ph©n cùc nªn dÔ hÊp thô n−íc. C©y in vitro th−êng cã mËt ®é khÝ khæng cao, khÝ khæng cã d¹ng trßn chø kh«ng elip, khÝ khæng më liªn tôc trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy. §Ó tr¸nh hiÖn t−îng thuû tinh ho¸ cã thÓ tiÕn hµnh mét sè gi¶i ph¸p:  Gi¶m sù hót n−íc cña c©y b»ng c¸ch t¨ng nång ®é ®−êng hoÆc c¸c chÊt g©y ¸p suÊt thÈm thÊu cao.  Gi¶m nång ®é c¸c chÊt chøa nit¬ trong m«i tr−êng.  Gi¶m sù s¶n sinh ethylen trong b×nh nu«i cÊy.  Sö lý axit absixic hoÆc mét sè chÊt øc chÕ sinh tr−ëng. Nh÷ng c«ng nghÖ míi trong vi nh©n gièng c©y trång 1.C«ng nghÖ vi nh©n gièng quang tù d−ìng  Lµ b−íc ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo do gi¸o s− T. Koyoki Kozai ®Ò xuÊt vµ nghiªn cøu tõ h¬n 2 thËp kû qua.  C«ng tr×nh nghiªn cøu tËp trung vµo vÊn ®Ò nh©n gièng c©y nu«i cÊy m« trªn m«i tr−êng kh«ng cã ®−êng nh−ng ®−îc ®iÒn khiÓn chñ ®éng chÕ ®é ¸nh s¸ng vµ cung cÊp CO2.  C«ng nghÖ nµy ®n ®−îc thö nghiÖm thµnh c«ng trªn nhiÒu ®èi t−îng c©y trång nh− cµ chua; khoai lang; rau spinach; d−a chuét; xµ l¸ch; keo; cµ phª; xoµi; tre; th«ng; ...  C«ng nghÖ nµy ®ang ®−îc tiÕp tôc hoµn thiÖn ®Ó lµm c¬ së cho hÖ thèng nh©n gièng c«ng nghiÖp hãa (T. Kozai; F.Afreen; S.M.A.Zobayed - 2005) 19 Nh÷ng c«ng nghÖ míi trong vi nh©n gièng c©y trång(tiÕp)  Lîi Ých cña vi nh©n gièng sö dông hÖ thèng quang tù d−ìng
Tèc ®é sinh tr−áng, chÊt l−îng vµ tû lÖ sèng cña m« thùc vËt ®−îc n©ng cao ë tÊt c¸c c¸c b−íc trong nh©n gièng trong ®iÒu kiÖn tù d−ìng.
ThiÖt h¹i do sù nhiÔm mÉu ®−îc h¹n chÕ do kh«ng sö dông ®−êng trong m«i tr−êng.
Tû lÖ ®ét biÕn cã thÓ ®−îc gi¶m v× c©y ®ùoc nu«i trong ®iÒu kiÖn m«i tr−êng gièng tù nhiªn.
Tù ®éng ho¸ vµ do ®ã gi¶m ®−îc chi phÝ lao ®éng. Nh÷ng c«ng nghÖ míi trong vi nh©n gièng c©y trång (tiÕp)  Nh−îc ®iÓm:
Chi phÝ cao cho viÖc ®iÒu khiÓn m«i tr−êng ( ¸nh s¸ng, nhiÖt ®é, CO2, O2)
C©y vÉn sinh tr−ëng trong ®iÒu kiÖn v« trïng v× vËy vÉn dÉn ®Õn chi phÝ cao cho hÖ thèng b×nh nu«i chuyªn dông vµ chuÈn bÞ gi¸ thÓ. Hép nu«i c©y sö dông trong hÖ thèng quang tù d−ìng. Dµi x Réng x Cao = 610 x 31 x 105 mm, thÓ tÝch 20 lÝt ( Zobayed et al., 2000). 20 21 Nh÷ng c«ng nghÖ míi trong vi nh©n gièng c©y trång (tiÕp) 2.Bioreactor
Sù ph¸t triÓn c«ng nghÖ Bioreactor trong vi nh©n gièng c©y trång
Takayama vµ Miasawa lµ nh÷ng ng−êi ®Çu tiªn nghiªn cøu sö dông biorector vµo nh©n gièng c©y trång: nh©n cñ siªu nhá khoai t©y, cñ gièng hoa ly (Takayama vµ Akita, 1988), hoa lan hå ®iÖp (Yong et, al, 2000; Datta et al, 1999), cá ngät víi c«ng suÊt 20000 chåi/ b×nh biorector 500lÝt (Takayama vµ Akita, 1994), ...
C«ng nghÖ nµy cho phÐp nh©n nhanh v« h¹n c¸c gièng c©y trång nhê thiÕt bÞ bioreactor hoµn toµn tù ®éng hãa. VÝ dô: mét bioreactor vibro - mixer ( rung vµ trén) trang bÞ víi c¸c èng silicone sôc khÝ tù do ®n cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt 100000 ph«i v« tÝnh cña c©y tr¹ng nguyªn trong mét lÝt dung dÞch huyÒn phï nÕu nh− dung dÞch ®ã ®−îc ®Æt trªn mét tÊm giÊy läc vµ ph¸t triÓn trong 4 tuÇn. (Preil vµ céng sù, 1988)
Tuy nhiªn, c«ng nghÖ nµy ®ßi hái thiÕt bÞ hiÖn ®¹i vµ ®¾t tiÒn, vËn hµnh rÊt phøc t¹p ®Æc biÖt lµ kh©u chèng nhiÔm cho huyÒn phï nu«i cÊy. 22 Nh÷ng c«ng nghÖ míi trong vi nh©n gièng c©y trång (tiÕp) ThuËn lîi cña hÖ thèng bioreactor so víi nu«i cÊy trong b×nh:
ThuËn lîi thø nhÊt lµ thÓ tÝch nu«i cÊy t¨ng, th−êng lµ Ýt nhÊt 1 lÝt. §iÒu nµy cho phÐp s¶n xuÊt nhiÒu ph«i, chåi h¬n mµ kh«ng cÇn nh÷ng kü thuËt cao cÊp.
ThuËn lîi thø hai, hÇu hÕt c¸c b×nh bioreactor ®−îc thiÕt kÕ víi mét c¬ chÕ khuÊy, b»ng c¬ häc hay b»ng thæi khÝ, ®Ó duy tr× nu«i cÊy gÇn nh− ®ång d¹ng.
ThuËn lîi thø ba, khi thao t¸c nu«i cÊy liªn tôc, m«i tr−êng nu«i cÊy vµ m«i tr−êng vËt lý cã thÓ ®−îc kiÓm so¸t thÝch hîp cho sinh tr−ëng. Cã nh÷ng chØ dÉn vÒ c¸c nh©n tè m«i tr−êng nh− pH vµ oxygen hßa tan. §iÒu nµy kh«ng thÓ thùc hiÖn ®−îc víi hÖ thèng nu«i cÊy b×nh tam gi¸c. 23 Nh÷ng c«ng nghÖ míi trong vi nh©n gièng c©y trång (tiÕp) C¸ch nh©n gièng b»ng bioreactor
Bioreactor cã thÓ ®−îc øng dông ®Ó vi nh©n gièng thùc vËt trªn quy m« th−¬ng m¹i theo 3 h−íng :  (1) T¹o chåi (chuèi, døa, hoa lan…)  (2) T¹o cñ in vitro (Khoai t©y, lily)  (3) T¹o ph«i soma(cµ phª, cao su, 24 25 26