Bài giảng Công nghệ sinh học trong bệnh cây

ền chất của miRNA (pre-miRNA) với cấu trúc thân-thòng lọng không hoàn chỉnh thành miRNA. Các siRNA và miRNA mới hình thành đều ở dạng sợi kép và trước khi lắp ráp thành RISC, chúng phải tách ra thành sợi đơn. Hoạt động của siRNA và miRNA sau khi đã lắp ráp thành phức hợp siRISC và miRISC là giống nhau: đều nhằm để cắt các RNA sợi đơn mục tiêu. Khác nhau Mặc dù giống nhau về tính chất hóa học, sinh hóa và cơ chế hoạt động thì miRNA và siRNA vẫn có các điểm khác nhau cơ bản về nguồn gốc, đường hướng hình thành, vai trò sinh học và mức độ bảo thủ về mặt tiến hóa: miRNAs có nguồn gốc (được mã hóa) tại các vị trí genome khác biệt với gen mục tiêu của nó. Trái lại, siRNAs có nguồn gốc từ mRNAs, transposons, viruses. miRNAs được xử lý (cắt) từ các phân tử tiền chất (pre-miRNA) có độ dài và cấu trúc kẹp tóc. Trái lại, siRNAs được xử lý (cắt) từ các phân tử dsRNA dài hoặc các cấu trúc kẹp tóc khá dài. Từ một phân tử pre-miRNA sẽ chỉ tạo một loại phân tử miRNA. Trái lại, một phân tử dsRNA hoặc một cấu trúc kẹp tóc dsRNA sẽ tạo nhiều phân tử siRNA khác nhau. siRNA gồm 2 nhóm: (1) nhóm đối xứng với 2 đầu đều có tính ổn định tương đương nên cả 2 sợi đơn sau khi tách ra đều lắp ráp hiệu quả thành siRISC và (2) nhóm không đối xứng do chỉ có một đầu ổn định nên chỉ có 1 sợi lắp ráp hiệu quả thành siRISC. Trái lại, phần lớn miRNA thuộc nhóm không đối xứng => tạo chỉ 1 loại miRISC. Trình tự miRNA gần như luôn luôn bảo thủ ở các sinh vật có quan hệ với nhau; trái lại trình tự chuỗi siRNA hiếm khi bảo thủ giữa các sinh vật có quan hệ. RNA silencing thông qua miRNA là một cơ chế điều hòa gen, đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Trái lại RNA silencing thông qua siRNA là (i) một cơ chế phòng thủ chống virus, (ii) ngăn chặn sự biểu hiện quá mức hoặc không cần thiết của các mRNA, và (iii) bảo vệ bộ gen khỏi bị gián đoạn bởi transposon Công nghệ RNAi trong tạo giống kháng bệnh virus Giới thiệu Virus là nhóm tác nhân gây bệnh quan trọng ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng khắp hế giới. Vì virus trong cây không thể bị tiêu diệt trực tiếp bởi các thuốc hóa học nên sử dụng giống kháng là một trong các chiến lược hiệu quả nhất hiện nay để phòng chống bệnh. Giống kháng bệnh có thể có được nhờ 2 phương phps chính: (1) tính kháng với nguồn gen kháng từ cây, và (2) tính kháng từ gen virus. Tính kháng từ gen virus đã được thử nghiệm từ lâu. Vào năm 1986, Powell-Abel et al. đã chứng minh rằng biểu hiện gen CP của TMV trên thuốc lá có thể kháng được virus. Ngoài gene CP, các nhà khoa học đã chuyển nhiều gen virus khác như replicase, vận chuyển, protease... và đã tạo ra nhiều mức kháng khác nhau (triệu chứng biểu hiện chậm, giảm mức dữ dội của triệu chứng, miễn dịch). Đầu tiên, các nhà khoa học cho rằng tính kháng có được là do protein của virus phải được biểu hiện. Tuy nhiên, nhiều quan sát cho thấy, các cấu trúc chứa gen virus không có khả năng dịch mã cũng qui định tính kháng (các cấu trúc này vẫn được phiên mã tốt trong nhân nhưng lượng mRNA của nó ở tế bào chất giảm đáng kể). Như vậy có 2 loại tính kháng nhờ chuyển gen virus là (1) thông qua protein và (2) thông qua RNA (hay RNAi) Tạo giống kháng thông qua RNAi có thể đạt được dựa trên siRNA hay miRNA. Đối với virus thực vật, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào siRNA còn miRNA mới chỉ được chú ý từ năm 2006. Các đặc điểm chính trong công nghệ RNAi dựa trên siRNA Thiết kế cấu trúc chuyển gen Đây là bước quan trọng nhất, quyết định thành công của một chương trình tạo giống kháng thông qua RNAi. Có 3 cách để thiết kế cấu trúc chuyển gen virus - Tạo cấu trúc chứa gen đồng nghĩa (sene). - Tạo cấu trúc chứa gen ngược nghĩa (antisense). - Tạo cấu trúc chứa gen theo cả 2 chiều đồng nghĩa và ngược nghĩa (cấu trúc tự bắt cặp). Tất cả các loại cấu trúc trên muốn tạo tính kháng thì đều phải hình thành cấu trúc dsRNA trong cây chuyển gen. Có nhiều cách để có thể hình thành cấu trúc dsRNA của gen chuyển. Chẳng hạn, các cấu trúc đồng nghĩa và ngược nghĩa có thể (i) được chuyển đồng thời vào cây, hoặc (ii) được chuyển riêng biệt để tạo các dòng chứa gen đồng nghĩa hoặc ngược nghĩa. Các dòng này sẽ được lai để tạo dòng mang cả gen đồng nghĩa và ngược nghĩa, hoặc (iii) trong trường hợp cây chỉ được chuyển với cấu trúc đồng nghĩa hoặc ngược nghĩa thì RdRp của cây sẽ tạo ra các phân tử dsRNA từ các transcripts của gen được chuyển. Tuy nhiên, chỉ loại cấu trúc tự bắt cặp đã được chứng tỏ là hiệu quả hơn cả trong việc tạo ra tính kháng. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu tạo tính kháng thông qua RNAi trên cây đều sử dụng các cấu trúc tự bắt cặp (hình). Đối với cấu trúc tự bắt cặp, nếu 2 chuỗi gen virus bao quanh một chuỗi intron thì hiệu quả PTGS sẽ tăng lên rất nhiều Hình. Hiệu quả PTGS với các cấu trúc chuyển gen potato virus Y (PVY) khác nhau. Hiệu quả được tính là % cây chuyển gen miễn nhiễm với PVY. Gen virus (PVY-pro) là NIa. Chuỗi loop là chuỗi gen unidA (GUS) dài ~800 nts. Intron là chuỗi intron của gen Pdk gene của cây Flaveria. (Smith et al., 2000). Chọn chuỗi gen virus Không có yêu cầu đặc biệt để chọn chuỗi gen. Các gen được lựa chọn có thể là gen CP, gen vận chuyển, gen protease..., thâm chí cả phần không dịch mã (ví dụ như phần 3’UTR của các potyvirrus). Các gen này thông thường được lựa chọn trên vùng bảo thủ của loài vì RNAi thông qua siRNA mang tính đặc hiệu rất cao. Ngoài ra vùng gen lựa chọn cũng nên qui định các chức năng sinh học chủ chốt của virus. Chẳng hạn đối với begomovirus nên chọn vùng đầu N của gen Rep (vừa bảo thủ vừa chứa nhiều motif quan trọng); đối với potyvirus nên chọn vùng đầu C của gen CP (bảo thủ cao) . Độ dài của chuỗi gen thường vài trăm bp. Nghiên cứu với tomatospoted wilt virus (TSWV) cho thấy độ dài tối thiểu để tạo tính kháng là 59 bp. Ví dụ công nghệ RNAi kháng bệnh virus Tạo cây chuyển gen kháng PVY thông qua RNA silencing (Missiou et al., 2004. Molecular Breeding 14: 185–197, 2004) Giới thiệu. Cây khoai tây là cây trồng quân trọng đứng hàng thứ 4 trên thế giới. Cây khoai tây bị nhiễm rất nhiều loại virus trong đó potato virus Y (PVY) là virus nghiêm trọng nhất. PVY lan truyên qua củ giống và nhiều loài rệp muội họ Aphidiade theo kiểu không bền vững. PVY gây hại trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt nghiêm trọng trên cây họ cà như khoai tây, cà chua, thuốc lá, ớt. Triệu chứng bệnh thay đổi theo loài/giống cây, chủng virus và điều kiện ngoại cảnh. PVY thuộc chi Potyvirus với đặc điểm bộ gen là: bộ gen RNA sợi đơn, cực (-), kích thước 9,7 kb. Bộ gen (theo chiều từ trái sang phải) gồm: 1 chuỗi 5’NTR (UTR), một ORF lớn mã hóa một polyprotein được xử lý sau dịch mã thành 10 protein chức năng, một chuỗi 3’ NTR (UTR), tận cùng là một chuỗi poly-A. Dựa trên so sánh chuỗi, hiện nay quần thể PVY gồm 4 chủng PVYO, PVYN, PVYNTN và PVYW. Hình. Đặc điểm bộ gen và 4 chủng của PVY (DPV, 2004). P1: protein P1 HcPro: Helper component protein P3: protein P3 CI: Crystal Inclusion NIa: Nuclear Inclusion a NIb: Nuclear Inclusion b CP: Coat protein NTR: non translated region (=UTR) Thiết kế cấu trúc chuyển gen (hình) và chuẩn bị dòng vi khuẩn chuyển gen Đoạn gen được lựa chọn là một đoạn dài 605 bp phần đầu 3’ của gen CP. Đoạn gen được phân lập bằng RT-PCR dùng cặp mồi Y9100: 5’CTGGATCCTGTCTCCTGATTGAAGTTTACAGTC3’ YREV1: 5’TTGAATTCAAAGGAACCATATATGCCACGATAT3’ - Đoạn gen CP được clon vào vector plasmid pT3T7-lac (Stratagene). - Chèn 1 đoạn spacer dài 1255 bp (vị trí BamHI/SalI) lấy từ bacteriophage l vào giữa đoạn CP đồng nghĩa và CP ngược chiều để tạo cassete pvyPH9100: CP (đồng nghĩa) – spacer – CP (ngược nghĩa). - Clone cassete pvyPH9100 vào vector plamid song cực pART7/27 để tạo cấu trúc chuyển gen pART27HP9100. Cấu trúc này được điều khiển bởi promotor CaMV35S và terminater ocs (của gen Octopine synthase). Cấu trúc cũng chứa marker nptII (kháng kanamycin) - Biến nạp cấu trúc pART27HP9100 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (chủng LBA4404) Hình. Bản đồ T-DNA của cấu trúc pHP9100 mang các chuỗi lặp đảo (tự ghép cặp) của PVY. CP: chuỗi gen vỏ protein CP. RB, LB: bờ phải và bờ trái của T-DNA. CaMV35S: promotor CaMV, OCS 3’: chuỗi terminator của gen mã hóa Octopine synthase. nptII: kháng kanamycine. Biến nạp cấu trúc chuyển gen vào cây khoai tây Cây khoai tây (giống Spunta) non 1 tháng tuổi được trồng trong nhà kính. Explant cắt từ lóng cây non được ủ với vi khuẩn A. tumefaciens chứa cấu trúc chuyển gen pART27PH9100 trong 24 giờ và được đặt trên môi trường tạo callus (môi trường MS chứa hormone zeatin, 2,4-D và kháng sinh kanamycin, cefotaxime). Tiếp theo, callus được chuyển sang môi trường tạo chồi (môi trường MS chứa hormone zeatin, GA3 và kháng sinh như trên). Tiếp theo callus được chuyển sang môi trường tạo rế (môi trường MS chứa hormone IAA và kháng sinh như trên). Cây explants được trồng trong điều kiện 25 °C ban ngày, 18 °C tối với 16 giờ sáng (ánh sáng huỳnh quang). Các phân tích chính cây chuyển gen Southern blot nhằm phát hiện số copy của cấu trúc đã được chuyển vào bộ gen của Cây chuyển gen 5-6 tháng tuổi được phân tích southern blot DNA tổng số được chiết từ 0.5 – 1 mg lá tươi. Phân cắt DNA tổng số = RE Điện di 10 – 15 mg DNA bằng agarose 0,7 % Chuyển và cố định DNA sang màng lai Lai với dò là đoạn gen CP 605 bp được gán nhán phóng xạ P32 Northen blot nhằm phát hiện siRNA hình thành từ cây chuyển gen Cây chưa lây nhiễm ở các tuổi khác nhau (khoảng 2 tháng sau khi chuyển ra nhà lưới) được sử dụng để phát hiện siRNA Chiết RNA tổng số từ khoảng 1 g lá Điện di trên gel polyacrylamide acrylamide ở điều kiện biến tính(12% acrylamide, 0.6% bisacrylamide, 7 M urea) với đệm TBE buffer (50 mM Tris, 41.5 mM boric acid, 0.5 mM EDTA). Chuyển và cố định RNA sang màng lai. Lai với dò là đoạn gen CP 605 bp được gán nhán phóng xạ P32 Lây nhiễm virus trên cây chuyển gen Cây chuyển gen ở giai đoạn 4 – 5 lá được lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học. Tất cả 4 chủng PVY và PVX đều được lây nhiễm. Các chủng này được giữ nguồn trên thuốc lá hoặc khoai tây. Nghiền lá (khoai tây hoặc thuốc lá) nhiễm virus với đệm phosphate 0.01 M chứa 0.4% Na2SO3 (sodium sulphite), pH 7.5 theo tỷ lệ 1/10. Lây nhiễm cơ học bằng bột carborandum Cây được đánh giá sau lây nhiễm bằng 3 phương pháp ELISA, tisue printing và northen blot ELISA nhằm phát hiện sự có mặt của virus (dựa vào protein virus) trong cây chuyển gen đã lây nhiễm virus Tisue printing (lai tại chỗ) nhằm phát hiện sự có mặt của virus (dựa vào RNA virus) trong lá cây chuyển gen đã lây nhiễm virus. Tạo cây chuyển gen kháng TYLCV thông qua RNA silencing Giới thiệu. TYLCV là một trong nhiều loài begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua. Các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Các begomovirus là các virus thực vật có bộ gen DNA vòng đơn có kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép gồm 2 phân tử DNA sợi vòng đơn gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn tương đương DNA-A Đối với các virus có bộ gen đơn thì DNA-A của chúng chứa 6 gen được tổ chức theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có 2 gen là (i) V1 mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyên qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào; và (ii) V2 mã hóa protein V2 có chức năng liên quan đến vận chuyển virus giữa các tế bào. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) có 4 gen là (i) C1 mã hóa protein tái sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối bộ gen virus tại một vị trí đặc biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tương tác với protein ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi cho tái sinh virus, (ii) C2 mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã, (iii) C3 mã hóa 1 protein tăng cường tái sinh và (iv) C4 mã hóa protein C4 với chức năng liên quan đén phổ ký chủ và phát triển triệu chứng. Giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiều nhau ở trên là một vùng không mã hóa chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin of replication) gồm (i) các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết của protein Rep và (ii) một cấu trúc thân – thòng lọng trong đó chuỗi TAATACTAT trên vùng thòng lọng là giống nhau ở tất cả các begomovirus và vị trí TA cuối cùng là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen begomovirrus trong quá trình tái sinh. Đối với các begomovirus có bộ gen kép thì DNA-A có tổ chức bộ genome và chức năng các gen tương tự như DNA-A của các begomovirus có bộ gen đơn (tên các gen được thêm ký tự A vào đằng trước thành AV1, AV2, AC1, AC2, AC3 và AC4); còn DNA-B của chúng chỉ chứa 2 gen được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau và mã hóa 2 protein là (i) protein con thoi có chức năng vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào và (ii) protein vận chuyển có chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào. Thiết kế cấu trúc chuyển gen (hình) và chuẩn bị dòng vi khuẩn chuyển gen Đoạn gen được lựa chọn là C1 (mã hóa protein Rep) với độ dài 727 bp nằm ở đầu 5’. Nguồn virus là một plasmid chứa toàn bộ bộ gen virus được clone từ trước. Đoạn gen ngược nghĩa được phân lập bằng PCR với cặp mồi A và B (bảng). Đoạn PCR ngược nghĩa được cắt kép với 2 RE là XhoI/BamHI và được nối vào vị trí tương ứng của vector pBPW8 để tạo ra cấu trúc pBPC1antisense Đoạn gen đồng nghĩa được phân lập bằng PCR với cặp mồi B và C (bảng). Đoạn PCR đồng nghĩa được cắt kép với 2 RE là KpnI/BamHI và được nối vào cấu trúc pBPC1antisense (cũng được cắt kép bằng KpnI/BamHI) để tạo ra cấu trúc pBPC1antisense-C1sene. Đoạn intron của Castor bean catalase được phân lập bằng cặp mồi D và E (bảng) từ plasmid pWJKK.IN-2 (của cơ quan CSIRO, Australia). Xử lý 2 đầu của đoạn intron được tạo ra bằng PCR với RE ClaI. Tương tự, cấu trúc pBPC1antisense-C1sene cũng được mở bằng RE ClaI. Nối đoạn intron (đã được cắt bằng ClaI) vào cấu trúc pBPC1antisense-C1sene (đã được mở bằng ClaI) để tạo cấu trúc pBPC1727antisen – intron – C1727sene. Cấu trúc này chứa cấu trúc kẹp tóc sau: C1(727nt, antisense) – intron – C1 (727nt, sene) Một đọan 3.4 kb của cấu trúc pBPC1727antisen – intron – C1727sene chứa cả promotor CaMV 35S và terminator tNos được giải phóng bằng HindIII và nối vào vị trí tương ứng của một vector song cực là pZ200 để tạo ra cấu trúc chuyển gen. Biến nạp cấu trúc chuyển gen trên vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (chủng LBA4404) Bảng Các mồi sử dụng trong thiết kế cấu trúc chuyển gen Mồi Chuỗi mồi RE A (c) TCTCTCGAGTTACGCCTTATTGGTTTC XhoI B (v) CGCGGATCCATGCCTCGTTTTATTTAAA BamHI C (c) CGGGGTACCTTACGCCTTATTGGTTTC KpnI D CCATCGATCTGCAGGTAAATTTCTAGTTTTTC ClaI E CCATCGATCTGCAGTTATCATCATCATCATAG ClaI (c) mồi gắn vào chuỗi tương đồng virus; (v) mồi gắn vào chuỗi virus Hình Cấu trúc chuyển gen kháng TYLCV. (a) Tổ chức bộ gen của TYLCV (b) Bản đồ đoạn chứa cấu trúc chuyển gie.CaMV 35S: promoter Intron: chuỗi intron của Castor bean catalase. LB, LR: bờ trái và bờ phải. tNos: chuỗi terminator của nopaline synthase. nptII: neomycin phosphotransferase II (kháng kanamycine). pNos: chuỗi promoter của nopaline synthase. (c) Sơ đồ hairpin RNA so khi intron bị cắt khỏi transcript Biến nạp cấu trúc chuyển gen vào cây khoai tây Cây khoai tây (giống Spunta) non 1 tháng tuổi được trồng trong nhà kính. Explant cắt từ lóng cây non được ủ với vi khuẩn A. tumefaciens chứa cấu trúc chuyển gen pART27PH9100 trong 24 giờ và được đặt trên môi trường tạo callus (môi trường MS chứa hormone zeatin, 2,4-D và kháng sinh kanamycin, cefotaxime). Tiếp theo, callus được chuyển sang môi trường tạo chồi (môi trường MS chứa hormone zeatin, GA3 và kháng sinh như trên). Tiếp theo callus được chuyển sang môi trường tạo rế (môi trường MS chứa hormone IAA và kháng sinh như trên). Cây explants được trồng trong điều kiện 25 °C ban ngày, 18 °C tối với 16 giờ sáng (ánh sáng huỳnh quang). Các phân tích chính cây chuyển gen Southern blot nhằm phát hiện số copy của cấu trúc đã được chuyển vào bộ gen của Cây chuyển gen 5-6 tháng tuổi được phân tích southern blot DNA tổng số được chiết từ 0.5 – 1 mg lá tươi. Phân cắt DNA tổng số = RE Điện di 10 – 15 mg DNA bằng agarose 0,7 % Chuyển và cố định DNA sang màng lai Lai với dò là đoạn gen CP 605 bp được gán nhán phóng xạ P32 Northen blot nhằm phát hiện siRNA hình thành từ cây chuyển gen Cây chưa lây nhiễm ở các tuổi khác nhau (khoảng 2 tháng sau khi chuyển ra nhà lưới) được sử dụng để phát hiện siRNA Chiết RNA tổng số từ khoảng 1 g lá Điện di trên gel polyacrylamide acrylamide ở điều kiện biến tính(12% acrylamide, 0.6% bisacrylamide, 7 M urea) với đệm TBE buffer (50 mM Tris, 41.5 mM boric acid, 0.5 mM EDTA). Chuyển và cố định RNA sang màng lai. Lai với dò là đoạn gen CP 605 bp được gán nhán phóng xạ P32 Lây nhiễm virus với cây chuyển gen Cây chuyển gen ở giai đoạn 4 – 5 lá được lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học. Tất cả 4 chủng PVY và PVX đều được lây nhiễm. Các chủng này được giữ nguồn trên thuốc lá hoặc khoai tây. Nghiền lá (khoai tây hoặc thuốc lá) nhiễm virus với đệm phosphate 0.01 M chứa 0.4% Na2SO3 (sodium sulphite), pH 7.5 theo tỷ lệ 1/10. Lây nhiễm cơ học bằng bột carborandum Cây được đánh giá sau lây nhiễm bằng 3 phương pháp ELISA, tisue printing và northen blot ELISA nhằm phát hiện sự có mặt của virus (dựa vào protein virus) trong cây chuyển gen đã lây nhiễm virus. Tisue printing (lai tại chỗ) nhằm phát hiện sự có mặt của virus (dựa vào DNA virus) trong cây chuyển gen đã lây nhiễm virus. Sử dụng công nghệ microRNA trong phòng chống bệnh virus Công nghệ RNAi dùng miRNA mới được nghiên cứu gần đây trong phòng chống bệnh virus thực vật. Một số ưu điểm dùng miRNA là: Ít bị hiệu ứng không đặc hiệu (off-target). Đây là hiệu ứng không mong muốn khi RISC (thông qua liên kết không đặc hiệu của sRNA) cắt các phân tử không phải mRNA mục tiêu. Hiện nay, việc chọn các mRNA với trình tự không tương đồng với bộ gen ký chủ là hoàn toàn khả thi nếu bộ gen ký chủ đã được giải trình tự toàn bộ. Mức độ tương thích promoter RNA cao. An toàn với môi trường (an toàn sinh học) do giảm thiểu khả năng tái tổ hợp giữa virus tự nhiên và gen virus được chuyển vào trong cây/ Dùng công nghệ miRNA tạo tính kháng CMV Giới thiệu (CPC, 2006) Cucumber mosaic virus (CMV) là môt trong những virus thực vật quan trọng nhất, gây hại hơn 800 loài cây 1 và 2 lá mầm thuộc 85 họ thực vật. Virus có thể lan truyền bằng 80 loài rệp muội theo kiểu không bền vững. Virus có thể và lan truyền bằng tiếp xúc cơ học và có thể truyền qua hạt giống của nhiều loài cây. Virus phân bố khắp thế giới. Phân tử virus có hình cầu, khoảng 29 nm (đường kính). CMV là một virus đa thành phần với bộ gen gồm 3 phân tử RNA gọi là RNA1, RNA2 và RNA 3; mỗi phân tử RNA genome được lắp ráp thành các phân tử riêng biệt (có vỏ protein riêng). Ngoài ra, CMV còn có 1 phân tử RNA subgenomic (hình thành trong quá trình tái sinh virus) không cần cho quá trình gây bệnh gọi là RNA4 được lắp ráp cùng với RNA3 trong cùng một phân tử. CMV là một virus RNA sợi đơn, mạch thẳng, cực dương. Tất cả 3 phân tử RNA của CMV đều có đầu 5’ chứa cap (7-methyl guanosine) và đầu 3’ có cấu trúc giống tRNA. RNA1 có kích thước khoảng 3.4 kb, mã hóa 1 protein là 1a có chức năng giống như một helicase và methyl transferase. RNA2 mã hóa 2 protein là 2a và 2b. Protein 2a là một polymerase. Protein 2b được biểu hiện từ RNA4 có chức năng liên quan đến di chuyển hệ thống, biểu hiện triệu chứng và ức chế PTGS của cây. RNA3 mã hóa 2 protein là 3a (liên quan đên di chuyển virus) và protein vỏ CP. Ngoài RNA subgenomic (RNA4), phân tử CMV cũng chứa một số phân tử RNA vệ tinh có kích thước từ 332 – 386 nts và có ảnh hưởng đến tính gây bệnh của virus. Các phân tử vệ tinh này phụ thuộc CMV để tái sinh. Thiết kế cấu trúc miRNA chuyển gen (JOURNAL OF VIROLOGY, June 2007, p. 6690–6699) Cấu trúc chuyển gen chứa chuỗi miRNA nhằm vào gen b2 của CMV. Cấu trúc được xây dựng dựa trên bộ khung một chuỗi pre-miRNA ký hiệu là miR171a của cây A. thaliana. Chuỗi pre-miRNA này nằm trên nhiễm sắc thể sô 2, 3 và 4 của cây A. thaliana với chuỗi mục tiêu là các mRNA mã hóa các yếu tố phiên mã liên quan đến ra rễ. Chuỗi pre-miRNA này đã được chứng minh từ trước là có tạo chuỗi miRNA trong cây. Cấu trúc chuyển gen được xây dựng bằng cách thay thế chuỗi miRNA của miR171a bằng một chuỗi tương ứng vị trí 178 tới 198 của gen b2 của CMV. Chuỗi này dài 21 nt và có trình tự (5’-GUAGAUGGUUCGGAACUGAUA-3’). Các bước để xây dựng cấu trúc chuyển gen tạo miRNA nhằm vào gen b2 của CMV bao gồm : Thiết kế 2 mồi lớn tương ứng với phần 5’ (đồng nghĩa) và 3’ (ngược nghĩa) của chuỗi pre-miR171a. Mỗi mồi chứa 1 chuỗi 21 nt đặc hiệu gen 2b của CMV (phần in béo và gạch chân) tại vị trí vốn là trình tự chuỗi miRNA của pre-miR171a. Ngoài ra đầu 5’ của mỗi mồi cũng chứa thêm 1 chuỗi chứa vị trí BamHI và SacI để tạo điều kiện cho clone. 5’-CGGGATCCATGAGAGAGTCCCTTTGTAGATGGTACGGAACTTATAGATCTTACCTGACCACACACG-3’ 5’-GCGAGCTCACGAGAGAGT-ACTGAGTAGATGGTTCGGAACTGATAGATAATCTAGAGAGAATAAT-3’ Dùng 2 mồi trên để chạy PCR với template là một plasmid chứa chuỗi pre-miR171a. Đoạn PCR hình thành là một cấu trúc lai gồm khung là pre-miR171a còn chuỗi miRNA là của gen b2 của CMV. Cấu trúc lai này chính là một pre-miRNA và được ký hiệu là miR2bprec Đoạn PCR được xử lý 2 đầu với BamHI/SacI và được nối vào vị trí tương ứng của vector pBI221. Vector này có chứa chuỗi promotor CaMV 35S (35Spro) và terminator của nopaline synthase gene (NOS Ter). Kết quả tạo ra vector pBI-35S-miR2bprec chứa một cassette biểu hiện : 35S Pro - miR2bprec – NOS Ter. Cassette biểu hiện được chuyển sang một vector song cực pCAMBIA 1300 để tạo ra vector p35S-miR2bprec. Chú ý là pCAMBIA 1300 chứa 1 marker chọn lọc là hygromycin phosphotransferase (hpt) dưới sự điề khiển của CaMV 35S. Vector p35S-miR2bprec được biến nạp vào vi khuẩn A. tumerfaciens (chủng EH105). cc uu c c cuuaccugaccacacacguag augagagagu cu gauauuggc ugguuca ucagau a |||||||||| || ||||||||| ||||||| |||||| ugcucucuca ga cuauaaccg gccgagu agucua u -u cu c u uuagaucucucuuauuacaua Hình Cấu trúc pre-miR171a của A. thaliana (từ cơ sở dữ miRBase) Hình Các cấu trúc pre-miRNA Hình trên cùng là sơ đồ cassette biểu hiện miRNA của gen b2 của CMV: promoter 35S (35S Pro) – miR2b – terminator của nopaline synthase (NOS Ter). Hình giữa: chuỗi kẹp tóc pre-miR171a của A. thaliana chứa chuỗi miR171 (màu đỏ). Hình dưới: chuỗi kẹp tóc miR2bpre chứa chuỗi miRNA là 21 nts của gen b2 của CMV (màu đỏ). Chuyển gen vào cây thuốc lá (J. of virology, June 2007, p. 6690–6699) Vector p35S-miR2bprec được biến nạp vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum cv. SR1 bằng phương pháp đĩa lá dung vi khuẩn A. tumerfaciens để tạo cây thế hệ T0. Các cây To được thử PCR để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. Cây T0 được tự thụ và hạt thế hệ T1 được gieo trên môi trường chứa hygromycin để chọn cây chuyển gen. Lây nhiễm nhân tạo Lá cây thuốc lá nhiễm CMV được nghiền trong đệm phosphate với tỷ lệ 1/10 và lây nhiễm bằng tiếp xúc cơ học trên 2 lá phía trên của cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 ở giai đoan 5-6 lá. Đánh giá cây chuyển gen được lây nhiễm CMV dựa trên triệu chứng Triệu chứng biểu hiện được đánh theo thang phân cấp thứ tự gồm 5 cấp: Cấp 0: không triệu chứng. Cấp 1: khảm nhẹ chỉ trên 1 lá ngọn. Cấp 2: khảm nhẹ, biểu hiện trên hơn 2 lá. Cấp 3: khảm rõ ràng trên lá già hơn và biến dạng nhẹ trên 2 lá ngọn. Cấp 4: triệu chứng tương tự cấp 3 nhưng cây còi cọc. Cấp 5: lá biến dạng rõ ràng và cây còi cọc mạnh. Phân tích miRNA trên cây chuyển gen Sự hình thành miRNA trên cây chuyển gen được đánh giá dựa trên kỹ thuật Northen blot. Các công đoạn tinh chiết, xây dựng dò và phát hiện RNA đều dùng các kít thương mại của hãng Ambion. Tinh chiết RNA (dùng kít mirVanaTM miRNA Isolation Kit). 250 mg mô lá được nghiền trong đệm chiết. Các phân tử RNA nhỏ (sRNA) được xử lý bằng cồn. Cố định sRNA qua màng lọc sợi thủy tinh. Rửa màng và giải hấp (elute) sRNA Thiết kế dò gán nhãn bức xạ (dùng kít mirVana™ miRNA Probe Construction Kit). Thiết kế một mồi oligo 5’-TCAGTTCCGAACCATCTACCCTGTCTC-3’. Mồi này có phần 5’ tương đồng với 19 nts của miR2b và phần 3’ (8 nt được gạch chân) tương đồng với phần 3’ của mồi T7 promotor (mồi T7 có sẵn trong kít). Mồi oligo và mồi T7 được ủ với enzyme Klenow để tạo sợi dsDNA. Tiếp theo, đoạn dsDNA được phiên mã trong hỗn hợp phiên mã chứa UTP-aP32 dùng T7 RNA polymerase để tạo dò RNA dài 19 nt gãn nhãn bức xạ. Phát hiện miRNA (dùng kít mirVana™ miRNA Detection Kit). Kỹ thuật lai hóa ở đây là lai hóa trong dung dịch. sRNA được trộn dò RNA gán nhãn bức xạ trong đệm lai hóa. Sau khi biến tính nhiệt, hỗn hợp được ủ qua đêm ở 42OC. Tiếp theo, hỗn hợp ủ được xử lý với RNAse A và RNAseT1 để loại bỏ dò thừa và RNA không lai hóa. Sản phẩm lai hóa (dạng sợi kép, rất bền) được điện di trên gel polyacrylamide biến tính 15% và kết quả được xác định bằng bức xạ đồ. Phân tích RNA của CMV trên cây lây nhiễm Phát hiện và lượng hóa RNA của CMV bằng kỹ thuật Northen blot (lai RNA:RNA) trên cây sau lây nhiễm nhằm đánh giá tính kháng. Tinh chiết RNA. RNA tổng số từ mô lá được chiết từ cây sau lây nhiễm dùng kit Trizol của hãng Invitrogen Chuẩn bị dò gán nhãnbức xạ. Dùng kit mirVana™ miRNA Probe Construction (hãng Ambion) tương tự như trên nhưng đoạn dò tương đồng với RNA virus là khoảng 200 nt đầu 3’ của RNA 2 của CMV. Phát hiện RNA virus bằng kỹ thuật northen blot chuẩn 20 mg RNA được điện di qua gel agarose 1.2% chứa 1% formaldehyde. Chuyển và cố định RNA sang màng Hybond-N (của hãng Amersham). Kiểm tra băng trên màng bằng nhuộm methylene blue (chú ý sản phẩm RNA 18S được sử dụng làm đối chứng nhằm kiểm tra lượng RNA điện di). Lai, rửa và phát hiện bằng bức xạ đồ băng RNA 2 của CMV bằng kỹ thuật northen blot chuẩn. Phân tích virion CMV trên cây lây nhiễm JOURNAL OF VIROLOGY, June 2007, p. 6690–6699 Phát hiện và lượng hóa sự có mặt của CMV trên cây lây nhiễm nhằm đánh giá tính kháng bằng ELISA. Kỹ thuật ELISA sử dụng là PTA-ELISA Nghiền lá cây bệnh trong đệm carbonate (pH9.6), nhỏ vào giếng của bản ELISA. Ủ bản ELISA ở 37OC/4giờ. Xử lý giếng với kháng thể thỏ đặc hiệu protei CP của CMV. Ủ bản ELISA ở 37OC/4giờ Xử lý giếng với kháng thể dê (liên kết enzyme HRP = horseradish peroxidase) đặc hiệu kháng thể thỏ. Ủ bản ELISA ở 37OC/4giờ. Thực hiện phản ứng tạo màu bằng xử lý giếng với cơ chất TMB (tetramethylbenzidine). Đánh giá kết quả bằng máy đọc ELISA ở 450 nm. Tham khảo CMV- compendium of Plant Protection, 2006, CABI Qu, J., Ye, J. and Fang, R. 2007. Artificial MicroRNA-Mediated Virus Resistance in Plants. Journal of virology, Vol.81: 6690–6699. Các kit thương mại để chiết sRNA, tạo dò gán nhãn bức xạ và phát hiện sRNA của hãng Ambion. Cơ sở dữ liệu miRNA tại website của trung tâm Sangger: Chương 8. PCR trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh Tóm tắt kỹ thuật PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử. PCR là một kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH. Có vô số tài liệu tiếng Việt và tiếng Anh về kỹ thuật PCR. Dưới đây là tóm tắt kỹ thuật Tùy thuộc khuôn là DNA hay RNA mà có tên phản ứng là PCR hay RT-PCR Khuôn là DNA => PCR (polymerase chain reaction) Khuôn là RNA => RT-PCR (Reverse transcription – PCR) Các bước cơ bản trong 1 phản ứng PCR gồm 3 bước : Biến tính. Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiêt độ cao (92 – 94 ) trong thời gian ngắn (khoảng 20 – 60 giây). Ỏ nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách thành sợi đơn. Gắn mồi. Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiêt độ gắn mồi (Ta) trong thời gian ngắn. Ta được tính toán tùy thuôch đặc điểm mồi, thường trong khoảng 40 – 60 . Ỏ nhiệt độ này, mồi gắn vào khuôn sợi đơn ở vị trí đặc hiệu. Tổng hợp sản phẩm PCR. Hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho phản ứng tổng hợp chuỗi (72 hoặc 68 tùy DNA polymerase chịu nhiệt). Trong trường hợp RT-PCR, trước khi thực hiện PCR, cần phải có thêm một bước chuyển khuôn RNA thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Hai bước RT và PCR có thể được thực hiện riêng rẽ hay trong cùng một tube phản ứng. Các bước trong chẩn đoán bệnh cây bằng PCR/RT-PCR Thiết kế mồi (primer) Chiết acid nucleic tổng số (DNA hoặc RNA) từ mô cây; dùng các kỹ thuật chiết thông thường (rẻ) hoặc kit chiết thương mại (đắt) Chạy PCR hoặc RT-PCR Kiểm tra và đánh giá kết quả bằng điện di Thiết kế và lựa chọn mồi (primer) Mồi là một chuỗi oligonucleotide sợi đơn ngắn (kích thước thường từ 18 – 24 nts). Có hai loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường các đối tượng của một chi, một họ). Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học… Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong chẩn đoán bệnh cây. Có 2 cách để có thể nhận được các mồi tốt. Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố. Tự thiết kế mồi. Tự thiết kế mồi Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit. Ngay sau khi các chuỗi DNA đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy theo yêu cầu. Các chú ý khi thiết kế mồi Độ dài mồi. Nên nằm trong khoảng 18-22 nts. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn. Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature). Tm là nhiệt độ mà tại đó 1/2 số sợi DNA kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng 52-58 oC. Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature). Ta được tính dựa trên Tm. Ta quá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng xuất PCR thấp. Ta quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Ta của 2 mồi xuôi và ngược dòng nên tương đương. Có nhiều cách tính Ta Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9 Hàm lượng GC. Số các gốc G và C nên nămg trong khoảng 40-60%. Chuỗi GC đầu 3’. Đầu tận cùng 3 ‘ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. Đầu 3’ không nên có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C. Cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc thứ cấp có thể hình thành trong cùng một mồi hoặc giữa 2 mồi. Mồi chứa cấu trúc thứ cấp xấu thường dẫn tới năng suất PCR bị giảm, thậm chí không có sản phẩm. Tính ổn định của cấu trúc thứ cấp được đo bằng ΔG (là năng lượng cần để phá vỡ cấu trúc thứ cấp, được tính từ các phần mềm thiết kế mồi). Các loại cấu trúc thứ cấp là: Hairpins. Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-2 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol. Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giưã các phân tử của cùng loại mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol. Tự mồi chéo (Cross Dimer). Là cấu trúc hình thành giưã các phân tử của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản ứng PCR). Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol. Các chuỗi lặp. Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime). Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi Độ ổn định đầu 3 ‘. Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nts) không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì có giá trị ΔG cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp. Vùng thiết kế mồi của khuôn. vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp. Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt cặp được. Thiết kế mồi chung (degenerate primer) Mồi chung là một mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ. Nếu vùng bảo thủ là đồng nhất thì mồi chung sẽ chỉ là một chuỗi mồi duy nhất. Nếu vùng bảo thủ chứa các vị trí sai khác thì mồi chung thực chất là một hỗn hợp các mồi, mỗi mồi tương ứng với một sai khác nucleotide. Trong thiết kế mồi chung, người ta sử dụng các mã suy biến tại các vị trí sai khác, ví dụ R là A hoặc G (số suy biến = 2); Y là C hoặc T (số suy biến bằng 2); N là A hoặc T hoặc G hoặc C (số suy biến bằng 4). Số sai khác nucleotide tại mỗi vị trí của mồi được gọi là các số suy biến. Tổng số mồi trong hỗn hợp sẽ bằng tích của tất cả các số suy biến tại mỗi vị trí. Để làm giảm số lượng mồi trong hỗn hợp, người ta thường sử dụng một nucleotide đặc biệt là inosine. Inosine có thể ghép cặp với bất kỳ nucleotide nào trong số 4 nucleotide A, T, G, C. Bảng Mã suy biến trong thiết kế mồi chung Viết tắt Nucleotide tương ứng Số suy biến R A hoặc G 2 Y C hoặc T 2 M A hoặc C 2 K G hoặc T 2 W A hoặc T 2 S C hoặc G 2 B C hoặc G hoặc T 3 D A hoặc G hoặc T 3 H A hoặc C hoặc T 3 V A hoặc C hoặc G 3 N A hoặc C hoặc G hoặc T 4 i Inosine 1 Phần mềm Các phần mềm thiết kế mồi và phân tích mồi có thể tải hoặc thực hiện trực tuyến tại website sau: Ví dụ mồi chung CIFor Một ví dụ mồi chung là mồi CIFor được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen CI của các potyvirus. Mồi này có trình tự là: 5’-GGiVViGTiGGiWSiGGiAARTCiAC-3’. Mồi CIFor có khả năng phát hiện hầu hết các virus thuộc chi Potyvirus. Hình dưới minh họa vị trí mồi trên bộ gen virus, trình tự mồi cũng như trình tự chuỗi gen CI của một số virus đại diện tại vị trí mồi. Mồi này đã xử dụng inosine tại các vị trí có số suy biến bằng 4, do vậy đã giảm số lượng mồi đơn trong hỗn hợp mồi từ 524288 xuống còn 32 mồi. Virus Trình tự nucleotide Mồi CIFor (5’ – 3’) GGi VVi GTi GGi WSi GGi AAR TCi AC Zucchini yellow mosaic virus GGA GCA GTG GGT TCT GGA AAA TCA AC Dasheen mosaic virus GGT GCT GTC GGG TCT GGT AAG TCG AC Potato virus A GGA GCA GTT GGT TCT GGC AAA TCA AC Clover yellow vein virus GGG GCT GTT GGA TCA GGA AAA TCG AC Lily mottle virus GGT GCT GTT GGA TCT GGA AAG TCG AC Papaya ringspot virus GGA GCT GTT GGT AGT GGT AAA TCA AC Lettuce mosaic virus GGT GGT GTC GGC TCC GGC AAG TCT AC Potato virus Y GGA GCT GTT GGG TCT GGA AAG TCA AC Maize dwarf mosaic virus GGA GCA GTC GGT TCG GGA AAA TCA AC Sugarcane mosaic virus GGA GCT GTT GGA TCA GGA AAA TGC AC Johnsongrass mosaic virus GGC AAC GTA GGA TCT GGG AAA TCA AC Cocksfoot streak virus GGA CCG GTC GGT TCC GGT AAA TCG TC Số suy biến 2 2 2 2 2 Tổng số mồi trong hỗn hợp mồi (dùng inosin2) 2 x 2 x 2 x 2 x 2 = 32 Tổng số mồi trong hỗn hợp mồi (nếu không dùng inosin) 4x2x2x4x4x4x2x2x4x4x2x4 = 524288 HcPro VPg 6K1 P1 P3 CI NIb NIa CP 6K2 3’ UTR 5’ UTR poly A CIFor Tham khảo Chương 9. Công nghệ huyết thanh học trong chẩn đoán Cơ sở của phản ứng huyết thanh học Các khái niệm Cơ sở của phương pháp huyết thanh học là dựa vào sự tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đó Kháng nguyên (antigen): Kháng nguyên thường là các đại phân tử chứa protein hoặc polysaccharide. Kháng nguyên phải có hai đặc tính quan trọng: (1) hoạt tính sinh miễn dịch tức khả năng kích thích động vật máu nóng hình thành kháng thể đặc hiệu và (2) tính đặc hiệu tức khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu tương ứng. Một số chất có trọng lượng phân tử thấp như các amino acid, một số loại polysaccharide... không có hoạt tính sinh miễn dich nhưng lại có khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên có chứa các chất này. Các chất đó được gọi là bán kháng nguyên (hapten). Nhóm quyết định kháng nguyên (epitope) Trên bề mặt kháng nguyên có các vùng đặc biệt có chức năng cảm ứng hình thành kháng thể và là vị trí liên kết kháng thể. Các vùng này được gọi là các nhóm quyết định kháng nguyên (epitope). Một nhóm quyết định kháng nguyên chỉ kích thích hệ miễn dịch của động vật máu nóng hình thành một dòng phân tử kháng thể. Kháng nguyên chứa một nhóm quyết định kháng nguyên gọi là kháng nguyên đơn giá, chứa nhiều nhóm quyết định kháng nguyên gọi là kháng nguyên đa giá. Các epitope có thể được chia thành: epitope trình tự: chỉ phụ thuộc trình tự amino acid epitope hình thái: phụ thuộc vào cả cấu trúc không gian epitope liên tục: là một chuỗi amino acid liên tục epitope không liên tục: là các amino acid không liền nhau (trên chuỗi cấp 1) nhưng do sự gấp của protein nên xắp xếp gần nhau dẫn tới cùng nhau tạo thành 1 epitope Kháng nguyên của tác nhân gây bệnh cây Virus. Đối với vi rusTrừ một vài ngoại lệ, phần có hoạt tính sinh miễn dich của virus thực vật là vỏ protein. Các virus thực vật là các kháng nguyên đa giá do vỏ protein của chúng có chứa nhiều điểm quyết định kháng nguyên. Vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn có thể có nhiều loại kháng nguyên như protein, polysacaride. Lông roi của vi khuẩn là một loại kháng nguyên tốt gọi là kháng nguyên H. Các chất từ vách tế bào vi khuẩn có hoạt tính kháng nguyên được gọi là kháng nguyên O. Kháng thể (antibody) Sự hình thành kháng thể: Hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật máu nóng bao gồm các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch (tuyến ức, lách, tủy...) là nơi sản sinh, duy trì, biệt hoá và điều khiển sự hoạt động của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (chủ yếu gồm 2 loại là lympho bào B và lympho bào C) tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể nhằm chống lại các tác nhân lạ xâm nhập. Có 2 kiểu đáp ứng miễn dịch: Kiểu đáp ứng miễn dịch dịch thể: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào B. Lympho bào B được biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất ra kháng thể dịch thể. Kháng thể dịch thể tồn tại trong dịch cơ thể (huyết tương) và sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. Kiểu đáp ứng miễn dịch tế bào: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T. Lympho bào T được biệt hoá thành lympho bào T mẫn cảm kháng nguyên và chính bản thân chúng là kháng thể tế bào. Kháng thể tế bào tồn tại trên bề mặt tế bào và cũng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. Như vậy, theo nghĩa rộng, kháng thể là bất kỳ phân tử nào có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên. Tuy nhiên, kháng thể sử dụng trong chẩn đoán bằng kỹ thuật huyết thanh học chính là các kháng thể dịch thể Kháng thể dịch thể là các globulin miễn dịch (Immunoglobulin-Ig). Có 5 lớp Ig là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE nhưng trong chẩn đoán huyết thanh học, thường chỉ sử dụng IgG. Cấu tạo của IgG (xem hình vẽ): gồm 4 phân tử polypeptid (2 chuỗi nặng, 2 chuỗi nhẹ) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfide. Phân tử IgG có 3 vùng chức năng chính (có thể tách được bằng một enzym protease là papain) Hai mảnh Fab (antigen binding fragment) giống nhau về cấu trúc và mang tính chất kháng thể do chứa vị trí liên kết với kháng nguyên. Các mảnh Fab, khi được tách ra bằng papain, sẽ vẫn giữ nguyên hoạt tính kháng thể nhưng không thể tạo ra phản ứng kết tủa hoặc phản ứng ngưng kết. Một mảnh Fc (cristallizable fragment) không có hoạt tính kháng thể nhưng chứa nhóm quyết định kháng nguyên của phân tử IgG do vậy khi tiêm phân tử IgG nguyên vẹn hoặc chỉ cần mảnh Fc từ 1 loài (chẳng hạn thỏ) sang 1 loài khác (chẳng hạn dê) thì loài thứ 2 sẽ vẫn tạo ra kháng thể đặc hiệu kháng thể của loài thứ nhất (anti-antibody). Đây là cơ sở cho các kiểu ELISA gián tiếp. Hình. Cấu trúc kháng thể IgG Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody (MAb) Là kháng thể được hình thành chỉ từ một dòng lympho bào B Nhận biết và liên kết với chỉ 1 epitope Sản xuất phức tạp Kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody (PAb) Là một hỗn hợp của các kháng thể đơn dòng Sản xuất đơn giản. Việc sản xuất chỉ bao gồm tiêm kháng nguyên (phân tử virus, protein virus, protein vi khuẩn, nấm…) vào động vật máu nóng (như thỏ, dê, chuột…) và thu kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh sẽ chứa một hỗn hợp nhiều loại kháng thể, mỗi loại đặc hiệu cho 1 epitope. Sản xuất kháng thể đơn dòng Các bước chính để sản xuất kháng thể đơn dòng gồm 1. Gây miễn dịch trên chuột. Bước này giống như sản xuất kháng thể đa dòng. 2. Dung hợp (lai) tế bào myeloma chuột và tế bào lá lách chuột đã gây miễn dịch. Nuôi cấy một dòng tế bào myeloma chuột. Tế bào myeloma là một loại tế bào bạch cầu bị ung thư nên có 2 đặc điểm: (1) không thể sản xuất kháng thể và (2) có thể sinh trưởng vô hạn định. Ngoài ra, vì chúng bị mất chức năng của gen HGPRT (hypoxantine guanine phosphoribosyl transferase) nên không thể sống được trên môi trường HTA (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) vì aminopterin trong môi trường ức chế một đường hướng sinh hóa liên quan đến biểu hiện gen HGPRT. Tinh chiết tế bào lá lách của chuột đã gây miễn dịch. Dịch tế bào lá lách sẽ chứa lympho bào B sản xuất kháng thể. Loại tế bào miễn dịch này có thời gian sống ngắn và không thể sống được trên môi trường nuôi cấy nhân tạo. Dung hợp các tế bào lá lách với các tế bào myeloma nhờ PEG (polyethylene glycol) để tạo ra các tế bào lai (hybridoma). Tế bào lai kết hợp đặc điểm của lympho bào B (tạo kháng thể) và đặc điểm của tế bào myeloma (sinh trưởng vô hạn định trên môi trường nhân tạo). Nuôi cấy tế bào lai trong môi trường chọn lọc. Môi trường chọn lọc chứa HTA (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) không cho phép sự sinh trưởng của các tế bào không lai. 3. Kiểm tra sự có mặt của Mabs trong dịch nuôi cấy của từng dòng tế bào lai bằng ELISA 4. Nuôi cấy phục hồi từng dòng tế bào lai có kháng thể mong muốn (ELISA +) 5. Tạo kháng thể từ các dòng tế bào lai có kháng thể mong muốn bằng invitro (trên môi trường nhân tạo hoặc in vivo (trong cơ thể chuột). Hình. Sơ đồ qui trình tạo kháng thể đơn dòng Qui trình tạo kháng thể đơn dòng (của Đại học Cornell, 2008) Gây miễn dịch trên thỏ Sử dụng chuột cái, 8-10 tuần tuổi Gây miễn dịch trên thỏ 3 lần (ngày 0, 14, 21): tiêm 100 uL dịch protein (1-100 ug kháng nguyên) + 100 uL adjuvant hoàn toàn (complete adjuvant). Lượng kháng nguyên tiêm lần đầu gấp đôi lượng kháng nguyên tiêm ở các lần sau. Lấy máu và thu kháng huyết thanh (~100 uL) trước mỗi lần tiêm. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể trong kháng huyết thanh = ELISA sau ngày 21. Giá trị ELISA nên tăng trong khoảng 100-1000 sau 21 ngày. Khi chuột đã hình thành đủ kháng thể (thường sau 3 lần tiêm, đôi khi sau 4 lần), tiêm tiếp kháng nguyên 3 lần (ngày 28, 29,30) nhưng không hòa với adjuvant. Thực hiện dung hợp vào ngày 31 Dung hợp (lai) Làm ấm các môi trường và Polyethylen glycol (PEG) 1500 (hãng Roche) tới 37 OC. Các môi trường gồm: Môi trường HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), hãng Sigma Môi trường Hyb-SFM (Hybridsoma Serum-Free Medium). Đây là môi trường chứa insulin, transferrin và chất kháng sinh đỏ phenol) (hãng Invitrogen) Môi trường Hyb-SFM +10 % FBS (foetal bovine serum = huyết thanh bào thai bò). Môi trường này là môi trường nuôi cấy tế bào (hãng Invitrogen) Chuẩn bị tế bào myeloma. Tế bào myeloma dòng X63-Ag8.653 được nuôi cấy trong môi trường Hyb+10% FCS (foetal calf serum) khoảng 1 tuần trước khi dung hợp. Tế bào được nuôi cấy trong đĩa petri (loại 15 cm) chứa 60 mL môi trường nuôi cấy Hyb+10% FCS trong tủ ấm. Thu thập – tinh chiết tế bào lá lách chuột đã gây miễn dịch. Giết chuột và đặt trong cốc thủy tinh chứa ~200 mL Betadine 80% chứa 20% ethanol 70%. Giải phẫu trong điều kiện vô trùng để lấy lá lách chuột. Lá lách được chuyển sang đĩa Petri chứa 1 mL môi trường Hyb SFM + 10%FCS. Cắt lá lách thành các mảnh nhỏ và dùng panh vô trùng ép để giải phóng tế bào lá lách. Rửa tế bào + tàn dư với 2- 3 mL môi trường (~ 4 lần) và chuyển toàn bộ sang tube 50 mL. Để tube khoảng 1 phút để lắng tàn dư và hút dịch tế bào sang tube mới. Ly tâm tube 900-1000 rpm trong 5 phút. Loại bỏ dịch trên tủa và hòa cặn tế bào lá lách trong 20 mL đệm HYB-SFM + 10% FBS. Đếm tế bào lá lách (cả hòa loãng 1:10 và không hòa loãng). Đếm số tế bào myeloma X63 (số lượng yêu cầu = 1/2 số lượng tế bào lá lách). Trộn trực tiếp tế bào lá lách với tế bào X63 Dung hợp Ly tâm hỗn hợp tế bào 900-1000 rpm /5 phút. Rửa tế bào với 25 ml môi trường Hyb-SFM medium. Ly tâm, giữ lại cặn tế bào. Búng nhẹ ống ly tâm để tách rời tế bào. Cho từ từ1.5ml PEG (cho khoảng 3x108 tế bào hỗn hợp) vào thành ống, tốc độ khoảng 1 mL/phút (cho từ từ để tế bào khỏi bị phồng). Sau khi cho PEG xong, trộn đều ống bằng lắc nhẹ. Ủ ống ở 37 OC / 1 phút. Dùng pipets cho rất từ từ 20 mL môi trường Hyb-SFM (1mL / phút đầu tiên, 3 mL / phút thứ 2 và 16 mL/phút thứ 3). Ly tâm. Hoà cặn tế bào lai trong môi trường HAT và cho vào các đĩa nuôi cấy tế bào loại 24 giếng. Lượng cho là 2 mL /giếng với nồng độ 106 tế bào / giếng. Bọc các đĩa với màng Saran và ủ trong tủ định ôn với điều kiện 37°C, 5% CO2. Dòng hóa Sau khi ủ khảng 10-14 ngày, các dòng tế bào có thể quan sát thấy bằng mắt và môi trường ở một số giếng bắt đầu chuyển màu vàng nhạt. Kiểm tra sự hình thành kháng thể bằng ELISA Ở các giêngs có phản ứng ELISA (+), chuyển từng dòng tế bào sang giếng của đĩa nuôi cấy loại 96 giếng chứa 150 uL môi trường Sau khoảng 3 ngày, thử tiếp ELISA cho từng clone Các clone + sẽ được nuôi cấy lần lượt trên môi trường HAT => HT => Hyb + 10%FCS. Sản xuất Kháng thể có thể được sản xuất bằng 2 cách: Nuôi cấy các dòng tế bào lai trên môi trường nuôi cấy như Hyb-SFM => tạo số lượng ít Nuôi cấy trong cơ thể chuột bằng cách tiêm tế bào lai vào xoang bụng => tạ số lượng nhiều Kỹ thuật chẩn đoán bằng ELISA ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật chẩn đoán quan trọng và phổ biến nhất hiện nay so với các kỹ thuật huyết thanh học khác. Trong bệnh cây, ELISA được sử dụng chủ yếu để chẩn đoán virus và một số vi khuẩn. Một trong số các hãng nổi tiếng có bán các kít ELISA chẩn đoán bệnh cây là Agdia ( Vật liệu chính cho ELISA Bản ELISA: bằng nhựa (polystyrene), 96 giếng, liên kết không đặc hiệu các loại protein Các loại dung dich đệm: Đệm nghiền mẫu, đệm pha kháng thể, đệm rửa, đệm pha chất nền (cơ chất). Kháng thể các loại Chất nền: nhiều loại, tùy thuộc enzyme, phổ biến nhất là NPP (nytrophenyl phosphate) Enzyme: nhiều loại, cần cơ chất tương ứng, phổ biến nhất là alkaline phosphatase (cơ chất tương ứng là NPP) Máy đọc ELISA: là một loại thiết bị so màu vi phiến nhằm lượng hóa màu phản ứng. Dụng cụ nghiền, chiết mẫu cây: chày, cối sứ… Các kỹ thuật ELISA. Có rất nhiều kỹ thuật ELISA khác nhau. Dựa vào quan hệ của kháng thể liên kết enzyme với kháng nguyên, ELISA có thể được chia làm 2 nhóm (xem hình) là: Nhóm trực tiếp (direct ELISA): Kháng thể liên kết enzyme là kháng thể phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật I, VIII và IX trong sơ đồ). Nhóm gián tiếp (indirect ELISA): Kháng thể liên kết enzyme không phải là kháng thể phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật II, III, IV, V, VI, VI trong sơ đồ). ELISA cũng gồm rất nhiều kiểu khác nhau. Hai ví dụ đang được sử dụng tại BM Bệnh cây là; Kẹp kép kháng thể (double antibody sandwich = DAS) (tất cả các kỹ thuật ngoài trừ kỹ thuật II trong sơ đồ) Bẫy kháng nguyên trước (plate-trapped antigen = PTA) như kỹ thuật II trong sơ đồ. Hình Các kỹ thuật ELISA khác nhau. Dưới đây là qui trình thử 2 kiểu phản ứng ELISA đại diện cho mỗi nhóm. Kỹ thuật ELISA trực tiếp kiểu kẹp kép kháng thể (DAS-ELISA) Cố định IgG đặc hiệu virus vào bản ELISA: IgG được hoà trong dung dịch đệm phủ (thường là đệm carbonate) và được cho vào giếng với lượng 100ml/giếng. Bản ELISA được ủ trong hộp ẩm ở 37OC khoảng 2-4 giờ. Bản ELISA, thường cấu tạo bằng polystirene có khả năng liên kết không đặc hiệu với protein do vậy sẽ liên kết với các phân tử IgG (là protein miễn dịch). Sau khi ủ, giếng được rửa bằng đêm rửa và nước. Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền mẫu cây đệm chiêt mẫu thành dịch cây. Dịch cây được cho vào giếng với lượng100ml/giếng. Bản ELISA được ủ ở 37OC khoảng 2-4 giờ hoặc qua đêm ở 4-6OC. Nếu trong dịch cây có chứa virus thì virus sẽ liên kết đặc hiệu với IgG có sẵn trong giếng còn protein của cây hoặc các virus khác sẽ không liên kết. Sau khi ủ, bản ELISA được rửa như bước 1. Cố định IgG liên kết enzim: Hoà IgG liên kết enzim (IgG-E) trong đệm liên kết và cho vào giếng với lượng 100ml/giếng. IgG này giống như IgG của bước 1 nhưng chỉ khác là nó được liên kết từ trước với 1 enzim là Alkaline Phosphatase (AP). Bản ELISA được ủ và rửa như bước 1. Cố định chất nền và đánh giá kết quả: Hoà chất nền trong đệm chất nền theo tỷ lệ 0.6mg/ml) và cho giếng với lượng100ml/giếng. Chất nền ở đây là Nitrophenyl phosphate (NPP). Bản ELISA được ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp ẩm trong tối 60 phút. Phản ứng hoá học ở đây là NPP sẽ bị thuỷ phân thành Nitrophenol phosphate dưới sự xúc tác của enzim AP. Nitrophenol phosphate là chất có màu vàng, do vậy có thể nhận biết được bằng mắt hoặc bằng máy đọc ELISA (máy so màu). Hiển nhiên, do nồng độ NPP đều giống nhau ở các giếng nên giếng nào có màu vàng càng đậm chứng tỏ nồng độ enzim càng cao tức nồng độ virus trong mẫu thử càng cao. Có thể ngừng phản ứng thuỷ phân bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 3M với lượng 25-50 ml/giếng. Phản ứng ELISA gián tiếp kiểu bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA) Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền mẫu cây trong đệm phủ và cho 100ml/giếng. ủ bản ELISA qua đêm ở 4-6OC trong hộp ẩm. Sáng hôm sau, rửa 3 lần bằng đệm rửa. Protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành giếng. Cố định IgG thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA: Hoà IgG đặc hiệu virus trong đệm huyết thanh và cho 100ml/giếng. ủ bản ELISA ở 25OC 1-2 giờ trong hộp ẩm. Rửa bản ELISA như bước 1. Cố định IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP vào bản ELISA: Hoà IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP trong đệm liên kết và cho 100ml/giếng. ủ bản ở 25OC 1-2 giờ. IgG liên kết AP thứ 2 này là IgG được tạo ra khi tiêm IgG của thỏ vào 1 loài động vật khác thỏ (chẳng hạn dê) nên không liên kết với virus mà liên kết với IgG thỏ đặc hiệu virus ở bước 2. Sau khi ủ, rửa bản như bước 1 Cố định chất nền vào bản ELISA: Thực hiện tương tự như ở DAS-ELISA.