Bài giảng Giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán Covid-19

PGS. TS. Cao Minh Nga Khoa Y - ÑH Y Döôïc TP. HCM IV Môû ñaàu I II III Tính chaát virus hoïc cuûa SARS-CoV-2 Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 Keát luaän I. Môû ñaàu  COVID-19 (bệnh hô hấp cấp tính) do SARS-CoV-2 (chủng virus Corona mới) gây ra từ 12/2019, là một đại dịch toàn cầu.  Thời kỳ ủ bệnh: 2-14 ngày, trung bình 5-7 ngày.  Lâm sàng: nhiễm không triệu chứng  nặng, tử vong ( 2,7%).  Xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 sớm  quản lý tốt lâm sàng, kiểm soát ổ dịch.  Xét nghiệm khẳng định căn nguyên: phát hiện SARS-CoV-2 bằng kỹ thuật real-time RT-PCR hoặc giải trình tự gen từ các bệnh phẩm. I. Môû ñaàu  Virus corona (CoV) có 4 giống chính: alpha, beta, gamma, delta  7 loại lây nhiễm cho người (HCoV) là: 1. 229E (alpha coronavirus) Gây cảm lạnh thông thường 2. NL63 (alpha coronavirus)  20% số ca nhiễm trùng hô hấp hàng năm 3. OC43 (beta coronavirus) thường gặp thứ 2 sau rhinovirus 4. HKU1 (beta coronavirus) 5. SARS-CoV  SARS, 2002 Gây bệnh nặng, 6. MERS-CoV  Hội chứng đều thuộc giống (genera) hô hấp Trung Đông, từ 2012 beta coronavirus 7. SARS-CoV-2  COVID-19, 2019 * Nhiều CoV gây bệnh ở động vật (tổn thương ruột/gia súc). II. Tính chaát virus hoïc cuûa SARS-CoV-2  Cấu trúc & thành phần: - là virus RNA có màng bọc, lớn (125nm) - RNA sợi đơn, không phân đoạn. - có cơ chế đọc sửa RNA  tỷ lệ đột biến tương đối thấp. - Có 4 protein cấu trúc  4 loại kháng nguyên (KN) : Spike (S): là protein ở các gai trên màng bọc Envelope (E): là protein nhỏ trên màng bọc Membrane (M): là protein lớn trên màng bọc Nucleocapsid (N): là protein của nucleocapsid. II. Tính chaát virus hoïc cuûa SARS-CoV-2  Cấu trúc & thành phần: 4 loại protein (kháng nguyên) S, M, E & N. II. Tính chaát virus hoïc cuûa SARS-CoV-2  Cấu trúc genome của SARS-CoV-2: - sợi đơn RNA, không phân đoạn, chiều dài  29,7 lớn nhất trong số các virus RNA - Khung đọc mở của các gen mã hóa protein cấu trúc: S, E, M, N. - Gen không cấu trúc: RdRp (RNA-dependent RNA polymerase), Orf1a, Orf1ab.  First line screening assay: E gene assay  Confirmatory assay: RdRp gene assay III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19  Các phương pháp (pp) chính chẩn đoán () bệnh nhiễm virus: - pp virus học: nuôi cấy virus trong nuôi cấy tế bào. - pp miễn dịch học: phản ứng KN - kháng thể (KT) - pp sinh học phân tử: phát hiện gen đặc hiệu của virus (RNA/DNA)  Cách phân loại khác: -  trực tiếp: phát hiện virus hoặc thành phần virus (KN, RNA/DNA)   giai đoạn sớm,  xác định. -  gián tiếp: phát hiện sự đáp ứng miễn dịch của ký chủ khi nhiễm virus là KT  hỗ trợ , dịch tễ học. III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19  XN phát hiện SARS-CoV-2, gồm: * Trực tiếp: phát hiện chính virus hay thành phần của virus - Nuôi cấy virus: phát hiện virus còn sống - XN khuếch đại acid nucleic (NAAT) hay sinh học phân tử - XN phát hiện kháng nguyên: chẩn đoán nhanh * Gián tiếp: phát hiện đáp ứng miễn dịch của người nhiễm virus - XN kháng thể 10 From: Sethuraman et al, JAMA. Published online May 6, 2020. doi:10.1001/jama.2020.8259 Diễn giải xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19  Khi có ca bệnh nghi ngờ  XN khẳng định nhiễm SARS-CoV-2.  Lấy bệnh phẩm: - Để chẩn đoán trực tiếp: + Dịch đường hô hấp trên (dịch hầu họng & mũi họng). + Dịch đường hô hấp dưới (đàm, dịch hút phế quản, dịch rửa phế nang) + Ngoài ra, SARS-CoV-2 RNA còn hiện diện trong phân, máu, nước bọt, dịch mắt, nước tiểu, tinh dịch, mô não, dịch não tủy. - Để chẩn đoán gián tiếp: mẫu máu (3 mL – 5 mL) Le ve ls From:C. Galli and D. Daghfal, Serological approaches for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection (White Paper) Viral RNA Thời gian từ khi nhiễm Th/k cấp muộn Kháng nguyên IgM IgG Th/k cấp sớm Ủ bệnh Viral detection tests Host immune response detection tests Bình phục Các dấu ấn sinh học chính khi nhiễm SARS-CoV-2 III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 Quy trình xét nghiệm phát hiện nhiễm SARS-CoV-2 cấp tính ở những người có nghi ngờ lâm sàng với COVID-19 (WHO, 11-9-2020) III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 1. Nuôi cấy virus (phân lập virus): - phân lập virus trong nuôi cấy tế bào - không khuyến cáo trong chẩn đoán thường qui - cần cơ sở có an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3) - cần nhân viên được đào tạo chuyên sâu - có kết quả sau 1 – 2 tuần - cần xác định tiếp tục bằng xét nghiệm đặc hiệu.  Ứng dụng: nghiên cứu, điều chế vaccine III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 2. Xét nghiệm sinh học phân tử hay khuếch đại acid nucleic (NAAT - Nucleic acid amplification test): Kỹ thuật thường sử dụng: - Real-time RT-PCR (Real-time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) Viết tắt: rRT-PCR hay qRT-PCR (quantitative RT-PCR) - Giải trình tự gene III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 2. Xét nghiệm sinh học phân tử 2.1. Real-time RT-PCR (rRT-PCR hay qRT-PCR) - Khuyến cáo trong chẩn đoán thường qui: sàng lọc & khẳng định bất kỳ trường hợp nào nghi nhiễm SARS-CoV-2 cấp. - Các gene đích của XN: E, N, S, RdRP, ORF1a và ORF1ab. + Chẩn đoán tối ưu:  2 gene đích của SARS-CoV-2, + Có thể: 1 gene đích duy nhất (vùng dịch tễ). III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 2. Xét nghiệm sinh học phân tử 2.1. Real-time RT-PCR (rRT-PCR hay qRT-PCR) Dương tính giả: - khi có kết quả dương tính yếu, vì một số XN tạo ra tín hiệu giả ở giá trị Ct cao. - do sai sót kỹ thuật: rất hiếm.  Khi kết quả XN chưa thỏa đáng: lấy mẫu và XN lại. III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 2. Xét nghiệm sinh học phân tử: Âm tính giả: - chất lượng BP kém do chứa quá ít vật liệu của BN; - BP được lấy muộn từ khi khởi bệnh (> 3 tuần), hoặc lấy BP vào thời điểm tải lượng virus thấp; - BP không được xử lý và/hoặc vận chuyển thích hợp; - các lý do kỹ thuật vốn có trong XN, ví dụ: + ức chế PCR + hoặc đột biến virus III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 2. Xét nghiệm sinh học phân tử - 2.2. Giải trình tự gene cho SARS-CoV-2  Để điều tra diễn tiến dịch bệnh: - những thay đổi về quy mô của dịch bệnh theo thời gian, - sự lây lan theo không gian của dịch bệnh - kiểm tra các giả thuyết về các đường lây truyền.  Để quyết định chọn kỹ thuật chẩn đoán, thuốc và vaccine.  Tuy nhiên, chi phí và khối lượng công việc cao,  thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên sâu,  nghiên cứu. III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 3. Xét nghiệm phát hiện KN đặc hiệu của SARS-CoV-2:  Là các XN tin cậy mà ít tốn kém, đơn giản và nhanh hơn.  Không khuếch đại mục tiêu đích như NAAT  kém nhạy hơn (0-94%) nhưng độ đặc hiệu cao (>97%). WHO: chấp nhận cho chẩn đoán LS khi XN đạt yêu cầu độ nhạy > 80%, độ đặc hiệu  97% so với kỹ thuật tham chiếu NAAT.  Các test chẩn đoán KN giúp  XN SHPT & chẩn đoán nhanh COVID-19.  Hiệu quả XN cao khi tải lượng virus cao vào thời điểm lấy mẫu: - giai đoạn đầu nhiễm SARS-CoV-2 - trong vòng 9 ngày sau khi khởi phát triệu chứng.  Kết quả DƯƠNG TÍNH GIẢ: có thể với HCoV khác. 22 Confidential SARS-CoV-2 structure and assay target https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=23311 Assay target ＝ NP（Nucleocapsid protein) NP is released from RNA in virions by pretreatment with detergent NP is measured/detected by sandwich immunoassay Dinesh et al. (2020). Structural basis of RNA recognition by the SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphoprotein bioRxiv https://dx.doi.org/10.1101/2020.04.02.022194 III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 3. Xét nghiệm phát hiện KN  Có 2 loại: - Test tại phòng xét nghiệm: Ví dụ: XN miễn dịch men hóa phát quang (Nhật bản) (Chemiluminescence Enzyme Immunoassay (CLEIA) assay). - Test nhanh (RDT - Rapid Diagnostic Tests): + thực hiện gần người bệnh. + KN (protein) đích: thường là kháng nguyên N (số lượng lớn) + thường là test sắc ký miễn dịch (Immuno-chromatography: ICA) + cho kết quả trong vòng 30 phút. Ví dụ: Test STANDARD COVID-19 Ag Le ve ls From:C. Galli and D. Daghfal, Serological approaches for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection (White Paper) Viral RNA Thời gian từ khi nhiễm Th/k cấp muộn Kháng nguyên IgM IgG Th/k cấp sớm Ủ bệnh Viral detection tests Host immune response detection tests Bình phục Các dấu ấn sinh học chính khi nhiễm SARS-CoV-2 III. Caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn COVID-19 4. Xét nghiệm phát hiện kháng thể (KT):  Không sử dụng cho mục đích sàng lọc & chẩn đoán xác định nhiễm SARS-CoV-2.  Kết quả DƯƠNG TÍNH: đã hoặc đang nhiễm SARS-CoV-2.  Kết quả ÂM TÍNH: - không đang bị nhiễm SARS-CoV-2. - đã nhiễm nhưng đáp ứng miễn dịch chưa đủ mạnh hoặc: chưa đủ thời gian tạo KT sau phơi nhiễm  XN phát hiện KT giúp: - Nghiên cứu & giám sát dịch tễ học COVID-19 - Hỗ trợ chẩn đoán, ví dụ: Độ nhạy khi kết hợp IgG & RNA > 99%. Tóm tắt: Phân biệt các phương pháp xét nghiệm V. Keát luaän  Có nhiều phương pháp xét nghiệm chẩn đoán COVID-19.  Real-time RT-PCR (rRT-PCR hay qRT-PCR): là xét nghiệm sàng lọc & khẳng định trong chẩn đoán thường qui.  XN phát hiện kháng nguyên: ngày càng hoàn thiện, rất hữu ích cho thực tiễn lâm sàng.  XN phát hiện kháng thể: không sử dụng cho mục đích sàng lọc & chẩn đoán xác định nhiễm SARS-CoV-2.  Nuôi cấy virus & giải trình tự gene: sử dụng cho mục đích nghiên cứu & sản xuất vaccine. Tài liệu tham khảo chính 1. WHO. Diagnostic testing for SARS-CoV-2. Interim guidance, 11-9-2020. 2. WHO. Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays. Interim guidance, 11-9- 2020. 3. Bộ Y tế. QUYẾT ĐỊNH về việc phê duyệt Kế hoạch xét nghiệm phát hiện nhiễm SARS-CoV-2 trong giai đoạn dịch COVID-19. 4042 / QĐ-BYT, 21-9-2020. 5. Đỗ Thị Thu Thủy. Cập nhật về phương pháp xét nghiệm SARS- CoV-2. CDC Hoa Kỳ tại Việt Nam, 12-10-2020. 6. Claudio Galli. Giới thiệu xét nghiệm IgG Ab. Abbott Diagnostics, 2020. 7. Tài liệu chuyên môn của Fujirebio. SARS-CoV-2 antigen assays, 2020. Thanks for your attention!