Bài giảng Lịch sử và Phương pháp nghiên cứu Nucleic Acid

7 Chương 1 Lịch sử và Phương pháp Nghiên cứu Nucleic Acid I. Lịch sử nghiên cứu Nucleic acid là những hợp chất cao phân tử đóng vai trò hết sức quan trọng trong hoạt động sống của mọi cơ thể sinh vật. Chúng tham gia vào các quá trình cơ bản của sự sống như sinh tổng hợp protein, sinh trưởng, sinh sản và di truyền. Trong một thời gian dài các nhà hóa học và các nhà nghiên cứu về sinh lý dinh dưỡng đã coi protein, lipid và carbonhydrate là ba chất quan trọng nhất tạo nên cơ thể sống. Quan điểm cho rằng nucleic acid là những cấu tử trơ của nhân và tế bào chất đã mãi mãi lãng quên từ khi chất thứ tư này – nucleic acid được chứng minh là chất quan trọng hơn so với các chất trước đó. Năm 1869, lần đầu tiên nhà hóa sinh học trẻ tuổi người Thụy Sĩ Friedrich Miescher (1844 -1895) đã phát hiện nucleic acid trong nhân tế bào. Ông đã đặt tên là nuclein vì nhận thấy nó tồn tại ở trong nhân tế bào (nucleus). Đối tượng nghiên cứu của Miescher là những bạch cầu (lymphocytes). Khi dùng acid kết tủa dịch chiết xuất từ nhân của tế bào mủ lấy từ bông băng bỏ đi (bằng cách dùng enzyme phân hủy protein của dịch dạ dày là pepsin để tiêu hóa các phần khác giàu protein của tế bào) ông đã vô cùng ngạc nhiên nhận thấy rằng, nhân tế bào chứa một chất không phải mỡ, không phải carbonhydrate, cũng không phải protein. Nó cũng không giống một chất sống nào đã biết và chứa phosphor và nitơ, hòa tan thì cho tính acid. Từ “nucleic acid” là do Altman đề nghị năm 1889 (ông đã phát hiện ra rằng đối tượng thuận tiện tốt nhất để chiết rút chất nuclein là những đầu tinh trùng của cá hồi). Và thực chất mỗi đầu tinh trùng của cá hồi hoàn toàn tương ứng với một nhân tế bào. Để điều chế chế phẩm nucleic acid, Miescher đã hòa tan phần đầu của tinh trùng (tế bào sinh dục đực) trong dung dịch muối nồng độ cao, sau đó bằng cách thêm nước vào đã gây ra kết tủa nucleic acid ở dạng sợi. Cần phải giữ chế phẩm lạnh do đó trong các ngày đông tháng giá của mùa đông, ông đã làm việc trong phòng không sưởi. Thực tế, lịch sử nghiên cứu hóa học của nucleic acid gắn liền 8 với tên tuổi của Felix Hoppe - Seiler (1825-1895), nhà sinh lý học và hoá học rất nổi tiếng người Đức vì chính ở phòng thí nghiệm của ông ở Tübingen. Miescher đã làm việc với danh nghĩa là người học trò và cộng tác viên khoa học trẻ. Mặc dù Miescher là một cộng tác viên vô cùng cẩn thận và đầy triển vọng song Hoppe - Seiler vẫn thấy cần thiết phải đích thân lặp lại thí nghiệm xem có đúng là một chất mới hay không. Kết quả thực nghiệm không những khẳng định thành tựu của Miescher mà còn thu được thêm nhiều dẫn liệu mới rất đặc trưng. Hoppe - Seiler còn phát hiện trong nhân tế bào nấm men cũng có chất nuclein giống như ở tế bào bạch cầu. Người kế tục phát triển công trình của Miescher là nhà hóa sinh học (hóa học hữu cơ) người Đức Albrecht Kossel (1853 - 1927). Năm 1882, ông đã phân tích nucleic acid ra những phần nhỏ chứa acid phosphoric, đường và base chứa nitơ (Kossel đã tách được hai pyrimidine và đặt tên là cytosine và thymine, cũng như hai purine với tên adenine và guanine). Do công trình này ông đã đạt giải Nobel về y và sinh lý học vào năm 1910. Một pyrimidine khác là uracil cũng đã được phát hiện sau này. Trong những năm đầu của thế kỷ XX (1900 - 1932), nhà hóa sinh học người Mỹ gốc Nga Phoebus Aaron Theodore Levene (1869 - 1940) đã xác định được đơn vị cấu tạo của nucleic acid là các nucleotide (hay mononucleotide) và phân biệt được hai loại nucleic acid: deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). Như vậy, cho đến năm 30 của thế kỷ XX này, người ta đã biết được thành phần của các nucleic acid. Levene đã đoán trước 4 nucleotide khác nhau liên quan đến RNA là adenylic acid (chứa adenine), guanilic acid (chứa guanine), cytidilic acid (chứa cytosine) và uridic acid (chứa uracil). Ông cũng giả thiết 4 nucleotide tiếp theo liên quan đến DNA là deoxyadenilic acid, deoxyguanilic acid, deoxythymidilic acid (chứa thymidine) và deoxycytidilic acid (chứa cytosine). Do các giả thiết này của Levene tỏ ra phù hợp với hiểu biết của hóa học cho nên chúng sớm được các nhà hóa học chấp nhận. Nhưng cho đến thời kỳ đầu những năm 1950, chúng vẫn chưa được chứng minh rõ ràng khi nhà hóa sinh học người Anh Alexander Robertus Todd (1907-1997) chưa tổng hợp được các nucleotide phù hợp một cách chính xác với các công thức của Levene. Todd đã xác nhận được rằng các chất này thực tế giống 9 các hợp chất đã thu nhận được từ nucleic acid. Với công trình này, Todd đã được trao giải thưởng Nobel về hóa học năm 1957. Trong những năm 1949 - 1953 nhà sinh học người Mỹ gốc Áo Erwin Chargaff (1905 - 2002) khi phân tích DNA đã phát hiện sự cân bằng của các base trong DNA: số nhóm purine bằng số nhóm pyrimidine (purine/pyrimidine = 1), số nhóm adenine bằng số nhóm thymine (adenine/thymine = 1), số nhóm guanine bằng số nhóm cytosine (guanine/cytosine = 1). Về sau này người ta đã đặt quy tắc mang tên ông về tổng lượng các loại nucleotide cấu tạo nên các DNA. Trong những năm đầu thập niên 1950, hai nhà vật lý học người Anh, Maurice Hugh Frederick Wilkins (1916 - 2004) cùng với Rosalind Franklin (1920 - 1958) bắt đầu tiến hành các nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc DNA. Wilkins là con trai của một bác sĩ người New Zealand chuyên học vật lý và vào thời kỳ đầu cuộc Chiến tranh Thế giới thứ hai, ông làm việc cho sự phát triển bom nguyên tử. Nhưng sau cuộc Thế chiến này, ông dùng tất cả sức lực của mình cho công việc nghiên cứu DNA và đã trở thành một trong những nhà bác học tiên phong trong lĩnh vực này nên được coi là nhà lý sinh học. Wilkins và Franklin đã áp dụng phương pháp nhiễu xạ Rơnghen (X-ray diffraction) vào việc nghiên cứu cấu trúc tinh thể của DNA (lấy từ tuyến ức bê, thymus). Với những bức ảnh chụp cấu trúc tinh thể DNA có dạng chữ thập, hai tác giả này gợi ý rằng DNA có thể gồm hai hoặc ba mạch đơn bện xoắn với nhau. Năm 1953, từ các nghiên cứu của mình kết hợp với các kết quả nghiên cứu trước đó của Chargaff và Wilkins, hai nhà khoa học ở trường Đại học Tổng hợp Cambridge là Francis Harry Compton Crick (England; 1916-2004) và James Dewey Watson (USA; 1928-2003) đã xây dựng thành công mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử DNA. Với công trình này, Watson và Crick đã được trao giải thưởng Nobel về y học và sinh lý học năm 1962. Từ đó Crick đã xây dựng một chuỗi xoắn kép DNA bằng đồng trong vườn nhà ông ở trung tâm Cambridge, sau đó đã viết: “Người ta hỏi tôi là khi nào thì sẽ mạ vàng”. Cùng với việc nghiên cứu cấu trúc DNA, các nhà khoa học cũng đã nỗ lực tìm hiểu vai trò và các chức năng sinh học của nó. Vào năm 1944, nghĩa là sau 75 năm kể từ khi phát hiện DNA trong nhân tế bào năm 1869, nhà vi khuẩn học người Mỹ Oswwald Theodore Avery (1877 - 1955) đã chứng minh DNA là chất liệu di 10 truyền khi bổ sung DNA chiết xuất từ chủng độc (chủng không độc của phế cầu khuẩn Diplococcus pneumoniae biến thành chủng độc gây viêm phổi và làm chết chuột bắt nguồn từ thí nghiệm biến nạp của F. Grifith năm 1928) vào môi trường nuôi cấy và kết hợp với việc xử lý bằng DNase. Điều đó chứng tỏ DNA quyết định tính chất di truyền của phế cầu khuẩn. Năm 1952, Alfred Day Hershey (1908 - 1997) và Martha Chase (1927 - 2003) cho biết, bằng đồng vị phóng xạ có thể theo dõi sự di chuyển của protein và DNA của virus (cơ sở là DNA chứa phosphor, protein chứa lưu huỳnh mà không chứa phosphor; vì vậy DNA virus có thể được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ phosphor, còn protein virus được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ lưu huỳnh). Khi đánh dấu một số hạt virus ở phần protein và một số hạt virus ở phần DNA rồi đưa vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn chủ E. coli thì thấy DNA virus nhanh chóng thâm nhập vào tế bào chủ, còn phần protein thì không. Thí nghiệm cũng đã chứng minh tầm quan trọng về mặt di truyền của DNA. Năm 1955, nhà hóa sinh học Mỹ Fraenkel-Konrad (1910 - ) đã chia virus ra làm hai phần và sau đó nối được hai phần đó lại, phần protein không gây nhiễm (không chui vào tế bào vật chủ) còn phần DNA thì gây nhiễm. Thí nghiệm của Krauss trên hồng cầu người chứng minh sự liên quan giữa cấu trúc hóa học của protein với vai trò di truyền của DNA (khi đưa DNA chiết xuất từ hồng cầu non của người lành vào tủy xương bệnh nhân thiếu máu hình lưõi liềm (có HbS không bình thường) thì thấy hemoglobin bình thường được tổng hợp. Điều đó chứng tỏ DNA quyết định cấu trúc đặc hiệu của protein. Các thí nghiệm sau đó của các nhà khoa học đã chú trọng vào việc tổng hợp DNA. Năm 1956 Severo Ochoa (1905 - 1993) và Arthur Kornberg (1918 - ) - hai nhà khoa học người Mỹ đã tổng hợp DNA in vitro bằng cách trộn enzyme DNA polymerase I được chiết xuất từ E. coli với các dNTP, DNA khuôn (DNA tự nhiên) và Mg++, DNA thu được không khác DNA tự nhiên. Hai nhà khoa học này đã được nhận giải thưởng Nobel về y học và sinh lý học vào năm 1959. Năm năm sau khi công bố công trình cấu trúc xoắn kép của DNA vào năm 1958, Matthew Stanley Meselson (1930 - ) và Franklin William Stahl (1928 - ) đã chứng minh bằng thực nghiệm dự đoán trên là hoàn toàn có cơ sở. Bằng cách nuôi vi khuẩn E. 11 coli ở môi trường chứa nitơ nặng 15N sau đó bằng 14N bình thường rồi theo dõi qua các thế hệ, xem sự thay đổi tỷ trọng của DNA qua máy ly tâm siêu tốc (siêu ly tâm); hai nhà khoa học đã xác định được cơ chế tái sinh bán bảo tồn của DNA. Về việc nghiên cứu RNA, cho đến cuối những năm 30 của thế kỷ XX, các nhà khoa học vẫn nghĩ rằng DNA là đặc trưng của các tế bào động vật, còn RNA chỉ có thể gặp được ở trong nấm men và các tế bào thực vật. Nguồn quan trọng nhất của DNA lúc này là tuyến ức (thymus), còn đối với RNA là nấm men. Các nghiên cứu chính xác hơn sau này đã cho thấy cả hai loại nucleic acid đều có mặt trong tất cả các tế bào động vật và thực vật. Năm 1939, các nhà nghiên cứu Torbjorn Oskar Caspersson (Thụy điển; 1910 - 1997) và Jean Brachet (Bỉ; 1909 - 1998) đã chứng minh sự tổng hợp mạnh mẽ protein trong bào tương cùng xảy ra với sự tổng hợp manh mẽ RNA. Năm 1956, S. Ochoa (nhà hóa sinh học người Mỹ) đã dùng enzyme RNA polymerase được chiết xuất từ vi khuẩn Azobacter vineladni để tổng hợp RNA in vitro. Năm 1956, George Emile Palade (1912 - ) đã chứng minh microsome có chứa những hạt có nhiều RNA gọi là thể ribo tức là ribosome (55% RNA, còn lại là protein). Năm 1961, Francois Jacob (1920 - ) và Jacques Lucien Monod (1910 - 1976) nêu vấn đề có một loại RNA khác có đặc điểm chuyển hóa nhanh chóng và có cấu tạo tương tự DNA. Đó là mRNA, là chất trung gian chuyển thông tin từ DNA đến chuỗi polypeptide được tổng hợp. Trước đó vào năm 1958, M. B. Hoagland (nhà hóa sinh học người Mỹ) đã nghiên cứu vấn đề đưa amino acid vào ribosome. Ông đã xác định là trước khi tham gia tổng hợp protein, amino acid được kết hợp với RNA vận chuyển (tRNA) để vận chuyển amino acid từ bào tương vào ribosome. Với những phương pháp thí nghiệm khác nhau các phòng thí nghiệm của Marshall Warren Nirenberg (1927 - ), Har Gobind Khorana (1922 - ) và Ochoa đã xác định được các bộ ba mật mã của toàn bộ 20 amino acid vào những năm 1961 - 1965. Do vai trò quan trọng của nucleic acid trong hoạt động sống của cơ thể sinh vật (tham gia vào các quá trình cơ bản của sự sống 12 như sinh tổng hợp protein, sinh trưởng, sinh sản và di truyền), cho nên việc nghiên cứu nucleic acid ngày càng được chú trọng. Từ những năm 70 của thế kỷ XX trở lại đây, nhất là trong 10 năm cuối của thế kỷ và những năm đầu của thế kỷ XXI này, hiểu biết về nucleic acid ngày càng được mở rộng. Nhờ những thành tựu của sinh học phân tử, một lĩnh vực khoa học mới đã hình thành và phát triển mạnh mẽ, đó là công nghệ gen, một trọng tâm được đầu tư nghiên cứu hàng đầu của công nghệ sinh học. II. Các phương pháp nghiên cứu Cũng như sự nghiên cứu các đại phân tử sinh học khác, có nhiều phương pháp và kỹ thuật được sử dụng trong việc nghiên cứu nucleic acid. Tuy nucleic acid có cấu trúc phức tạp và hoạt động rất chặt chẽ, nhưng nhờ những thành tựu mới về kỹ thuật, đã ra đời nhiều phương tiện và phương pháp nghiên cứu hiện đại, đảm bảo độ chính xác cao, cho phép khám phá thêm nhiều điều quan trọng ở nucleic acid. 1. Các phương pháp chung 1.1. Phương pháp nhiễu xạ Rơnghen Phương pháp này dựa trên sự tán xạ của tia X (tia Rơnghen) qua cấu trúc tinh thể của chất cần phân tích. Bằng cách đó và pha của tia X bị nhiễu xạ kết hợp với việc xử lý dữ liệu trên máy tính, người ta có thể xác định được chính xác vị trí của một nguyên tử bất kỳ so với các nguyên tử còn lại trong một đại phân tử. Nhờ vậy, người ta có thể thu nhận được một hình ảnh "tĩnh" về cấu trúc phân tử nằm ở trạng thái tinh thể. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các chất nằm trong tế bào không bao giờ tồn tại ở trạng thái tinh thể, mà chúng thường nằm ở trạng thái hoà tan hoặc kết hợp với các cấu trúc khác của tế bào. Bởi vậy, người ta thường sử dụng thêm phương pháp phân tích cộng hưởng từ hạt nhân để thu được cấu trúc phân tử của chất cần phân tích ở trạng thái hoạt động sinh học. Nhờ kết quả nhiễu xạ Rơnghen trên các sợi nucleic acid, người ta đã xác định được cấu trúc không gian của phân tử nucleic acid (chủ yếu là của DNA). 1.2. Phương pháp điện di 13 Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào tính phân cực của phân tử và khả năng di chuyển về một hướng xác định khi chịu tác động của một điện trường. Trong các dung dịch kiềm và trung tính, các đại phân tử nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên trong điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Bằng phương pháp điện di, chúng ta có thể thu được nucleic acid dạng tinh khiết từ dịch chiết nghiên cứu. Phương pháp này cũng được dùng để tách riêng các nucleic acid DNA, RNA, cũng như các loại RNA riêng biệt (mRNA, rRNA, tRNA). 1.3. Phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào khả năng phân bố của các chất chạy sắc ký khi đưa vào dung môi kết hợp với khả năng hấp phụ của vật liệu sắc ký. Các chất khác nhau có khả năng hòa tan vào dung môi khác nhau và được vật liệu sắc ký hấp phụ với lực khác nhau cho nên tốc độ di chuyển của chúng trên sắc ký đồ là khác nhau. Do đó các chất này sẽ được tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Phương pháp này được dùng để tách chiết và tinh chế nucleic acid. Có nhiều phương pháp sắc ký: sắc ký giấy, sắc ký cột, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí. 1.4. Phương pháp quang phổ Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu. Người ta cũng xác định được độ tinh khiết của chế phẩm nucleic acid khi xác định độ hấp thụ ánh sáng ở 280 và 260 nm (độ hấp thụ cực đại của protein là ở 280 nm). 1.5. Phương pháp đồng vị phóng xạ Nguyên tắc của phương pháp này là các chất đồng vị phóng xạ được gắn lên chất nghiên cứu và dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi để theo dõi quá trình biến đổi của các chất khi đưa chúng vào cơ thể hoặc môi trường cần nghiên cứu. Nhờ vậy có thể xác định được cơ chế tham gia quá trình biến đổi của chất cần nghiên cứu. Cũng có thể dùng máy đo phóng xạ để định lượng chất cần nghiên cứu. 14 Phương pháp đồng vị phóng xạ được dùng để nghiên cứu cơ chế tổng hợp nucleic acid. Ngoài ra việc xác định thành phần cấu trúc cũng như định lượng nucleic acid cũng được tiến hành bằng phương pháp này. Các đồng vị hay dùng cho các nghiên cứu này là: 3H, 14C, 32P, 15N. 1.6. Phương pháp hóa học Dùng phương pháp thủy phân thích hợp bằng acid hay kiềm, người ta có thể thu nhận được các phần khác nhau của nucleic acid. Bằng cách kết hợp với các phương pháp khác như sắc ký hay điện di, các thành phần được tách riêng để nghiên cứu cấu trúc, thành phần hóa học và tính chất của chúng. Người ta cũng có thể dùng phương pháp hóa học để định tính nucleic acid trong tế bào nhờ những phản ứng hóa học đặc trưng. 1.7. Phương pháp dùng hệ thống vô bào Người ta có thể sử dụng đối tượng nghiên cứu là cơ thể toàn vẹn, lát cắt mô, tế bào, nhưng một phương pháp nghiên cứu rất có hiệu quả là phương pháp dùng các hệ thống vô bào (không dùng tế bào nguyên vẹn). Nghiền vỡ tế bào rồi dùng các phương pháp ly tâm để tách các thành phần khác nhau của tế bào. Dựa trên nhu cầu nghiên cứu, người ta có thể thêm vào hệ thống vô bào các chất khác nhau. Nhờ hệ thống vô bào này chúng ta có thể nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp protein, vai trò của các nucleic acid trong quá trình này, cũng như bản thân quá trình tổng hợp các nucleic acid. P. C. Zamecnik và cộng sự lần đầu tiên phát triển các hệ thống vô bào để nghiên cứu sinh tổng hợp protein, đã xác định các hạt ribonucleoprotein (ribosome) là nơi sinh tổng hợp protein và đã phát hiện ra tRNA. 2. Các phương pháp tách chiết nucleic acid Để đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo, nucleic acid cần được tách với một lượng đủ lớn và đủ tinh sạch. Chính vì vậy điều cần chú ý trước hết là phải thu nhận các nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Việc nghiền lắc mạnh không đúng quy trình cũng dễ làm tổn thương đến phân tử nucleic acid (dễ bị gãy). Các enzyme nội bào bị phá vỡ cũng có thể thủy phân nucleic acid. Để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (deoxyribonuclease 15 = DNase, và ribonuclease = RNase) cần tách chiết nucleic acid ở nhiệt độ thấp, hoặc sử dụng các chất ức chế sự hoạt động của các enzyme này. 2.1. Phương pháp tách chiết DNA DNA là phân tử có kích thước lớn nên cần tránh các tác nhân có học hoặc hóa học mạnh, tránh làm đứt gãy. Có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tách chiết DNA, như: ly tâm gradient tỷ trọng ClCs, cột sắc ký trao đổi anion (Kit QIAGEN), v.v. Dưới đây chỉ là một trong các phương pháp tách chiết DNA đó. Phương pháp tách chiết này gồm 3 bước cơ bản sau: - Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (ở tế bào eukaryote) bằng hỗn hợp chất tẩy (SDS - sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) và proteinase. Các DNA sẽ được giải phóng ra môi trường. Các protein liên kết với DNA cũng tự bị phân hủy. - Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu mà chủ yếu là protein bằng dung dịch: phenol chloroform. Dung dịch này làm biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Sau khi ly tâm loại protein (nằm giữa pha nước và pha phenol: chloroform) sẽ thu được nucleic acid (ở pha nước). - Bước 3: Kết tủa nucleic acid. Mục đích là thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme cũng như có thể hòa tan trở lại theo nồng độ mong muốn. + Dùng etanol nồng độ cao (2,5 dung tích ethanol/1 dung tích mẫu) trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), ở nhiệt độ thấp. Hầu như toàn bộ nucleic acid đều kết tủa trong điều kiện này. + Dùng isopropanol (thể tích dung môi: thể tích mẫu là 1:1), không có sự hiện diện của muối. Các DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, do đó có thể loại chúng ra khỏi dịch chiết bằng cách này. Tủa thu được bằng 2 cách trên được thu nhận lại bằng cách ly tâm. Sau đó được rửa lại bằng ethanol 70% để loại bỏ các muối và các dấu vết isopropanol. Và cuối cùng là, tiến hành xử lý bằng RNase để loại bỏ RNA. 2.2. Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA Các loại RNA đềulà các phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi 16 các enzyme ribonuclease (RNase). Hoạt tính của các enzyme này rất cao và bền vững với các tác nhân thường dùng để bất hoạt enzyme (như xử lý 900C trong 1h không làm mất hoạt tính nó). RNase lại có mặt khắp nơi (ví dụ trên đầu ngón tay của người thao tác...). Chính vì vậy, cần phải có nhiều biện pháp thận trọng để tránh các tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay được xử lý với DEPC hầu tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần. - Việc tách chiết RNA toàn phần cũng gồm 3 bước cơ bản như đối với DNA: (Lưu ý rằng, đây cũng chỉ là một trong các phương pháp được sử dụng mà thôi. Hiện nay phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để chiết tách RNA là Tri201.) + Nghiền tế bào mô trong dung dịch có một một chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính protein mạnh (guamidium thiocyanate), một chất khử (2 - mercaptoethanol). Các chất này có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA. + Loại protein bằng xử lý phenol: chloroform và ly tâm. + RNA được kết tủa bằng ethanol và thu lại bằng ly tâm. Dưới dạng kết tủa trong etanol hoặc đông lạnh ở -700C trong nước có chứa chất ức chế RNase là R - nasine, RNA có thể được bảo quản trên một năm. Và, cuối cùng là bước tách RNA khỏi DNA. - Tách chiết mRNA (ở các tế bào nhân chuẩn) Khoảng 90-99% tổng số RNA tế bào là rRNA (80 - 85%), tRNA(15 - 20%), snRNA (<1%). Chúng có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng bằng điện di, ly tâm.... mRNA chiếm khoảng 1 - 5% tổng số RNA tế bào. Kích thước và trình tự của loại này vô cùng đa dạng. Tuy vậy, chúng có một đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi polyA (có thể lên đến 100A). Người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng cách dựa vào cấu trúc trên và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, sử dụng sắc ký ái lực trên cột oligodT - cellulose. Các bộ mẫu thử (các kit) được xuất hiện trên thương trường hiện nay sử dụng các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt là dựa vào nguyên tắc đã nêu trên. Rằng liên kết bỏ sung với oligodT, sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ, chúng sẽ được thu nhận lại qua ly tâm hoặc sử dụng nam châm và mRNA sẽ được tách khỏi các viên bi và giữ lại. Bằng cách này có thể thu nhận mRNA từ những mẫu có khối lượng rất 17 nhỏ. Sau khi tách chiết các nucleic acid có thể được tinh sạch bằng các phương pháp siêu ly tâm, sắc ký hay điện di. 2.3. Phương pháp siêu ly tâm Siêu ly tâm trên một gradient liên tục cesium chloride (CsCl). Khi ly tâm, dung dịch CsCl đậm đặc trong ống ly tâm sẽ tự động hình thành một građient tỷ trọng với tỷ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy ống. Dưới tác dụng của lực ly tâm, các nucleic acid di chuyển trong ống đến vị trí có tỷ trọng bằng với tỷ trọng của chính chúng sẽ đạt thế cân bằng và ngừng lại, hình thành một lớp cố định trong ống. Sau khi ly tâm, lớp này sẽ được thu nhận lại. Phương pháp này thường được dùng để tinh sạch plasmid và phage. - Siêu ly tâm trên đệm CsCl (gradient không liên tục): Hỗn hợp nhiều nucleic acid có tỷ trọng biết trước khác nhau được đặt trên một lớp dung dịch CsCl (đệm). Trong quá trình ly tâm chỉ có những phân tử có tỷ trọng cao hơn tỷ trọng lớp đệm mới di chuyển qua được lớp đệm. Ở đây, ống ly tâm bao gồm nhiều lớp đệm có tỷ trọng tăng dần từ miệng đến đáy ống. Nucleic acid cần tinh sạch sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp đệm. Phương pháp này thường dùng để tinh sạch một lượng lớn phage. - Siêu ly tâm trên gradient saccharose: Thường dùng để phân tích thô một hỗn hợp có kích thước chênh lệch nhau nhiều kb. Ứng dụng chúng trong chọn lọc các đoạn DNA có kích thước xác định dùng trong việc thiết lập các ngân hàng gen. 2.4. Phương pháp sắc ký Có thể dùng các phương pháp sắc ký khác nhau để phục vụ cho các mục đích khác nhau trong tách chiết nucleic acid. - Sắc ký ái lực trên polyU - sepharose hay trên oligodT - cellulose để tinh sạch mRNA. - Sắc ký lọc gel trong phân tách các nucleic acid ra khỏi các nucleic tự do sau quá trình đánh dấu DNA hoặc RNA. - Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi những lượng rất nhỏ DNA. - Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography - HPLC). Phương pháp có độ phân giải cao này được dùng trong tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp (độ phân 18 giải một nucleotide), plasmid, phân tách các đoạn DNA. 3. Các phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid Muốn định tính và định lượng các nucleic acid, người ta phải tiến hành thu nhận chúng ở dạng sạch. Các phương pháp thường dùng trong định tính và định lượng chúng là phương pháp đo mật độ quang, điện di, siêu ly tâm, sắc ký. 3.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu phục vụ yêu cầu nghiên cứu. Nguyên tắc của phương pháp đã được trình bày ở phần trước. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm).Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số OD260nm/OD280nm đối với DNA là OD260nm/OD280nm ≥ 1,8; còn đối với RNA là OD260nm/OD280nm ≥ 2. 3.2. Phương pháp điện di gel Cơ sở của phương pháp này đã được trình bày ở phần trước. Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu nucleic acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thước trung bình của các đoạn nucleic acid cần phân tách. Mối tương quan giữa nồng độ agarose và acrylamide cần sử dụng để phân tách các trình tự có kích thước xác định được thể hiện qua bảng 1.1. 3.2.1. Gel polyacrylamide Thường dùng để tách các đoạn kích thước nhỏ dưới 1000 cặp base. So với gel agarose thì thao tác với gel này phức tạp hơn. Vì vậy, gel này chỉ được dùng cho những mục đích đặc hiệu. Ứng dụng chủ yếu của loại gel này là: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA có chiều dài dưới 500 cặp base 19 Gel được đổ giữa hai tấm thủy tinh và điện di thực hiện theo chiều thẳng đứng. Bảng 1.1 Tương quan giữa nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách % acrylamide Kích thước các đoạn cần phân tách (cặp base: bp) 4 200 - 800 5 80 - 200 8 40 - 100 11 10 - 50 % agarose Kích thước các đoạn cần phân tách (kb) 0,6 - 0,8 1 - 20 0,9 - 1,2 0,5 - 7 1,2 - 1,5 0,2 - 5 3.2.2. Gel agarose Là loại gel thông dụng nhất. Thao tác với loại gel này đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 - 20kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Trong gel agarose các nucleic acid sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Hóa chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại. Dưới sự chiếu sáng bằng tia tử ngoại (λ = 260 - 360 nm), nucleic acid sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam. Để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker - MWM). Đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA - DNA ladder). Điện di trên gel agarose còn được sử dụng để tinh sạch và thu nhận mẫu. Ở đây, sau khi điện di, các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại theo một trong các phương pháp sau: (i) Cắt phần agarose chứa các vạch DNA, sau đó thu nhận lại DNA bằng cách khuyếch tán từ gel agarose vào một dung dịch đệm thích hợp. 20 (ii) Khoét một “giếng” nhỏ trong agarose ngay dưới vạch DNA. Bơm dung dịch đệm vào đầy “giếng” và điện trường được tái lập. DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dịch đệm và được thu nhận lại. (iii) Dùng gel agarose đặc biệt như Nusieve hay Seaplaque có điểm nóng chảy rất thấp (650C) cho điện di. Sau điện di, vạch DNA được cắt ra và ủ trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 650C. Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và kết tủa. 4. Các phương pháp xác định trình tự của nucleic acid Các phương pháp phân tích nucleic acid đã nêu đã cung cấp nhiều thông tin về nucleic acid nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của một đoạn nucleic acid cụ thể. Thông tin về sự tương ứng của nucleic acid với gene gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào, chỉ có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của nucleic acid. Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid nói chung dựa vào hai nguyên tắc cơ bản, được tóm tắt dưới đây (về chi tiết, có thể tham khảo trong: Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1997; Đỗ Quý Hai 2001.): - Nguyên tắc hóa học (Phương pháp Maxam - Gilbert, 1977): dựa vào các phản ứng hóa học thủy phân đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau. - Nguyên tắc enzyme học (Phương pháp Sanger (1977) và các phương pháp cải biên): Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm dideoxynucleotide (nhóm 3′-ON được thay bằng H) cùng với các deoxy nucleiotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Ở cả hai trường hợp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotide. Với việc sử dụng một đoạn nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự cần xác định dược đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. Câu hỏi ôn tập 1. Trình bày tóm tắt lịch sử nghiên cứu các nucleic acid. 21 2. Mô tả các phương pháp chung thường dùng trong nghiên cứu nucleic acid. 3. Trình bày nguyên tắc và ứng dụng của các phương pháp tách chiết nucleic acid. 4. Mô tả các phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid. 5. Sơ lược về các phương pháp xác định trình tự của các nucleic acid. Tài liệu Tham khảo Nguyễn Bá Lộc. 2000. Giáo trình Axit nucleic và Sinh tổng hợp protein. NXB Giáo dục. Đỗ Quý Hai. 2001. Bài giảng Axit Nucleic. Trường ĐHKH, Đại Học Huế. Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng (1992): Hoá sinh học. NXB Giáo dục, Hà Nội. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương. 1997. Sinh học Phân tử. NXB Giáo Dục. Lehninger L. et al. 1993. Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York. Stryer L. 1981. Biochemistry. W.-H. Freeman and Co., San Francisco.